CZ269199A3 - Peptidy obsahující T-buněčný epitop specifický pro kolagen, jejich použití a farmaceutické přípravky obsahující takové peptidy - Google Patents

Abstract

Peptid, kterýmá aminokyselinovou sekvenci podle vzorce I: Ar Xaa-Gy-44-A5-Gly-A7-Xaa-Gy, kde Ai je aminokyselinový zbytek s aromatickýmnebo alifatickýmpostrannímřetězcem, A4 je asparaginový nebo argininový zbyteknebo aminokyselinový zbytek s aromatickým nebo alifatickýmpostrannímřetězcem, A5 jejakákoliv přirozeně se vyskytující aminokyselina, A7 je aminokyselina s negativně nabitýmzbytkem, Xaajejakýkoliv aminokyselinový zbytek a Glyje glycinový zbytek Použití takových peptidů k léčení, zvláště k léčení autoinunitních nemocí jakoje revmatoidní artritida.

Description

Peptidy obsahující T-buněčný epitop specifický pro kolagen, jejich použití a farmaceutické přípravky obsahující takové peptidy

Oblast techniky

Předkládaný vynález poskytuje nové peptidy odvozené z kolagenu Cil, způsoby jejich přípravy a jejich použití v terapii, zvláště pro léčení revmatoidní artritidy a příbuzných autoimunitních nemocí.

Dosavadní stav techniky

Molekuly kolagenu patří k hlavním strukturním proteinům pojivové tkáně. Skládají se ze tří polypeptidových řetězců, které vytvářejí rozsáhlou trojšroubovicovou strukturu s jedinečnou repetítivní aminokyselinovou sekvencí X-Y-Gly. Extracelulární matrix chrupavky je jedinečná tím, že obsahuje hlavně kolagen typu II, ale obsahuje i typy IX a XI. Cil byl nedávno klonován z myši a byla stanovena celá jeho aminokyselinová sekvence v délce 1419 aminokyselin (Metsarantam et al·., 1991, J.Biol. Chem. 266: 16862-9).

Má se zato, že kolagen typu II je skrytý před buňkami imunitního systému, neboť se vyskytuje pouze v avaskulárních (neprokrvených) tkáních jako je chrupavka a hmota sklivce oka. Jakožto takto izolovaný protein má Cil schopnost, když je injikován s Freundovým kompletním adjuvans, vyvolat tkáňově specifickou autoimunitní nemoc. Tato indukovaná nemoc se nazývá kolagenem indukovaná artritida (CIA). CIA je normálně indukována injekcí cizího Cil, který vyvolá produkci ·· · · ·· ·« • · · · · · • · φ · φ • · · · · · φ • · · · · · ···· · · ·· ·

T-buněk a protilátek schopných rozpoznat odpovídající vlastní protein (self-protein) .

Citlivost k CIA u myší je omezena na myši s MHC typu I-A⁴ a I-A^r. Vazebné motivy těchto molekul jsou podobné motivům lidských DR4 a DR1. proto se věří, že Cil je autoantigen y případě revmatoidní artritidy (RA).

Pro léčení RA není dosud k dispozici žádná kauzální terapie. Dosavadní způsoby léčení, jako je např. pGužití kortikosteroidú, jsou nespecifické, neboť obecně celkové potlačují imunitní odpověď. Současný výzkum, naznačil, že důležitou roli v patogenezi RA hrají autoreaktivní T-buňky, což vedlo k představě, že tolerizace těchto patogenních T-buněk nasálním/perorálním podáním imunogenních peptidů by mohla mít léčebný potenciál.

Miyahara, H. et al. (Immunology, 1995, 86: 110-115) popsali použití fragmentu kolagenu typu II pro potlačení artritidy u myší. Avšak použitý fragment (Cil 607-621) neobsahoval vazebný motiv pro žádnou z HLA-DR molekul souvisejících s RA u člověka a nemůže být proto použit jako toleragen pro léčení člověka.

Dokument WO 96/20950 chtěl popsat peptidy z kolagenu typu II schopné vázat se na HLA DRB1 lidského proteinu MHC, což, jak se navrhuje, by mělo být užitečné pro léčení RA. Avšak tyto peptidy, které jsou přítomny v úseku 273 až 404 proteinu kolagenu Cli, vykazují pouze slabou účinnost v relevantních testech předpokládané tolerance pro PA.. Peptidy podle předkládaného vynálezu mají významně vyšší terapeutickou účinnost.

Předkládaný vynález poskytuje peptidy, o kterých se zjistilo, že byly zvláště účinné v indukci imunitní tolerance k epitopům T-buněk odvozeným z kolagenu Cil. Tyto peptidy se • · mohou využít pro léčení autoiminunitních nemocí jako je revmatoidní artritida.

Předkládaný vynález proto poskytuje izolovaný peptid, který má nebo obsahuje sekvenci aminokyselin podle vzorce (I) :

A;—X a a^—Gl y—A4 — A 5 — Gl y^—A?—Xa a^—G1 y (I)

A; je aminokyselinový zbytek s aromatickým nebo alifatickým posoranním řetězcem.,

A_; je asparaginový nebo argininový zbytek nebo aminokyselinový zbytek s aromatickým nebo alifatickým postranním řetězcem,

A.5 je jakákoliv přirozeně se vyskytující aminokyselina,

A- je aminokyselina s negativně nabitým zbytkem,

Xaa je jakýkoloiv aminokyselinový zbytek a Gly je glycinový zbytek.

Peptidy podle předkládaného vynálezu jsou výhodně peptidy, které obsahují 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselin, výhodněji jsou to peptidy s 9 aminokyselinami.

Pro peptidy podle předkládaného vynálezu platí následující navzájem nezávislé výhodné znaky:

A: je F, I, L, A nebo P a nej výhodně ji F,

A. je F, I, L, A., N nebo P a nejvýhodněji F,

A_s je K nebo R,

A- je E, D, Q, P nebo N a nej výhodněji Q.

K výhodným peptidům podle předkládaného vynálezu patří peptidy buďto obsahující, nebo samy mající, jednu z následujících aminokyselinových sekvencí:

ESG SPG ENG, PPG ADG QPG, ARG NDG QPG, QPG AKG DQG, APG AKG EAG, PTG VTG PKG, AQG SRG EPG, RVG PPG ANG, PAG ASG NPG, ANG • · • · · · ···· · · · · · · ·

				• · · • * ·	• · • · ·	• · · · • · · · ·
			4	• · · • · · · · ·	• · • ·	• · • · 9
NPG PAG, TDG IPG ,	AKG,	DPG	uQG PAG,	SAG APG IAG,	APG	EKG EPG,
IAG APG FPG, PQG	LAG	QRG,	FPG PRG	PPG, PKG ANG	DPG,	APG ASG
DRG, LPG AP.G LTG,	. DAG	PQG	KVG, A.LG	APG APG, PAG	ANG	EKG, KQG
DRG EA.G, nebo AB.G	APG	EPG	(sekvence identifik.	č. 1	a z z o i ;
a výhodněji 'buďto	RVG	PPG	ANG (sekvence id. č.	8)	nebo ANG
NPG PAG (sekvence	id.	č. 1	0) .

K příkladům výhodných peptidů podle předkládaného vynálezu patří také peptidy buďto obsahující, nebo samy mající, jednu z následujících aminokyselinových sekvencí:

VKG	ESG	SPG	ENG	SPG;	FAG	PPG A.DG	QPG	AKG;	AAG ARG	NDG	QPG
PAG;	ADG	QPG	AKG	DQG	EA.G ;	APG AKG	EA.G	PTG	ARG; PQG	PTG	VTG
PKG	ARG;	PEG	A.QG	SRG	EPG	NPG; AA.G	RVG	PPG	ANG NPG;	PAG	ASG
NPG	TDG	IPG;	PPG	ANG	NPG	PAG PPG;	NPG	TDG	IPG AKG SA.G;	RAG
DPG	LQG	PAG	APG.;	AKG	SAG	A.PG IA.G	A.PG;	PAG	APG EKG EPG	DDG,
APG	IAG	APG	FPG	PRG;	PPG	PQG LAG	QRG	IVG;	APG FPG	PRG	PPG
PQG;	LAG	PKG	ANG	DPG	RPG;	KQG A.PG	ASG	DRG	PPG; EPG	LPG	ARG
LTG	RPG;	RPG	DAG	PQG	KVG	PSG; ETG	ALG	A.PG	A.PG PPG;	PPG	PAG
ANG	EKG	EVG,	PTG	KQG	DRG	EA.G AQG;	nebe	i STG	ARG APG	EPG	ETG
(sekvence identifik. č	. 26	až 52);	výhodněj	i AAG RVG	PPG	ANG
NPG	(sekvence id	. č.	33) ,	a nej výhodněji PPG ANG NPG	PA.G	PPG

(skvence id. č. 35).

Výhodně peptidy podle předkládaného vynálezu obsahují sekvenci 9 až 15 aminokyselin přítomnou v nepřerušeném sledu v úseku 701 až 721 kolagenu II.

Předkládaný vynález se také týká peptidu, který obsahuje epitop T-buňky specifický pro kolagen II, kterýžto peptid obsahuje alespoň 9 aminokyselin v nepřerušené souvislé sekvenci shodné se sekvencí vybranou z úseků 110 až 239, 338 až 379 a 587 až 895 sekvence kolagenu II, kde každá • · « · · aminokyselin je volitelně nahrazena funkčně ekvivalentní aminokyselinou, přičemž peptid má vzorec (I) definovaný výše.

Vynález dále poskytuje farmaceutický přípravek obsahující peptid podle předkládaného vynálezu ve spojeni s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Přípravek se výhodně použije k tomu, že poskytne toleranci k autoimunitní nemoci jako je např. revmatoidní artritida nebo relapsující polychondritida.

ynal e z dále poskytuje použití peptidu podle předkládaného vynálezu nebo přípravku podle předkládaného vynálezu pro výrobu léku pro použití při léčení autoimunitních nemocí.

Vynález se dále týká způsobu léčení člověka nebo zvířete trpícího autoimunitní nemocí jako je např. revmatoidní artritida nebo relapsující polychondritida, kterýžto způsob obsahuje podávání člověku nebo zvířeti terapeuticky účinného množství peptidu nebo přípravku podle vynálezu.

Peptidy podle předkládaného vynálezu se mohou připravit způsoby, které jsou odborníkovi známy. Na^ mi pomocí standardní techniky postupné kondenzace (vytváření peptidové vazby) na syntetizátoru peptidů pevné fázi pomocí automatického (viz např. Jones,· J. The Chemical

Svnthesis of Peptides, pp 132-156, First edition, Oxford University Press, 1991, a R. Epton (ed) Innovation and Perspectives in Solid Phase Peptide Synthesis, SPCC (UK) , Ltd, 1990). Příprava začíná od C-koncové aminokyseliny, kterou je možné získat již naroubovanou na metylbenzhydrylamin, benzhydrylamin nebo cnlormetylovanou pryskyřici, nebo na jiný vhodný pevný nosič. Další aminokyseliny se přidávají postupně krok za krokem po té, co byly ochráněny jejich postranní řetězce. Při této kondenzační metodě jsou alfa-aminoskupiny aminokyselin chráněny pomocí • · · · · · · · · · · • · · ·· · ···· • · · · · · · · ··· · · · ······ · · ······ · · · ·· «·

F-moc nebo t-Boc. Ochranné skupiny pro postranní řetězce aminokyselin jsou v oboru dobře známy. Celý chráněný peptid se uvolní z chiormetyiované pryskyřice amonioiýzou, čímž se získá chráněný amid, nebo z metylbenzhydryiaminové nebo benzhydrilaminové pryskyřice acidolýzou.

Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být také připraveny metodou v roztoku, buďto postupnou kondenzací nebo kondenzací fragmentů (viz např.: Jones, 1. The Chemical Synthesis of Peptides, pp 1 15-131, First edition, Oxford

University Press, 1991) . Aminokyselina s vhodně chráněnou alfa-aminoskupinou se naváže na aminokyselinu s vhodně chráněnou alfa-karboxylovou skupinou (v závislosti na vybrané metodě syntézy tato ochrana nemusí být nutně potřeba) pomocí diímidů, symetrických nebo nesymterických anhydridú nebo pomocí jiných kondenzačních činidel nebo způsobů odborníkovi známých. Tyto způsoby mohou být buďto chemické nebo enzymatické. Skupiny chránící alfa-aminoskupinu a/nebo alfakarboxylovou skupinu se odstraní a další vhodně chráněná aminokyselina nebo .blok aminokyselin se připojí, čímž se prodlouží rostoucí peptid. V každé syntéze je možné použít různé kombinace ochranných skupin a chemických/enzymatických způsobů a strategie kondenzace/syntézy peptidu.

Peptidy podle předkládaného vynálezu jsou definovány tím, že obsahují T-buněčný epitop. Jinými slovy tedy jsou schopné aktivovat T-buňky. Existuje několik známých způsobů, jak stanovit sílu vazby. Výhodně je peptid podle předkládaného vynálezu schopen aktivovat T-buňku s vazebnou silou nejméně 2 podle uvolňovacího IFN-γ testu a/nebo s hodnotou stimulačního indexu nejméně 3. Test uvolňování IFN-γ lze provádět způsoby v oboru známými nebo způsobem, který je dále popsán v příkladech. Podobně stimulační index může být stanoven pomocí v oboru známých proliferačních cestu, např. testem popsaným v Analysis of type II collage.o reactive T cells in mouše, Andersson a Holmdahl, Eur. J. ImmunoL. 20: 1061 -1066, 1990. Výhodně se test provádí způsobem popsaným v příkladech této přihlášky.

Peptidy podle vynálezu jsou využitelné v léčení aniž by byly modifikovány, ale alternativně je možné peptidy modifikovat, např. mohou být konjugovány, tj. kovalentně navázány, na nosičový sytém, např. na mukózové vazebné struktury jako je např. cholerový β-toxin, což napomáhá absoroci ve střevu.

2,

Peptidy podle předkládaného vynálezu se mohou užít pro léčení, profylaxi nebo stanovení diagnózy autoimunitních nemocí a termíny terapie nebo léčení užívané v tomto textu je třeba chápat tak, že zahrnují současně i profylaxi a diagnostiku.

Peptid podle předkládaného vynálezu je izolovaný peptid, to znamená, že k peptidům podle předkládaného vynálezu nepatří peptidy přítomné v organismu. Peptidy podle vynálezu mohou být buďto z přirozených nebo rekombinantně připravených peptidů nebo proteinů nebo mohou být syntetizovány chemicky, jak se popisuje v této přihlášce.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou podávat v dávkách od 10 gg do 10 mg na den buď jako jediná dávka nebo rozdělené do 2 až 4 dávek na den. Jednotková léková forma obsahuje dávku ug až 10 mg sloučeniny podle, předkládaného vynálezu.

Sloučenina podie vynálezu se může podávat intranasálním způsobem ve formě roztoku, suspenze, HFA aerosolu nebo ve formě přípravku obsahujícího suchý prášek, např. pomocí aplikátoru Turbuhaler®, nebo systémovým způsobem, např. perorálně ve formě tablet, pilulek, tobolek, sirupů, prášku, granulátu, a nebo také parenterálně ve formě sterilních

4

4*4

4 4 4 4

4 4 4 mzí, nebo také rektálně ve parenteramzcn rozzoKu ner formě číoku.

Sloučeniny podle předkládaného· vynálezu se mohou podávat samy o sobě nebo ve .formě farmaceutického přípravku, který obsahuje sloučeninu podle vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelnými ředidlem, adjuvans nebo nosičem. Zvláště výhodné jsou takové sloučeniny, které neobsahují látky schopné vyvolat nepříznivou, např. alergickou, reakci.

Práškové přípravky a tlakově balené HFA aerosoly sloučenin podle vynálezu se mohou podávat nasální inhalací. Pro inhalaci je sloučenina podle vynálezu jemně rozdrobněna. Rozdrcbněná sloučenina má výhodně částice se statistickým středním průměrem (dle hmocnosti) 10 gm a je suspendována ve směsi propeientů za pomoci dispergačního činidla, jako je např. mastná kyselina obsahující 8 až 20 atomů uhlíku (např. kyselina olejová) nebo její sůl, žlučová sůl, fosfolipid, alkylsacharid, perfluorovaný nebo polyetoxylovaný surfaktant nebo jiné farmaceuticky přijatelné dispergační činidlo.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se také mohou podávat prostřednictvím inhalátoru pro suchý prášek. Takový inhalátor může být buď jednodávkový nebo vícedávkový inhalátor a může to být dechově ovládaný inhalátor suchého prášku.

Jednou možností přípravy je smíchat jemně rozdrobněnou sloučeninu podle vynálezu s nosičovou látkou, např. mono-, di- nebo polysacharidem, cukerným alkoholem nebo jinými polyoly. Vhodnými nosiči jsou cukry, např. laktóza, glukóza, rafinóza, malezitóza, laktitol, maltitol, trehalóza, sacharóza, manitol a škrob. Alternativně se jemně rozdrobněná sloučenina může obalit (potáhnout) jinou látkou. Prášková směs se také může plnit do tvrdých želatinových tobolek, z nichž každá obsahuje požadovanou dávku účinné látky.

• ·

9'

Farmaceutický přípravek obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu je výhodně ve formě tablet, pilulek, tobolek, sirupů, prášku nebo granulátu pro perorální podávání nebo ve formě sterilních roztoků parenterální podávání nebo ve formě podávání.

nebo suspenzí pro čípků pro rektální

Pro s adjuvans sorbitol, perorální podávání se nebo nosičem, jakým je manitol, nebo škrobv, může např j ako účinná látka smíchat . laktó za, sacharó za, bramborový, kukuřičný škrob nebo amylopektin, deriváty celulózy, pojidlem jako· je např. želatina nebo polyvinylpyrolidon, a lubrikantem, jako je např. stearan hořečnatý, stearan vápenatý, polyetylenglykol, vosky, parafin apod., a pak lisovat do tablet.

Pokud jsou požadovány potahované připravené způsobem popsaným výše, se koncentrovaným cukerným roztokem, který arabskou gumu, želatinu, mastek, oxid tablety, jádro může potáhnout může obsahovat titaničitý apod.

Alternativně může být tableta potažena vhodným polymerem rozpuštěným, v těkavém organickém rozpouštědle.

Pro přípravu měkkých želatmových tobolek se může sloučenina podle předkládaného vynálezu smíchat např. s rostlinným olejem nebo polyetylenglykolem. Tvrdé želatinové tobolky mohou obsahovat granulát sloučeniny buďto s výše popsanými pomocnými látkami pro tablety, např. laktózou, sacharózou, sorbitolem, manitolem, škroby, deriváty celulózy nebo želatinou. Do tvrdých želatinových tobolek se také mohou plnit kapalné nebo polotuhé formy léčiva.

Kapalné přípravky pro perorální podávání mohou být ve formě sirupů nebo suspenzí, např. ve formě roztoků obsahujících sloučeninu podle vynálezu a cukr, a dále směs etanolu, vody, glycerolu a propylenglykolu. Volitelně mohou takové kapalné přípravky obsahovat barviva, chuťová a vonná korigenora, sacharin a karboxymetylcelulózu jako zabuštovadlo, případně další pomocné látky odborníkovi známé.

Předkládaný vynález je dále ilustrován pomocí příkladu, které ho v žádném případě nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Řetězce peptidů Cil, uvedené v tabulce i, z nichž každý se skládá z 15 aminokyselin, . byly syntetizovány pomoci automatického syntetizátoru SMPS 350 (Zinsser, Frankfurt/Main, Německo) chemickou cestou s Fmoc (Atherton, Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis - A Practicai Approach. IRL Press, Oxford). Každý peptid byl acetylcván na svém N-konci a amidován na C-konci. Kvalita peptidů byla hodnocena pomocí HLPC a hmotnostní spektcrskopií vzorku pepcidu byla potvrzena očekávaná molekulová hmotnost.

Úsek aminokyselin, který je zobrazen tučným písmem, je tzv. sekvence jádra, tj . úseku aminokyselin, který se váže nezsilněji, ve srovnání s vazebnou silou strukturně blízce příbuzných peptidů.

» · · · • · · 9 9 · • · · 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9

Peptid	aminokyselinové zbytky	Peptid	aminokyselinové zbytky
110-124	VKG ESG SPG ENG SPG	635-649	FA-G PPG ADG QPG AKG
140-154	AAG ARG NDG QPG PA.G	641-655	ADG QPG AKG DQG EAG
161-175	GPG FPG APG AKG EAG	665-679	PSG APG P G PTG VTG
170-134	APG AKG EAG PTC- ARG	g77_ ggi_	PQG PTG VTG PKG -ARG
135-199	PEG AQG SRG EPG NPG	701-715	AAG RVG PPG ANG NPG
203-21'	PAG ASG NPG TDG IPG	707-721	PPG ANG NPG PAG PPG
209-223	NPG TDG IPG AKG SA.G	740-754	RAG DPG LQG PAG APG
218-232	AKG SAG -APG IAG APG	749-763	PAG APG EKG EPG DDG
224-233	APG IAG APG FPG PRG	770-734	PPG PQG LAG QRG IVG
230-244	APG FPG PRG PPG PQG	779-793	QPG IVG LPG QPG ERC-
333-352	LAG PKG ANG DPG RPG	806-320	KQG APG ASG DRG PPG
353-367	EPG LPG ARG LTG RPG	321-835	PVG PPG LTG PAG EPG
365-379	RPG DAG PQG KVG PSG	857-871	ETG ALG APG APG PPG
593-607	PPG PAG ANG EKG EVG	381-895	PTG KQG DRG EAG AQG
614-628	STG ARG APG EPG ETG

Příklad 2

Myší Cil byl extrahován z mečovitého výběžku kosti hrudní známým způsobem pepsinového štěpení a pak dále purifikován vysolením. Krysí Cil byl purifikován ze Swarmova chondrosarkomu opět známým způsobem. Kolageny byly rozpuštěny v 0, 1M kyselině octové. Kolagen, který se užil pro restimulaci buněk primárních lymfatických uzlin byl denaturován inkubováním 30 minut v 56 °C.

·· ·» f · · I • 4« a uvoínov mohla být testována proliferační odpověď í cytokinů odebranými buňkami lymfatických uzlin, byly imun nebo samci myší (B10.Q X DBA/1)F1 ve stáří V až 10 týdnu izováni do chodidla zadních končetin 50 Lig myšího Cil syntetického peptidu emulgovaného v CFA (obsahující

H37Ra, Diřco, Detroit, Mi) . Artritida u stejných myší ve stáří 7 až 10 týdnu imunizovaly do kořene ocasu dávkou 100

byla	indukována
tím,	že se myši
Lig	krysího Cil

emulgovaného CFA připraveného podle příkladu 2.

Fo 5 týdnech byla imunitní reakce myší zesílena dávkou μς Cíl emulgovaného v hmotnostním poměru 1:1 IFA (Difco, Detroit, Mí). Ze silně artritických kloubů byly odsátím odebrány buňky lymfatických uzlin, sloučeny a dále popsaným způsobem testovány v proliferčním testu na reaktivitu s panelem myších peptidů Cil připravených podle příkladu 1.

Uvolňování cytokinů bylo testováno v 50 μΐ supernatantu z indukovaných kultur buněk primárních lymfatických uzlin, které byly restimulovány in vitro panelem peptidů Cil připravených podle příkladu 1 pomocí minisouprav IFN-γ a íl-4 (Endogen, Cambridge,MA). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

·· ···· « » · • · · • C · • · tf • · « ·· ·· • · · · • ··

Φ » • · · ···« »·

Tabulka 2

Peptid	S±	výdej ΙΕΝ-γ (ng/ml·)	Peptid	SI	výdej IrN-y (ng,zml}
110-124	2,2	2,2	635-649	2,7	0,4
140-154	2, 1	1,5	641-655	2,0	0, 9
161-175	3, 1	4,2	665-679	3,5	1,5
170-18 4		1,5	677-691	2,2	2,9
185-199	4, 1	1,9	701-715	18,0	2, 5
203-217	3, 6	6,5	707-721	19, 4	5, 8
209-223	5,2		740-754	2,8	2, 4
218-232	3, 9	2,3	749-763	4,8	1,0
224-238	5, 0	4,4	770-784	2,7	1,4
230-244	3, 9	5,8	779-793	3,9
338-352	4,4	2,0	806-820	2,3
353-367	3, 1	1,5	821-835		1, 8
365-379	2,8		857-871	2,4	0, 3
593-607	2, 9	0,7	881-895	2,6	0, 6
614-628	2,7	2,3

Příklad 4

Z buněk lymfatických uzlin myší indukovaných myším Cil byly odebrány buďto T nebo 3 buňky pomocí magneticky aktivovaného třídiče buněk (MACS) se superparamagnetickými mikroperličkami konjugovanými s krysí monoklonální anti-myší protilátkou L3T4 (CD4) nebo krysí anti-myší protilátkou E220 CD45R)(obě protilátky od Miltenyi Biotec GmbH, Bergish Gladbach, Německo) v podstatě podle doporučení výrobce, kromě toho, že PBS/BSA pufr byla nahrazen PBS obsahujícím 2¾ FCS, 5mM EDTA, 50 pmM 2-ME a lOmM HEPES. Frakce byly analyzovány • · · * * · «··· ·· · · · · * ··· ·· · ···· • · ··· · · « ··· ··· ··«··· · · ······ ·« · ·· ·· průtokovým cytometrsm FACScan (Becton Dickinson) pomocí kcnjugátu ( FITC-anti-myší CD3-S) pro označení (obarvení) T-buněk a konjugátu (FITC-anti-myší lehký řetězec k) pro označení B-buněk (Pharmigen, San Diego, CA) . Buňky byly po separaci třikrát propláchnuty médiem DMEM bez séra a pak použity v proliteračním testu podle příkladu 3. Obohacené T-buňky CD4+ jakožto buňky prezentující antigen byly smíchány s buňkami sleziny ze syngenních myší v hmotnostním poměru 1:2. Buňky AP byly použity ve formě suspenze jednotlivých buněk ze slezin ošetřených 0,84% NH₄C1 při pH 7,4, aby došlo k iýze červených krvinek.

Tabulka 3

Buněčný typ	CPM χ 10'3
nefrakcionovaně	13, 6
CD4+ obohacené	21,4
CD4+ ochuzené	0,3
CD45R obohacené	12,5
CD45R ochuzené	0,4

• · · · · · • · · · · · « · · · · • · · · · · · • · · · · Λ ···· ·· ·· ·

Sekvence	1 1	č	1 ;	ESG SPG ENG
Sekvence	id.	c.	o .	PPG AEG QPG
Sekvence	id.	c.	3 :	AKG NDG QPG
Sekvence	j_ d	č.	4 :	QPG AKG DQG
Sekvence	ΐ H	č.	5:	APG AKG EAG
Sekvence	13.	č.	6:	PTC- VTC- PKG
Sekvence	id.	č.	7 ;	A.QG SRG EPG
Sekvence	id.	č.	8 :	RVG PPG AKG
Sekvence	id.	č.	9 :	PAG A.SG NPG
Sekvence	id.	Γ'	10	: ANG NPG PAG
S ekvencs	id.	c.	11	: TDC- IPG AKG
Sekvence	id.	č.	12	: DPG LQG PA.G
Sekvence	id.	č.	13	: SA.G APG IAG
Sekvence	id.	c.	14	: APG EKG EPG
Sekvence	id.	č.	15	: IA.G A.PG PPG
Sekvence	id.	č.	16	: PQC- LAK QRC-
Sekvence	id.	č.	17	: FPG PRG PPG
Sekvence	Íd .	č.	18	: PKG AKG DPG
Sekvence	id.	č.	19	: AKG ASG DRC-
Sekvence	id.		2 0	: LPG AKG LTG
Sekvence	id.	č.	21	: DA.G PQG KVG
Sekvence	id.	č.	22	: AKG AKG AKG
Sekvence	id.	č.	23	: PAG ANG EKG
Sekvence	id.	č.	24	: KQG DRG E.AG
Sekvence	id.	č.	25	: AKG APG EPG
Se Kvence	id.	č.	26	: VKG ESG SPG	ENG	SPG
Sekvence	id.	č.	27	: FA.G PPG AKG	QPG	AKG
Sekvence	id.	č.	28	: AA.G AKG NDG	QPG	PAG
Sekvence	id.	č.	29	: AKG QPG AKG	DQG	EAG
Sekvence	id.	č.	30	: APG AKG EAG	PTG	ARG

·· ·· • ta • ta ta • · ·

Sekvence id.	č .		ťQG	PTG	V'í'G		Λ T~ z-
Sekvence	ή j	c.	3 2 ;	PEG	AQG	SRG	EPG	NPG
Sekvence	ί d .	c .	3 3 :	2. Δ C	RVG	PPG	AN u	NPG
Sekvence	Ί V	č.	34 :	n 2 c	asg	NPG	TDG	IPG
Sekvence	η	č.	3 5 :	PPG	ang	NPG	PAG	PPG
Sekvence	id.	č.	3 6 :	NPG	TDG	IPG	AKG	SAG
Sekvence	id.	č.	3 7 :	RAG	DPG	LQG	PAG	APG
Sekvence	id.	č.	38 :	AKG	SAG	APG	IA-G	APG
Sekvence	i		3 9 :	PAG	APG	EKG	Ξ ťG	DDG
Sekvence	id.	č.	40 :	APG	IAG	APG	vpc	PRG
Sekvence	id.	č.	41 :	PPG	PQG	LAG	QRG	IVG
Sekvence	id.	c.	42 :	APG	FPG	PRG	PPG	PQG
Sekvence	id.	č.	43 :	LAG	PKG	ANG	DPG	RPG
Sekvence	id.	č.	4 4 :	KQG	APG	ASG	DRG	PPG
Sekvence	id .	č.	45 :	EPG	LPG	ARG	LTG	RPG
Sekvence	id.	č.	46:	RPG	DAG	PQG	KVG	PSG
Sekvence	id.	č.	47:	EXG	ALG	APG	APG	PPG
Sekvence	id.	č.	4 8 :	PPG	PAG	ANG	EKG	EVG
Sekvence	id.	č.	49 :	PTG	KQG	DRG	EA.G	AQG
Sekvence	id.	č.	50 :	STG	ARG	APG	EPG	ETG
Sekvence	id.	č.	51 :	AAG	RVG	PPG	ANG	NPG
Sekvence	id.	č.	52 :	PPG	ANG	NPG	PAG	PPG

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   i. izolovaný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci podle vzorce (I) :

   A<-Xaa-Gly-A₄-A;-Gly-A.--Xaa-Gly (I} kde

   Αχ je aminokyselinový zbytek s aromatickým nebo alifatickým postranním řetězcem,

   A₄ je asparaginový nebo argininový zbytek nebo aminokyselinový zbytek s aromatickým nebo alifatickým postranním řetězcem,

   A; je jakákoliv přirozeně se vyskytující aminokyselina,

   A? je aminokyselina s negativně nabitým zbytkem,

   Xaa je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a Giy je glycinový zbytek.
2. 2. Izolovaný peptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci kteréhokoliv z peptidů podle nároku 1.
3. 3. Peptid podle nároku 2, který obsahuje 10 až 15 aminokyselin.
4. 4. Peptid podle nároku 1, kde A₅ je lysinový nebo argininový zbytek a A- je zbytek kyseliny glutamové.
5. 5. Izolovaný peptid, který má kteroukoliv z následujících sekvencí:

   ESG SPG ENG, PPG ADG QPG, ARG NDG QPG, QPG AKG DQG,

   APG AKG EAG, PTG VTG PKG, AQG SRG EPG, RVG PPG ANG, PAG ASG NPG, ANG NPG PAG, TDG IPG AKG, DPG LQG PAG, SAG APG IAG, APG EKG EPG, IAG APG FPG, PQG LAG QRG, FPG PRG PPG, PKG ANG DPG, APG ASG DRG, LPG ARG LTG, DAG PQG KVG, ALG APG APG, PAG ANG EKG, KQG DRG EAG _f nebo ARG APG EPG (sekvence id

   Izolovaný peptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci kteréhokoliv peptidu podle nároku 3.

   Izolovaný peptid, který má kteroukoliv z následujících sekvencí:

   VKG ESG SPG ENG SPG; FAG PPG ADG QPG AKG; AAG ARG NDG QPG PAG; ADG QPG AKG DQG EAG; APG AKG EAG PTG ARG;

   • · · ·

   PQG PTG VTG PKG ARG ; PEG AQG SRG EPG NPG; .AAG RVG PPG ANG NPG; PAG ASG NPG TDG IPG; PPG ANG NPG PAG PPG; NPG TDG IPG AKG SAG ; PA.G DPG LQG PAG APG; AKG SAG .APG IAG APG; PAG APG EKG EPG DDG; A?G IAG APG FPG PRG; PPG PQG LAG QRG IVG; APG FPG PRG PPG PQG; LAG PKG .ANG DPG RPG; KQG APG ASG DRG PPG; EPG LPG -ARG LTG RPG; RPG DAG PQG KVG PSG; ETG ALG APG APG PPG; PPG PAG ANA EKG EVG; PTG KQG DRG EAG .AQG; nebo STG ARG .APG EPG ETG (sekvence id. č. 26 až 52). 3 . I zol o van; ý peptid, který je fragmentem 10 až 14 aminokys e 1 .i n z kteréhokoliv peptidu podle nároku 7. q _ Pept id p odle kteréhokoliv z předchozích nároků, který se váže ϊ na T-buňky ’ s vazebnou silou alespoň 2 podle testu uvolnová ní IFN-γ • 10 .Peptid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který se

   váže na T-buňky se stimulačním indexem alespoň 3.

   • · • · · · · ·

   11. Peptid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, přičemž sekvence peptidu se vyskytuje v sekvenci kolagenu II v úsecích 110 až 239, 333 až 379 nebo 537 až 395.

   12. Peptid podle nároku 11, přičemž sekvence peptidu se vyskytuje v sekvenci kolagenu II v úseku 701 až 721.

   13.Izolovaný peptid podle kteréhokoliv z předchozích nároků pro použití k léčení.

   14. Peptid podle nároku 13, kde léčení obsahuje indukci tolerance.

   15. Použití izolovaného peptidu podle kteréhokoliv z předchozích nároků pro výrobu léku pro použití k léčení autoimunitních nemocí.

   16. Použití podle nároku 15, kde autoimunitní nemoc je revmatoidní artritida.

   17. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 ve spojeni s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

   18.Způsob léčení člověka nebo zvířete, trpícího autoimunitní nemocí nebo náchylného k autoimunitní nemoci, vyznačující se tím, že obsahuje podání člověku nebo zvířeti terapeuticky účinného množství peptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 podle nároku 17.

   až 12 nebo přípravku • · • · ·
6. 9. Peptid, který obsahuje T-buněčný epitop specifický pro kolagen II, a který obsahuje alespoň devět aminokyselin se stejnou sekvencí a v nepřetržitém sledu za sebou z úseků 110 až 239, 338 až 379 a 587 až 895 sekvence kolagenu II, přičemž každá aminokyselina je volitelně nahrazena funkčně ekvivalentní aminokyselinou, a přičemž peptid má vzorec

   A;-Xaa-si y- A4— A5—Gl y—A^ - Xaa—Gl y (I) kde

   A- je aminokyselinový zbytek s aromatickým nebo alifatickými postranním řetězcem,

   Aj je asparaginový nebo arginmový zbytek nebo aminokyselinový zbytek s aromatickými nebo alifatickým postranním, řetězcem,

   A= je jakákoliv přirozeně se vyskytující aminokyselina,

   A- je aminokyselina s negativně nabitým zbytkem,

   Xaa je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a Gly je glycinový zbytek.