CZ25864U1

CZ25864U1 - Device for classification of photoautotrophic microorganism live cells

Info

Publication number: CZ25864U1
Application number: CZ201327879U
Authority: CZ
Original assignee: Ústav prístrojové techniky Akademie ved CR v.v.i.; Photon Systems Instruments, Spol. S R.O.
Priority date: 2013-04-29
Filing date: 2013-04-29
Publication date: 2013-09-16

Description

Zařízení pro třídění živých buněk fotoautotrofních mikroorganismůDevice for sorting living cells of photoautotrophic microorganisms

Oblast technikyTechnical field

Technické řešení se týká zařízení pro třídění živých buněk fotoautotrofních mikroorganismů.The invention relates to a device for sorting living cells of photoautotrophic microorganisms.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

V posledních několika desetiletích došlo k velkému rozvoji využívání rozmanitých metod pro třídění mikroorganismů. Obecně je lze rozdělit na metody pasivní a aktivní. Pasivní metody využívají fyzikálních vlastností tříděných objektů, velikosti, hmotnosti, elektrického náboje, adheze, indexu lomu, chemického složení bez vnějšího zásahu, jak je popsáno např, ve spisech Huang Y, Mather EL, Bell JL, et al. MEMS-based sample preparation for molecular diagnostics. Anal Bioanal Chem. 2002;372:49-65, nebo Mohamed H, McCurdy LD, Szarowski DH, et al. Development of a rare cell fractionation device: Application for cancer detection. IEEE Trans Nanobioscience. 2004;3:251-6 nebo Mandrusov E, Houng A, Klein E, et al. Membrane-based cell affinitychromatography to retrieve viable cells. Biotechnol Prog. 1995;11:208-13 nebo konečně Voldman J, Gray ML, Toner M, et al. A microfabrication-based dynamic array cytometer. Anal Chem. 2002;74:3984-90. Aktivní metody využívají rozhodovacího procesu pro separaci vhodných či nevhodných objektů. U objektu je detekován a analyzován Ramanův rozptyl, fluorescence, absorpční, nebo emisní spektrum. Objekt je pak selektován na základě zvolené podmínky, založené na výsledku analýzy, jak je popsáno např. ve spise Huh D, Gu W, Kamotani Y, et al. Microfluidics for flow cytometric analysis of cells and particles. Physiol Meas. 2005;26:R73-98. U třídicích systémů je s výhodou využito mikrofluidních čipů, které usnadňují dopravu organismů do místa vlastní separace a taktéž poslouží k rozdělení a uchování separovaných objektů v ideálních podmínkách. Běžným nedostatkem mikrofluidních čipů je adheze a sedimentace objektů při procesu separace.Over the last few decades, there has been a great deal of development in the use of a variety of methods for sorting microorganisms. In general, they can be divided into passive and active methods. Passive methods utilize the physical properties of sorted objects, size, weight, electrical charge, adhesion, refractive index, chemical composition without external interference, as described, for example, in Huang Y, Mather EL, Bell JL, et al. MEMS-based sample preparation for molecular diagnostics. Anal Bioanal Chem. 2002; 372: 49-65; or Mohamed H, McCurdy LD, Szarowski DH, et al. Development of a rare cell fractionation device: Application for cancer detection. IEEE Trans Nanobioscience. 2004; 3: 251-6 or Mandrusov E, Houng A, Klein E, et al. Membrane-based cell affinity chromatography to retrieve viable cells. Biotechnol Prog. 1995; 11: 208-13 or finally Voldman J, Gray ML, Toner M, et al. A microfabrication-based dynamic array cytometer. Anal Chem. 2002; 74: 3984-90. Active methods use the decision-making process to separate suitable or inappropriate objects. Raman scattering, fluorescence, absorption, or emission spectra are detected and analyzed. The object is then selected on the basis of the selected condition based on the analysis result as described, for example, in Huh D, Gu W, Kamotani Y, et al. Microfluidics for flow cytometric analysis of cells and particles. Physiol Meas. 2005; 26: R73-98. In sorting systems, microfluidic chips are advantageously used, which facilitate transport of organisms to the site of their own separation and also serve to divide and preserve separated objects in ideal conditions. A common drawback of microfluidic chips is the adhesion and sedimentation of objects during the separation process.

Podstata technického řešeníThe essence of the technical solution

Uvedené nedostatky dosavadního stavu techniky do značné míry eliminuje zařízení pro třídění živých buněk fotoautotrofních mikroorganismů podle technického řešení, které je opatřeno průhledným mikrofluidním čipem s vertikálním kanálem o šířce od 0,5 do 2 mm, na jehož homím konci je vstup tříděných fotoautotrofních mikroorganismů v nosné kapalině. Do vertikálního kanálu je v jeho střední části zaústěn výstupní mikroport, tvořený šikmo dolů směřujícím mikrokanálkem o šířce od 30 do 100 pm, který se následně stáčí vzhůru a rozšiřuje se do jímky pro vybrané buňky fotoautotrofních mikroorganismů. Tato jímka je zaslepena oddělávací uzávěrou pro zabránění kolísání tlakových poměrů v mikrofluidním systému. K průhlednému mikrofluidnímu čipu je připojen zdroj světla pro vyvolání emise elektromagnetického záření z tříděných fotoautotrofních mikroorganismů v nosné kapalině. Dále je k němu připojen detektor emitovaného elektromagnetického záření fotoautotrofních mikroorganismů s analyzátorem emitovaného elektromagnetického záření fotoautotrofních mikroorganismů a jejich polohy a nástavec pro fokusování laserového svazku pro zachycení a přemísťování vybraných buněk fotoautotrofních mikroorganismů do mikroportu pro vybrané buňky fotoautotrofních mikroorganismů.These prior art drawbacks are largely eliminated by a device for screening living cells of photoautotrophic microorganisms according to the present invention, which is provided with a transparent microfluidic chip with a vertical channel of 0.5 to 2 mm width, at the upper end of which is the screened photoautotrophic microorganisms in the carrier liquid. In the middle section of the vertical channel there is an outlet microport, formed by an obliquely downwardly directed microchannel with a width of 30 to 100 µm, which is then turned upwards and expanded into a well for selected cells of photoautotrophic microorganisms. This well is sealed with a separating cap to prevent pressure fluctuations in the microfluidic system. A light source is connected to the transparent microfluidic chip to induce the emission of electromagnetic radiation from sorted photoautotrophic microorganisms in the carrier liquid. It is connected to the emitted electromagnetic radiation detector of photoautotrophic microorganisms with the emitted electromagnetic radiation analyzer of the photoautotrophic microorganisms and their position and a laser beam focusing attachment for capturing and moving selected photoautotrophic microorganism cells into the microport for selected photoautotrophic microorganism cells.

Ve výhodném provedení zařízení podle tohoto technického řešení je zdroj světla připojený k mikrofluidnímu čipu tvořen LED diodami nebo laserem.In a preferred embodiment of the device according to the present invention, the light source connected to the microfluidic chip consists of LEDs or a laser.

V jiném výhodném provedení zařízení podle tohoto technického řešení, a to tam, kde se měří a vyhodnocuje autofluorescence z fotosyntetizujících pigmentů fotoautotrofních mikroorganismů, je detektorem emitovaného elektromagnetického záření tříděných fotoautotrofních mikroorganismů CCD kamera.In another preferred embodiment of the apparatus of the present invention, where autofluorescence from photosynthesizing pigments of photoautotrophic microorganisms is measured and evaluated, the CCD camera is a detector of emitted electromagnetic radiation.

V dalším výhodném provedení zařízení podle tohoto technického řešení, a to tam, kde se měří a vyhodnocuje Ramanovský rozptyl, je detektorem emitovaného elektromagnetického záření tříděných fotoautotrofních mikroorganismů spektrometr a citlivá CCD kamera.In another preferred embodiment of the apparatus of the present invention, where Raman scattering is measured and evaluated, the emitted electromagnetic radiation detector is a sorted photoautotrophic microorganisms spectrometer and a sensitive CCD camera.

-1 CZ 25864 Ul-1 CZ 25864 Ul

Přehled obrázku na výkreseOverview of the figure in the drawing

Technické řešení bude dále podrobněji popsán podle přiloženého výkresu, na němž je schematicky znázorněno příkladné provedení zařízení pro třídění živých buněk fotoautotrofních mikroorganismů.The technical solution will be described in more detail below with reference to the accompanying drawing, in which an exemplary embodiment of a device for sorting living cells of photoautotrophic microorganisms is schematically shown.

Příklady provedení technického řešeníExamples of technical solution

Na výkrese je schematicky znázorněno zařízení pro třídění živých buněk fotoautotrofních mikroorganismů podle technického řešení. Toto zařízení je opatřeno průhledným mikrofluidním čipem 4 s vertikálním kanálkem 1 o šířce od 0,5 do 2 mm, na jehož horním konci je vstup 5 tříděných fotoautotrofních mikroorganismů v nosné kapalině. Do vertikálního kanálku 1 je v jeho střední části zaústěn výstupní mikroport 3, tvořený šikmo dolů směřujícím mikrokanálkem 6 o šířce od 30 do 100 pm, který se stáčí vzhůru a rozšiřuje se do jímky, která je zásobníkem 2 pro vybrané buňky fotoautotrofních mikroorganismů a která je zaslepena neznázoměnou oddělávací uzávěrou pro zabránění kolísání tlakových poměrů v mikrofluidním systému. Délka šikmo dolů směřující části mikrokanálku 6 je u příkladného provedení asi 0,1 mm. K mikro fluidnímu čipu 4 je připojen zdroj 7 světla pro vyvolání emise elektromagnetického záření z tříděných fotoautotrofních mikroorganismů v nosné kapalině. Zdrojem 7 světla může být zdroj s LED diodami nebo laserový zdroj. Zdroj 7 světla osvětluje přes průhlednou hmotu mikrofluidního čipu 4 fotoautotrofních mikroorganismů v nosné kapalině ve vertikálním kanálku 1. Další součástí systému je detektor 8 emitovaného elektromagnetického záření fotoautotrofních mikroorganismů s analyzátorem emitovaného elektromagnetického záření fotoautotrofních mikroorganismů a jejich polohy. V případě, že systém měří autofluorescenci z fotosyntetizujících pigmentů fotoautotrofních mikroorganismů, je detektorem emitovaného elektromagnetického záření tříděných fotoautotrofních mikroorganismů běžná CCD kamera. V případě, že systém měří Ramanovský rozptyl, je detektorem emitovaného elektromagnetického záření tříděných fotoautotrofních mikroorganismů spektrometr a citlivá CCD kamera. Součástí systému je i laserový zdroj 9, generující laserový svazek pro zachycení a přemísťování vybraných buněk fotoautotrofních mikroorganismů do mikroportu pro vybrané buňky fotoautotrofních mikroorganismů. U dna mikrofluidního čipu 4 je vytvořen odpadní kanálek 10 pro odvod těch sedimentovaných fotoautotrofních mikroorganismů v nosné kapalině, které nebyly přemístěny do zásobníku 2 vybraných buněk fotoautotrofních mikroorganismů. Mikrofluidní čip 4 je uložen na nástavci 11 s mikroposuvem pro fokusování laserového svazku.The drawing schematically shows a device for sorting living cells of photoautotrophic microorganisms according to the invention. This device is provided with a transparent microfluidic chip 4 with a vertical channel 1 having a width of from 0.5 to 2 mm, at the upper end of which is an inlet 5 of sorted photoautotrophic microorganisms in a carrier liquid. In the central channel 1, an outlet microport 3 is formed in its central part, consisting of an obliquely downwardly directed microchannel 6 of a width of 30 to 100 µm, which swivels upwards and expands into a well which is a reservoir 2 for selected cells of photoautotrophic microorganisms. blinded by a separating cap (not shown) to prevent pressure fluctuations in the microfluidic system. The length of the inclined downward portion of the microchannel 6 in the exemplary embodiment is about 0.1 mm. A light source 7 is connected to the micro-fluid chip 4 to cause the emission of electromagnetic radiation from the sorted photoautotrophic microorganisms in the carrier liquid. The light source 7 may be an LED source or a laser source. The light source 7 illuminates through the transparent mass of the microfluidic chip 4 of the photoautotrophic microorganisms in the carrier liquid in the vertical channel 1. Another part of the system is a detector 8 of emitted electromagnetic radiation of photoautotrophic microorganisms with an emitted electromagnetic radiation analyzer of photoautotrophic microorganisms. When the system measures autofluorescence from photosynthesizing pigments of photoautotrophic microorganisms, a conventional CCD camera is a detector of emitted electromagnetic radiation of sorted photoautotrophic microorganisms. If the system measures Raman scattering, the emitted electromagnetic radiation detector is a sorted photoautotrophic microorganism, a spectrometer and a sensitive CCD camera. The system also includes a laser source 9 generating a laser beam for capturing and moving selected cells of photoautotrophic microorganisms into a microport for selected cells of photoautotrophic microorganisms. At the bottom of the microfluidic chip 4, a waste channel 10 is provided for draining those sedimented photoautotrophic microorganisms in a carrier liquid that has not been transferred to a reservoir 2 of selected photoautotrophic microorganism cells. The microfluidic chip 4 is mounted on a microprobe 11 to focus the laser beam.

V činnosti prvního příkladného provedení tohoto zařízení se vzorek zkoumaných fotoautotrofních mikroorganismů vstříkne do vstupu 5 tříděných fotoautotrofních mikroorganismů v nosné kapalině, načež mikroorganismy sedimentují do dolní části mikrofluidního čipu 4. Zdroj 7 světla, což může být zdroj s LED diodami, osvětlí zkoumané fotoautotrofní mikroorganismy v nosné kapalině. Pak se zdroj 7 světla vypne a detekuje se autofluorescence z fotosyntetizujících pigmentů fotoautotrofních mikroorganismů. Přibližně v polovině mikrofluidního čipu 4 jsou zobrazeny optickým systémem na detektoru 8 emitovaného elektromagnetického záření fotoautotrofních mikroorganismů, což je CCD kamera. Tato autofluorescence se analyzuje a zkoumá se, jestli daný fotoautotrofní mikroorganismus splňuje podmínky pro výběr, to jest zda splňuje prahovou podmínku na velikost fluorescenční stopy a intenzitu autofluorescence. Současně se i urči, jaká je jeho poloha. Pokud je fotoautotrofní mikroorganismus vybrán, je uchopen v blízkosti ohniska laseru z laserového zdroje 9 laserovým paprskem, což je princip optické pinzety, a přemístěn k výstupnímu mikroportu 3 pro sběr vybraných buněk fotoautotrofních mikroorganismů tak, aby proudnice kapaliny procházející tímto místem odplavila fotoautotrofní mikroorganismus k výstupnímu mikroportu 3 a od něj mikrokanálkem 6 do zásobníku 2 pro vybrané buňky fotoautotrofních mikroorganismů.In the operation of the first exemplary embodiment of this apparatus, a sample of photoautotrophic microorganisms to be examined is injected into the inlet 5 of the sorted photoautotrophic microorganisms in a carrier liquid, whereupon the microorganisms sediment into the bottom of the microfluidic chip 4. carrier liquid. Then the light source 7 is switched off and autofluorescence is detected from the photosynthesizing pigments of the photoautotrophic microorganisms. Approximately half of the microfluidic chip 4 are imaged by an optical system on a detector 8 of emitted electromagnetic radiation of photoautotrophic microorganisms, which is a CCD camera. This autofluorescence is analyzed to investigate whether the photoautotrophic microorganism meets the selection conditions, i.e., whether it meets the threshold condition for fluorescence trace size and autofluorescence intensity. At the same time determine its position. When the photoautotrophic microorganism is selected, it is held close to the laser focus from the laser source 9 by a laser beam, which is the principle of optical tweezers, and moved to the exit microport 3 to collect selected cells of the photoautotrophic microorganisms. microport 3 and therefrom by microchannel 6 into stack 2 for selected cells of photoautotrophic microorganisms.

V činnosti druhého příkladného provedení tohoto zařízení se vzorek zkoumaných fotoautotrofních mikroorganismů rovněž vstříkne do vstupu 5 tříděných fotoautotrofních mikroorganismů v nosné kapalině, načež mikroorganismy sedimentují do dolní části mikrofluidního čipu 4. Zdroj 7In the second exemplary embodiment of the apparatus, a sample of photoautotrophic microorganisms of interest is also injected into the inlet 5 of the sorted photoautotrophic microorganisms in the carrier liquid, whereupon the microorganisms sediment into the bottom of the microfluidic chip 4. Source 7

-2 CZ 25864 Ul světla, což jev tomto případě zdroj laserového svazku o vlnové délce 785 nm, osvětlí zkoumané fotoautotrofní mikroorganismy v nosné kapalině. Pak se zdroj 7 světla vypne a detekuje se spektrum Ramanova rozptylu na mikroorganismu. Toto spektrum Ramanova rozptylu umožňuje bezkontaktní a nedestruktivní identifikaci chemických vazeb v mikroorganismu. Z poměru spektrálních maxim odpovídajících beta-karotenu lze určit jeho koncentraci a u některých druhů řas i určit velikost lipidických kapének. Poměr spektrálních maxim odpovídajících jednoduché a dvojné vazbě mezi uhlíky umožňuje určení nasycenosti lipidů uvnitř mikroorganismu. Zařízení pracuje tak, že jakmile je detekována přítomnost mikroorganismu, zacílí na něj chytací svazek a tento mikroorganismus přemístí do pozice ramanovského svazku, načež se vypne chytací svazek, zapne se měřicí svazek pro detekci ramanovských spekter, sejme se Ramanovo spektrum, vyfiltruje se, vyhodnotí se poměry vybraných spektrálních maxim, vypne se měřicí svazek pro detekci ramanovských spekter, zapne se chytací svazek a jím se mikroorganismus přesune do příslušné proudnice, která tento mikroorganismus dopraví k výstupnímu mikroportu 3 a od něj mikrokanálkem 6 do zásobníku 2 pro vybrané buňky fotoautotrofních mikroorganismů.Light, which in this case is the source of a 785 nm laser beam, illuminates the photoautotrophic microorganisms examined in the carrier liquid. Then the light source 7 is switched off and the spectrum of Raman scattering on the microorganism is detected. This spectrum of Raman scattering enables non-contact and non-destructive identification of chemical bonds in a microorganism. From the ratio of spectral maxima corresponding to beta-carotene it is possible to determine its concentration and in some algae species also to determine the size of lipid droplets. The ratio of the spectral maxima corresponding to the single and double carbon bonds allows the determination of lipid saturation within the microorganism. The device operates by detecting the presence of a microorganism, detecting the capture beam and moving the microorganism to the position of the Raman beam, then turning the capture beam off, turning on the measuring beam to detect the Raman spectra, picking up the Raman spectrum, filtering, evaluating proportions of selected spectral maxima, turn off the measuring beam to detect Raman spectra, turn on the capture beam and move the microorganism to the appropriate stream, which transports the microorganism to the output microport 3 and from it through micro channel 6 to selected photoautotrophic microorganism cells.

Výhodou zařízení pro třídění živých buněk fotoautotrofních mikroorganismů je, že vertikální orientace vertikálního kanálku 1 brání kontaktu mikroorganismů se stěnou, takže nedochází k přichycování mikroorganismů ke stěně. Není třeba řídit pohyb kapaliny v průhledném mikrofluidním čipu 4, protože mikroorganismy samy sedimentuj i v kapalině, která je statická. Rychlost sedimentace mikroorganismů lze řídit hustotou nosné kapaliny. Třebaže není možné analyzovat všechny mikroorganismy v kapalině, ty, které nejsou analyzované, samy sedimentují na dno mikrofluidního čipu 4 a nedostanou se mikrokanálkem 6 do zásobníku 2 pro vybrané buňky fotoautotrofních mikroorganismů. Naopak je možno je odčerpat odpadním kanálkem 10 pro opakované třídění. Vybrané mikroorganismy se zase samovolně nedostanou zpět do vertikálního kanálku I a je možné je odebrat mikropipetou nebo mikrofluidní stříkačkou. Další výhodou je, že se minimalizuje vzdálenost a čas, kdy mikroorganismy proudí v systému, protože jsou vstřiknuty přímo do vertikálního kanálku i mikrofluidního čipu 4. Celý systém je přitom možné plně automatizovat, přičemž velikou výhodou způsobu i zařízení je, že se s mikroorganismy zachází bezkontaktně a nedestruktivně, což sebou nese i to, že kontaminace vytříděných mikroorganismů je minimální.An advantage of the device for sorting living cells of photoautotrophic microorganisms is that the vertical orientation of the vertical channel 1 prevents contact of the microorganisms with the wall, so that the microorganisms do not adhere to the wall. There is no need to control the movement of the liquid in the transparent microfluidic chip 4 because the microorganisms themselves settle in the liquid which is static. The sedimentation rate of the microorganisms can be controlled by the density of the carrier liquid. Although it is not possible to analyze all microorganisms in the liquid, those that are not analyzed sediment themselves to the bottom of the microfluidic chip 4 and do not reach the micro-channel 6 into the reservoir 2 for selected cells of photoautotrophic microorganisms. Conversely, they can be pumped through the waste channel 10 for repeated sorting. The selected microorganisms do not spontaneously return to the vertical channel I and can be removed with a micropipette or microfluidic syringe. Another advantage is that the distance and time when microorganisms flow in the system is minimized as they are injected directly into both the vertical channel and the microfluidic chip 4. The whole system can be fully automated while the great advantage of the method and device is that the microorganisms are handled contactless and non-destructive, which also means that contamination of sorted microorganisms is minimal.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Způsob i zařízení podle technického řešení lze použít pro laboratorní i průmyslový výběr mikroorganismů pro jejich další využití v lékařství nebo v průmyslu.The method and the device according to the invention can be used for laboratory and industrial selection of microorganisms for further use in medicine or in industry.

NÁROKY NA OCHRANUPROTECTION REQUIREMENTS

Claims

Apparatus for screening living cells of photoautotrophic microorganisms, characterized in that it is provided with a transparent microfluidic chip (4) having a vertical channel (1) with a width of 0.5 to 2 mm, at the upper end of which is an inlet (5) of sorted photoautotrophic microorganisms in the carrier liquid, the vertical channel (1) having an outlet microport (3) in its central part, formed by an obliquely downwardly directed microchannel (6) having a width of 30 to 100 μηι, which swivels upwardly and extends into a sump for a selected cell of photoautotrophic microorganisms which is blinded by a separating cap to prevent pressure fluctuations in the microfluidic system and wherein a light source (7) is connected to the microfluidic chip (4) to cause emission of electromagnetic radiation from the sorted photoautotrophic microorganisms in the carrier liquid; emitted electromagnetic radiation photoautotrophic microorganisms with an emitted electromagnetic radiation analyzer of photoautotrophic microorganisms and their position and a laser beam focusing attachment (11) for capturing and moving the selected photoautotrophic microorganisms into the output microport (3) for selected photoautotrophic microorganism cells.

Device according to claim 1, characterized in that a light source (7) in the form of LEDs or a laser is connected to the microfluidic chip (4).

5

Device according to claim 1, characterized in that the detector (8) of the emitted electromagnetic radiation of the sorted photoautotrophic microorganisms is a CCD camera for sensing autofluorescence from the photosynthesizing pigments of the photoautotrophic microorganisms.

Device according to claim 1, characterized in that the detector (8) of the emitted electromagnetic radiation of the sorted photoautotrophic microorganisms is a spectrometer and a sensitive CCD camera for sensing the spectrum of Raman scattering on the microorganism.