CZ280021B6

CZ280021B6 - Riboflavin isolation process

Info

Publication number: CZ280021B6
Application number: CS911074A
Authority: CZ
Inventors: Roman Rndr. Csc. Zeman; Reimund Ing. Denk; Renata Ing. Dvořáková; Viktor Ing. Smetana; Hana Ing. Csc. Bulantová; Milan Ing. Vodňanský; František Rndr. Csc. Smékal; Ivan Ing. Svoboda
Original assignee: Icn Czech Republic A.S.
Priority date: 1991-04-16
Filing date: 1991-04-16
Publication date: 1995-09-13
Also published as: CS107491A3; SK280146B6

Abstract

Způsob izolace riboflavinu z buněk sovětského kmene Bacilluus subtilis 24/pMX/45 ošetřením vyfermentované půdy nebo z ní odseparované pasty tenzidy a/nebo organickými rozpouštědly nebo samotnými tenzidy, následným odstředěním, varem s organickými kyselinami, popř. ještě s organickými rozpouštědly, odstředěním či filtrací za horka za vzniku odpadní pasty, zahuštěním supernatantu nebo filtrátu, krystalizací, filtrací, promytím vodou a organickými rozpouštědly a sušením. Požadovaný riboflavin (vitamin B.sub.2.n.) je získán ve vysoké kvalitě a výtěžku.ŕA method for the isolation of riboflavin from cells of a Soviet strain of Bacilluus subtilis 24 / pMX / 45 by treating fermented soil or paste separated therefrom with surfactants and / or organic solvents or surfactants alone, followed by centrifugation, boiling with organic acids, and the like. still with organic solvents, centrifugation or hot filtration to form waste paste, concentration of supernatant or filtrate, crystallization, filtration, washing with water and organic solvents, and drying. The desired riboflavin (vitamin B2) is obtained in high quality and yield

Description

Vynález se týká způsobu izolace riboflavinu z vyfermentované živné půdy po ukončení kultivace buněk produkčního mikroorganismu Bacillus subtilis.The present invention relates to a method for isolating riboflavin from fermented broth after culturing the cells of the Bacillus subtilis producing microorganism.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Riboflavin (vitamin B₂) je produkován řadou mikroorganismů jako například rodu Pseudomonas, Gluconobacter, Brevibacterium, Bacillus, Nocardia, Candida nebo Saccharomyces a jiné. Riboflavin se z vyfermentované půdy izoluje a čistí nejrúznějšími způsoby. Podle evropské patentové přihlášky č. 0 137 226 je riboflavin produkován některými kvasinkami za použití nižších alifatických sloučenin (C]_ až C₄). Po skončení kultivace se riboflavin extrahuje v kyselém prostředí za teplot vyšších než 50 °C a čistí se. Získaný produkt je nutno ještě přečistit, a tím dochází k jeho ztrátám. Japonský patentový spis č. 1 021 096 uvádí separaci půdy do pevných součástí, několikastupňovou izolaci riboflavinu horkou vodou a krystalizaci. Nevýhodou uvedeného postupu je práce s velkými objemy a ztráta produktu při čistění. Způsob izolace a čištěni riboflavinu se podle DOS č. 3 421 714 provádí rozpuštěním riboflavinu v alkalickém prostředí s aktivním uhlím. Po úpravě pH na 0,8 až 6,5 se směs zahřívá při 90 ° až 100 ’C po dobu 10 až 80 minut. Následnou krystalizaci se získá produkt o čistotě 92 až 94 % při výtěžku 90 až 92 %. Podle japonského patentového spisu č. 0 100 591 se izolace a čištění riboflavinu provádí pomocí iontoměničů, eluce roztokem anorganických solí a chromatografie na sloupcích naplněných polystyrénovou pryskyřicí. Tento postup je však dost nákladný a složitý pro výrobní využití. DOS č.Riboflavin (vitamin B ₂ ) is produced by a variety of microorganisms such as Pseudomonas, Gluconobacter, Brevibacterium, Bacillus, Nocardia, Candida or Saccharomyces and others. Riboflavin is isolated from the fermented soil and purified in various ways. According to European patent application no. 0137226 riboflavin produced by some yeast for the use of lower aliphatic compounds (C] _ to _C4). At the end of the culture, riboflavin is extracted in an acid medium at temperatures above 50 ° C and purified. The product obtained is still to be purified and is thereby lost. Japanese Patent Specification No. 1,021,096 discloses separation of soil into solids, multi-step isolation of riboflavin with hot water, and crystallization. The disadvantage of this process is the work with large volumes and the loss of product during cleaning. The method of isolation and purification of riboflavin according to DOS No. 3,421,714 is carried out by dissolving riboflavin in an alkaline medium with activated carbon. After adjusting the pH to 0.8 to 6.5, the mixture is heated at 90 ° to 100 ° C for 10 to 80 minutes. Subsequent crystallization yielded a product with a purity of 92-94% in a yield of 90-92%. According to Japanese Patent Publication No. 0 100 591, the isolation and purification of riboflavin is carried out by means of ion exchangers, elution with a solution of inorganic salts and chromatography on polystyrene resin-filled columns. However, this process is quite expensive and complicated for production use. DOS č.

406 319 uvádí pouze zlepšený postup čištění izolovaného čistého riboflavinu oxidací peroxidem vodíku, kyselinou dusičnou a podobně za zvýšené teploty, přerušením oxidace vlitím studené vody a krystalizaci. Čistota produktu se pohybuje mezi 94 až 96 % při výtěžku 86 až 94 %.No. 406,319 discloses only an improved process for purifying isolated pure riboflavin by oxidation with hydrogen peroxide, nitric acid and the like at elevated temperature, interrupting oxidation by pouring cold water and crystallizing. The purity of the product is between 94-96% with a yield of 86-94%.

Známé postupy jsou materiálově i technologicky značně náročné a pro výrobu v průmyslovém měřítku neekonomické. Byla proto hledána cesta jak tyto nedostatky odstranit, což se podařilo vypracováním způsobu podle tohoto vynálezu.The known processes are materially and technologically demanding and uneconomical for production on an industrial scale. It has therefore been sought to overcome these drawbacks, which has been accomplished by the method of the invention.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Způsob izolace riboflavinu z vyfermentované živné půdy po ukončení kultivace buněk produkčního mikroorganismu Bacillus subtilis podle vynálezu spočívá v tom, že se v prvním stupni vyfermentované živná půda nebo oddělená biomasa uvádí v prostředí vody do styku s neiontovými nebo iontovými tenzidy typu laurylsíranu, oxyethylovaného nonvlfenolu nebo p - oktylfenolu a/nebo s organickými rozpouštědly ze skupiny alkanů s 5 až 10 atomy uhlíku, cykloalkanů s 5 až 7 atomy uhlíku, esterů alkankarboxylových kyselin celkem se 2 až 6 atomy uhlíku nebo aromatických uhlovodíků se 6 až 8 atomy uhlíku nebo chlorovaných alkanů s 1 až atomy uhlíku, biomasa se opět oddělí a ve druhém stupni se sus-1- penduje na koncentraci buněk 0,01 až vodě, obsahující kyseliny s 1 organických teplotu 40 stupni při fázi, potomThe method for isolating riboflavin from fermented broth after culturing the cells of the Bacillus subtilis production microorganism according to the invention comprises contacting the fermented broth or the separated biomass in a water environment with nonionic or ionic surfactants of the lauryl sulphate type, oxyethylated nonvlphenol or p - octylphenol and / or organic solvents from the group of C 5 -C 10 alkanes, C 5 -C 7 cycloalkanes, C 2 -C 6 alkanecarboxylic acid esters or C 6 -C 8 aromatic hydrocarbons or 1-chlorinated alkanes up to carbon atoms, the biomass is separated again and in the second step sus-1- is pendent to a cell concentration of 0.01 to water containing acids with 1 organic temperature of 40 degrees per phase, then

0,1 až až 3 atomy aprotických až 120 ’C po teplotě nejméně 30 °C rozdělí na se z této fáze vyloučený riboflavin % hmot, s uhlíku, a/nebo rozpouštědel, dobu 0,25 ažFrom 0.1 to 3 aprotic atoms up to 120 ° C after a temperature of at least 30 ° C, riboflavin, by weight, with carbon and / or solvents, separated from this phase by 0.25 to

0,5 g vlhké hmoty / ml ve vodou mísitelné organické přísadu jednoho nebo více tato směs se zahřívá na 20 h, potom se ve třetím pevnou a kapalnou izoluj e.0.5 g wet mass / ml of a water miscible organic additive one or more is heated for 20 h, then isolated in a third solid and liquid.

Při provádění způsobu podle vynálezu se v prvním stupni vyfermentovaná půda nebo oddělená biomasa uvádí v prostředí vody do styku s tenzidy a/nebo organickými rozpouštědly po dobu 5 min až 5 h. Ve druhém stupni se k suspenzi biomasy ve vodě jako ve vodě rozpustná kyselina přidává kyselina mravenčí, octová, mléčná nebo štavelová a jako aprotické rozpouštědlo dimethylsulfoxid, dioxan, dimethylformamid nebo pyridin. K tomu lze poznamenat, že jsou použitelné i minerální kyseliny, ale ve srovnání s organickými kyselinami neposkytuji lepši výsledky. V závěrečném, tj. ve třetím stupni, se získaná kapalná fáze před krystalizací riboflavinu zahušťuje nejvýše na 0,1 původního objemu. Při vyšším zahuštění se již riboflavin začíná nekontrolované vylučovat a jeho izolace by byla podstatně obtížnější a spojena se zbytečnými ztrátami.In carrying out the process according to the invention, in the first step, the fermented soil or the separated biomass is contacted with surfactants and / or organic solvents in a water medium for 5 min to 5 h. formic, acetic, lactic or oxalic acid and, as the aprotic solvent, dimethylsulfoxide, dioxane, dimethylformamide or pyridine. It can be noted that mineral acids are also useful but do not give better results compared to organic acids. In the final step, i.e. in the third step, the obtained liquid phase is thickened to a maximum of 0.1 of the original volume before crystallization of the riboflavin. At higher concentration, riboflavin is already uncontrolled secretion and its isolation would be considerably more difficult and associated with unnecessary losses.

Odstředování půdy (pevných částic) se provádí vždy na kyvetové nebo průtokově odstředivce. Krystalizace byla prováděna při 5 až 10 C po dobu až do 48 h, získané krystaly byly promyty vodou a etanolem nebo acetonem v koncentraci 50 až 100 % obj. a sušeny byly při 30 až 120 °C po dobu 3 až 72 h. Suchý produkt riboflavinu má čistotu 92 až 100 %, při výtěžku 88 až 93 %.Centrifugation of the soil (solid particles) is always performed on a cuvette or flow centrifuge. Crystallization was performed at 5-10 ° C for up to 48 h, the obtained crystals were washed with water and ethanol or acetone at a concentration of 50-100% v / v and dried at 30-120 ° C for 3-72 h. riboflavin has a purity of 92-100%, with a yield of 88-93%.

Způsob izolace riboflavinu podle vynálezu umožňuje jednoduchým způsobem izolovat produkt z vyfermentované půdy bez dalšího čištění přímo do konečné formy o čistotě 92 až 100 %, při výtěžku 88 až 93 %. Tyto hodnoty přesahují hodnoty běžně udávané v literatuře a jsou srovnatelné s hodnotami dosahovanými špičkovými technologiemi včetně konečného čištění čistého preparátu riboflavinu.The riboflavin isolation process according to the invention makes it possible in a simple manner to isolate the product from fermented soil without further purification directly into the final form with a purity of 92-100%, in a yield of 88-93%. These values exceed those commonly reported in the literature and are comparable to those achieved by state of the art technology including the final purification of the pure riboflavin preparation.

Způsob podle vynálezu byl s úspěchem ověřen i ve výrobním měřítku.The process according to the invention has also been successfully tested on a production scale.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

Vlhká pasta buněk sovětského kmene Bacillus subtilis 24 /pMX/ 45, získaná odstředěním vyfermentované půdy (16 000 g), byla v množství 4,2 kg suspendována ve vodě na výsledný objem 12 litrů. Suspenze byla míchána s nonylfenolen oxyetylovaným 9 moly etylenoxidu v koncentraci 1 % objem / objem a butylacetátem v koncentraci 5 % objem / objem po dobu 0,5 h, potom byla ponechána v klidu, dokud se neoddělily jednotlivé fáze. Vrchní fáze byla odsáta a spodní suspenze byla oddělena na průtokové odstředivce. Získaná pasta byla resuspendována v 19,5 litrech pitné vody, která obsahovala kyselinu mravenčí v koncentraci 10 % objem / objem, a směs byla vařena při 105 °C po dobu 4 h. Směs byla potom odstředěna, supernatant byl ponechán krystalovat přes noc. Krystaly riboflavinu byly odděleny vakuovou filtraci, promytyThe wet cell paste of the Soviet strain Bacillus subtilis 24 / pMX / 45, obtained by centrifugation of fermented soil (16,000 g), was suspended in water at 4.2 kg to a final volume of 12 liters. The suspension was stirred with nonylphenolene oxyethylated with 9 moles of ethylene oxide at a concentration of 1% v / v and butyl acetate at a concentration of 5% v / v for 0.5 h, then allowed to stand until the phases separated. The top phase was aspirated and the bottom suspension was separated on a flow centrifuge. The resulting paste was resuspended in 19.5 liters of drinking water containing 10% v / v formic acid, and the mixture was boiled at 105 ° C for 4 h. The mixture was then centrifuged, the supernatant was allowed to crystallize overnight. The riboflavin crystals were collected by vacuum filtration, washed

-2CZ 280021 B6-2GB 280021 B6

2,5 litry deionizované vody a 1,26 litrem 96 % etanolu a sušeny 6 h při 105 °C ve vznosové sušárně. Bylo získáno 455 g riboflavinu o čistotě 100 %, při výtěžku 88 %.2.5 liters of deionized water and 1.26 liters of 96% ethanol and dried for 6 hours at 105 ° C in a fluid-bed dryer. 455 g of 100% pure riboflavin were obtained in a yield of 88%.

Příklad 2Example 2

100 g pasty získané odstředěním vyfermentované půdy jako v příkladě 1, bylo suspendováno ve 400 ml vody. K suspenzi bylo přidáno 100 ml chloroformu, směs byla třepána 60 min a odstředěna na kyvetové odstředivce. Získaná pasta byla suspendována v 1 600 ml vody obsahující kyselinu octovou v koncentraci 30 % objem / objem, ke směsi byl přidán etylacetát v koncentraci 10 % objem / objem a směs byla vařena při 100 ’C po dobu 2 h. Po oddělení odpadní pasty a zbytků chloroformu na průtokové odstředivce bylo získáno 998 ml supernatantu, který byl 2x zahuštěn. Po krystalizaci v chladu (5 °C) po dobu 12 h, vakuové filtraci, promytí 100 ml deionizované vody a 75 % acetonem v množství 50 ml a sušeni při 60 ° C po dobu 10 h ve větrané komorové lískové sušárně, bylo získáno 9,2 g riboflavinu o čistotě 98,2 %, při výtěžku 90,6 %.100 g of the paste obtained by centrifuging the fermented soil as in Example 1 was suspended in 400 ml of water. 100 ml of chloroform was added to the suspension, the mixture was shaken for 60 min and centrifuged on a cuvette centrifuge. The resulting paste was suspended in 1600 ml of water containing 30% v / v acetic acid, 10% v / v ethyl acetate was added to the mixture and the mixture was boiled at 100 ° C for 2 h. 998 ml of the supernatant was obtained, which was concentrated twice. After crystallization in cold (5 ° C) for 12 h, vacuum filtration, washing with 100 ml deionized water and 75% acetone in 50 ml and drying at 60 ° C for 10 h in a ventilated chamber hazel drier, 9, 2 g of riboflavin with a purity of 98.2% in a yield of 90.6%.

Příklad 3Example 3

Vyfermentovaná půda v množství 3,1 litru byla míchána s laurylsulfátem sodným v koncentraci 1 % hmota / objem po dobu 0,5 h. Suspenze byla odstředěna a získaná pasta byla suspendována ve 2 litrech deionizované vody tak, aby koncentrace kyseliny mravenčí ve směsi byla 20 % objem / objem. K suspenzi byl přidán dimetylsulf oxid v koncentraci 5 % objem / objem a směs byla zahřívána při 100 °C po dobu 4 h. Horká suspenze byla za použití křemeliny vakuově zfiltrována, čirý filtrát byl zahuštěn na polovinu objemu a ponechán krystalovat 20 h při 5 °C, potom byly krystaly riboflavinu odděleny vakuovou filtraci, promyty 250 ml deionizované vody a 100 ml etanolu (96 %) a sušeny 20 h při 37 °C ve větrané komorové lískové sušárně. Bylo získáno 23,0 g riboflavinu o čistotě 100 % při výtěžku 92,8 %.The fermented soil of 3.1 liters was stirred with sodium lauryl sulfate at a concentration of 1% w / v for 0.5 h. The suspension was centrifuged and the resulting paste was suspended in 2 liters of deionized water so that the formic acid concentration in the mixture was 20%. % v / v. Dimethylsulfoxide was added to the suspension at a concentration of 5% v / v and the mixture was heated at 100 ° C for 4 h. The hot suspension was vacuum filtered using diatomaceous earth, the clear filtrate was concentrated to half volume and allowed to crystallize at 5 ° for 20 h. C, then the riboflavin crystals were separated by vacuum filtration, washed with 250 ml deionized water and 100 ml ethanol (96%) and dried for 20 h at 37 ° C in a ventilated chamber hazel drier. 23.0 g of 100% pure riboflavin were obtained in a yield of 92.8%.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Způsob podle vynálezu umožňuje technologicky i materiálově nenáročnou výrobu riboflavinu (vitaminu B₂), který se získává ve vysoké čistotě a v ekonomicky uspokojivém výtěžku.The process according to the invention enables the production of riboflavin (vitamin B ₂ ), which is technologically and materially undemanding, which is obtained in high purity and in an economically satisfactory yield.

Claims

Method for the isolation of riboflavin from fermented broth after the cultivation of cells of the production microorganism Bacillus subtilis, characterized in that in the first step the fermented broth or separated biomass is contacted in water environment with nonionic or ionic surfactants of lauryl sulphate type, oxyethylated nonylphenol or p-octylphenol and / or with organic solvents from the group of 5 to 10 carbon atoms, 5 to 7 carbon atoms cycloalkanes, 2 to 6 carbon atoms total alkanecarboxylic acids or 6 to 8 aromatic hydrocarbons or chlorinated alkanes having from 1 to 4 carbon atoms, the biomass is separated again and suspended in a second step to a cell concentration of 0.01 to 0.5 g of wet mass / ml in water containing 0.1 to 85 wt. 1 to 3 carbon atoms and / or the addition of one or more organic aprotic solvents; The mixture is heated to a temperature of 40 to 120 ° C for 0.25 to 20 hours, then separated into a solid and a liquid phase at a temperature of at least 30 ° C in the third stage, then the riboflavin precipitated from this phase is isolated.

The method according to claim 1, characterized in that in the first stage the fermented soil or the separated biomass is contacted in a water environment with surfactants and / or organic solvents for 5 min to 5 h.

Process according to claim 1, characterized in that the water-soluble acid is formic, acetic, lactic or oxalic acid.

The process according to claim 1, characterized in that in the second step aprotic solvents are dimethylsulfoxide, dioxane, dimethylformamide or pyridine.

Method according to claim 1, characterized in that in the third step the liquid phase obtained before the crystallization of riboflavin is concentrated to a maximum of 0.1 of the original volume.