CZ20598A3 - Inhibition of cellular respiration and production of plants with male sterility - Google Patents
Inhibition of cellular respiration and production of plants with male sterility Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20598A3 CZ20598A3 CZ98205A CZ20598A CZ20598A3 CZ 20598 A3 CZ20598 A3 CZ 20598A3 CZ 98205 A CZ98205 A CZ 98205A CZ 20598 A CZ20598 A CZ 20598A CZ 20598 A3 CZ20598 A3 CZ 20598A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- plant
- cells
- tissue
- genes
- Prior art date
Links
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 title claims description 3
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 title description 9
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 67
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 40
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 24
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 101710103970 ADP,ATP carrier protein Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 101710133192 ADP,ATP carrier protein, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 claims abstract description 10
- 101100457919 Drosophila melanogaster stg gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108700021031 cdc Genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101150069072 cdc25 gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 31
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 claims description 12
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 10
- 230000003915 cell function Effects 0.000 claims description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 9
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 101150082487 MFS14 gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 101100130266 Zea mays MFS14 gene Proteins 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 description 4
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 4
- IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-methoxy-2-methylbenzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC(S(N)(=O)=O)=C(C)C=C1N IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150015935 ATP2 gene Proteins 0.000 description 4
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 101150008083 ant gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 4
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 4
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 244000025670 Eleusine indica Species 0.000 description 3
- 235000014716 Eleusine indica Nutrition 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- YFBSBLHMAWUCJB-UHFFFAOYSA-N methyl syringate Natural products COc1cc(cc(OC)c1O)C(=O)OO YFBSBLHMAWUCJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 2
- 241000208133 Nicotiana plumbaginifolia Species 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- KQNDIKOYWZTZIX-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KQNDIKOYWZTZIX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 230000009643 growth defect Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000008127 male flower development Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000829958 Homo sapiens N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010050258 Mitochondrial Uncoupling Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 description 1
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UFKPDBLKLOBMRH-XHNCKOQMSA-N Ser-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O UFKPDBLKLOBMRH-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011157 advanced composite material Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000020197 coconut milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000023409 microsporogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- LZGUHMNOBNWABZ-UHFFFAOYSA-N n-nitro-n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)N([N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 LZGUHMNOBNWABZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 101150113864 pat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000003744 tubulin modulator Substances 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Oblast techniky produkce rostlin se samčíThe field of male plant production technology
Předkládaný vynález se týká způsobu produkce rostlin se samčí sterilitou tak, že se využije gen, který se může v rostlině exprimovat a inhibuje základní buněčnou funkci, a tím poruší úplnou expresi vybraných znaků rostlin.The present invention relates to a method of producing plants with male sterility by using a gene that can be expressed in the plant and inhibits a basic cellular function, thereby disrupting the full expression of selected plant traits.
Dosavadní stav technikyCurrent state of the art
Naše mezinárodní patentová přihláška č. WO 90/08831 popisuje a nárokuje si inhibici dýchání užitím různých porušovacích genů (porušovačů) , které také nazýváme geny inaktivující pyl.Our International Patent Application No. WO 90/08831 describes and claims the inhibition of respiration using various disruptor genes (disruptors), which we also call pollen inactivating genes.
Schopnost takových inaktivujících genů působit tímto způsobem je velmi rozdílná, a proto je nutné nadále zlepšovat genové sekvence, aby bylo možné vybírat vhodné geny pro určité aplikace.The ability of such inactivating genes to act in this way is highly variable, and it is therefore necessary to continue to improve gene sequences in order to select suitable genes for certain applications.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout geny, které se použijí pro brzdění genové exprese.The object of this invention is to provide genes that are used for inhibiting gene expression.
Podle předkládaného vynálezu je poskytnut způsob brzdění (inhibice) genové exprese v cílovém rostlinném pletivu zahrnující trvale transformovanou rostlinnou buňku takového druhu, že z ní může být regenerována celá rostlina, s rekombinantním genem (t.j.rekombinantní molekulou DNA) nesoucím tkáňově nebo vývojově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového pletiva, a dále nesoucím porušovací gen kódující takový protein, který je schopen, je-li exprimován, inhibovat buněčné dýchání v cílovém pletivu, cožAccording to the present invention, there is provided a method of inhibiting (inhibiting) gene expression in a target plant tissue comprising a permanently transformed plant cell of such a kind that a whole plant can be regenerated from it, with a recombinant gene (i.e. a recombinant DNA molecule) carrying a tissue- or development-specific promoter, which functions in the cells of the target tissue, and further carrying a disruptive gene encoding such a protein that is capable, when expressed, of inhibiting cellular respiration in the target tissue, which
vede k odumření buněk. Porušovací gen je vybrán ze skupiny skládající se z genu T-urfl3, genů kódujících a- nebo βtubulin, krátké ko-suprese ve směru čtení („sense) dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a aktivátoru replikačního počátku (ROA), a krátké, ve směru čtení orientované („sense), molekuly genu translokátoru adenin nukleotidu (ANT) z vnitřní mitochondriální membrány.leads to cell death. The disruptive gene is selected from the group consisting of the T-urfl3 gene, genes encoding α- or βtubulin, a short sense co-suppression of two essential maize cell cycle genes, cdc25 and replication origin activator (ROA), and a short , in the reading direction oriented ("sense"), of the adenine nucleotide translocator (ANT) gene molecule from the inner mitochondrial membrane.
Utlumení („down-regulation) genové aktivity způsobené ko-supresí ve směru čtení („sense co-supression) je popsáno v naší mezinárodní patentové přihlášce č. WO 90/08299.Down-regulation of gene activity caused by sense co-suppression is described in our International Patent Application No. WO 90/08299.
Geny a- nebo β-tubulinu působí jako porušovače tím, že destabilizují uspořádání mikrotubulů v rostlinných buňkách, čímž ruší základní funkci mikrotubulů v cílové tkáni, což vede k odumření buněk.The α- or β-tubulin genes act as disruptors by destabilizing the microtubule arrangement in plant cells, thereby disrupting the essential microtubule function in the target tissue, leading to cell death.
Užití krátké ko-suprese ve směru čtení dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a aktivátoru replikačního počátku (ROA), porušuje buněčné dělení a vede k růstovým defektům v cílovém orgánu nebo pletivu.The use of short co-suppression in the read-through of two essential maize cell cycle genes, cdc25 and replication origin activator (ROA), disrupts cell division and leads to growth defects in the target organ or tissue.
Promotor je nejlépe promotor specifický pro prašník a/nebo tapetum nebo promotor specifický pro pyl, takže exprese porušovacího proteinu v příslušném pletivu regenerované rostliny vede k rostlině se samčí sterilitou. Výhodněji je promotor specifický pro prašník a/nebo tapetum izolován užitím sekvencí cDNA, které jsou ukázány na obrázcích 1, 2, 3, a způsoby popsanými v naší mezinárodní patentové přihlášce č. WO 90/08826.The promoter is preferably an anther- and/or tapetum-specific promoter or a pollen-specific promoter such that expression of the disrupting protein in the appropriate tissue of the regenerated plant results in a male-sterile plant. More preferably, the anther- and/or tapetum-specific promoter is isolated using the cDNA sequences shown in Figures 1, 2, 3, and the methods described in our International Patent Application No. WO 90/08826.
Plasmidové vektory obsahující sekvence DNA z obrázkůPlasmid vectors containing the DNA sequences from the images
1,2,3 jsou deponovány podle Budapešťské konvence.1,2,3 are deposited according to the Budapest Convention.
Plasmíd pMSIO v hostitelském kmeni Escherichia coli RR1 obsahující genovou sekvenci na obr. 1, byl deponován v národní kolekci průmyslových a mořských bakterií 9. ledna 1989 pod přístupovým číslem NCIB 40090.Plasmid pMSIO in the Escherichia coli RR1 host strain containing the gene sequence of Fig. 1 was deposited in the National Collection of Industrial and Marine Bacteria on January 9, 1989 under NCIB accession number 40090.
Plasmíd pMS14 v hostitelském kmeni E. coli DH5a, obsahující genovou sekvenci na obr. 2, byl deponován v národní • · • ·Plasmid pMS14 in the host strain E. coli DH5a, containing the gene sequence in Fig. 2, has been deposited in the National • · • ·
kolekci průmyslových a mořských bakterií 9. ledna 1989 pod přístupovým číslem NCIB 40099.collection of industrial and marine bacteria on 9 January 1989 under NCIB accession number 40099.
Plasmid pMS18 v hostitelském kmeni E. coli RR1, obsahující genovou sekvenci na obr. 3, byl deponován v národní kolekci průmyslových a mořských bakterií 9. ledna 1989 pod přístupovým číslem NCIB 40100.Plasmid pMS18 in the E. coli RR1 host strain, containing the gene sequence of Fig. 3, was deposited in the National Collection of Industrial and Marine Bacteria on January 9, 1989 under NCIB accession number 40100.
Izolace a charakterizace těchto genových sekvencí je plně popsána ve WO 93/01294.The isolation and characterization of these gene sequences is fully described in WO 93/01294.
Je možné použít také jiné promotory, například promotor MFS14 specifický pro tapetum.Other promoters can also be used, for example the tapetum-specific MFS14 promoter.
Předkládaný vynález také poskytuje rostlinu, která má ve svém genomu trvale inkorporovanou rekombinantní molekulu DNA nesoucí geny obsahující tkáňově specifický nebo vývojově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového pletiva, a dále nesoucí porušovací gen kódující takový protein, který je schopen, je-li exprimován, inhibovat základní buněčnou funkci jako je například dýchání, uspořádání mikrotubulů nebo buněčné dělení v buňkách cílového pletiva, což vede k odumření buněk.The present invention also provides a plant that has permanently incorporated into its genome a recombinant DNA molecule carrying genes containing a tissue-specific or developmentally specific promoter that functions in cells of a target tissue and further carrying a disruptive gene encoding such a protein that is capable, when expressed , inhibit a basic cellular function such as respiration, microtubule arrangement or cell division in the cells of the target tissue, leading to cell death.
Vynález také poskytuje rostlinu, zejména jednodšložnou rostlinu, konkrétně kukuřici, která má ve svém genomu trvale inkorporovanou rekombinantní molekulu DNA nesoucí geny obsahující tkáňově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového pletiva, a dále nesoucí porušovací gen kódující takový protein, který je schopen inhibovat základní buněčnou funkci jako je dýcháni, uspořádání mikrotubulů v buňkách cílového pletiva, což vede k odumření buněk, přičemž porušovací gen je vybrán ze skupiny skládající se z genu Turfl3, krátké, ve směru čtení orientované, molekuly genu translokátoru adenin nukleotidu (ANT), genů kódujících a- nebo β-tubulin a krátké ko-suprese ve směru čteni dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a ROA.The invention also provides a plant, in particular a monocot plant, namely corn, which has permanently incorporated into its genome a recombinant DNA molecule carrying genes containing a tissue-specific promoter that functions in the cells of the target tissue, and further carrying a disruptive gene encoding such a protein capable of inhibiting the basic cellular function such as respiration, the organization of microtubules in cells of the target tissue, leading to cell death, the offending gene being selected from the group consisting of the Turfl3 gene, a short, read-through oriented molecule, the adenine nucleotide translocator (ANT) gene, genes encoding α- or β-tubulin and short upstream co-suppression of two essential maize cell cycle genes, cdc25 and ROA.
Tyto rekombinantní geny být použity jako prostředek inhibice buněčného růstu v řadě organismů, od jednoduchých jednobuněčných ke složitým mnohobuněčným organismům, jako jsou rostliny a zvířata. Použitím tkáňově nebo buněčně specifických promotorů mohou být ve složitých organismech zaměřeny a zničeny konkrétní buňky nebo tkáně. Jedno konkrétní použití zamýšlené pro tento vynález je zničení buněk nezbytných pro vývoj samčího květu, což vede k samčí sterilitě.These recombinant genes have been used as a means of inhibiting cell growth in a variety of organisms, from simple unicellular to complex multicellular organisms such as plants and animals. Using tissue- or cell-specific promoters, specific cells or tissues can be targeted and destroyed in complex organisms. One particular use contemplated for this invention is the destruction of cells necessary for male flower development, resulting in male sterility.
Vynález tedy poskytuje způsob prevence nebo inhibice růstu a vývoje rostlinných buněk založený na rekombinantních genech, které inhibují základní buněčnou funkci jako je dýchání nebo uspořádání mikrotubulů. Technika má široké použití u velkého množství zemědělských plodin, kde se vyžaduje inhibice konkrétních buněk nebo tkáně.The invention thus provides a method of preventing or inhibiting the growth and development of plant cells based on recombinant genes that inhibit a basic cellular function such as respiration or microtubule arrangement. The technique has wide application in a large number of agricultural crops where inhibition of specific cells or tissue is required.
Obzvláštnímu zájmu se těší inhibice samčí plodnosti u kukuřice pro produkci hybridů Fl in šitu. Koncept inhibice mitochondriální funkce jako mechanismu pro samčí sterilitu pochází z určitého předběžného výzkumu cytoplasmatické samčí sterility typu T u kukuřice (cms-T), který prokázal spojení mezi samčím sterilním fenotypem a mitochondriální dysfunkcí. Ačkoliv musí být ještě určen přímý kauzální vztah mezi mitochondriální dysfunkcí a cms-T, narůstající důkazy potvrzují, že jsou nezbytné plně funkční mitochondrie, zejména v tapetálních buňkách prašníků. Toto je kritické zejména během mikrosporogeneze, protože metabolické požadavky kladené na tapetální buňky mají za následek 40-násobné zvýšení počtu mitochondrií.Of particular interest is the inhibition of male fertility in maize for the production of Fl in situ hybrids. The concept of inhibition of mitochondrial function as a mechanism for male sterility comes from some preliminary research on T-type (cms-T) cytoplasmic male sterility in maize, which demonstrated a link between the male sterile phenotype and mitochondrial dysfunction. Although a direct causal relationship between mitochondrial dysfunction and cms-T has yet to be determined, increasing evidence confirms that fully functional mitochondria are essential, particularly in anther tapetal cells. This is particularly critical during microsporogenesis, as the metabolic demands placed on the tapetal cells result in a 40-fold increase in the number of mitochondria.
Vynález poskytuje tedy řadu negativních mutací, které působí v mitochondriích tak, že inhibují dýchání. Jsou-li exprimovány specificky v prašníkovém pletivu kukuřice, mají tyto mutace za následek samčí sterilní fenotyp.Thus, the invention provides a series of negative mutations that act in the mitochondria to inhibit respiration. When expressed specifically in maize anther tissue, these mutations result in a male sterile phenotype.
K porušení buněčné funkce se používá také expresi genů anebo β-tubulinu. Během normálního buněčného života je exprese tubulinových genů regulována jejich endogenními promotory a úzce souvisí s požadavky buněk na tyto proteiny, které jsou polymerizovány a složeny do mikrotubulů během růstu a vývoje ···· 0 0 0 0 rostliny. Expresí tubulinových genů neregulovaným způsobem za použití netubulinových promotorů v konkrétním pletivu nebo stádiu vývoje je porušena rovnováha mezi volnými tubulinovými monomery a molekulami, které jsou polymerizovány v mikrotubulech, což má za následek nestabilitu komplexu mikrotubulů a buněčnou dysfunkci. Tento účinek při expresi v buňkách tapeta nebo jiných buňkách prašníku způsobí, že jsou rostliny sterilní.Expression of genes or β-tubulin is also used to disrupt cell function. During normal cell life, the expression of tubulin genes is regulated by their endogenous promoters and is closely related to the requirements of cells for these proteins, which are polymerized and folded into microtubules during plant growth and development. By expressing tubulin genes in an unregulated manner using non-tubulin promoters in a particular tissue or developmental stage, the balance between free tubulin monomers and molecules that are polymerized in microtubules is disrupted, resulting in microtubule complex instability and cellular dysfunction. This effect, when expressed in tapetum cells or other anther cells, renders plants sterile.
Navrhuje se také použití krátké ko-suprese ve směru čtení dvou základních genů buněčného cyklu, např. cdc25 a ROA, k utlumení funkce. Tento účinek při expresi v tapetu nebo jiných buňkách prašníku způsobí, že jsou rostliny sterilní.The use of short co-suppression upstream of two essential cell cycle genes, eg cdc25 and ROA, is also proposed to silence function. This effect, when expressed in the tapetum or other anther cells, renders the plants sterile.
Způsob použitý pro transformaci rostlinných buněk není pro tento vynález obzvláště podstatný a může být použita jakákoliv metoda vhodná pro cílovou rostlinu. Transgenní rostliny se získají regenerací z transformovaných buněk. Z literatury jsou známy četné transformační postupy, jako je např. infekce za použití Agrobacterium tumefaciens nebo jeho plasmidu Ti, elektroporace, mikroinjekce rostlinných buněk a protoplastů, mikroprojektilová transformace a transformace pylové láčky. Pro plné detaily známých metod se odkazuje na literaturu.The method used to transform plant cells is not particularly essential to the present invention and any method suitable for the target plant may be used. Transgenic plants are obtained by regeneration from transformed cells. Numerous transformation procedures are known from the literature, such as infection using Agrobacterium tumefaciens or its Ti plasmid, electroporation, microinjection of plant cells and protoplasts, microprojectile transformation and pollen tube transformation. Reference is made to the literature for full details of known methods.
Nyní bude popsán vývoj a testování těchto rekombinantních genů jako porušovačů mitochondriální funkce v jednobuněčném organismu, kvasince. Bude také popsán mechanismus, kterým jsou tyto rekombinantních geny použity pro inhibici růstu a diferenciace buňky v transformované rostlině postupů je použít kvasinku jako identifikaci a optimalizaci rekombinantních genů proteinů, které porušují mitochondriální funkci, rostlinné buňky transformovány vybranými rekombinantními geny a budou z nich regenerovány celé rostliny.The development and testing of these recombinant genes as disruptors of mitochondrial function in a unicellular organism, yeast, will now be described. The mechanism by which these recombinant genes are used to inhibit the growth and differentiation of the cell in the transformed plant will also be described. The procedure is to use yeast as the identification and optimization of recombinant genes for proteins that disrupt mitochondrial function, plant cells transformed with selected recombinant genes, and whole plants will be regenerated from them. .
Cílem těchto modelový systém pro pro expresi Poté budou • ·The goal of these model system for for expression Then they will • ·
Popis obrázkůDescription of the picture
nesenou plasmidem pMS18.carried by plasmid pMS18.
Obrázek 4 ukazuje sekvenci genu T-urfl3 (sekvence s identifikačním číslem 1) s primery Turf-1 (sekvence s identifikačním číslem 2) a Turf-2R (sekvence s identifikačním číslem 3), které jsou podtrženy.Figure 4 shows the sequence of the T-urfl3 gene (SEQ ID NO: 1) with primers Turf-1 (SEQ ID NO: 2) and Turf-2R (SEQ ID NO: 3) underlined.
Obrázek 5 ukazuje DNA kódující oblast 59 aminokyselin z genu ATP-2 z Nicotinia plumbaginifolia (sekvence s identifikačním číslem 4 a 5) s primery PREB-IB (sekvence s identifikačním číslem 6) a PREB-R (sekvence s identifikačním číslem 7.Figure 5 shows the DNA coding region of 59 amino acids from the ATP-2 gene of Nicotinia plumbaginifolia (SEQ ID NO: 4 and 5) with primers PREB-IB (SEQ ID NO: 6) and PREB-R (SEQ ID NO: 7.
Obrázek 6 ukazuje štěpné místo sekvence pre-β.Figure 6 shows the cleavage site of the pre-β sequence.
Obrázek 7 je mapa vektoru pCaMVI-,Ν.Figure 7 is a map of the pCaMVI-,Ν vector.
Obrázek 8 je mapa vektoru RMS17.Figure 8 is a vector map of RMS17.
Obrázek 9 je mapa vektoru pIE109.Figure 9 is a map of the pIE109 vector.
Obrázek 10 ukazuje promotorovou sekvenci MFS14 (sekvence s identifikačním číslem 8) s následujícími rysy:Figure 10 shows the promoter sequence of MFS14 (SEQ ID NO: 8) with the following features:
pozice 2198 začátek transkripce CCTACAA (souhlasný CTCATCA) pozice 2167 ATCCATT (možný motiv sekvence TATA) pozice 2141 CCAT (možný motiv sekvence CAAT) pozice 2233 začátek cDNA CACACAG pozice 2295 začátek translace GCAACAATGGCG (souhlasný TAAACAATGGCT).position 2198 start of transcription CCTACAA (consensus CTCATCA) position 2167 ATCCATT (possible TATA sequence motif) position 2141 CCAT (possible CAAT sequence motif) position 2233 start of cDNA CACACAG position 2295 start of translation GCAACAATGGCG (consensus TAAACAATGGCT).
Obrázek 11 je mapa vektoru RMS11.Figure 11 is a RMS11 vector map.
Obrázek 12 je mapa vektoru pMANT3.Figure 12 is a map of the pMANT3 vector.
Obrázek 13 ukazuje konstrukci vektorů pro transformaci kukuřičné buněčné linie.Figure 13 shows the construction of vectors for the transformation of a maize cell line.
• · • ·• · • ·
Obrázek 14 je graf ukazující počty transformovaných rostlin v různých pokusech.Figure 14 is a graph showing the numbers of transformed plants in different experiments.
Vynález bude nyní ilustrován následujícími příklady.The invention will now be illustrated by the following examples.
Příklady provedení vynálezuExamples of embodiments of the invention
Příklad 1Example 1
Sestrojení vektoru RMS17 pro transformaci kukuřiceConstruction of the RMS17 vector for maize transformation
Pro amplifikaci genu T-urfl3 z kukuřice cms-T (linieFor amplification of the T-urfl3 gene from cms-T maize (line
RW33:TMS) a mitochondriální cílové sekvence pre-β z Nicotiana plumbaginifolia se použila metoda polymerázové řetězové reakce - PCR. Vzorky DNA z rostlinného materiálu byly připraveny za použití metody popsané Edwardsem a kol. (Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1349) .RW33:TMS) and the mitochondrial target sequence of pre-β from Nicotiana plumbaginifolia, the method of polymerase chain reaction - PCR was used. DNA samples from plant material were prepared using the method described by Edwards et al. (Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1349).
Kompletní gen T-urfl3 byl amplifikován metodou PCR pomocí primerů turf-1 (5'ATCGGATCCATGATCACTACTTTCTTAAACCTTCCT-3', identifikačním číslem 2) (5'TAGTCTAGATCACGGTACTTGTACGCTATCGGT - 3', identifikačním číslem 3), které byly sekvence s a turf-2R sekvence s navrženy podle publikované sekvence (Dewey a kol., 1986, Cell, 44, 429-449). Podmínky PCR byly následující: 3 5 cyklů denaturace v 94°C po 0,8 min, nasednutí primerů v 65°C po 1 min a prodlužování řetězce v 72 °C po 2,5 min. Aby se napomohlo následnému klonování, byly primery pro PCR navrženy tak, že zavedly jedinečná restrikční místa BamHI a Xbal na 5' a 3' konce genu, v uvedeném pořadí. Pozice těchto primerů odpovídající sekvenci genu T-urfl3 je ukázána na obrázku 4.The complete T-urfl3 gene was amplified by PCR using primers turf-1 (5'ATCGGATCCATGATCACTACTTTCTTAAACCTTCCT-3', ID number 2) (5'TAGTCTAGATCACGGTACTTGTACGCTATCGGT - 3', ID number 3) and turf-2R sequence with designed by published sequence (Dewey et al., 1986, Cell, 44, 429-449). The PCR conditions were as follows: 3 5 cycles of denaturation at 94°C for 0.8 min, primer annealing at 65°C for 1 min and chain extension at 72°C for 2.5 min. To aid subsequent cloning, PCR primers were designed to introduce unique BamHI and XbaI restriction sites at the 5' and 3' ends of the gene, respectively. The position of these primers corresponding to the T-urfl3 gene sequence is shown in Figure 4.
Podobně byla amplifikována metodou PCR oblast 59 aminokyselin z genu ATP2 z Nicotiana plumbagini folia, která kóduje funkční mitochondriální cílovou sekvenci pre-β, pomocí primerů PREB-IB (5'ATCGGTACCGCCATGGCTTCTCGGAGGCTTCTCGCCT-3', • · • · · • · ·· · sekvence s identifikačním číslem 6) a PREB-R (5'ATCGGATCCCGCTGCGGAGGTAGCGTA-3', sekvence s identifikačním číslem 7) , které byly navrženy podle publikované sekvence (Boutry a kol., 1987, Nátuře, 328, 341). Podmínky pro PCR byly stejné jak je uvedeno výše, kromě teploty pro nasednutí primerů, která byla snížena na 60 °C. Aby se napomohlo následnému klonování, byly PREB-IB a PREB-2R navrženy tak, že zavedly jedinečná restrikční místa Kpnl a BamHI na 5' a 3' konce amplifikovaného fragmentu, v uvedeném pořadí. Pozice těchto primerů odpovídající genu ATP2 je ukázána na obrázku 5.Similarly, a 59 amino acid region from the Nicotiana plumbagini folia ATP2 gene, which encodes a functional mitochondrial target sequence pre-β, was amplified by PCR using the primers PREB-IB (5'ATCGGTACCGCCATGGCTTCTCGGAGGCTTTCCGCCT-3', • · • · · • · ·· · sequence with identification number 6) and PREB-R (5'ATCGGATCCCGCTGCGGAGGTAGCGTA-3', sequence with identification number 7), which were designed according to the published sequence (Boutry et al., 1987, Nature, 328, 341). PCR conditions were the same as above, except the temperature for primer annealing was reduced to 60°C. To aid subsequent cloning, PREB-IB and PREB-2R were designed by introducing unique KpnI and BamHI restriction sites at the 5' and 3' ends of the amplified fragment, respectively. The position of these primers corresponding to the ATP2 gene is shown in Figure 5.
Po amplifikaci v PCR byl fragment pre-B štěpen Kpnl aAfter PCR amplification, the pre-B fragment was digested with KpnI a
BamHI, aby vznikly kohezivní konce, a byl klonován do odpovídajících míst vektoru pUC18 za vzniku plasmidu pPBl. PCR produkt TURF13 byl štěpen BamHI a Xbal a klonován na odpovídající místa v pPBl za vzniku plasmidu pPB2. V pPB2 je sekvence pre-β fúzována s genem T-urfl3 při dodržení čtecího rámce tak, že po expresi v rostlinné buňce je celý produkt transportován do mitochondrií. Štěpení sekvence pre-β v předpovězeném místě mezi zbytky 55 a 56 uvolní protein Turfl3, který na svém NH2 konci obsahuje další 4 zbytky ze sekvence pre-β (obrázek 6).BamHI to create cohesive ends and was cloned into the corresponding sites of the pUC18 vector to generate plasmid pPB1. The TURF13 PCR product was digested with BamHI and XbaI and cloned into the corresponding sites in pPB1 to form plasmid pPB2. In pPB2, the pre-β sequence is fused to the T-urfl3 gene in frame so that upon expression in the plant cell, the entire product is transported into mitochondria. Cleavage of the pre-β sequence at the predicted site between residues 55 and 56 releases the Turf13 protein, which contains an additional 4 residues from the pre-β sequence at its NH 2 terminus (Figure 6).
Genová fúze pre^/T-urf13 v pBB2 je odstraněna štěpením enzymy Kpnl a Balí, opatřena tupými konci a klonována do plasmidu pCAMVIxN (obrázek 7) , který byl naštěpen BamHI a opatřen tupými konci za vzniku pPB3. Tento klonovací krok umístí fúzovaný gen pre^/T-urf13 pod transkripční kontrolu promotoru CAMV 35S. V tomto rekombinantním genu je přítomen intron Adhl, aby zvýšil úroveň exprese v kukuřičných buňkách (Mascarenhas et al., 1990, Plant Mol. Biol., 15, 913-920) a sekvence nos 3' poskytuje místo pro přidání polyA. Aby vznikl konečný vektor RMS17 (obrázek 8), byla zavedena selekční kazeta PAT z pIE109 (obrázek 9) jako fragment EcdRI do jedinečného místa BcoRI v pPB3, což umožňuje in vitro selekci transformovaných kukuřičných buněk na médiu s bialaphosem.The pre^/T-urf13 gene fusion in pBB2 is removed by KpnI and Bali digestion, blunt-ended, and cloned into plasmid pCAMVI x N (Figure 7), which has been digested with BamHI and blunt-ended to form pPB3. This cloning step places the pre^/T-urf13 fusion gene under the transcriptional control of the CAMV 35S promoter. In this recombinant gene, an Adhl intron is present to increase the expression level in maize cells (Mascarenhas et al., 1990, Plant Mol. Biol., 15, 913-920) and the nos 3' sequence provides a site for the addition of polyA. To create the final RMS17 vector (Figure 8), the PAT selection cassette from pIE109 (Figure 9) was introduced as an EcdRI fragment into the unique BcoRI site in pPB3, allowing in vitro selection of transformed maize cells on bialaphos medium.
• · • ·• · • ·
Příklad 2Example 2
Transformace buněk BMS kukuřice plasmidem RMS17Transformation of maize BMS cells with plasmid RMS17
Cílem tohoto pokusu bylo ukázat, že exprese rekombinantního genu prep/T-urfl3 v kukuřičných buňkách BMS pěstovaných v tkáňové kultuře vede ke snížení životaschopnosti buněk, jak bylo měřeno stanovením transgenních kalusů po transformaci. Vektor RMS17 (obrázek 8) byl do kukuřičných buněk BMS pěstovaných v tkáňové kultuře zaveden pomocí transformační techniky užívající mikrovláken karbidu křemíku. Příprava mikrovláken karbidu křemíkuThe aim of this experiment was to show that expression of the prep/T-urf13 recombinant gene in BMS maize cells grown in tissue culture results in a decrease in cell viability as measured by transgenic calli assays after transformation. The RMS17 vector (Figure 8) was introduced into BMS maize cells grown in tissue culture using a transformation technique using silicon carbide microfibers. Preparation of silicon carbide microfibers
Se suchými mikrovlákny se vždy zacházelo v digestoři, aby se předešlo vdechnutí a možnému poškození plic. Tato vlákna mohou být karcinogenní, protože mají podobné vlastnosti jako azbest. Vlákna Silar SC-9 byla poskytnuta Advanced Composite Materiál Corporation Greer, South Carolina, USA. Sterilní suspenze vláken byla připravena následujícím postupem. Přibližně 50 mg vláken bylo vloženo do předem zvážené 1,5 ml zkumavky Eppendorf, která byla uzavřena a zvážena znovu, aby se určila hmotnost vláken. Víčko zkumavky bylo proděravěno injekční jehlou a přikryto dvojitou vrstvou hliníkové folie. Zkumavka byla sterilizována v autoklávu (121°C, 15 psi, 20 minut) a usušena. Pro každý pokus se připravily čerstvé suspenze vláken, protože bylo publikováno, že úroveň transformace DNA byla vyšší při použití čerstvých roztoků než při použití roztoků starších. 5 % (hmotnost/objem) suspenze vláken byla připravena ve sterilní deionizované vodě. Seuspenze se několik sekund třepala na mikrotřepačce, aby se vlákna resuspendovala těsně před použitím.Dry microfibers were always handled in a fume hood to avoid inhalation and possible lung damage. These fibers can be carcinogenic because they have similar properties to asbestos. Silar SC-9 fibers were provided by Advanced Composite Material Corporation Greer, South Carolina, USA. A sterile suspension of fibers was prepared by the following procedure. Approximately 50 mg of fibers were placed in a preweighed 1.5 ml Eppendorf tube, which was sealed and reweighed to determine the weight of the fibers. The lid of the test tube was pierced with an injection needle and covered with a double layer of aluminum foil. The tube was autoclaved (121°C, 15 psi, 20 minutes) and dried. Fresh fiber suspensions were prepared for each experiment, as it has been reported that the level of DNA transformation was higher when fresh solutions were used than when older solutions were used. A 5% (w/v) fiber suspension was prepared in sterile deionized water. The suspension was shaken for several seconds on a microshaker to resuspend the fibers just before use.
Přenos (transformace) DNA do buněkTransfer (transformation) of DNA into cells
Všechny postupy se prováděly v digestoři s laminárním prouděním vzduchu za aseptických podmínek. DNA byla do buněk transformována následujícím postupem. Specifické modifikace této metody jsou v textu vyznačeny.All procedures were performed in a laminar air flow hood under aseptic conditions. DNA was transformed into cells using the following procedure. Specific modifications of this method are indicated in the text.
···· 0 · 00 · Β • · « 0 · · « ·· » 4 • 0 ···*···· 0 · 00 · Β • · « 0 · · « ·· » 4 • 0 ···*
0 <0 <
0 000 00
Buňky a suspenze mikrovláken byly pipetovány za použití pipetových špiček Gilson s odříznutým koncem. Do sterilní zkumavky Eppendorf se odměřilo 100 μΐ čerstvého média BMS (viz příloha 1) . K němu se přidalo 40 μΐ 5 % (hmotnost/objem) suspenze vláken a 25 μΐ (1 mg/ml) plasmidové DNA, vše bylo protřepáno na stolní mikrotřepačce (Vortex Genie 2 Scientific Industries, lne) nejvyšší rychlostí po dobu 60 s. Okamžitě po protřepání bylo přidáno 500 μΐ buněčné suspenze, tj . 250 μΐ buněk (po stočení). Zkumavka Eppendorf byla poté uzavřena víčkem a protřepána nejvyšší rychlostí po dobu 60 s ve vzpřímené pozici. Pro transformaci dalších buněčných linií byl použit stejný postup.Cells and microfiber suspensions were pipetted using cut-off Gilson pipette tips. 100 μΐ of fresh BMS medium was measured into a sterile Eppendorf tube (see Appendix 1). To this was added 40 μΐ of a 5% (w/v) fiber suspension and 25 μΐ (1 mg/ml) of plasmid DNA, all shaken on a benchtop microshaker (Vortex Genie 2 Scientific Industries, lne) at maximum speed for 60 s. Immediately after shaking, 500 μΐ of the cell suspension was added, i.e. 250 μΐ cells (after spinning). The Eppendorf tube was then capped and shaken at top speed for 60 s in an upright position. The same procedure was used to transform other cell lines.
V tomto pokuse byly zahrnuty tři kontroly. Dva pozitivní kontrolní vektory, z nichž pPG3 obsahoval samotnou selekční kazetu PAT, a RMS15, který je totožný s RMS17 kromě toho, že gen T-urfl3 je nahrazen genem mitochondriálního rozpojovacího proteinu, UCP, který nemá žádný účinek na buňky BMS pěstované v tkáňové kultuře. V obou rekombinantních genech je přítomná cílová sekvence pre-β. Negativní kontrolu, která by měla kompletně zabránit založení transgenních kalusů, poskytl RMS13, který je totožný s RMS17 kromě toho, že fúzovaný gen preP/T-urfl3 je nahrazena genem cytotoxické ribonukleázy, barnázy.Three controls were included in this experiment. Two positive control vectors, of which pPG3 contained the PAT selection cassette alone, and RMS15, which is identical to RMS17 except that the T-urfl3 gene is replaced by the mitochondrial uncoupling protein gene, UCP, which has no effect on BMS cells grown in tissue culture . A pre-β target sequence is present in both recombinant genes. A negative control that should completely prevent establishment of transgenic calli was provided by RMS13, which is identical to RMS17 except that the preP/T-urf13 fusion gene is replaced by the cytotoxic ribonuclease gene, barnase.
Průměrný počet transgenních kalusů založených v tomto pokuse je ukázán v tabulce 1.The average number of transgenic calli established in this experiment is shown in Table 1.
TABULKA 1TABLE 1
·· ΒΒ·· ΒΒ
Β Β Β ΒΒ Β Β Β
Β Β·Β • ΒΒΒΒ ΒΒ Β·Β • ΒΒΒΒ Β
Tato data ukazují, že vzhledem ke dvěma pozitivním kontrolám, pPG3 a RMS15, vede exprese fúzovaného genu prep/Turfl3 k významnému snížení (p < 5 % nebo lépe) v zakládání transgenních kalusů. Toto naznačuje, že protein T-urfl3 zacílený na mitochondrie, má na buňky škodlivý účinek, pravděpodobně díky zhoršení mitochondriální funkce. Exprese cytotoxické ribonukleázy, barnázy, kompletně ruší založení transformovaných kalusů.These data show that, relative to the two positive controls, pPG3 and RMS15, expression of the prep/Turf13 fusion gene results in a significant reduction (p < 5% or better) in the establishment of transgenic calli. This suggests that the mitochondria-targeted protein T-urf13 has a deleterious effect on cells, possibly through impairment of mitochondrial function. Expression of the cytotoxic ribonuclease, barnase, completely abrogates the establishment of transformed calli.
Příklad 3Example 3
Sestrojení vektoru RMS11 pro transformaci kukuřiceConstruction of the RMS11 vector for maize transformation
RMS11 je transformační vektor, ve kterém je exprese fúzovaného genu pre-P/T-urf13 řízena promotorem z kukuřičného tapeta MFS14. Sekvence promotoru MFS14 a nepřekládané zaváděcí oblasti od pozice -2198 do +97 je ukázána na obrázku 10. Tímto způsobem je exprese proteinu T-urfl3 omezena na buňky tvořící pyl a není v celé rostlině.RMS11 is a transformation vector in which the expression of the pre-P/T-urf13 fusion gene is driven by the promoter from the maize tapetum MFS14. The sequence of the MFS14 promoter and the untranslated insertion region from position -2198 to +97 is shown in Figure 10. In this way, expression of the T-urf13 protein is restricted to the pollen-forming cells and not throughout the plant.
Aby se sestrojil RMS11, byl fragment Kpnl-Sall z pPB2 obsahující fúzovaný gen pre-p/T-urf13 opatřen tupými konci a vložen do tupě zakončeného místa BamHI plasmidu pSC9 za vzniku pPB4 . V pPB4 je fúzovaný gen pre-P/T-urf13 nyní umístěn mezi pozicemi -152 až +97 promotorového fragmentu a 3' polyadenylační sekvencí nos. Tato kompletní kazeta byla z pPB4 odstraněna štěpením Sad a FcoRI a klonována do odpovídajících míst pSC7 za vzniku plasmidu pB5. pSC7 obsahuje oblast pozic -153 až -5800 promotoru MFS14, takže vložení fragmentu SacI-EcoRI z pPB4 obnoví plný promotor MFS14 o délceTo construct RMS11, the KpnI-Sall fragment from pPB2 containing the pre-p/T-urf13 fusion gene was blunt-ended and inserted into the blunt-ended BamHI site of plasmid pSC9 to generate pPB4. In pPB4, the pre-P/T-urf13 fusion gene is now located between positions -152 to +97 of the promoter fragment and the 3' polyadenylation sequence nos. This complete cassette was removed from pPB4 by Sad and FcoRI digestion and cloned into the corresponding sites of pSC7 to form plasmid pB5. pSC7 contains the -153 to -5800 region of the MFS14 promoter, so insertion of the SacI-EcoRI fragment from pPB4 restores the full-length MFS14 promoter
5,8 kb.5.8 kb
RMS11 (obrázek 11) byl dokončen vložením in vitro selekční kazety PAT z plE109 do jedinečného místa EcoRI plasmidu pPB5.RMS11 (Figure 11) was completed by inserting the in vitro PAT selection cassette from plE109 into the unique EcoRI site of plasmid pPB5.
• ·• ·
Příklad 4Example 4
Transformace buněk kukuřice vektorem RMS11 metodou bombardování mikročásticemi, která vede ke vzniku trvale transformovaných rostlin se samčí sterilitouTransformation of maize cells with the RMS11 vector by the microparticle bombardment method resulting in permanently transformed plants with male sterility
K transformování regenerovatelné buněčné kultury kukuřice metodou bombardování mikročásticemi byl použit vektor RMS11. Rostlinný materiálThe RMS11 vector was used to transform a regenerable maize cell culture by microparticle bombardment. Plant material
Embryogenní drobivý kalus typu II byl indukován z nezralých zygotických embryí vyjmutých z rostlin A188, buď pěstovaných ve skleníku nebo na poli, a to 10 až 12 dní po opylení pylem z inbrední linie B73. Médium použité pro indukci a udržování kalusu bylo založeno na médiu typu N6 podle Armstronga a Greena. Médium obsahovalo 6 mM L-prolin, 2 % (hmotnost/objem) sacharózu, 2 mg/1 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinu (2,4-D) a 3 % (hmotnost/objem) Gelrit (Obchodní značka, Caroline Biological Supply), a mělo hodnotu pH 6,0. Kalus byl pěstován 4 týdny před tím, než byla indukována suspenzní kultura. Suspenzní kultura byla indukována v tekutém médiu typu MS obsahujícím 100 mg/1 myoinositolu, 2 mg/1 2,4-D, 2 mg/1 1-naftalenoctové kyseliny (NAA), 6 mM L-prolin, 200 ml/1 hydrolyzátu kaseinu (Difco Laboratories), 3 % (hmotnost/objem) sacharózu a 5 % (objemových) kokosového mléka (Difco Laboratories), a mělo hodnotu pH 6,0. Buněčné suspenze byly udržovány v médiu ve 125 ml Erlemeyerových baňkách při teplotě 28 °C ve tmě na třepačce s rychlostí 125 rpm. Suspenze byly každého 3,5 dne pasážovány tak, že bylo odebráno 3 ml (po stočení) buněk a 10 ml starého média a přeneseno do 20 ml čerstvého kultivačního média. Suspenzní kultury byly v době, kdy byly použity pro bombardování, staré 6 měsíců až 1 rok. V některých transformacích byly použity suspenzní kultury předtím uchowávané kryoprezervací a obnovené.Embryogenic friable callus type II was induced from immature zygotic embryos removed from A188 plants, either grown in the greenhouse or in the field, 10 to 12 days after pollination with pollen from the inbred line B73. The medium used for callus induction and maintenance was based on Armstrong and Green type N6 medium. The medium contained 6 mM L-proline, 2% (w/v) sucrose, 2 mg/l 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and 3% (w/v) Gelrit (Trademark, Caroline Biological Supply ), and had a pH value of 6.0. The callus was grown for 4 weeks before the suspension culture was induced. Suspension culture was induced in liquid MS-type medium containing 100 mg/l myoinositol, 2 mg/l 2,4-D, 2 mg/l 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 6 mM L-proline, 200 ml/l casein hydrolyzate (Difco Laboratories), 3% (w/v) sucrose, and 5% (v/v) coconut milk (Difco Laboratories), and had a pH value of 6.0. Cell suspensions were maintained in medium in 125 mL Erlemeyer flasks at 28°C in the dark on a 125 rpm shaker. Suspensions were passaged every 3.5 days by removing 3 ml (after spinning) of cells and 10 ml of old medium and transferring to 20 ml of fresh culture medium. The suspension cultures were 6 months to 1 year old at the time they were used for bombardment. In some transformations suspension cultures previously cryopreserved and reconstituted were used.
Bombardování mikročásticemi • ·Microparticle Bombardment • ·
Buněčné suspenze byly přefiltrovány přes 1,0 mm a pak 0,5 mm sítko. Buňky o celkovém objemu 0,2 ml (po stočení), které prošly sítkem, byly resuspendovány v 5 ml média a rovnoměrně naneseny na disk filtračního papíru Whatman 4 pomocí vakuové filtrace v mikroanalytickém Precipitace plasmidové DNA wolframové mikročástice, a držáku o průměru v nadšroubovicové poté bombardováníCell suspensions were filtered through a 1.0 mm and then a 0.5 mm sieve. Cells of a total volume of 0.2 ml (after vortexing) that had passed through the sieve were resuspended in 5 ml of medium and uniformly spread on a disc of Whatman 4 filter paper by vacuum filtration in a microanalytical Precipitation of plasmid DNA tungsten microparticle, and a diameter holder in a superhelical then bombing
4,7 cm. formě na použitím přístroje PDS-100 Biolistics (Obchodní značka, DuPont) byly provedeny v podstatě tak, jak popisuje výrobce. Cílové destičky byly bombardovány jednou.4.7 cm. form using the PDS-100 Biolistics (Trademark, DuPont) instrument was performed essentially as described by the manufacturer. Target tiles have been bombarded once.
Selekce transformovaných buněk a regenerace rostlinSelection of transformed cells and regeneration of plants
Každý disk filtračního papíru s buňkami byl po bombardování přenesen na médium typu N6 obsahující 100 mg/1 myoinositolu, 2 mg/1 2,4-D, 3 % (hmotnost/objem) sacharózu a 0,3 % (hmotnost/objem) Gelrit, a mělo pH 6,0. Pro selekci byl využit gen NPTII, a proto bylo médium doplněno kanamycin sulfátem v koncentraci 200 mg/1. Disky byly přeneseny na čerstvé médium se selekčním činidlem po 7 dnech, a pak opět po 14 dnech. Suspense pak byla rozdělena na 2 stejné části a každá byla přenesena na Petriho misku 100x20 mm s 20 ml pevného média obsahujícího selekční činidlo a 3 % Gelrit (hmotnost/objem). Po 2 až 5 týdnech byly rychle rostoucí, a tedy pravděpodobně transformované, kalusy přemístěny na čerstvé selektivní médium. Rostliny byly z kalusu regenerovány tím, že se kalusy přesadily na médium typu MS obsahující 1 g/1 myoinositolu, 1 mg/1 NAA, 6 % (hmotnost/objem) sacharózu a 3 % (hmotnost/objem) Gelrit, mělo pH 6,0. Po dalších 2 až 3 týdnech byly kalusy přesazeny na MS médium obsahující 0,25 mg/1 NAA a 3 % (hmotnost/objem) sacharózu a přemístěny na světlo, kde se začalo objevovat klíčení embryí. Poté byly rostlinky pěstovány na médiu typu MS poloviční koncentrace obsahujícím 500 mg/1 myoinositolu, 3 % (hmotnost/objem) sacharózu a 0,3 % Gelrit a mělo pH 6,0 a to po dobu 1 až 2 týdnů před tím, než byly přesazeny do skleníku.After bombardment, each filter paper disk with cells was transferred to N6 medium containing 100 mg/1 myoinositol, 2 mg/1 2,4-D, 3% (w/v) sucrose, and 0.3% (w/v) Gelrit , and had a pH of 6.0. The NPTII gene was used for selection, and therefore the medium was supplemented with kanamycin sulfate at a concentration of 200 mg/1. Discs were transferred to fresh medium with selection reagent after 7 days, and then again after 14 days. The suspension was then divided into 2 equal portions and each was transferred to a 100x20 mm petri dish with 20 ml of solid medium containing the selection agent and 3% Gelrit (w/v). After 2 to 5 weeks, rapidly growing, and thus presumably transformed, calli were transferred to fresh selective medium. Plants were regenerated from callus by transplanting calli onto MS-type medium containing 1 g/l myoinositol, 1 mg/l NAA, 6% (w/v) sucrose, and 3% (w/v) Gelrit, pH 6, 0. After another 2 to 3 weeks, the calli were transplanted onto MS medium containing 0.25 mg/1 NAA and 3% (w/v) sucrose and transferred to light, where embryo germination began to occur. Plants were then grown on half-strength MS medium containing 500 mg/l myoinositol, 3% (w/v) sucrose, and 0.3% Gelrit at pH 6.0 for 1 to 2 weeks before being transplanted into the greenhouse.
• · • ·• · • ·
Po přesazení do skleníku byla každá rostlina z nezávisle transformovaného klonu testována na přítomnost rekombinantního genu MFS14/pre-B/T-urf13 pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) . DNA byly izolována z malých kousků listového pletiva metodou dle Edwardse et al. , (1991, Nucleic Acid Research 19, 1349) . Tato DNA pak byla užita v PCR s oligonukleotidovými primery 14-SA (5'-AGACGCTGAGCTCAAGGACGTGA-3', sekvence s identifikačním číslem 9) a turf-2R (viz příklad 1).After transplanting to the greenhouse, each plant from an independently transformed clone was tested for the presence of the recombinant MFS14/pre-B/T-urf13 gene by polymerase chain reaction (PCR). DNA was isolated from small pieces of leaf tissue by the method of Edwards et al. , (1991, Nucleic Acids Research 19, 1349). This DNA was then used in PCR with oligonucleotide primers 14-SA (5'-AGACGCTGAGCTCAAGGACGTGA-3', SEQ ID NO: 9) and turf-2R (see Example 1).
V době kvetu byly rostliny z každého nezávisle transformovaného klonu vizuálně hodnoceny ve skleníku podle stupnice vyvinuté pro hodnocení linií se samčí sterilitou (viz tabulka 2) . Rostliny hodnocené stupněm 4 a níže jsou funkčně sterilní. Hodnocení nezávislých klonů pozitivních v PCR jako kumulativní skóre je ukázáno v tabulce 3 a porovnáno s linií kukuřice, která vznikla transformací bombardováním plasmidem RMS11, ale byla v PCR negativní.At flowering, plants from each independently transformed clone were visually scored in the greenhouse according to a scale developed for scoring male-sterility lines (see Table 2). Plants rated grade 4 and below are functionally sterile. The evaluation of independent PCR-positive clones as a cumulative score is shown in Table 3 and compared to a maize line that was generated by RMS11 plasmid bombardment transformation but was PCR-negative.
Sterilní rostliny byly zpětně kříženy pylem z fertilních netransgenních rostlin BE70. Semena vzniklá jedním takovým křížením (klon YK23, rostliny 5xBE70) byla vyseta ve skleníku a rostliny ponechány do květu. Přítomnost rekombinantní molekuly MFS14/pre-B/T-urf13 byla vyhodnocena pomocí PCR a testem PAT (který hodnotí přítomnost selektovatelného markéru použitého při transformaci). Hodnocení fertility těcto rostlin ukazuje tabulka 4. Nežádoucí, v PCR negativní rostliny, byly ze skleníku odstraněny ještě před kvetením. Rostliny 1 a 2 měly nejednoznačný výsledek PCR testu a byly ponechány ve skleníku až do kvetení. Rostlina 12 byla udržována jako kontrola. Jak je vidět v tabulce 4, 6 rostlin z potomstva bylo sterilních, a tato sterilita korelovala s přítomností vneseného transgenu, jak bylo potvrzeno testem PCR a PAT. To je v souladu s přítomností jediného transgenního lokusu zodpovědného za sterilitu.Sterile plants were backcrossed with pollen from fertile non-transgenic BE70 plants. The seeds resulting from one such cross (clone YK23, 5xBE70 plants) were sown in the greenhouse and the plants were allowed to flower. The presence of the recombinant MFS14/pre-B/T-urf13 molecule was assessed by PCR and the PAT assay (which assesses the presence of a selectable marker used in transformation). The evaluation of the fertility of these plants is shown in Table 4. Undesirable, PCR-negative plants were removed from the greenhouse before flowering. Plants 1 and 2 had an equivocal PCR test result and were left in the greenhouse until flowering. Plant 12 was maintained as a control. As seen in Table 4, 6 of the progeny plants were sterile, and this sterility correlated with the presence of the introduced transgene as confirmed by PCR and PAT. This is consistent with the presence of a single transgenic locus responsible for sterility.
TABULKA 2TABLE 2
Klasifikace prašníků (podle L.M. Josephsona)Classification of anthers (according to L.M. Josephson)
Rostliny kukuřice spadající do třídy 4 a 5 byly považovány za fertilní.Maize plants falling into class 4 and 5 were considered fertile.
TABULKA 3TABLE 3
TABULKA 4TABLE 4
Přiklad 5Example 5
Konstrukce vektoru pRMS-23 pro transformaci kukuřiceConstruction of pRMS-23 vector for maize transformation
Zkoušelo se, zda exprese, souhlasně se směrem čtení, krátké rekombinantní molekuly DNA odvozené z genu pro adenin nukleotid translokátor (ANT) kukuřice vede k poruše růstu buněk kukuřice. Fragment z kukuřičného genu ANT byl izolován metodou PCR a oligonukleotidových primerů navržených podle sekvence kukuřičného genu, který publikoval Bathgate et al. (1989, Eur. J. Biochem., 83, 303-310).It was tested whether expression, upstream of a short recombinant DNA molecule derived from the maize adenine nucleotide translocator (ANT) gene, resulted in impaired growth of maize cells. A fragment from the maize ANT gene was isolated by PCR and oligonucleotide primers designed according to the sequence of the maize gene published by Bathgate et al. (1989, Eur. J. Biochem., 83, 303-310).
Fragment genu ANT byl amplifikován pomocí primerů MANT-1 (5'-ATGCCCGGGCTTGCAATGTCTGTTAGCGGTGGCATCA-3', sekvence s identifikačním číslem 10) a MANT-2RB (5'ATGCCCGGGCGATGGGGTAAGATGCAAGACCA-3', sekvence s identifikačním číslem 11). Podmínky pro PCR byly: 35 cyklů složených z denaturace při 94 °C po 0,8 min, nasednutí primerů při 65 °C po 1 min a prodlužování řetězce při 72 °C po 2,5 min. Kvůli usnadnění klonování byly primery pro PCR navrženy tak, že vnesly jedinečné restrikční místo Smál na 5' i 3' konec klonovaného genu. Sekvence kukuřičného genu ANT byla publikována v Eur. J. Biochem. (1989) 183, 303-310. Sekvence primeru MANT-1 odpovídá sekvenci ze začátku kódující sekvence genu a sekvence MANT-2R leží blízko konce genu.The ANT gene fragment was amplified using primers MANT-1 (5'-ATGCCCGGGCTTGCAATGTCTGTTAGCGGTGGCATCA-3', SEQ ID NO: 10) and MANT-2RB (5'ATGCCCGGGCGATGGGGTAAGATGCAAGACCA-3', SEQ ID NO: 11). PCR conditions were: 35 cycles consisting of denaturation at 94°C for 0.8 min, primer annealing at 65°C for 1 min and extension at 72°C for 2.5 min. To facilitate cloning, PCR primers were designed to introduce a unique Smα1 restriction site at both the 5' and 3' ends of the cloned gene. The sequence of the maize ANT gene was published in Eur. J. Biochem. (1989) 183, 303-310. The MANT-1 primer sequence corresponds to the sequence at the beginning of the coding sequence of the gene, and the MANT-2R sequence lies near the end of the gene.
Po proběhnutí PCR, ve které vznikl fragment DNA očekávané velikosti 1050 bp, byla DNA naštěpena Smál a fragment byl subklonován do místa Smál plasmidu pUC18, čímž vznikl plasmid pojmenovaný pMANTl. Následovalo zavedení fragmentu SacI-EcoRI polyadenylační signální sekvence ze 3' konce genu nos do 3' konce klonovaného genu ANT, a tak vznikl plasmid pMANT2. Dále byl vložen fragment HindiII-BamHI nesoucí 35s promotor CaMV a intron ADH1 z pCaMVIJSI (obr. 5) do příslušných míst pMANT2, a tím vznikl pMANT3. Konstrukce pRMS-23 (obr.12) byla ukončena vložením genové kazety PAT z plasmidu pIE109 (obr.7), umožňující in vitro selekci, do jedinečného místa EcoRI plasmidu pMANT3.After PCR, which produced a DNA fragment of the expected size of 1050 bp, the DNA was cleaved with Smal and the fragment was subcloned into the Smal site of plasmid pUC18, resulting in a plasmid named pMANT1. This was followed by the introduction of a fragment of the SacI-EcoRI polyadenylation signal sequence from the 3' end of the nos gene into the 3' end of the cloned ANT gene, and thus plasmid pMANT2 was created. Next, a HindiII-BamHI fragment carrying the 35s CaMV promoter and the ADH1 intron from pCaMVIJSI (Fig. 5) was inserted into the respective sites of pMANT2, resulting in pMANT3. The construction of pRMS-23 (Fig. 12) was completed by inserting the PAT gene cassette from plasmid pIE109 (Fig. 7), enabling in vitro selection, into the unique EcoRI site of plasmid pMANT3.
Příklad 6Example 6
Transformování buněk BMS z kukuřice plasmidem pRMS-23Transformation of maize BMS cells with plasmid pRMS-23
Cílem tohoto pokusu bylo ukázat, že exprese plasmidu pRMS-23 v kultivovaných buňkách BMS kukuřice snižuje životaschopnost buněk, měřenou jako schopnost zakládat transgenní kalusy jako důsledek transformace. Vektorové DNA byly vneseny do buněk BMS v buněčné kultuře technikou, která pro transformaci využívá vláken karbidu křemíku, jak je popsáno v příkladu 2.The aim of this experiment was to show that expression of plasmid pRMS-23 in cultured maize BMS cells reduces cell viability, measured as the ability to establish transgenic calli as a consequence of transformation. Vector DNAs were introduced into BMS cells in cell culture by a technique that uses silicon carbide filaments for transformation as described in Example 2.
Po transformaci plasmidem pRMS-23 byl stanoven průměrný počet transgenních kalusů relativně vzhledem k pozitivní kontrole transformované pPG3, která obsahovala samotnou in vitro selekční genovou kazetu (tab. 5). Data v tabulce • · ukazují, že exprese krátkého úseku genu translokátoru adenin nukleotidu významně snižuje vznik transgenních kalusů.After transformation with plasmid pRMS-23, the average number of transgenic calli was determined relative to the positive control transformed pPG3, which contained the in vitro selection gene cassette itself (Table 5). The data in Table • · show that the expression of a short segment of the adenine nucleotide translocator gene significantly reduces the formation of transgenic calli.
TABULKA 5TABLE 5
Příklad 7Example 7
Konstrukce vektorů pTBR a pTBS pro transformování kukuřiceConstruction of pTBR and pTBS vectors for maize transformation
Zkoušelo se, zda neregulovaná exprese genu a-tubulinu povede k poruchám růstu buněk kukuřice. Byly připraveny dva rekombinantní geny, obsahující cDNA kódující α-tubulin ze dvou biotypů Eleusine indica. Plasmid pTBR (obr.13) obsahuje cDNA pro α-tubulin z biotypu Eleusine indica rezistentního k dinitroanilinu, který byl klonován jako Hinfl fragment s tupými konci do pCaMVIxN s tupými konci štěpeného BamHI (obr.7). pTBS (obr. 13) obsahuje cDNA pro α-tubulin z citlivého biotypu, který byl klonován stejně jako v případě popsaném pro pTBR.It was tested whether unregulated expression of the α-tubulin gene would lead to growth defects in maize cells. Two recombinant genes containing cDNA encoding α-tubulin from two biotypes of Eleusine indica were prepared. Plasmid pTBR (Fig. 13) contains the cDNA for α-tubulin from the dinitroaniline-resistant Eleusine indica biotype, which was cloned as a blunt-ended Hinfl fragment into pCaMVI x N blunt-ended BamHI digested (Fig. 7). pTBS (Fig. 13) contains the cDNA for α-tubulin from a susceptible biotype, which was cloned in the same way as described for pTBR.
Příklad 8Example 8
Transformace buněk BMS kukuřice vektory pTBR a pTBSTransformation of maize BMS cells with pTBR and pTBS vectors
Cílem pokusu bylo ukázat, že exprese pTBR a pTBS v kultivovaných buňkách BMS kukuřice vede ke snížení životaschopnosti buněk vyjádřené jako schopnost zakládat po • » transformaci transgenní kalusy. Vektorové DNA byly vneseny do buněk BMS v buněčné kultuře technikou, která pro transformaci využívá vláken karbidu křemíku, jak je popsáno v příkladu 2.The aim of the experiment was to show that the expression of pTBR and pTBS in cultured maize BMS cells leads to a decrease in cell viability expressed as the ability to establish a transgenic callus after • » transformation. Vector DNAs were introduced into BMS cells in cell culture by a technique that uses silicon carbide filaments for transformation as described in Example 2.
Po transformaci vektory pTBR a pTBS byl stanoven průměrný počet transgenních kalusů relativně vzhledem k pozitivní kontrole transformované pPG3, která obsahovala samotnou in vitro selekční genovou kazetu (obr. 14). Data v tabulce ukazují, že neregulovaná exprese genu pro α-tubulin z obou biotypů Eleusine indica významně snižuje vznik transgenních kalusů.After transformation with pTBR and pTBS vectors, the average number of transgenic calli was determined relative to the positive control transformed pPG3, which contained the in vitro selection gene cassette alone (Fig. 14). The data in the table show that unregulated expression of the α-tubulin gene from both biotypes of Eleusine indica significantly reduces the formation of transgenic calli.
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Předkládaný vynález se týká způsobu produkce rostlin se samčí sterilitou tak, že se využije gen, který se může v rostlině exprimovat a inhibuje základní buněčnou funkci, a tím poruší úplnou expresi vybraných znaků rostlin. Vynález poskytuje způsob inhibice růstu a vývoje rostlinných buněk založený na rekombinantních genech, jejichž exprese vede k inhibici základní buněčné funkce jako je dýchání nebo uspořádání mikrotubulů. Konkrétní použití zamýšlené pro tento vynález je zničení buněk nezbytných pro vývoj samčího květu, což vede k samčí sterilitě. Technika má široké použití u velkého množství zemědělských plodin, kde se vyžaduje inhibice konkrétních buněk nebo pletiva.The present invention relates to a method of producing plants with male sterility by using a gene that can be expressed in the plant and inhibits a basic cellular function, thereby disrupting the full expression of selected plant traits. The invention provides a method of inhibiting the growth and development of plant cells based on recombinant genes, the expression of which leads to the inhibition of a basic cellular function such as respiration or the arrangement of microtubules. A particular use contemplated for this invention is the destruction of cells necessary for male flower development, resulting in male sterility. The technique has wide application in a large number of agricultural crops where inhibition of specific cells or tissue is required.
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:LIST OF SEQUENCES (2) INFORMATION FOR SEQUENCE ID 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 357 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:(A) LENGTH: 357 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRAND TYPE: double (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomic) (vii) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISMUS: T-urfl3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:(A) ORGANISM: T-urfl3 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:(2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:(A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FILAMENT TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (vii) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISMUS: Turf-1 primer • · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:(A) ORGANISM: Turf-1 primer • · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
ATCGGATCCA TGATCACTAC TTTCTTAAAC CTTCCT 36 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:ATCGGATCCA TGATCACTAC TTTCTTAAAC CTTCCT 36 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:(A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FILAMENT TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (vii) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISMUS: Turf-2R primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:(A) ORGANISM: Turf-2R primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
TAGTCTAGAT CACGGTACTT GTACGCTATC GGT 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:TAGTCTAGAT CACGGTACTT GTACGCTATC GGT 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 269 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:(A) LENGTH: 269 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRAND TYPE: double (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomic) (vii) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISMUS: gen ATP-2 z Nicotinia plumbaginifolia (ix) ZNAKY:(A) ORGANISM: ATP-2 gene from Nicotinia plumbaginifolia (ix) CHARACTERISTICS:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (3) POZICE: 1...267 (D) DALŠÍ INFORMACE: /startovací kodon = 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:(A) NAME/DESIGNATION: CDS (3) POSITION: 1...267 (D) ADDITIONAL INFORMATION: /start codon = 1 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
·· ·· ·· ·· » · · · » · ·· • · · · · ♦ · ··· ·· ·· ·· » · · · » · ·· • · · · · ♦ · ·
ATC GG IleATC GG Ile
Ser Glu Pro Ser Gly Lys Ile Thr 75 80Ser Glu Pro Ser Gly Lys Ile Thr 75 80
269 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:269 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 89 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:(A) LENGTH: 89 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE ID NO. 5:
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:(A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FILAMENT TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (vii) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISMUS: PREB-IB primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:(A) ORGANISM: PREB-IB primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
ATCGGTACCG CCATGGCTTC TCGGAGGCTT CTCGCCT 37 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:ATCGGTACCG CCATGGCTTC TCGGAGGCTT CTCGCCT 37 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA(A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FILAMENT TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA
(vii) PŮVODNÍ ZDROJ:(vii) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISMUS: PREB-2R primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:(A) ORGANISM: PREB-2R primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
ATCGGATCCC GCTGCGGAGG TAGCGTA 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:ATCGGATCCC GCTGCGGAGG TAGCGTA 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
···· ········ ····
ACATTTCCCC AACGGAGTCG CCAAAAAGTG TGTTGGCGCC GATCCAGGCG CGAAACACTG 1260ACATTTCCCC AACGGAGTCG CCAAAAGTG TGTTGGCGCC GATCCAGGCG CGAAACACTG 1260
GAGATGGACC GTTTGGCGGT GTTCTCCGGG TGAGGACGGT CCGCGACCTG GGTCCAGCAG 1320GAGATGGACC GTTTGGCGGT GTTCTCCGGG TGAGGACGGT CCGCGACCTG GGTCCAGCAG 1320
CGACTCTCCT CTACGTGTGT CCGGACGGTC CGTCGTCTGG GGCTCGGACG GTCGCGATGG 1380CGACTCTCCT CTACGTGTGT CCGGACGGTC CGTCGTCTGG GGCTCGGACG GTCGCGATGG 1380
CGCAGAGGGT CTTCTTCTTC GCAGCCGACC TAGATCTCGC CTCCCGGGAG GGACCGTCGG 1440CGCAGAGGGT CTTCTTCTTC GCAGCCGACC TAGATCTCGC CTCCCGGGAG GGACCGTCGG 1440
GGAGGAGAGA TTGTAGGGTG TGTCTTGGCG TCGACAGGCC ACACAATACG CCTCTAGTCG 1500GGAGGAGAGA TTGTAGGGTG TGTCTTGGCG TCGACAGGCC ACACAATACG CCTCTAGTCG 1500
ACGTAGAGCC GAAGAGAGGT GAAGGATTGA GGTAGAAGGA GGCTAAACTT GGGCTAAACT 1560ACGTAGAGCC GAAGAGAGGT GAAGGATTGA GGTAGAAAGGA GGCTAAACTT GGGCTAAACT 1560
AGAACTACTG CTAATGCATA AGGTAAAAAC GAGAAGTGGA CTTCATTTGA TCGATTGTGG 1620AGAACTACTG CTAATGCATA AGGTAAAAAC GAGAAGTGGA CTTCATTTGA TCGATTGTGG 1620
AAGTAATCTG ACTGTAGCCC TTTATCTATA TAAAGGGGAG GTATGGACCC GTTACAAGCC 1680AAGTAATCTG ACTGTAGCCC TTTATCTATA TAAAGGGGAG GTATGGACCC GTTACAAGCC 1680
GTTTTCCGAG CTAATCTCAC GGTTTTAGTT AATAAATCCT GCGAGAAACT CGGAACTCTA 1740GTTTTCCGAG CTAATCTCAC GGTTTTAGTT AATAAATCCT GCGAGAAACT CGGAACTCTA 1740
ACTGATTCTA CTCATGCGCG AACCATTCGT GCGCCACCGC TGCCCGTCCC GCGATCGCTC 1800ACTGATTCTA CTCATGCGCG AACCATTCGT GCGCCACCGC TGCCCGTCCC GCGATCGCTC 1800
AGTTAACCCT GTGTTGTGCG CTGTGATTTG GTGGCATATA AAACCACATT TGCAATAAAA 1860AGTTAACCCT GTGTTGTGCG CTGTGATTTG GTGGCATATA AAACCACATT TGCAATAAAA 1860
ATTTGTAGGG ATTTAACATA CCAAGTGCTG CGAAAGGAAT CGTTTTCGGA GGACCCAAAA 1920ATTTGTAGGG ATTTAACATA CCAAGTGCTG CGAAAGGAAT CGTTTTCGGA GGACCCAAAA 1920
TTAAAGAGGC AGATGCTAGA GCTCGTCCAG CTCAGCGCTG AGCACCTGTG TTGTCTTCCT 1980TTAAAGAGGC AGATGCTAGA GCTCGTCCAG CTCAGCGCTG AGCACCTGTG TTGTCTTCCT 1980
CGTCCACGCC GGCGGAGATG AACGGCAACA AAGGCGGAAA GGCCGAGACG CTGAGCTCAA 2040CGTCCACGCC GGCGGAGATG AACGGCAACA AAGGCGGAAA GGCCGAGACG CTGAGCTCAA 2040
GGACGTGACA CCGCGCGTAC CTCGCGTTCA GTTGGCTCAC ACAACAGCAG CTCGCTCGCC 2100GGACGTGACA CCGCGCGTAC CTCGCGTTCA GTTGGCTCAC ACAACAGCAG CTCGCTCGCC 2100
CCAAGC7CCC GCGTCCTGAT CCGTAGGTGA GCCATGCAAA GGTCGCCGCG CGCCCTGATC 2160CCAAGC7CCC GCGTCCTGAT CCGTAGGTGA GCCATGCAAA GGTCGCCGCG CGCCCTGATC 2160
CATTGCACCC TTCAAAGCTC GAACCTACAA ATAGCGTGCA CCAGGCATCC TGGCCACACC 2220CATTGCACCC TTCAAAGCTC GAACCTACAA ATAGCGTGCA CCAGGCATCC TGGCCACACC 2220
CACACAGCAA GCCAGCAGAG CAGAAAGCAG CCGCAGCCCC AGCCCCCACA AAGACGAAGG 2280CACACAGCAA GCCAGCAGAG CAGAAAGCAG CCGCAGCCCC AGCCCCCACA AAGACGAAGG 2280
CAACA 2285 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:CAACA 2285 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:(A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FILAMENT TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (vii) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISMUS: 14-SA primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:(A) ORGANISM: 14-SA primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:
AGACGCTGAG CTCAAGGACG TGA 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:AGACGCTGAG CTCAAGGACG TGA 23 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární(A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FILAMENT TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear
ATGCCCGGGC TTGCAATGTC TGTTAGCGGT GGCATCA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:ATGCCCGGGC TTGCAATGTC TGTTAGCGGT GGCATCA (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:(A) LENGTH: 32 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FILAMENT TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (vii) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISMUS: MANT-2RB primer (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:(A) ORGANISM: MANT-2RB primer (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:
ATGCCCGGGC GATGGGGTAA GATGCAAGAC CA ty ΙοΓ-IŠATGCCCGGGC GATGGGGTAA GATGCAAGAC CA you ΙοΓ-IŠ
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9515161.9A GB9515161D0 (en) | 1995-07-24 | 1995-07-24 | Production of male sterile plants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20598A3 true CZ20598A3 (en) | 1998-04-15 |
Family
ID=10778172
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ98205A CZ20598A3 (en) | 1995-07-24 | 1996-07-11 | Inhibition of cellular respiration and production of plants with male sterility |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0853674A1 (en) |
| JP (1) | JPH11509417A (en) |
| CN (1) | CN1197481A (en) |
| AR (1) | AR002924A1 (en) |
| AU (1) | AU705759B2 (en) |
| BG (1) | BG102274A (en) |
| BR (1) | BR9609535A (en) |
| CA (1) | CA2224736A1 (en) |
| CZ (1) | CZ20598A3 (en) |
| GB (1) | GB9515161D0 (en) |
| HU (1) | HUP9802858A3 (en) |
| MX (1) | MX9800575A (en) |
| NO (1) | NO980314L (en) |
| NZ (1) | NZ312750A (en) |
| PL (1) | PL324656A1 (en) |
| RU (1) | RU2168545C2 (en) |
| TR (3) | TR199801883T2 (en) |
| WO (1) | WO1997004116A1 (en) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU719627B2 (en) * | 1995-07-24 | 2000-05-11 | Syngenta Limited | Inhibition of cell respiration and production of male sterile plants |
| WO1999042587A1 (en) * | 1998-02-20 | 1999-08-26 | Zeneca Limited | Pollen specific promoter |
| DE69941869D1 (en) | 1998-03-27 | 2010-02-11 | Max Planck Gesellschaft | SPECIFIC GENES OF THE BASIC ENDOSPERM TRANSFER CELL LAYER (BETL) |
| GB9820970D0 (en) * | 1998-09-25 | 1998-11-18 | Zeneca Ltd | Promoter |
| WO2001064924A1 (en) * | 2000-03-02 | 2001-09-07 | Südwestdeutsche Saatzucht | Embryo sac-specific genes |
| US7205454B2 (en) * | 2002-07-31 | 2007-04-17 | Bayer Bioscience N.V. | Corn root preferential promoters and uses thereof |
| CA2867383A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| MX2014011044A (en) * | 2012-03-13 | 2015-05-15 | Pioneer Hi Bred Int | Genetic reduction of male fertility in plants. |
| EA201491670A1 (en) * | 2012-03-13 | 2015-07-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | GENETIC REDUCTION OF MALE REPRODUCTIVE FUNCTION IN PLANTS |
| CA2867377A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| CN111235163B (en) * | 2020-03-20 | 2022-05-31 | 南京农业大学 | Rice meiosis development related gene OsMFS1 and application thereof |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5409837A (en) * | 1988-01-14 | 1995-04-25 | Mycogen Plant Science, Inc. | Modified unF-13 protein and gene |
| GB8901675D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Inhibitor of gene expression |
| AU8723791A (en) * | 1990-09-06 | 1992-03-30 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Compounds and constructs for producing male sterile plants |
| GB9126818D0 (en) * | 1991-12-18 | 1992-02-19 | Ici Plc | Alteration of plant and plant cell morphology |
| ES2211864T3 (en) * | 1992-07-02 | 2004-07-16 | Syngenta Participations Ag | SEQUENCES OF cDNA SPECIFIC ANTERA, SEQUENCES OF GENOMIC DNA AND SEQUENCES OF RECOMBINANT DNA. |
| AU5420594A (en) * | 1992-11-02 | 1994-05-24 | Mogen International N.V. | Plants with reduced susceptibility to plant-parasitic nematodes |
| AUPN225695A0 (en) * | 1995-04-07 | 1995-05-04 | Australian National University, The | Plants with altered mitochondrial function |
-
1995
- 1995-07-24 GB GBGB9515161.9A patent/GB9515161D0/en active Pending
-
1996
- 1996-07-11 WO PCT/GB1996/001675 patent/WO1997004116A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-07-11 AU AU64652/96A patent/AU705759B2/en not_active Ceased
- 1996-07-11 RU RU98103336/13A patent/RU2168545C2/en not_active IP Right Cessation
- 1996-07-11 TR TR1998/01883T patent/TR199801883T2/en unknown
- 1996-07-11 MX MX9800575A patent/MX9800575A/en not_active Application Discontinuation
- 1996-07-11 HU HU9802858A patent/HUP9802858A3/en unknown
- 1996-07-11 EP EP96924071A patent/EP0853674A1/en not_active Withdrawn
- 1996-07-11 JP JP9506406A patent/JPH11509417A/en active Pending
- 1996-07-11 TR TR1998/01884T patent/TR199801884T2/en unknown
- 1996-07-11 TR TR1998/00112T patent/TR199800112T1/en unknown
- 1996-07-11 CA CA002224736A patent/CA2224736A1/en not_active Abandoned
- 1996-07-11 NZ NZ312750A patent/NZ312750A/en unknown
- 1996-07-11 CN CN96197145A patent/CN1197481A/en active Pending
- 1996-07-11 CZ CZ98205A patent/CZ20598A3/en unknown
- 1996-07-11 BR BR9609535A patent/BR9609535A/en not_active Application Discontinuation
- 1996-07-11 PL PL96324656A patent/PL324656A1/en unknown
- 1996-07-23 AR ARP960103701A patent/AR002924A1/en not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-01-23 NO NO980314A patent/NO980314L/en not_active Application Discontinuation
- 1998-02-24 BG BG102274A patent/BG102274A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997004116A1 (en) | 1997-02-06 |
| EP0853674A1 (en) | 1998-07-22 |
| AU705759B2 (en) | 1999-06-03 |
| NZ312750A (en) | 2000-02-28 |
| AR002924A1 (en) | 1998-04-29 |
| TR199801883T2 (en) | 1998-12-21 |
| BR9609535A (en) | 1999-02-23 |
| RU2168545C2 (en) | 2001-06-10 |
| HUP9802858A3 (en) | 2000-11-28 |
| HUP9802858A2 (en) | 1999-03-29 |
| NO980314D0 (en) | 1998-01-23 |
| TR199800112T1 (en) | 1998-04-21 |
| NO980314L (en) | 1998-03-23 |
| MX9800575A (en) | 1998-04-30 |
| AU6465296A (en) | 1997-02-18 |
| TR199801884T2 (en) | 2000-09-21 |
| JPH11509417A (en) | 1999-08-24 |
| BG102274A (en) | 1998-09-30 |
| CN1197481A (en) | 1998-10-28 |
| CA2224736A1 (en) | 1997-02-06 |
| PL324656A1 (en) | 1998-06-08 |
| GB9515161D0 (en) | 1995-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5929307A (en) | Method for the production of hybrid plants | |
| AU747636C (en) | Novel nucleic acid sequence encoding FLP recombinase | |
| AU708618B2 (en) | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin | |
| EP3694308A1 (en) | Systems and methods for cellular reprogramming of a plant cell | |
| EP1000164B1 (en) | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of streptavidin | |
| US6720475B1 (en) | Modified nucleic acid sequence encoding FLP recombinase | |
| CZ20598A3 (en) | Inhibition of cellular respiration and production of plants with male sterility | |
| MXPA98000575A (en) | Inhibition of cell breathing and production of sterile plants ma | |
| EP2397031A1 (en) | Compositions and methods for modulation of plant cell division | |
| US7056739B1 (en) | Compositions and methods for modulation of plant cell division | |
| AU719627B2 (en) | Inhibition of cell respiration and production of male sterile plants | |
| US20020129399A1 (en) | Biotin-binding compounds for induction of sterility in plants | |
| WO2022226316A1 (en) | Compositions and methods for generating male sterile plants | |
| CA2200496C (en) | Genetic transformation using a parp inhibitor | |
| MXPA97009731A (en) | Induction of male sterility in plants through the expression of high levels of avid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |