CZ248489A3

CZ248489A3 - Process for preparing simple derivatives of lysergic acid

Info

Publication number: CZ248489A3
Application number: CS892484A
Authority: CZ
Inventors: Miroslav Rndr Csc Flieger; Renata Rndr Linhartova; Zdenek Rndr Phmr Drsc Rehacek; Premysl Rndr Csc Sajdl; Josef Ing Stuchlik; Zdenek Rndr Malinka; Pavel Ing Harazim; Ladislav Ing Cvak; Jan Rndr Bremek
Original assignee: Galena S P
Priority date: 1989-04-21
Filing date: 1989-04-21
Publication date: 1994-11-16
Also published as: CZ281196B6

Abstract

This method consists of producing simple derivatives of lysergic acid of formula I and II by the aggressive bioconversion of clavine alkaloids, and the simultaneous induction of the biosynthesis of the mentioned derivatives of lysergic acid. The objective is to increase the production of the individual derivatives of lysergic acid which are optimal raw materials for the further production of semi-synthetic ergot alkaloids for use in various therapeutic preparations. The required effect is achieved by specific aggression initiated during saprophytic cultivation by the addition of at least 0.4 g of clavine alkaloids in an arbitrary ratio to 1 l of the nutrient medium. Clavine alkaloids may be added to the nutrient medium at any phase of the fermenting process. Bioconversion with concurrent induction may be performed under conditions of stationary surface cultivation and/or submerged cultivation using suspension and/or immobilized cells of the strain of Claviceps paspali Stevens et Hall.

Description

Vynález se týká způsobu výroby jednoduchých derivátů kyseliny lysergové agresivní biokonversí klavinových alkaloidů a současnou indukci biosynthesy jednoduchých derivátů kyseliny lysergové pomoci saprofytních kultur produkčních kmenů Claviceps paspali Stevens et Hal1.The present invention relates to a process for the production of simple lysergic acid derivatives by aggressive bioconversion of clavin alkaloids and to the simultaneous induction of biosynthesis of simple lysergic acid derivatives by saprophytic cultures of production strains of Claviceps paspali Stevens et Hal1.

Jednoduché deriváty kyseliny lysergové tvoří skupinu námelových alkaloidů. Vedle amidu kyseliny lysergové CerginO, spadají do této skupiny alfa-hydroxyethylamid kyseliny lysergové >řvzorěp I? a ergometrin Jřvzorég, IIŮ včetně isomerů a epimerů.Simple derivatives of lysergic acid form a group of ergot alkaloids. In addition to lysergic acid amide CerginO, this group includes alpha-hydroxyethylamide of lysergic acid. and ergometrine, including the isomers and epimers.

Jednoduché deriváty kyseliny lysergové se vyznačuji významnými f ysiologickými účinky. Ve farmaceutickém průmyslu se uplatňují při výrobé léčebných preparátů. Tvoří přímou složku léčiv CergometrinO nebo jsou využívány jako substráty při přípravé polosyntetických derivátů námelových alkaloidů Cnicergolin, tergurid, lysurid, methylergometrin aj.3 s rozšířenými a případné novými biologickými účinky. Nové fsolosyntetické deriváty kyseliny lysergové se uplatňuji v humánní a veterinární mediciné se vzrůstající intenzitou.Simple lysergic acid derivatives have significant physiological effects. They are used in the pharmaceutical industry in the manufacture of medical preparations. They form a direct component of CergometrinO or are used as substrates in the preparation of semisynthetic ergot alkaloid derivatives Cnicergoline, terguride, lysuride, methylergometrine, etc. 3 with widespread and possibly new biological effects. The novel fsolosynthetic derivatives of lysergic acid are used in human and veterinary medicine with increasing intensity.

V biosyntetické dráze námelových alkaloidů slouží jako prekursory kyseliny lysergové a jejich derivátů skupina klavinových alkaloidů. K1 avi nové alkaloidy představuji další skupinu fysiologicky účinných námelových alkaloidů. Pro farmaceutický průmysl je ’/ýznamným zejména elymoklavin jřvzor^g 1115^ využívaný k výrobě po1 ©syntetických derivátů s léčebnými účinky.In the biosynthetic pathway of ergot alkaloids, a group of clavin alkaloids serves as precursors of lysergic acid and its derivatives. K1 avi new alkaloids represent another group of physiologically effective ergot alkaloids. Of particular interest to the pharmaceutical industry is elymoclavin, as shown in " g 1115 ", which is used to produce poly-synthetic derivatives with therapeutic effects.

C III 5C III 5

V odborné a patentové literatuře jsou popsány postupy fermentační přípravy klavinových alkaloidů i jednoduchých derivátů kyseliny lysergové. Fermentační produkce elymoklavinu je provázena souběžnou biosynthesou agroklavinu, případně i dalších nežádoucích klavinových alkaloidů. Byl popsán i postup biokonverze agr ok lavinu na elymoklavin, který je však provázen souběžnou biosynthesou dalších nežádoucích klavinových alkaloidů. Byl popsán i postup biokonverze agroklavinu na elymoklavin, který je však provázen souběžnou biosynthesou dalších nežádoucích klavinových alkaloidů. Důsledkem nákladných isolačnich postupů se ztěžuje použitelnost fermentačního produktu k semisynthese.Procedures for fermentative preparation of clavin alkaloids and simple lysergic acid derivatives are described in the scientific and patent literature. Fermentation production of elymoclavin is accompanied by concomitant biosynthesis of agroclavin or other undesirable clavin alkaloids. The procedure of bioconversion of agro avalanche to elymoclavin has also been described, but it is accompanied by concurrent biosynthesis of other undesirable clavin alkaloids. The process of bioconversion of agroclavin to elymoclavin has also been described, but it is accompanied by concomitant biosynthesis of other undesirable clavin alkaloids. The costly isolation procedures make the fermentation product usable for semisynthesis.

Dosud popsané postupy biosynthesy jednoduchých derivátů kyseliny lysergové skýtají podstatně nižší výtěžky, než postupy biosynthesy klavinových alkaloidů. Vedle postupů přímé fermentační produkce jednoduchých derivátů kyseliny lysergové je popsán postup biologické konverze elymoklavinu na kyselinu paspalovou Cisomer kyseliny lysergovéj bezbuněčnou frakci houby rodu Claviceps a postup biokonverze chemicky substituovaného elymoklavinu na chemicky substituované deriváty kyseliny lysergové druhem Claviceps fusi for mis. Pro průmyslovou výrobu pol ©syntetických námelových alkaloidů je užiti uvedených biokonverzních postupů ekonomicky neschůdné.The biosynthesis processes of simple lysergic acid derivatives described hitherto offer considerably lower yields than the biosynthesis processes of clavin alkaloids. In addition to direct fermentative production methods for simple lysergic acid derivatives, a process for the biological conversion of elymoclavin to paspalic acid is described. The lysergic acid isomer of a cell-free fraction of a fungus of the genus Claviceps and bioconversion of chemically substituted elymoclavin to chemically substituted lysergic derivatives by Claviceps fusi for mis. For the industrial production of polysynthetic ergot alkaloids, the use of said bioconversion processes is economically feasible.

Výše uvedené nevýhody postupů přípravy jednoduchých derivátů kyseliny lysergové odstraňuje způsob výroby jednoduchých derivátů kyseliny lysergové a to hydroxyethylamidu kyseliny lysergové Cvzorec 10 a ergometrinu Cvzorec 110, včetně jejich isomerů a epimerú, agresivní biokonverzi kl a vi nových alkaloidů a současnou indukci biosynthesy jednoduchých derivátů kyseliny lysergové, vyznačující se tim, že při saprofytni kultivaci kmenů druhu Claviceps paspali Stevens et Halí, produkujících tyto deriváty, se navodí fysioiogický stav potřebný pro vysoce účinnou biokonverzi klavinových alkaloidů a současnou indukci biosynthesy jednoduchých derivátů kyseliny lysergové. Vhodný fysioiogický stav se navodí specifickou agresi a to tak, že se k živnému mediu, obsahujícímu zdroje asi mi 1 ovát el ného uhlíku a dusíku, minerální soli, stopové prvky a/ nebo biologicky aktivní látky přidají biosynthetické prekursory kyseliny lysergové, tj. chanoklavin-I, chanoklavin-I-aldehyd, agroklavin, elymoklavin a/ nebo jejich směs v libovolném poměru v celkovém množství nejméně 0,4 g/1 živného media. Agresivní biokonverzi se současnou indukci lze provádět za podmínek stacionární povrchové kultivace a/ nebo submersní kultivace suspensní ch a/ nebo i mobilizovaných buněk kmenů Claviceps paspai i Stevens et Hal1.The aforementioned disadvantages of the simple lysergic acid preparation processes eliminate the process of making simple lysergic acid derivatives, namely Lysergic acid hydroxyethylamide Cvzorec 10 and ergometrine Cvzorec 110, including their isomers and epimers, aggressive bioconversion of kl and vi new alkaloids, while inducing biosynthesis of simple lysergic derivatives. characterized in that the saprophytic cultivation of Claviceps paspali strains of Stevens et Hall producing these derivatives induces a physiological condition required for high-efficiency bioconversion of clavin alkaloids while simultaneously inducing biosynthesis of simple lysergic acid derivatives. A suitable physiological state is induced by specific aggression by adding biosynthetic precursors of lysergic acid, i.e. chanoclavine, to the nutrient medium containing sources of about 1 molar carbon and nitrogen, mineral salts, trace elements and / or biologically active substances. I, chanoclavin-1-aldehyde, agroclavin, elymoclavin and / or a mixture thereof in any ratio in a total amount of at least 0.4 g / l nutrient medium. Aggressive bioconversion with simultaneous induction can be carried out under the conditions of stationary surface culture and / or submersive culture of suspension and / or mobilized cells of both Claviceps paspai and Stevens et Hal1.

Hlavni výhodou způsobu dle vynálezu je ekonomicky výhodná produkce jednoduchých derivátů kyseliny lysergové, využitelných k výrobě léčebných substanci.The main advantage of the process according to the invention is the economically advantageous production of simple lysergic acid derivatives useful for the manufacture of therapeutic substances.

Další výhodou způsobu dle vynálezu je možnost zpracováni dosud nevyužitých doprovodných klavinových alkaloidů, odpadajících při isolaci elymoklavinu. Další výhodou je to, že vhodně rozpuštěné klavinové alkaloidy lze ke kultuře houby Claviceps paspali přidat v libovolné fázi produkčního stupně kultivačního procesu. Další výhodou je možnost zabezpečit přísun klavlnú kofermentacl suspensního nebo kol mobilizovaného kmene, produkujícího klavinové alkaloidy.A further advantage of the process according to the invention is that it is possible to treat the unused accompanying clavin alkaloids which are eliminated during elymoclavin isolation. Another advantage is that suitably dissolved clavic alkaloids can be added to the culture of Claviceps paspali at any stage of the production step of the culture process. A further advantage is the possibility of providing a clave cofermentation of the suspension or co-mobilized clave alkaloid producing strain.

Další výhodou je možnost vyvftit skutečnosti, že biokonverze je vícestupňovým f ysiologickým procesem, k purifikaci směsi klavinových alkaloidů. Je-li specifická agrese vyvolána chanoklavinem-I, chanoklavin-I-aldehydem a agroklavinem, jsou tyto alkaloidy v buňce nejdříve konvertovány na elymoklavin, který je vylučován zpět do media. Je-li biokonversni proces přerušen ve vhodném okamžiku, získá se směs derivátů kyseliny lysergové a elymoklavinu, jejíž složky jsou snadně oddělitelné a přímo využitelné pro výrobu pol©syntetických námelových alkaloidů.Another advantage is the possibility to account for the fact that bioconversion is a multi-stage physiological process to purify a mixture of clavin alkaloids. If specific aggression is induced by chanoclavin-I, chanoclavin-1-aldehyde and agroclavin, these alkaloids in the cell are first converted to elymoclavin, which is secreted back into the medium. If the bioconversion process is interrupted at the appropriate time, a mixture of lysergic acid and elymoclavin derivatives is obtained, the components of which are readily separable and directly useful for the production of polysynthetic ergot alkaloids.

Způsob výroby Jednoduchých derivátů kyseliny lysergové agresivní biokonverzi klavinových alkaloidů a současnou indukci biosynthesy dle vynálezu je doložen následujícími příklady provedeni, aniž by jimi byl předmět vynálezu jakkoli omezen.The process for the production of the simple lysergic acid derivatives by the aggressive bioconversion of clavin alkaloids and the simultaneous induction of biosynthesis according to the invention is exemplified by the following non-limiting examples.

Příklad 1Example 1

Submersnlm inokulem kmene Claviceps paspali CCM 8061 v množství 10 % obj. se naočkují 500 ml Erlenmeyerovy baňky, obsahující 100 ml sterilního media o složeni Cg/1 H^OD: sorbit 50, kyselina jantarová 36, KH₂PO₄ 2, MgS0₄.7H₂0 0,3, FeS0₄· 7H₂0 0,001, ZnSO^ 7H₂O 0,01. pH media se upraví pomoci NH₄0H na 5,4. Baňky se kultivují na rotační třepačce při 3,2 ot./s a excentru 2,5 cm, při teplotě 24^C v temnu. Zvlášt se připraví sterilní roztoky agr ok lavinu, elymoklavinu a směsi obou alkaloidů ve 2,5kyselině vinné.A 10 ml volumetric Claviceps paspali CCM 8061 inoculum is inoculated with a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of sterile medium Cg / 1 H 2 OD: sorbitol 50, succinic acid 36, KH ₂ PO ₄ 2, MgSO ₄ . 7H ₂ 0 0.3, FeSO ₄ · 7H ₂ 0 0.001, ZnSO 4 7H ₂ O 0.01. pH of the medium is adjusted with NH ₄ 0H to pH 5.4. The flasks are cultivated on a rotary shaker at 3.2 rpm and a 2.5 cm eccentric, at 24 ° C in the dark. In particular, sterile solutions of agro avalanche, elymoclavin and mixtures of both alkaloids in tartaric acid are prepared.

V nultém, čtvrtém, pátém a šestém dnu kultivace se roztoky těchto alkaloidů přidají k jednotlivým kulturám kmene tak, aby výsledná koncentrace klavi nových alkaloidů v mediu byla 1 až 3 g/1. Souběžně probíhají kontrolní kultivace bez přídavku alkaloidů. Kultivace se ukončí po 7, 10 a 14 dnech. Výsledky kultivace, tj. obsah hydroxyethylamidů kyseliny lysergové, obsah zbytkových klavinových alkaloidů, procento konverze klavinových alkaloidů a procento indukce biosynthesy hydroxyethylamidů kys. lysergové, jsou uvedeny v tabulce 1.On the zero, fourth, fifth and sixth days of culture, the solutions of these alkaloids are added to the individual cultures of the strain so that the resulting concentration of clave of the new alkaloids in the medium is 1 to 3 g / l. In parallel, control cultures are carried out without the addition of alkaloids. Cultivation is terminated after 7, 10 and 14 days. The culture results, i.e. lysergic acid hydroxyethylamide content, residual clavin alkaloid content, percent conversion of clavin alkaloids, and percent induction of lysergic acid hydroxyethylamide biosynthesis are shown in Table 1.

Přiklad 2Example 2

Submersnlm inokulem kmene Claviceps paspali CCM 8061 v množství 10 % obj. se zaočkuje 9 000 1 sterilního media o složeni dle přikladu 1 ve fermentačním tanku o celkovém objemu 15 000 1. Kultura se kultivuje za míchání l,83f ot./s a vzdušněni 56 1/s při 2^°C. Ve 4. dnu kultivace se ke kultuře přidá sterilní vodný roztok 2,5 % kyseliny vinné s rozpuštěnou směsi agroklavinu a elymoklavinu v poměru 23 : 77 tak, aby výsledná koncentrace klavinových alkaloidů v mediu byla 1,5 g/1. Současně se zvýší vzduš6 nění na 02 1/s. Po 14 dnech kultivace Je celkový obsah hydroxy— ethyl amidů kyseliny lysergovó v mediu 2,92 g/1, obsah zbytkových klavinú je 0,29 g/1.Submerged inoculum of Claviceps paspali CCM 8061 at 10% by volume was inoculated with 9,000 l of sterile medium of the composition of Example 1 in a fermentation tank with a total volume of 15,000 l. / s at 2 ° C. On day 4 of the culture, a sterile aqueous solution of 2.5% tartaric acid with a dissolved mixture of agroclavin and elymoclavin in a ratio of 23: 77 is added to the culture so that the final concentration of clavin alkaloids in the medium is 1.5 g / l. At the same time, the aeration increases to 02 1 / s. After 14 days of cultivation, the total lysergic acid hydroxyethyl amide content in the medium is 2.92 g / l, the residual clave content is 0.29 g / l.

Příklad 3Example 3

Submersnim inokulem kmene Claviceps paspali CCM 8003 v množství 10 % obj. se zaočkuje 1 000 1 media o složeni Cg/1 H^OO: sorbit 100, kyselina jantarová 30, kukuřičný extrakt Ccorn steep liquor, 00 % suš. 3 10, CNHO^SO, 20, NaCl 10, ΚΙΤΡΟ. 2,Submerged inoculum of Claviceps paspali CCM 8003 in an amount of 10% by volume was inoculated with 1000 L of a composition of Cg / 1 H 2 OO: sorbitol 100, succinic acid 30, corn extract Ccorn steep liquor, 00% dry 3 10, CNHO ^. SO, 20, NaCl 10, ΚΙΤΡΟ. 2,

MgS0₄. 7H₂O 0,3, CaCNO^g. 4HgO 0,1, ^ZnS04· ^7H2° 0,01, FeSO^ 7HgO 0,01, MnS0₄·5H₂0 0,000, CuS0₄· OHgO 0,000, pH media upraveno pomocí NaOH na 0,4. Medium je ve fermentačnim tanku o celkovém objemuMgS0 ₄ . 7H ₂ O 0.3, CaCNO 4 g. 4HgO 0.1, ^ZnSO 4 · ^7H 2 ° 0.01, FeSO 4 7HgO 0.01, MnSO ₄ · 5H ₂ 0.000, CuSO ₄ · OHgO 0.000, pH of the medium adjusted to 0.4 with NaOH. The medium is in a total volume fermentation tank

I 500 1. Současně s inokulem se přidá sterilní roztok kyseliny vinné s rozpuštěnou směsi chanoklavin-Z-aldehydu a chanoklavinu-I v poměru 13 : 87 tak, aby výsledná koncentrace klavinových alkaloidů v mediu byla 1,8 g/1. Kultura se kultivuje za míchániA sterile tartaric acid solution with a 13: 87 mixture of chanoclavin-2-aldehyde and chanoclavin-1 is added concurrently with the inoculum to give a final concentration of clavin alkaloids in the medium of 1.8 g / l. The culture is cultivated with stirring

2,83 ot./s a vzdušněni 12 000 1/h při 2á|°C po dobu 14 dnů. Po 14 dnech kultivace je celkový obsah hydroxyethylamidů kyseliny lysergové v mediu 3,00 g/1, obsah zbytkových klavinů je 0,03 g/1.2.83 rpm and air 12,000 rpm at 2 ° C for 14 days. After 14 days of cultivation, the total lysergic acid hydroxyethylamide content in the medium is 3.00 g / l, the residual clavin content is 0.03 g / l.

Přiklad 4Example 4

Submersnim inokulem kmene Claviceps paspali CCM 8062 v množství 10 % obj. se naočkují 500 ml Erlenmeyerovy baňky, obsahující 100 ml media o složení Cg/1 HgOj: manit ol 30, kyselina jantarová 30, propylénglykol 30. KH₂P0₄ 1, MgSO^ 7HgO 0,3, NaNOg 0,1,A 10 ml volumetric Claviceps paspali CCM 8062 inoculum was inoculated with a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of a Cg / 1 HgO 3 medium: mannitol 30, succinic acid 30, propylene glycol 30. KH ₂ PO _{4 4} , MgSO ₄ 7HgO 0.3, NaNOg 0.1,

CaCN0₃5₂. 4H₂0 0,03, 2nS0₄· 7Hg0 0,000, CuS0₄· SHgO 0,000,CaCNO ₃ 5 ₂ . 4H ₂ 0 0.03, 2nSO ₄ · 7Hg0 0.000, CuSO ₄ · SHgO 0.000,

MnS0_4< SHgO 0,01, FeS0₄· 7HgO 0,020, pH upraveno pomocí NH₄0H na hodnotu 0,20. Baňky se kultivují na rotační třepačce při 2,8 ot./s a excentru 2,0 cm při teplotě 24^C v temnu. V 8. dnu kultivace se ke kultuře přidá sterilní 2,0 % kyselina vinná s rozpuštěnou směsi chanoklavinu-I, agroklavinu a elymoklavinu v poměru 3 : 9 : 88 tak, aby výsledná koncentrace klavinových alkaloidů v mediu byla 0,8 g/1. Po 10 dnech* kultivace je celkový obsah jednoduchých derivátů kyseliny lysergové v mediu 2,13 g/1, z toho ergometr i nu 78 %, er ginu 11 % a hydr oxyet hyl amidů kys. lysergovéMnSO _{4 <} SHgO 0.01, FeSO ₄ · 7HgO 0.020, pH adjusted to 0.20 with NH ₄ OH. The flasks are cultivated on a rotary shaker at 2.8 rpm and an eccentric of 2.0 cm at 24 ° C in the dark. On day 8 of the culture, sterile 2.0% tartaric acid with a 3: 9: 88 mixture of chanoclavin-1, agroclavin and elymoclavin was added to the culture so that the final concentration of clavin alkaloids in the medium was 0.8 g / L. After 10 days of cultivation, the total content of simple lysergic acid derivatives in the medium is 2.13 g / l, of which ergometer is 78%, erin 11% and hydroxyethyl hyl amides of lysergic acid.

II %. Obsah zbytkových klavinů je 0,000 g/1.II%. The residual piano content is 0.000 g / l.

Přiklad 3Example 3

Mycelíum kmene Claviceps paspali CCM 8061 z odstředěné submersní kultury se smíchá se sterilním roztokem alginátu Protanal LF 10/60 CProtan, Dramen, NorskoZ) tak, aby v 1 ml směsi bylo 0,1 omogenizovaná směs se za sterilních podmínek kape do 2,5^% roztoku CaCl^. Vzniklé kuličky v alginátu imobi1izováného biokatalyzátoru se nechají stát v roztoku CaCl^ po dobu 50 min. Poté se oddělí a promyjí sterilní deštilovanou vodou. Biokatalyzátor v množství 20 g se preinkubuje v 500 ml Erlenmeyerově baňce plněné ÍOO ml sterilního media o složení Cg/1 HgOD: sacharosa 30, CaCNO^g. 4HgO 1, KH₂PO₄ 0,25,The mycelium of Claviceps paspali strain CCM 8061 from the centrifuged submersible culture is mixed with sterile alginate solution Protanal LF 10/60 (Crotan, Dramen, NorwayZ) so that 0.1 ml of the mixture is dripped under sterile conditions up to 2.5 µm under sterile conditions. % CaCl2 solution. The resulting beads in the alginate of the immobilized biocatalyst were allowed to stand in CaCl 2 solution for 50 min. Then they are separated and washed with sterile distilled water. The 20 g biocatalyst was preincubated in a 500 ml Erlenmeyer flask filled with 100 ml of sterile Cg / 1 HgOD: sucrose 30, CaCNO4 g. 4HgO 1, KH ₂ PO ₄ 0.25,

MgSO^. 7HgO 0,03, ZnSO^.7HgO 0,02, kvasničný extrakt 0,1, pH upraveno na hodnotu 5,2. Preinkubace se provádí na rotační třepačce při 2,8 ot./s a exeentru 2,5 cm, při teplotě 25^C po dobu 36 hodin. Poté se biokatalyzátor oddělí od media a převede se do 100 ml media o složení Cg/1 H^OZ): sorbit 50, kyselina jantarová 18,MgSO4. 7HgO 0.03, ZnSO 4 .7HgO 0.02, yeast extract 0.1, pH adjusted to 5.2. Preincubation is carried out on a rotary shaker at 2.8 rpm and 2.5 cm excentric, at 25 ° C for 36 hours. Then the biocatalyst is separated from the medium and transferred to 100 ml of a medium having the composition (Cg / 1 H 2 O 2): sorbit 50, succinic acid 18,

V tomto mediu se biokatalyzátor kultivuje na rotační třepačce při 3,2 ot./s a exeentru 2,5 cm při teplotě 25rC. Ve 12. hodině kultivace se přidá roztok chanoklavinu, agroklavinu a elymoklavinu v kyselině jantarové o poměru složek 8 ; 37 : 55 tak, aby výsledná koncentrace klavinových alkaloidů byla 2,5 g/1 media.In this medium, the biocatalyst was cultivated on a rotary shaker at 3.2 rpm and 2.5 cm excentric at 25rC. At 12 o'clock of cultivation, a solution of chanoclavin, agroclavin and elymoclavin in succinic acid with a component ratio of 8; 37: 55 so that the final concentration of the clavin alkaloids was 2.5 g / l medium.

Po 84· hodinách kultivace obsahuje medium elymok lavin v množství 2,34 g/1, agroklavin v množství 0,12 g/1, chanoklavin v neměřitelném množství, hydr oxyet hyl amidy v množství 0,98 g/1. Medium se od biokatalyzátoru oddělí, použije se k isolací elymoklavinu a hydr oxyet hyl amidů kyseliny lysergové. K biokatalyzátoru se přidá čerstvé medium výše uvedeného složení, obsahující navíc směs chanoklavin-I-sukcinátu, agroklavinsukcinátu a elymoklavinsukcinátu ve výše uvedeném poměru v celkovém množství 2,5 g/1 media. Medium se kultivuje s biokatalyzátorem za výše uvedených podmínek a po 72 hodinách se od biokatalyzátoru* oddělí a použije se k isolací elymoklavinu a hydr oxyet hyl amidů kys. lysergové. Biokatalyzátor se výše uvedeným způsobem použije k purifikaci směsi klavinových alkaloidů a souběžné produkci hydr oxyet hyl amidů kys. lysergové opakovaně ještě 5 krát. Při 7 cyklech použití biokatalyzátoru by— lo celkově získáno medium obsahujíc! 16,41 g elymoklavinu/1, 0.82 g agroklavinu/1, 0,03 g chanokl avinu-I/1 a 7,14 g hydroxyethyl amidů kys. 1 ysergové/1.After 84 hours of cultivation, the medium contains 2.34 g / l of avalanches, 0.12 g / l of agroclavin, unmeasurable chanoclavin, and 0.98 g / l of hydroxyethyl amides. The medium was separated from the biocatalyst and used to isolate elymoclavin and lysergic acid hydroxyethyl amides. To the biocatalyst is added fresh medium of the above composition, containing in addition a mixture of chanoclavin-1-succinate, agroclavinsuccinate and elymoclavinsuccinate in the above ratio in a total amount of 2.5 g / l medium. The medium is cultured with the biocatalyst under the above conditions and after 72 hours it is separated from the biocatalyst * and used to isolate elymoclavin and lysergic acid hydroxyethyl amides. The biocatalyst is used as described above to purify the mixture of clavin alkaloids and simultaneously produce lysergic acid oxyoxyhyl amides repeatedly 5 more times. In 7 cycles of use of the biocatalyst, a medium containing a total of 10% was obtained. 16.41 g of elymoclavin (1), 0.82 g of agroclavin (1), 0.03 g of chanocl avin-1 (1) and 7.14 g of hydroxyethyl amides of 1 ysergic acid (1).

Přiklad 6Example 6

Submersnlm i nok úlem kmene Claviceps purpur ea CCM F-733, produkujícího klavinové alkaloidy, se v množství 10 % obj. zaočkuje 3 400 1 sterilního media o složeni Cg/1 H^OO: sacharosa 150, kukuřičný výluh Ccorn steep liquor, 60 % sušinaZ) 10, CNH^OgSO^ 5, kyselina jantarová 5, KH₂P0₄ 0,24, CaClg 1,1, MgS0₄.7H₂0 0,25Claviceps magenta and CCM F-733, a clavic alkaloid-producing strain, was inoculated at 10% by volume with 3,400 L of sterile Cg / 1 H 2 OO: sucrose 150, Ccorn steep liquor, 60% dry matter Z) 10, CNH 2 O 5 SO 4, succinic acid 5, KH ₂ PO ₄ 0.24, CaCl 2 1.1, MgSO ₄ .7H ₂ 0 0.25

ZnSO . 7H 0 0,015, FeS0..7H~0 0,02, fenobarbital sodný 0,1, pH 4 15 4 G upraveno na 5,8. Medium je ve fermentačnim tanku o objemu 5 000 litrů. Kultura se kultivuje za míchání 1,83 ot. /s a vzdušněni 20 1/s při 22^0. Submersnlm inokulem kmene Claviceps paspali CCM 8061 v množství 10 X obj. se zaočkuje 3 300 1 sterilního media o složeni dle přikladu 1 ve fermentačnim tanku o celkovém objemu 5 000 1. Kultura se kultivuje za mícháni 1,83 ot./s a vzdušněni 20 1/s při teplotě 25^°C. Po 172 hodinové kultivaci kultury Claviceps purpurea CCM F-733 a po 48 hodinové kultivaci kultury Claviceps paspali CCM 8061 se obsahy obou fermentačních tanků přepustí do 15 000 1 fermentačního tanku, obsahujícího 2 600 1 sterilního media o složeni Cg/1 HgOl·: sacharosa 110, glukosa 40, sorbit 1OO, kyselina jantarová 30, KH₂P0₄ 1, CNHp₂S0₄10, kukuřičný výluh C60 X suš. 3 3, CaClg 1,2, MgS0₄·7HgO 0,25, ZnS0₄.7H₂0 0,01, FeS0₄·7HgO 0,02, fenobarbital sodný 0,2, pH upraveno na hodnotu 5,4. Společná kofermentace obou kmenů probíhá po dobu 14 dnů při 24|°C, za mícháni 1,83 ot. /s a vzdušněni 62 1/s. Po ukončené kultivaci je celkový obsah námelových alkaloidů v mediu 4,89 g/1, z toho hydroxyethylamidy kyseliny lysergové tvoři 73 X, elymoklavin 24,3 X, agroklavin 2,6 X. chanoklavin-I 0,1 %.ZnSO. 7H 0 0.015, FeSO 7 · H 0 0.02, sodium phenobarbital 0.1, pH 4 15 4 G adjusted to 5.8. The medium is in a 5,000 liter fermentation tank. The culture is cultivated with stirring 1.83 rpm. / s and air 20 1 / s at 22 ^ 0. Submerged inoculum of Claviceps paspali CCM 8061 at 10% by volume is inoculated with 3,300 L of sterile medium of the composition of Example 1 in a 5,000 L fermentation tank. The culture is cultivated with stirring 1.83 rpm and 20 L air. / s at 25 ° C. After cultivating Claviceps purpurea CCM F-733 for 172 hours and cultivating Claviceps paspali CCM 8061 for 48 hours, the contents of both fermentation tanks are transferred to a 15,000 L fermentation tank containing 2,600 L of sterile Cg / 1 HgO1 · sucrose 110 , glucose 40, sorbitol 100, succinic acid 30, KH ₂ PO ₄ 1, CNH p ₂ SO ₄ 10, corn steep liquor C60 X dry 3 3, CaClg 1.2, MgSO ₄ · 7HgO 0.25, ZnSO ₄ .7H ₂ 0 0.01, FeSO ₄ · 7HgO 0.02, sodium phenobarbital 0.2, pH adjusted to 5.4. The co-fermentation of both strains takes place for 14 days at 24 ° C, with stirring 1.83 rpm. / sa air 62 1 / s. After cultivation, the total ergot alkaloid content in the medium is 4.89 g / l, of which lysergic acid hydroxyethylamides are 73%, elymoclavin 24.3%, agroclavin 2.6%, chanoclavin-I 0.1%.

Tabulka 1Table 1

Biokonverze kla vino vých alkaloidů a indukce biosyntézy jednoduchých derivátů kyseliny lysergovéBioconversion of Claval Alkaloids and Induction of Biosynthesis of Simple Lysergic Acid Derivatives

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 0 0 A AND 1 1 10 10 0.46 0.46 1.50 1.50 0.25 0.25 75.0 75.0 2.7 2.7 4 4 A AND 1 1 10 10 0.46 0.46 1.54 1.54 0.25 0.25 75.0 75.0 5.5 5.5 4 4 A AND 1 1 14 14 1.12 1.12 2.44 2.44 0.04 0.04 96.0 96.0 15.1 15.1 4 4 E E 1 1 14 14 1.12 1.12 2.20 2.20 0.05 0.05 95.0 95.0 3.8 3.8 5 5 E E 2 2 14 14 0.90 0.90 3.80 3.80 0.23 0.23 89.0 89.0 31.0 31.0 5 5 S WITH 2 2 14 14 0.90 0.90 3.50 3.50 0.30 0.30 85.0 85.0 20.7 20.7 6 6 A AND 1 1 14 14 1.22 1.22 2.70 2.70 0.05 0.05 95.0 95.0 21.6 21.6 7 7 A AND 2 2 14 14 1.22 1.22 4.70 4.70 0.42 0.42 79.0 79.0 46.0 46.0 7 7 E E 2 2 14 14 1.22 1.22 3.84 3.84 0.44 0.44 78.0 78.0 19.3 19.3 7 7 S WITH 3 3 14 14 1.22 1.22 5.40 5.40 0.82 0.82 73.0 73.0 28.0 28.0 10 10 S WITH 2 2 14 14 1.22 1.22 4.30 4.30 0.67 0.67 66.0 66.0 33.5 33.5

Legenda ke sloupcům:Legend to columns:

1: Přidání alkaloidu, den1: Addition of alkaloid, day

2: Přidání alkaloidu, alkaloid2: Addition of alkaloid, alkaloid

3: Přidání alkaloidu, konc. <g/I>3: Addition of alkaloid, conc. <g / l>

4: Délka fermentace Cdny)4: Length of fermentation (Cdny)

5: JDKL <g/L> kontrola5: JDKL <g / L> control

6: JDKL Cg/1) s přídavkem6: JDKL Cg / 1) with addition

7: Zbytkový E <gZl>7: Residual E <gZ1>

8: Konverze na JDKL <308: Conversion to JDKL <30

9: Indukce tvorby JDKL9: Induction of JDKL formation

JDKL - jednoduché deriváty kyseliny lysergové, A - agroklavin, E - elymoklavin, S - směs A + E o poměru 65:35JDKL - simple derivatives of lysergic acid, A - agroclavin, E - elymoclavin, S - mixture A + E in ratio 65:35

Claims

PATENTOVÉ *

Claims

A process for the production of simple lysergic acid derivatives of formulas I and II by aggressive bioconversion of clavin alkaloids and simultaneous induction of biosynthesis, characterized in that in saprophytic cultivation of Claviceps paspali strains of Stevens et Halí producing these derivatives, a nutrient medium containing sources of about 1 of carbon monoxide and nitrogen, mineral salts, trace elements and / or biologically active substances add chanoclavin-I, chanoclavin-1-aldehyde, agroclavin, elymoclavin and / or a mixture thereof in any ratio in a total amount of at least 0.4 g / l nutrient media.

2.

Process according to claim wherein _R lj the bioconversion the current induction performed under conditions stationary surface cultivation and / or submersnl cultivation of suspension and / or immobilized cells of a strain of Claviceps paspali Stevens et Hall.