CZ279300B6

CZ279300B6 - Aqueous solution for stabilizing antigens and/or antibodies bonded to a solid carrier

Info

Publication number: CZ279300B6
Application number: CS921014A
Authority: CZ
Inventors: Petr Rndr. Mančal; Ivo Rndr. Lochman
Original assignee: Sevapharma A.S.
Priority date: 1992-04-03
Filing date: 1992-04-03
Publication date: 1995-04-12
Also published as: CZ101492A3; SK101492A3; SK277861B6

Abstract

Řešení se týká složení vodného roztoku pro stabilizaci biologicky aktivních látek vázaných na pevný nosič, který je nerozpustný ve vodě. Obsahuje-li uvedený roztok kyselinu epsilon amino kapronovou v definovaném rozsahu koncetrací, dochází ke zvýšení stability vázané biol. aktivní látky. Řešení je vhodné zejména pro uplatnění ve farmaceutickém průmyslu při výrobě diagnostických souprav typu enzymové imunoanalýzy a radioimunoanalýzy.ŕThe present invention relates to a composition of an aqueous solution for stabilizing water-insoluble, biologically active substances bound to a solid support. If said solution contains epsilon amino caproic acid within a defined range of concentrations, the stability of bound biol is increased. active ingredient. The solution is particularly suitable for use in the pharmaceutical industry in the production of diagnostic kits such as enzyme immunoassays and radioimmunoassays.

Description

Oblast technikyTechnical field

Řešení se týká farmaceutického průmyslu.The solution relates to the pharmaceutical industry.

Dosavadní stavBackground

V současné době se běžně používá postup, kdy se váže biol. aktivní látka na pevný nosič pasivní adsorpcí, zpravidla při alkalickém pH, po dobu několika hodin při teplotě 4 - 37 °C. Po promytí se většinou dále aplikuje blokační roztok, který obsahuje obvykle proteiny, nejčastěji hovězí sérový albumin (BSA), kdy se protein váže na dosud neobsazená aktivní místa polystyrénového nosiče, čímž dochází ke snižování nespecifických reakcí při provádění vlastního testu. Po promytí a usušení je nosič zataven do fólie a uchováván v suchu a chladnu. Je stálý obvykle několik měsíců bez měřitelné ztráty aktivity.Currently, a biol binding procedure is commonly used. active substance to solid support by passive adsorption, usually at alkaline pH, for several hours at 4-37 ° C. After washing, a blocking solution, usually containing proteins, most commonly bovine serum albumin (BSA) is usually applied, where the protein binds to the unoccupied active sites of the polystyrene carrier, thereby reducing non-specific reactions in the assay. After washing and drying, the carrier is sealed in foil and kept dry and refrigerated. It is stable for several months without measurable loss of activity.

Některé biologicky aktivní látky (antigeny a/nebo protilátky), izolované z hyperimunních sér, ascitických tekutin či jiného biol. materiálu, mohou navzdory částečné purifikaci obsahovat stopy proteolytických enzymů. Tyto enzymy se naváží na nosič spolu s danou protilátkou a mohou způsobovat během skladování její degradaci a tím i pokles aktivity nosiče. Některé biol. aktivní látky jsou na přítomnost těchto enzymů citlivější, jiné méně. Množství přítomných proteolytických enzymů se může měnit i od šarže k šarži a není snadné předem přesně určit, jak stabilní bude daná šarže nosiče s navázanou biol. aktivní látkou. Někdy může i sám hovězí albumin, použitý k blokaci, obsahovat nežádoucí proteolytické enzymy.Some biologically active substances (antigens and / or antibodies) isolated from hyperimmune sera, ascites fluids or other biols. material, may contain traces of proteolytic enzymes despite partial purification. These enzymes bind to the carrier together with the antibody and may cause its degradation during storage and thus decrease the activity of the carrier. Some biol. active substances are more sensitive to the presence of these enzymes, others less. The amount of proteolytic enzymes present can vary from batch to batch, and it is not easy to predict precisely how stable a given batch of carrier with a biol bound will be. active substance. Sometimes the bovine albumin itself used for blocking may also contain undesired proteolytic enzymes.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Podstata vynálezu spočívá v tom, že ke stabilizaci biologicky aktivních látek, tj. antigenů a/nebo protilátek, vázaných na pevný nosič, se použije vodný blokační roztok, který obsahuje místo proteinů kyselinu e-aminokapronovou, a to v koncentraci 0,01 mg/ml až 100 mg/ml roztoku. Tím se odstraní uvedené nevýhody.The principle of the invention is to use an aqueous blocking solution which contains β-aminocaproic acid instead of proteins at a concentration of 0.01 mg to stabilize biologically active substances, i.e. antigens and / or antibodies, bound to a solid carrier. ml to 100 mg / ml solution. This eliminates these disadvantages.

Kyselina e-aminokapronová (EACA) je inhibitorem proteolytických enzymů a používá se ke stabilizaci roztoků, obsahujících bílkoviny. Je také schopna pasivní adsoprce na pevný nosič, např. polystyren. Vynález tedy využívá těchto dvojích vlastností EACA ke stabilizaci antigenů a/nebo protilátek, vázaných na pevný nosič. Použije-li se místo běžného proteinového blokačního roztoku roztok EACA, dojde k vazbě EACA na dosud neobsazená aktivní místa polystyrénového nosiče. Tím dojde jednak k obsazení oněch nežádoucích volných aktivních míst (tedy k blokaci a snížení nespecifických reakcí), a jednak takto navázaná EACA svou neschopností inhibovat proteázy brání degradaci navázané biologicky aktivní látky účinkem ev. přítomných proteolytických enzymů.E-aminocaproic acid (EACA) is an inhibitor of proteolytic enzymes and is used to stabilize protein-containing solutions. It is also capable of passive adsorption to a solid support such as polystyrene. Thus, the invention utilizes these dual properties of EACA to stabilize antigens and / or antibodies bound to a solid support. If an EACA solution is used instead of a conventional protein blocking solution, the EACA binds to the unoccupied active sites of the polystyrene carrier. Thus, both unwanted free active sites (i.e., block and reduce non-specific reactions) are occupied, and on the other hand, the bound EACA by its inability to inhibit proteases prevents the degradation of the bound biologically active agent by ev. proteolytic enzymes present.

-1CZ 279300 B6-1GB 279300 B6

Navazování biologicky aktivních látek (nejčastěji antigenů či protilátek) na nerozpustné polymerní nosiče (nejčastěji na polystyren) má široké uplatnění při výrobě diagnostických souprav na principu enzymové imunoanalýzy (EIA, ELISA), radioimunoanalýzy (RIA) a při některých dalších metodách. Tyto Soupravy pak slouží k detekci či stanovení biologicky aktivních látek při diagnostice a monitorování řady onemocnění (infekčních, nádorových, metabolických, genetických atd.).The binding of biologically active substances (most often antigens or antibodies) to insoluble polymeric carriers (most often to polystyrene) is widely used in the manufacture of diagnostic kits based on the enzyme immunoassay (EIA, ELISA), radioimmunoassay (RIA) and some other methods. These kits are then used to detect or determine biologically active substances in the diagnosis and monitoring of a number of diseases (infectious, tumor, metabolic, genetic, etc.).

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

a) Na polystyrénovou mikrotitrační destičku byla navázána pasivní adsorpcí monoklonální protilátka anti-HBe, klon A2 (tj. proti e antigenů viru hepatitidy B). Navazování probíhalo přes noc při +4 °C, v prostředí 0,01 mol/1 dihydrogenuhličitanového pufru pH = 9,6, protilátka měla koncentraci 0,1 mg/ml roztoku.a) The polystyrene microtiter plate was bound by passive adsorption of a monoclonal anti-HBe antibody, clone A2 (ie against hepatitis B virus e antigens). Binding was carried out overnight at +4 ° C, in a 0.01 mol / l dihydrogen carbonate buffer pH = 9.6, the antibody having a concentration of 0.1 mg / ml solution.

b) Roztok byl odsát z jamek a byl aplikován blokační vodný roztok podle vynálezu s optimální koncentrací EACA 1 mg/ml roztoku, nebo běžný blokační roztok BSA 10 mg/ml roztoku. Vše bylo inkubováno 1 hod při pokojové teplotě.b) The solution was aspirated from the wells and a blocking aqueous solution of the invention was applied with an optimal EACA concentration of 1 mg / ml solution, or a conventional blocking solution of BSA 10 mg / ml solution. Incubate for 1 hour at room temperature.

c) Po odsátí blokačního roztoku byla destička vysušena stlačeným vzduchem a zatavena pod vakuem do třívrstevné fólie polyamid/Al/polyetylen.c) After aspiration of the blocking solution, the plate was dried with compressed air and sealed under vacuum into a three-layer polyamide / Al / polyethylene film.

U takto připravených destiček byla sledována stabilita při +4 ’C a +37 °C jako % aktivity protilátek, vázaných na destičku, při ELISA testu (průkazu sérového HBeAg).The plates prepared in this way were evaluated for stability at +4 ° C and +37 ° C as% of the activity of the plate-bound antibodies in an ELISA (serum HBeAg demonstration).

klasický roztok sclassic solution with

BSA blokační mg/ml blokační roztok dle vynálezuBSA blocking mg / ml blocking solution of the invention

4 ^CC4 ^C C 37 °C Deň: 32 ° C 4 °C Low: 14 ° C 37 ° 37 ° čas time AKTIVITA ACTIVITY (%) (%) AKTIVITA ACTIVITY (%) (%) 0 0 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 1 měsíc 1 month 100 100 ALIGN! 91 91 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 2 měsíce 2 months 100 100 ALIGN! 82 82 100. 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 3 měsíce 3 months 98 98 45 45 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 4 měsíce 4 month 97 97 20 20 May 100 100 ALIGN! 72 72 6 měsíců 6 months 96 96 11 11 100 100 ALIGN! 42 42

CC

Z výsledků stabilitních testů vyplývá, že použitím blokačního roztoku dle vynálezu o optimální koncentraci EACA dochází k podstatnému zvýšení stability protilátek anti-HBe, vázaných na polystyrénovou destičku. Po půl roce při 37 ’C je aktivita destičky, stabilizované dle vynálezu, stejná jako u destičky, blokované klasickým způsobem po 3 měsících. Exspirace destičky, připravené za použití vynálezu, je cca dvojnásobná než bez něj.The results of the stability tests show that the use of the blocking solution according to the invention with an optimal concentration of EACA significantly increases the stability of the anti-HBe antibodies bound to the polystyrene plate. After half a year at 37 ° C, the activity of the plate stabilized according to the invention is the same as that of the plate blocked in the classical manner after 3 months. The expiration of the plate prepared using the invention is about twice as high as without it.

-2CZ 279300 B6 <-2GB 279300 B6 <

Příklad 2Example 2

a) Na polystyrénovou mikrotitrační destičku byla navázána pasivní adsorpcí monoklonální protilátka anti-HBe, klon A2 (tj. proti e antigenu viru hepatitidy B). Navazování probíhalo přes noc při +4 °C, v prostředí 0,01 mol/1 dihydrogenuhličitanového pufru pH = 9,6, protilátka měla koncentraci 0,01 mg/ml.a) The polystyrene microtiter plate was bound by passive adsorption of a monoclonal anti-HBe antibody, clone A2 (ie against the hepatitis B virus e antigen). Binding was carried out overnight at +4 ° C, in a 0.01 mol / l dihydrogen carbonate buffer pH = 9.6, the antibody having a concentration of 0.01 mg / ml.

b) Roztok byl odsát z jamek a byl aplikován blokační roztok podle vynálezu s minimální účinnou koncentrací, tj. 0,01 mg EACA/ml vodného roztoku, nebo běžný blokační vodný roztok BSA 10 mg/ml roztoku.b) The solution was aspirated from the wells and a blocking solution of the invention was applied with a minimum effective concentration, i.e. 0.01 mg EACA / ml aqueous solution, or a conventional blocking aqueous solution of BSA 10 mg / ml solution.

U takto připravených destiček byla sledována stabilita při +4 °C a +37 °C jako % aktivity protilátek, vázaných na destičku, při ELISA testu (průkazu sérového HBeAg).The plates thus prepared were monitored for stability at + 4 ° C and + 37 ° C as% of plate-bound antibody activity in an ELISA (serum HBeAg demonstration).

klasický blokační roztok s 10 mg/ml BSA °C 37 °C blokační roztok dle vynálezu °C 37 °Cclassic blocking solution with 10 mg / ml BSA ° C 37 ° C blocking solution according to the invention ° C 37 ° C

čas time AKTIVITA ACTIVITY (%) (%) AKTIVITA ACTIVITY (%) (%) 0 0 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 1 měsíc 1 month 100 100 ALIGN! 91 91 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 2 měsíce 2 months 100 100 ALIGN! 82 82 100 100 ALIGN! 90 90 3 měsíce 3 months 98 98 45 45 100 100 ALIGN! 60 60 4 měsíce 4 month 97 97 20 20 May 100 100 ALIGN! 38 38 6 měsíců 6 months 96 96 11 11 100 100 ALIGN! 20 20 May

Stabilita destiček, stabilizovaných dle vynálezu s minimální účinnou koncentrací EACA, je mírně lepší, než u destiček, připravených klasickým způsobem.The stability of the plates stabilized according to the invention with a minimum effective concentration of EACA is slightly better than the plates prepared by the classical method.

Příklad 3Example 3

b) Roztok byl odsát z jamek a byl aplikován blokační roztok podle vynálezu s maximální možnou koncentrací EACA, tj. 100 mg/ml vodného roztoku, nebo běžný blokační vodný roztok BSA 10 mg/ml roztoku.b) The solution was aspirated from the wells and a blocking solution according to the invention was applied with a maximum possible concentration of EACA, i.e. 100 mg / ml aqueous solution, or a conventional blocking aqueous solution of BSA 10 mg / ml solution.

-3CZ 279300 B6-3GB 279300 B6

U takto připravených destiček byla sledována stabilita při +4 °C a +37 °C jako % aktivity protilátek, vázaných na destičku, při ELISA testu (průkazu sérového HBeAg).The plates prepared in this way were monitored for stability at + 4 ° C and + 37 ° C as% of plate-bound antibody activity in an ELISA (serum HBeAg detection).

klasický blokační roztok s 10 mg/ml BSA blokační roztok dle vynálezu čas °Cclassical blocking solution with 10 mg / ml BSA blocking solution according to the invention time ° C

AKTIVITA °C °C °CACTIVITY ° C ° C ° C

AKTIVITA (%)ACTIVITY (%)

0 0 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 1 měsíc 1 month 100 100 ALIGN! 91 91 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 2 měsíce 2 months 100 100 ALIGN! 82 82 100 100 ALIGN! 100 100 ALIGN! 3 měsíce 3 months 98 98 45 45 100 100 ALIGN! 98 98 4 měsíce 4 month 97 97 20 20 May 100 100 ALIGN! 70 70 6 měsíců 6 months 96 96 11 11 100 100 ALIGN! 44 44

Stabilita destiček, stabilizovaných dle koncentrací EACA, je tedy srovnatelná s s optimální koncentrací (příklad 1).Thus, the stability of platelets stabilized according to EACA concentrations is comparable to that of the optimal concentration (Example 1).

vynálezu s maximální výsledky, získanýmiof the invention with the maximum results obtained

Claims

PATENT CLAIMS

Aqueous solution for stabilizing antigens and / or antibodies bound to a solid support, characterized in that it contains ε-aminocaproic acid at a concentration of 0.01 mg / ml to 100 mg / ml.