CZ275196A3

CZ275196A3 - Glycosylated analogs of dalargin

Info

Publication number: CZ275196A3
Application number: CZ962751A
Authority: CZ
Inventors: Marie Rndr. Prof. Csc. Tichá; Tomáš Rndr. Doc. Csc. Trnka; Věra Rndr. Doc. Csc. Pacáková; Tomislav Rndr. Drsc. Barth; Jan Ing. Csc. Pospíšek; Václav Rndr. Csc. Kašička; Karel Ing. Csc. Ubik; Linda Rndr. Csc. Hauserová
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
Priority date: 1996-09-19
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 1998-04-15

Abstract

Glykosolováné analogy dalarginu obecného vzorce I. X-Tyr (OY)-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg (Z)-OH (I) kde X je zbytek maltosy, Y je vodík a Z je vodík či zbytek maltosy (látky I, II) nebo X je zbytek laktosy, Y je vodík a Z je vodík či zbytek laktosy (látky ΙΠ, IV) nebo X je zbytek galaktosy, Y je vodík a Z je vodík či zbytek galaktosy nebo kde X je zbytka D-galaktosy, Y je vodík či zbytek thiogalaktosy, Z je vodík či zbytek guanidýlové skupiny argininu modifikovaný vazbou sacharidů. Látky obecného vzorce I se připraví tak, že na dalargin se působí redukujícím cukrem za přítomnosti natrium borohydridu /látky I-VI),. nebo chloroethylthiogalaktopyranosidem (látky VII, VIII).Glycosolized analogues of dalargin X-Tyr (OY) -D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg (Z) -OH (I) wherein X is a maltose residue, Y is hydrogen and Z is hydrogen or a maltose residue (substances I, II) or X is a lactose residue, Y is hydrogen and Z is hydrogen or a residue lactose (ΙΠ, IV) or X is the galactose residue, Y is hydrogen and Z is hydrogen or galactose or wherein X is a D-galactose residue, Y is hydrogen or thiogalactose residue, Z is hydrogen or the remainder of the arginine guanidyl group modified carbohydrate binding. General Substances formula I is prepared by acting on the dalargine reducing sugar in the presence of sodium borohydride (s) I-VI). or chloroethylthiogalactopyranoside (substances VII, VIII).

Description

Glykosylované analogy dalarginuGlycosylated analogues of dalargin

Qblast techniky t iQblast techniques t i

Vynález se týká glykosylovaných analogů dalarginu a způsobu '* jejich přípravy.The invention relates to glycosylated analogues of dalargin and to a process for their preparation.

Dosavadní stav techniky *BACKGROUND OF THE INVENTION

Dalargin je synthetický analog 1-6 Dynorphinu, fragmentu přirozeného peptidu Dynorphinu A, který je složen ze 17 aminokyselin. Dalargin, peptid o struktuře ' 4Dalargin is a synthetic analog of 1-6 Dynorphin, a fragment of the natural peptide of Dynorphin A, which is composed of 17 amino acids. Dalargin, peptide of structure '4

Tyr-D-Alá-Gly-Phe-Leu-Arg byl poprvé připraven Titovem a spol.(Bjul. Vsesoyuznovo kardiol. centra AMN SSSR, č. 2, 1985). Tento peptid nalezl praktické uplatnění a to jak v humánní medicíně, kde je využíván pro positivní účinky v hojení jícnových varexů tak v technologii odchovu rybího plůdku , který je během krátkodobé koupele v roztoku dalarginu vybaven antistresovými účinky.Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg was first prepared by Titov et al. (Bjul. Vsesoyuzn's Cardiol Center AMN USSR, No. 2, 1985). This peptide has found practical application both in human medicine, where it is used for positive effects in healing of oesophageal varices and in fish fry rearing technology, which is equipped with antistress effects during short-term bath in dalargin solution.

Biodostupnost látek peptidového charakteru k příslušným receptorovým strukturám a metabolická stabilita jsou faktory, které významně ovlivňují celkový biologický účinek.Stabilitu peptidu lze ovlivnit řadou strukturních obměn jak tak i modifikací peptidové vazby, popsány obě možnosti, stabilisace struktury insercí další nekodové aminokyseliny (J.Pospíšek et al. Collection Czechoslov. Chem.Commun. 52, 1867-1871,Bioavailability of substances of peptide character to relevant receptor structures and metabolic stability are factors that significantly influence the overall biological effect. Peptide stability can be influenced by a number of structural modifications as well as by modification of peptide bond, both possibilities described, structure stabilization by insertion of another non-coding amino acid. al. Collection Czechoslov. Chem.Commun 52, 1867-1871,

1987), J.Pospíšek et al. Collection Czechoslov.Chem.Commun.1987), J.Pospíšek et al. Collection Czechoslov.Chem.Commun.

jednotlivých aminokyselin V případě dalarginu bylyof individual amino acids In the case of dalargin were

54, 2271-75, 1989, J.Pospíšek et al. CS patent 270617) tak methylací peptidové vazby v posici mezi glycinem a fenylalaninem '( J.Pospíšek et al. CS patent Application 1718/93).54, 2271-75 (1989); J.Pospíšek et al. CS patent 270617) and methylation of the peptide bond at the position between glycine and phenylalanine (J.Pospíšek et al. CS patent Application 1718/93).

Změna biodostupnosti je v řadě enkefalinových a dynorfinových peptidů (dynorfin je prekursorem enekefalinu) vázána na vybavení základní peptidové struktury skupinou nepeptidového charakteru. Glykopeptidové konjugáty enkefalinu charakteristické vazbou cukru v karboxyterminální části (Š. Horvát et al. Helv. Chim. Acta 74, 951-955, 1991 , Š.Horvát et al. Inter .J.Peptide and Protein Research 41, 399,1993) nevykázaly sice významně zvýšenou antivirální aktivitu,, nicméně byly shledány netoxickými a pravděpodobně i více stabilnější v buněčných systémech. Biologicky významně prodloužený analgetický účinek u myší byl prokázán u alfa a beta glykosylovaných analogů enkefalinu, u kterých byl fenylalanin v posici 4 nahrazen D-serinem či D-threoninem. Hydroxyl těchto skupin sloužil jako glykosylační centrum (R. Polt et al. J.Am.Chem.Soc. 114, 10249- 1992). Protrahované účinky glykosylovaných analogů enkefalinů jsou dávány dosouvislosti s lepší prostupností látek do mozku a pravděpodobně i s postupným uvolňováním původního peptidu odštěpením glykosidického substituentu.The change in bioavailability in a number of enkephalin and dynorphin peptides (dynorphin is a precursor of enecephalin) is bound to equip the basic peptide structure with a non-peptide moiety. Glycopeptide conjugates of enkephalin characterized by sugar binding in the carboxyterminal portion (S. Horvat et al. Helv. Chim. Acta 74, 951-955, 1991, S. Horvat et al. Inter. J. Peptide and Protein Research 41, 399, 1993) did not show however, they were found to be non-toxic and probably more stable in cellular systems. A biologically significantly prolonged analgesic effect in mice has been demonstrated in alpha and beta glycosylated enkephalin analogs in which phenylalanine at position 4 has been replaced by D-serine or D-threonine. The hydroxyl of these groups served as a glycosylation center (R. Polt et al. J. Am. Chem. Soc. 114, 10249-1992). The protracted effects of glycosylated enkephalin analogs are due to the improved permeability of substances to the brain and possibly to the gradual release of the parent peptide by cleavage of the glycosidic substituent.

Podstata vynálezu <7.SUMMARY OF THE INVENTION <7.

ΤΤ

Předmětenu-vynálezujsou glykosyldváné analogy dalarginu obecného vzorce I.The present invention relates to glycosylated analogues of dalargine of formula I.

X-Tyr(OY)-D-Ála-Gly-Phe-Leu-Arg(Z)-OH (I) kde X je zbytek maltosy, Y je vodík a Z je vodík či zbytek maltosy (látky I, II) - 3 nebo X je zbytek laktosy, Y je vodík a Z je vodík či zbytek laktosy (látky ÍIl/ IV) nebo X je zbytek galaktosy, Y je vodík a Z je vodík či zbytek galaktosy $ nebo kde X je zbytek D-galaktosy, Y je vodík či zbytek ; thiogalaktosy, Z je vodík či zbytek guanidylové skupiny argininu modifikovaný vazbou sacharidůX-Tyr (OY) -D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg (Z) -OH (I) wherein X is maltose residue, Y is hydrogen and Z is hydrogen or maltose residue (compounds I, II) - 3 or X is a lactose residue, Y is hydrogen and Z is hydrogen or a lactose residue (II / IV) or X is a galactose residue, Y is hydrogen and Z is a hydrogen or galactose residue $ or wherein X is a D-galactose residue, Y is hydrogen or a residue; thiogalactose, Z is hydrogen or a guanidyl moiety of arginine modified by carbohydrate binding

Látky obecného vzorce I se připraví tak, že na dalargin se působí redukujícím cukrem za přítomnosti natrium borohydrídu (látky I-VI), nebo 2 - chlorethyl-l-thio-Zí-Dgalaktopyranosidem.The compounds of formula (I) are prepared by treating the dalargine with a reducing sugar in the presence of sodium borohydride (compounds I-VI), or with 2-chloroethyl-1-thio-Z-D-galactopyranoside.

Látky I-VI se s výhodou připraví tak, že na dalargin rozpuštěný v pufru o neutrálním pH se působí redukujícím cukrem v přítomnosti kyanborohydridu sodného při 37°C po dobu 2¾ hodin.Compounds I-VI are preferably prepared by treating the dalargine dissolved in a neutral pH buffer with a reducing sugar in the presence of sodium cyanoborohydride at 37 ° C for 2¾ hours.

Po ukončení glykosylace se reakce zastaví okyselením, například 50% kyselinou octovou.Upon completion of glycosylation, the reaction is stopped by acidification, for example with 50% acetic acid.

Látky VII a VIII se připravítak, že na dalargin rozpuštěný v NaHCO₃ se působí 2-chloroethyl-l-thio-Z3-D- galaktopyranosidém při 37°C po dobu 18 hodin. Reakce se zastaví přidáním pevného NaHCO₃.Compounds VII and VIII were prepared by treating dalargine dissolved in NaHCO ₃ with 2-chloroethyl-1-thio-Z ₃ -D-galactopyranoside at 37 ° C for 18 hours. The reaction is stopped by adding solid NaHCO ₃ .

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1.Example 1.

*';· Příprava sloučeniny I a II. K roztoku dalarginu (5 mg ve i fysiol. roztoku pufrovaném Na-fosfátem na hodnotu 7,5) bylo přidáno 30 mg maltosy a 10 mg kyanborohydridu sodného. Směs byla ponechána 24 hod při 37° C. Poté byla reakce zastavena okyselením 50 % kyselinou octovou. Reakční směs byla dělena na koloně Biogelu P-2 (1,5 cm x 45 cm), který byl v rovnováze s 0,05 M NH₄. Kolona byla eluována stejným roztokem kyseléhoPreparation of Compounds I and II. 30 mg of maltose and 10 mg of sodium cyanoborohydride were added to a solution of dalargine (5 mg in Na-phosphate buffered saline at 7.5). The mixture was left at 37 ° C for 24 h. The reaction was then quenched by acidification with 50% acetic acid. The reaction mixture was separated on a Biogel P-2 column (1.5 cm x 45 cm) which was equilibrated with 0.05 M NH ₄ . The column was eluted with the same acid solution

- 4 uhličitanu amonného rychlostí 8 ml/hod, frakce byly jímány po 2 ml. Během eluce byla monitorována přítomnost peptidů (280nm) a volného cukru (Dubois et al. Anal.Chem.18, 350, 1956). Glykosylované deriváty dalarginu byly separovány HPLC a jejich přítomnost sledována hmotovou spektroskopií kapilární elektroforesou a biologickým testem GPI.- 4 ammonium carbonate at a rate of 8 ml / h, fractions were collected in 2 ml increments. Peptide (280nm) and free sugar were monitored during elution (Dubois et al. Anal.Chem.18, 350, 1956). Glycosylated dalargin derivatives were separated by HPLC and their presence was monitored by capillary electrophoresis mass spectroscopy and GPI bioassay.

Příklad 2.Example 2.

Příprava sloučenin III a IV. Bylo postupováno dle příkladu 1 s tou výjimkou, že jako redukující cukr byla použita laktosa. Reakční a analytické podmínky byly identické s příkladem 1.Preparation of compounds III and IV. The procedure of Example 1 was followed except that lactose was used as the reducing sugar. The reaction and analytical conditions were identical to Example 1.

IAND

Příklad 3.Example 3.

Příprava sloučenin V a VI. Bylo postupováno dle příkladu 1 s tou výjimkou, že jako redukující cukr byla použita D- galaktosa. Reakční a analytické podmínky byly identické s příkladem 1.Preparation of Compounds V and VI. The procedure of Example 1 was followed except that D-galactose was used as the reducing sugar. The reaction and analytical conditions were identical to Example 1.

Příklad 4.Example 4.

Příprava sloučenin VII a VIII. Dalargin v množství 10 mg byl rozpuštěn ve 2 ml O,1M NaHCO₃, pH 8,2 a přidáno 50 mg 2-chloroethyl-l-thio-p-D-galaktopyranosidu. Směs byla ponechána inkubovat 18 hod při 37° C. Poté byla reakce zastavena přidáním pevného NaHCO₃ na hodnotu pH 6,0. Dále bylo pokračováno jako v příkladě 1. Analytické podmínky byly identické s příkladem i.Preparation of Compounds VII and VIII. 10 mg of Dalargine was dissolved in 2 ml of 0.1 M NaHCO ₃ , pH 8.2 and 50 mg of 2-chloroethyl-1-thio-β-D-galactopyranoside was added. The mixture was allowed to incubate for 18 hours at 37 ° C. Then the reaction was stopped by adding solid NaHCO ₃ to a pH of 6.0. The analytical conditions were identical to Example 1.

IAND

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Látky, podle vynálezu lze využít v základním výzkumu, ve ' . -Sr farmaceutickém průmyslu a ve zdravotnictvíThe substances according to the invention can be used in basic research. -Sr pharmaceutical industry and healthcare

Claims

Patent claims

Glycosylated analogs of dalargin of general formula I.

i y

J X-Tyr (OY) -D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg (Z) -OH (I) wherein X is a maltose residue, Y is hydrogen and Z is a hydrogen or maltose residue (compounds I, II) or X is lactose residue, Y is hydrogen and Z is hydrogen or lactose residue (compounds III, IV) or X is galactose residue, Y is hydrogen and Z is hydrogen or galactose residue or where X is D-galactose residue, Y is hydrogen or the residue of thiogalactosy; a carbohydrate-modified residue of the guanidyl group of arginine

Process for the preparation of glycosylated analogues of dalargin according to claim 1, characterized in that dalargin is treated with a reducing sugar in the presence of sodium borohydride (compounds ₇ I-VI) or chloroethylthiogalactopyranoside (compounds VII, VIII).