CZ23399U1 - Kombinace sad primerů pro normalizaci exprese genů v ječmeni za působení sucha - Google Patents
Kombinace sad primerů pro normalizaci exprese genů v ječmeni za působení sucha Download PDFInfo
- Publication number
- CZ23399U1 CZ23399U1 CZ201125336U CZ201125336U CZ23399U1 CZ 23399 U1 CZ23399 U1 CZ 23399U1 CZ 201125336 U CZ201125336 U CZ 201125336U CZ 201125336 U CZ201125336 U CZ 201125336U CZ 23399 U1 CZ23399 U1 CZ 23399U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- primer
- gene expression
- combination
- expression
- genes
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 24
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims description 15
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 title claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 7
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 6
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000003679 Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (Phosphorylating) Human genes 0.000 description 1
- 108090000094 Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (Phosphorylating) Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Řešení se týká kombinace sad primerů se specifickými primeiy pro normalizaci exprese genů v různých orgánech ječmene vystaveného působení sucha na základě polymerázové řetězové reakce v reálném čase (dále real-time PCR).
Dosavadní stav techniky
Klíčovým tématem posledních let je globální oteplování a s ním spojený nedostatek vody, který velmi omezuje produkci polních plodin. Pro přesnou kvantifikaci exprese klíčových genů, které by mohly mít vliv na zlepšení suchovzdomosti plodin, případně na kvantifikaci markérů suchovzdomosti, je potřeba vyvinout vhodnou směs referenčních genů. V poslední době se stále více upozorňuje na fakt, že jediný referenční gen není postačující pro přesnou kvantifikaci, pro dané podmínky, rostlinný druh a pletivo. Je tedy nutné vyvinout a optimalizovat vhodný set několika referenčních genů. Speciální statistické programy určí, jaký počet referenčních genů je pro danou situaci dostačující a které z analyzovaných referenčních genů jsou nejvhodnější.
Nevýhodou dosud používaných směsí s jedním referenčním genem je malá reprodukovatelnost a spolehlivost reakce, což je nežádoucí.
Podstata technického řešení
Uvedené nedostatky odstraňuje kombinace sad primerů pro normalizaci exprese genů v ječmeni za působení sucha, podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje tři sady příměrových kombinací pro současné stanovení exprese genů pro GAPDH, HOGAPDH a EF1alpha, metodou real-time PCR, přičemž nukleotidové sekvence pro stanovení exprese genu pro GAPDH jsou
Primer F: 5 '-GTTGGCAAGGTGCTCCC AG A-3'
Primer R: 5 -GCTCATAGGTGGCTGGCTTG-3', pro stanovení exprese genu pro HOGAPDH jsou
Primer F: 5 -TGTCCATGCCATGACTGCAA-3'
Primer R: 5 -CCAGTGCTGCTTGGAATGATG-3' a pro stanovení exprese genu pro EFl-alpha jsou
Primer F: 5 -ATGATTCCCACCAAGCCCAT-3'
Primer R: 5 -AC ACC AACAGCCACAGTTTGC-3'.
Podstatou technického řešení je také nová sada primerů podle technického řešení pro stanovení exprese genu pro GAPDH o složení
Primer F: 5-GTTGGCAAGGTGCTCCCAGA-3'
Primer R: 5 -GCTCATAGGTGGCTGGCTTG-3'.
Podstatou technického řešení je spolehlivý set pro stanovení referenčních genů pro ječmen (Horcle um vulgare} za podmínek sucha pro listy i odnožovací uzle, který obsahuje tři sady příměrových kombinací, z nichž jedna pro stanovení GAPDH je nově navržená sekvence, ostatní pro stanovení HOGAPDH a EFl-alpha jsou sekvence převzaté z Faccioli et al. (2007), ale jejich současné použití pro stanovení referenčních genů pro ječmen za působení sucha dosud nebylo popsáno.
Jednotlivé kombinace sad primerů pro stanovení tří uvedených genů jsou podle technického řešení charakterizovány tím, že obsahují 10 mikrolitrů Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), ke kterému se přidají roztoky primerů o specifické nukleotidové sek- 1 CZ 23399 UI věnci (GTTGGCAAGGTGCTCCCAGA a GCTCATAGGTGGCTGGCTTG pro stanovení GAPDH; TGTCCATGCCATGACTGCAA a CCAGTGCTGCTTGGAATGATG pro stanovení HOGAPDH; ATGATTCCCACCAAGCCCAT a ACACCAACAGCCACAGTTTGC pro stanovení EFl-alpha), jejichž konečná koncentrace je v reakční směsi 0,2 mikromolámí a reakční směs se doplní vodou pro PCR (bez RNáz a DNáz) do objemu 18 mikrolitrů. K reakční směsi se poté přidají 2 mikrolitry vzorku cDNA o koncentraci 150 ng/μΐ. Reakce je připravena vždy s jednou primerovou kombinací, výpočet normalizačního faktoru však znamená geometrický průměr všech tří výsledků exprese těchto referenčních genů.
Reakce probíhá v termocykleru pro real-time PCR při následujícím teplotním profilu: 10 minut při 95 °C, následuje 40 cyklů skládajících se ze dvou kroků (15 sekund pří 95 °C, 1 minuta při 60 °C).
Exprese všech tří referenčních genů je stabilní napříč všemi vzorky a lze ji použít pro normalizaci exprese sledovaných genů. Přítomnost jediného PCR produktu pro každý gen lze detekovat na 2% agarosovém gelu.
Kombinace sad primérů podle technického řešení se setem primérů pro určení exprese spolehlivých referenčních genů pro ječmen (Hordeum vulgare), vystavený stresovým podmínkám sucha, byla podle technického řešení testována u listů i odnožovacích uzlů na velmi odolné syrské odrůdě Tadmor a na odolné české odrůdě Amulet, která má jiný systém hospodaření s vodou.
Vyvinutá kombinace sad primérů podle technického řešení se setem referenčních genů bude využitelná pro molekulámě-bio logické hodnocení markérů suchovzdomosti při vývoji či hodnocení odrůd odolných vůči suchu.
Primery pro stanovení GAPDH podle technického řešení pro normalizaci exprese genů v různých orgánech ječmene vystaveného působení sucha byly navrženy původci a kombinace tří příměrových párů pro normalizaci genové exprese byla optimalizována pro dané podmínky ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v.v.i., Praha, CZ, kde probíhalo i statistické hodnocení vhodnosti použití různých příměrových kombinací.
Následující příklady provedení vynález pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.
Příklady provedení
Příklad 1
Pro analýzu byly použity listy a odnožovací uzle dvou odrůd ječmene (Tadmor a Amulet). Byly odebrány kontrolní vzorky listů a odnožovacích uzlů s dostatečnou zálivkou a vzorky stresované suchem. Každý vzorek byl odebírán a analyzován ve třech biologických opakováních. RNA byla izolována pomocí Trizol Reagent (Invitrogen, USA), přečištěna (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Germany), ošetřena DNasou (RNase Free DNase Set, Qiagen, Germany) a změřena její koncentrace a čistota na spektrofotometru. RNA byla naředěna na požadovanou koncentraci (150 ng/μΐ). Integrita RNA byla změřena pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA) a přepsána do cDNA (TaqMan Reverse Transcription Reagens, Applied Biosystems, USA) pomocí termocykleru (Veriti Thermal Cycler, Applied Biosystems, Singapore). Reakční směs měla složení 7,2 mikrolitrů sterilní deionizované vody (Sigma), 10 mikrolitrů Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK) a 0,4 mikrolitrů primeru F a příměru R (10 mikromolámí) pro daný referenční gen.
Kombinace sad primérů podle technického řešení pro real-time PCR byla připravena do 96-jamkového plata a ke směsi bylo přidáno 2 μΐ vzorku cDNA o koncentraci 150 ng/μΐ, v technických triplikátech. Reakce probíhala v termocykleru pro real-time PCR (7900 Fast Real-Time PCR Systém, Applied Biosystems, USA) při následujícím teplotním profilu: 10 minut při 95 °C, následuje 40 cyklů skládajících se ze dvou kroků (15 sekund při 95 °C, 1 minuta při 60 °C).
-2CZ 23399 Ul
Získaný produkt byl vždy kontrolován elektroforetickou separací na 2% agarosovém gelu a byl identifikován jediný PCR produkt. Bylo analyzováno 14 příměrových párů, tři uvedené byly vybrány třemi nezávislými statistickými programy - GeNorm (Vandesompele et al. 2002), NormFínder (Andersen et al. 2004) a BestKeeper (Pfaffl et al. 2004) jako nejvhodnější a zcela postačující kombinace referenčních genů pro následné normalizace cílových genů. Tyto tři referenční geny lze využít pro normalizaci exprese genů ječmene za podmínek sucha a to zejména pri vývoji markérů odolnosti.
Průmyslová využitelnost
Kombinace sad primerů pro normalizaci exprese genů v ječmeni za působení sucha je založena na kombinaci tří referenčních genů. Lze ji využít pro normalizaci exprese genů ječmene stresovaného suchem a to zejména pri vývoji markérů odolnosti a urychlit tak proces optimalizace a normalizace pri šlechtění odrůd ječmene odolných vůči nedostatku vody.
Vysvětlivky zkratek použitých v textu:
GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;
HOGAPDH - Homologue to (Q6K5G8) putative glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (phosphorylating), complete;
EFl-alpha - (Q03033) elongation factor 1-alpha (EF-l-alpha), complete.
Použitá literatura:
Andersen CL, Jensen JL, Omtoft TF. 2004. Normalization of real-time quantitative reverse transcriptionPCR data: a model-based variance estimation approach to identity genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Research 64:5245-5250.
Faccioli P, Ciceri GP, Provero P, Stanca AM, Morcia C, Terzi V. (2007): A combined stratégy of „in silíco“ transcriptome analysis and web search engine optimization allows an agile Identification of reference genes suitable for normalization in gene expression studies, Plant Molecular Biology 63:679-688.
Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. (2004): Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper—Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology Letters 26:509-515.
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. (2002): Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometrie averaging of multiple intemal control genes. Genome Biology 3: RESEARCH0034.
Claims (3)
- NÁROKY NA OCHRANU1. Kombinace sad primerů pro normalizaci exprese genů v ječmeni za působení sucha, vyznačující se tím, že obsahuje tři sady příměrových kombinací pro současné stanovení exprese genů pro GAPDH, HOGAPDH a EFl-alpha, metodou real-time PCR, přičemž nukleotidové sekvence pro stanovení exprese genu pro GAPDH jsouPrimer F: 5 -GTTGGCAAGGTGCTCCCAGA-3'Primer R: 5 -GCTCATAGGTGGCTGGCTTG-3', pro stanovení exprese genu pro HOGAPDH jsouPrimer F: 5 -TGTCCATGCCATGACTGCAA-3'Primer R: 5 -CCAGTGCTGCTTGGAATGATG-3' a pro stanovení exprese genu pro EFl-alpha jsou-3CZ 23399 UlPrimer F: 5'-ATGATTCCCACCAAGCCCAT-3'Příměr R: 5 -ACACCAACAGCCACAGTTTGC-3'.
- 2. Sada primerů pro stanovení exprese genu pro GAPDH, vyznačující se tí obsahuje
- 5 Primer F: 5 -GTTGGCAAGGTGCTCCCAGA-3'Primer R: 5 -GCTC ATAGGTGGCTGGCTTG-3' .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ201125336U CZ23399U1 (cs) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | Kombinace sad primerů pro normalizaci exprese genů v ječmeni za působení sucha |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ201125336U CZ23399U1 (cs) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | Kombinace sad primerů pro normalizaci exprese genů v ječmeni za působení sucha |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ23399U1 true CZ23399U1 (cs) | 2012-02-13 |
Family
ID=45597804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ201125336U CZ23399U1 (cs) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | Kombinace sad primerů pro normalizaci exprese genů v ječmeni za působení sucha |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ23399U1 (cs) |
-
2011
- 2011-12-15 CZ CZ201125336U patent/CZ23399U1/cs not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tian et al. | Semen-specific miRNAs: Suitable for the distinction of infertile semen in the body fluid identification? | |
| Sirker et al. | Evaluating the forensic application of 19 target microRNAs as biomarkers in body fluid and tissue identification | |
| Chen et al. | Quantitation of microRNAs by real-time RT-qPCR | |
| Wan et al. | Selection of appropriate reference genes for gene expression studies by quantitative real-time polymerase chain reaction in cucumber | |
| Torres et al. | Selection and validation of endogenous controls for microRNA expression studies in endometrioid endometrial cancer tissues | |
| Wang et al. | Screening and confirmation of microRNA markers for forensic body fluid identification | |
| Maire et al. | Analysis of miRNA-gene expression-genomic profiles reveals complex mechanisms of microRNA deregulation in osteosarcoma | |
| Salas-Huetos et al. | Spermatozoa from patients with seminal alterations exhibit a differential micro-ribonucleic acid profile | |
| Brunet-Vega et al. | Variability in microRNA recovery from plasma: Comparison of five commercial kits | |
| Salas-Huetos et al. | New insights into the expression profile and function of micro-ribonucleic acid in human spermatozoa | |
| Feber et al. | MicroRNA prognostic signature for nodal metastases and survival in esophageal adenocarcinoma | |
| Sauer et al. | An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification | |
| Sauer et al. | An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensically relevant body fluids | |
| Zhang et al. | MicroRNAs: potential regulators involved in human anencephaly | |
| Zhang et al. | The selection of endogenous genes in human postmortem tissues | |
| Jin et al. | Reference gene selection for qPCR analysis in cineraria developing flowers | |
| Zhang et al. | Ultrasensitive detection of circular RNA by accurate recognition of the specific junction site using stem-loop primer induced double exponential amplification | |
| Wei et al. | Screening and evaluation of endogenous reference genes for miRNA expression analysis in forensic body fluid samples | |
| Wang et al. | Selection of suitable reference genes for miRNA expression normalization by qRT-PCR during flower development and different genotypes of Prunus mume | |
| Fujimoto et al. | Optimal small-molecular reference RNA for RT-qPCR-based body fluid identification | |
| Segersten et al. | The role of microRNA profiling in prognosticating progression in Ta and T1 urinary bladder cancer | |
| Zeka et al. | RT-qPCR-based quantification of small non-coding RNAs | |
| Sobue et al. | Characterization of gene expression profiling of mouse tissues obtained during the postmortem interval | |
| Han et al. | Computational identification of microRNAs in the strawberry (Fragaria× ananassa) genome sequence and validation of their precise sequences by miR-RACE | |
| CN102443638B (zh) | 一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20120213 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20151215 |