CZ2022466A3

CZ2022466A3 - Nenasycené oligosacharidy, způsob jejich přípravy a jejich použití

Info

Publication number: CZ2022466A3
Application number: CZ2022-466A
Authority: CZ
Inventors: Tomáš Klejch; Radovan Buffa; Jiří Bednařík; Martina Brandejsová; Hana Vágnerová; Vladimír Velebný
Original assignee: Contipro A.S.
Priority date: 2022-11-10
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2024-05-22
Also published as: CZ310437B6; WO2024099487A1

Abstract

Oligosacharidy vzorce I jsou složené ze střídajících se glukózových a N-acetylglukosaminových jednotek s dvojnou vazbou v poloze 4 terminálního neredukujícího sacharidu (glukózy) a s primární hydroxylovou skupinou v poloze 1 N-acetylglukosaminu na redukujícím konci. Postup přípravy je založen na enzymatickém nebo chemickém štěpení polymerní kyseliny hyaluronové anebo jejich esterů a následné redukci esterů oligosacharidů s borohydridem sodným. Materiály obsahující oligasacharidy vzorce I vykazují zvýšenou odolnost vůči enzymatické degradaci (bovinní testikulární hyaluronidáza, Streptococcus pneumoniae hyaluronan lyáza), a také selektivní negativní vliv na viabilitu některých linií rakovinových buněk.

Description

Nenasycené oligosacharidy, způsob jejich přípravy a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká oligosacharidů složených ze střídajících se glukózových a Nacetylglukosaminových jednotek, s nenasycenou glukózovou jednotkou na neredukujícím konci a redukovaným anomemím koncem podle strukturního vzorce I:

kde n = 0 až 10 jejich přípravy a způsobu použití. Oligosacharid s touto strukturou vykazuje zvýšenou odolnost vůči enzymatické degradaci a negativně ovlivňuje růst některých linií rakovinových buněk.

Dosavadní stav techniky

Postupná syntéza oligosacharidů

Syntéza penta- a hexasacharidů se střídajícími se jednotkami glukózy a N-acetylglukosaminu spoj enými 1 —>3 vazbou s methoxyfenylovou skupinou na redukuj ícím konci byla popsána v článku (Halkes, K. M. a kol.: Carbohydrate Research, 30, 161-174, 1998). Pro spojení chráněných sacharidů byla používána trichloracetimidátová aktivace za katalýzy fluoridem boritým nebo trimethylsilyl trifluormethansulfonátem ve výtěžku 69-81%.

V publikaci (Lin, Ch.-Ch. akol.: Journal of the Chinese Chemical Society, 47, 921-928,2000) byla popsána příprava disacharidu B-D-Glukopyranosyl(1^3)-l-thiol-B-glukosaminu jako stavební jednotky pro přípravu delších oligosacharidů. Donor glukózové jednotky je syntetizován v 9 krocích, glukosaminový akceptor v 5 krocích, spojení obou jednotek a změna chránících skupin probíhá ve 3 krocích.

One-pot syntéza chráněného disacharidu, tetrasacharidu a hexasacharidů se střídajícími se jednotkami glukózy a N-acetylglukosaminu spojenými 1—>3 vazbou byla popsána v článku (Huang, L.; Huang, X.: Chemistry - a European Journal, 13, 529-540, 2007). Monosacharidy nebo disacharidy byly připojovány s výtěžkem 54-75% pro glykosylaci.

Obecně lze konstatovat, že postupná syntéza oligosacharidů je náročná, zahrnuje mnoho chránících a odchraňovacích kroků, práci v toxických rozpouštědlech a má nízkou výtěžnost, zejména pro delší oligosacharidy. Nevýhodou je také nutná a mnohdy obtížná kontrola stereochemie vznikajících glykosidických vazeb. Další nevýhodou může být použití tvrdých podmínek (silně

CZ 2022 - 466 A3 kyselé prostředí), které mohou vést k rozkladu sacharidových cyklů obsahujících dvojnou C=C vazbu.

Sacharidy obsahujících násobné vazby

Byla popsána příprava nenasycených esterů uranových kyselin pomocí β-eliminace v bazickém prostředí (BeMiller, J. N. a kol: Carbohydrate research, 25, 419-428, 1972). Aby bylo zabráněno nežádoucí hydrolýze, byla eliminace prováděna methoxidem sodným v methanolu. Algináty jsou depolymerizovány pomaleji než pektiny.

Zahříváním pektinu ve slabě kyselém vodném roztoku (pH=6,l) lze získat kratší fragmenty obsahující dvojnou vazbu (Sajjaanantakul, T. a kol: Journal of Food Science, 54, 5, 1272-1277, 1989). Intenzita štěpení se zvyšuje s rozsahem esterifíkace karboxylových funkcí methylovou skupinou. V této práci byla štěpena nejvýše 2% glykosidických vazeb.

Byla popsána příprava sacharidu s dvojnou vazbou v poloze 4 a 5 (Mathad, V. T. a kol.: Indian Journal of Chemistry, 36B, 808-809, 1997). V prvním krokuje provedena acetylace hydroxylových skupin, následuje oxidace polohy 6 na aldehyd se simultánní tvorbou dvojné vazby, poté je aldehyd redukován NaBFL, a nakonec jsou v bazickém prostředí odstraněny acetylové skupiny.

Bylo popsáno několik způsobů, jak zavést násobnou -C=C- vazbu přímo do sacharidového cyklu v polymemím řetězci. Jedním z nich je enzymatické štěpení polymerů pomocí lyáz, kde dvojná vazba vzniká na neredukujícím konci polymeru (Kelly S. J. a kol. Glycobiology, 11, 4, 294-304, 2001), v tomto případě kyseliny hyaluronové.

Další způsob umožňuje zavést dvojnou vazbu do struktury různých glykosaminoglykanů v poloze 4 a 5 po celé délce řetězce, takže lze efektivně modifikovat i polymery s vyšší molekulovou hmotností (Buffa R. a kol. CZ305106, WO2014023272A1). Tyto materiály vykázaly selektivní negativní vliv na viabilitu rakovinových buněk.

Dále bylo popsáno alkalické štěpení benzylesteru chondroitin sulfátu ve směsi DMF/EtOH/EtONa (Gao, N. a kol.: Carbohydrate Polymers, 127, 427-437, 2015). Takto vzniklé oligosacharidy vykazovaly po deesterifikaci lepší antikoagulační účinky než nízkomolekulámí heparin.

Obecně lze konstatovat, že nenasycené oligosacharidy lze připravit enzymatickým nebo chemickým štěpením. Chemické štěpení je nej častěji prováděno bazicky a vyžaduje aktivaci, například převedením alkoholu na aldehyd nebo karboxylové kyseliny na její ester. Pro štěpení lze využít jak oligosacharidy, tak i polysacharidy.

Kyselina hyaluronová

Kyselina hyaluronová nebo její sodná sůl je nesulfatovaný glykosaminoglykan složený ze dvou opakujících se jednotek D-glukuronové kyseliny a A-acctyl-D-glukosaminii (Vzorec II).

(Π)

Vzorec II.

-2CZ 2022 - 466 A3

Molekulová hmotnost nativní kyseliny hyaluronové může dosáhnout až 5.10⁶ g.mol¹. Tento póly sacharid tvoří významnou součást pojivových tkání, kůže a synoviální tekutiny kloubů a hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako je hydratace, diferenciace buněk a organizace proteoglykanů. Kyselina hyaluronová se v biologických systémech přirozeně vyskytuje, tudíž je přirozeně bio-degradovatelná a bio-kompatibilní. Proto je vhodným substrátem pro širokou škálu biomedicinských aplikací.

Kyselina hyaluronová je v biologických podmínkách degradována hydrolázami a lyázami. V prvním případě si produkty zachovávají strukturu dle vzorce II, dochází pouze ke zkrácení řetězce. Pokud je kyselina hyaluronová štěpena lyázou, dochází ke vzniku řetězce s dvojnou vazbou na koncovém sacharidu na neredukujícím konci (Vzorec III). Biologické účinky oligomemí a polymemí kyseliny hyaluronové se výrazně liší (Russo, R. I. C. a kol.: International journal of cancer, 122, 1012-1018, 2008), záleží i na způsobu štěpení hyaluronanu (Jobe, K. L. a kol.: Immunology letters, 89, 99-109, 2003).

(Ill)

Vzorec III.

Redukce karboxylových kyselin

Redukci alifatických karboxylových kyselin, které ve své struktuře obsahují acetylové a jiné esterové skupiny, lze uskutečnit pomocí komplexu dimethylsulfíd/boran v tetrahydrofúranu (Williams S. J. a kol.: Journal of the American Chemical Society, 122, 10, 2223 - 2235, 2000) Reakce probíhá při 20 °C s tím, že je potřebný delší reakční čas (až 72 hodin).

Použití boranů generovaných systémem (NaBH₄ + H2SO4) na redukci alifatických karboxylových kyselin obsahujících éterické skupiny byla popsána v patentu (Haidar P. a kol.: US250454, 2011). Reakce probíhala 45 minut v tetrahydroforanu a diethyletheru v teplotním rozmezí 0 - 35 °C.

Selektivní redukce alifatických karboxylových kyselin, které ve své struktuře obsahují hydroxylové skupiny a ethery, byla popsána v článku (Murray J. a kol: Chem. Comm., 50, 88, 13608 - 13611, 2014). Reakce probíhá 12 hodin při 0 až 60 °C v inertní atmosféře a jako redukční činidlo byl použit systém (NaBH₄ + I2) v tetrahydrofúranu.

Efektivní redukci nízko-molekulámích alifatických i aromatických karboxylových kyselin na příslušné alkoholy lze uskutečnit s nadbytkem (3-4 ekvivalenty) pinakol bórami při 20 °C bez přítomnosti rozpouštědel a katalyzátoru (Harinath A. a kol: Chem. Comm., 10, 55, 1386-9, 2019). Tento přístup ale nelze použít pro molekuly obsahující velké množství hydroxylových skupin, které by rychle reagovaly s boranem za vzniku vodíku.

-3 CZ 2022 - 466 A3

Obecně lze konstatovat, že při redukcích karboxylových kyselin buď přímo s borany, nebo s borany v komplexu s dimethylsulfidem, nebo s borany generovanými in situ, je použití protických rozpouštědel nevhodné s ohledem na rychlou reakci boranů s vodíkem rozpouštědla za vzniku molekulárního vodíku. Tyto reakce probíhají efektivně buď v aprotických systémech (étery), nebo bez přítomnosti rozpouštědla.

Redukci alifatických karboxylových kyselin, které ve své struktuře obsahují esterové skupiny, lze uskutečnit pomocí dvoukrokové syntézy, kde se v prvním kroku aktivuje karboxylová skupina pomocí oxalyl dichloridu v N,N-dimethylformamidu, tetrahydrofuranu, dichloromethanu nebo acetonitrilu při -78 až + 20 °C, a v druhém kroku se aktivovaná karboxylová skupina redukuje s lithium tri-(tert-butoxy)aluminum hydridem v tetrahydrofuranu, dichloromethanu a acetonitrilu při 20 °C v čase 1,5 hodiny (Chany A.-C. a kol.: Organic and Biomolecular Chemistry, 13, 35, 9190 - 9193, 2015).

Redukci hexasacharidu kyseliny hyaluronové modifikované na karboxylu jako methyl ester byla popsána v článku (Onoera K. a kol.: Agricultural and Biological Chem., 27, 2, 143-149, 1963). Jako činidlo bylo použito LiAlH4 v tetrahydrofuranu.

I při redukcích karboxylových kyselin s hydridy na bázi hliníku je použití protických rozpouštědel nevhodné s ohledem na rychlou reakci aluminium hydridů s vodíkem rozpouštědla za vzniku molekulárního vodíku. Redukce probíhají efektivně v aprotických rozpouštědlech typu tetrahydrofuran, dichloromethan anebo acetonitril.

V článku (Montchamp J.-L. a kol.: Journal ofthe American Chemical Society, 114, 12, 4453, 1992) byla popsána redukce alifatických karboxylových kyselin, které ve své struktuře obsahují také hydroxylové skupiny a ethery, pomocí aktivace karboxylu s triethyl ortoformiátem a 4methylmorfolin-N-oxidem. Následná redukce byla uskutečněna pomocí NaBH4 s oxidem osmičelým v ethanolu a vodě. Jako vedlejší produkt byla pozorována racemizace v poloze alfa karboxylu.

NaBH4 byl použit na redukci široké škály karboxylových kyselin po in situ aktivaci s benzotriazol1-yloxytris(dimethylamino)fosfonium hexafluorofosfátem. Reakce probíhá rychle v mírných podmínkách v tetrahydrofuranu s přídavkem N,N- diisopropylethylaminu za vzniku alkoholů s vysokým výtěžkem (McGeary R. P.: Tetrahedron Letters, 39, 3319-3322, 1998). Při redukci konjugované kyseliny, v tomto případě kyseliny skořicové, dochází k 18% redukci dvojné vazby.

Karboxylové skupiny tetrasacharidu esterifikované na methylestery, který obsahují i nechráněné hydroxylové skupiny, lze redukovat pomocí NaBH4 v methanolu. Redukce na příslušný alkohol probíhá 1 hodinu při 20 °C (D'Acquarica I. a kol.: Tetrahedron, 58, 51, 10127-10136, 2002).

Podobný přístup byl popsán v článku (Stolz F. a kol.: European Journal of Organic Chemistry, 15, 3304-3312, 2004), kde byly alifatické karboxylové kyseliny obsahující také etherové skupiny redukovány pomocí NaBH4 po aktivaci karboxylu s 1,1'-karbonyldiimidazolem. Reakce byla uskutečněna v systému ethanol, dichlormethan, N,N-dimethylformamid.

Disacharid s volnými hydroxylovými skupinami a s cholesterolem vázaným na redukující konec O-glykosidickou vazbou byl redukován na karboxylu po jeho esterifikaci s diazomethanem v methanolu. Jako činidlo byl použit NaBH4a reakce probíhala 2 hodiny v methanolu při ambientní teplotě (Yoshikawa K. a kol.: Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 46, 7, 1102-1107, 1998).

Směs oligosacharidů kyseliny hyaluronové byla esterifikována pomocí reakce s diazomethanem a následně byla redukována pomocí 0,2-20 ekvivalentů NaBH4 ve vodě při 25 °C. Získaný materiál vykazoval stupeň substituce 5-50% (Christner, J. E. a kol.: Biochemistry Journal, 167, 711-716, 1977).

- 4 CZ 2022 - 466 A3

Redukce methylesterů karboxylových kyselin v methanolu pomocí NaBH4 probíhá za nižších teplot, pokud je do systému přidán katalytický methanolát sodný (Prasanth, C. P. a kol.: Journal of Organic Chemistry, 2018, 83, 1431-1440). Tímto způsobem je zabráněno rozkladu činidla vlivem kyselosti rozpouštědla.

Obecně lze konstatovat, že při redukcích karboxylových kyselin s hydridy na bázi boru je nutná aktivace karboxylu na jeho reaktivnější (elektrofilnější) derivát. Aktivace probíhá zpravidla v aprotických podmínkách a následná redukce s NaBH4 probíhá většinou ve směsích s protickými rozpouštědly typu methanol, ethanol nebo voda. Jako redukované substráty byly použity i sloučeniny obsahující hydroxylové a amidické skupiny.

Enzymatické redukce

Alifatické karboxylové kyseliny s obsahem etherů a acetamidů lze redukovat ve vodě pomocí enzymu z Gloeosporium olivarum při 27 °C. Reakční čas 768 hodin je ale extrémně dlouhý, přičemž byla pozorována i racemizace alfa pozice redukovaného karbonylu (Tsuda Y. a kol.: Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33, 5, 1955-1960, 1985).

Další enzym schopný redukovat alifatické karboxylové kyseliny s obsahem etherických skupin byl isolován z houby Glomerella cingulata. Tento enzym funguje při 27 °C ve vodě, reakční čas je až 624 hodin, přičemž byla pozorována i racemizace alfa pozice karbonylu (Tsuda Y. a kol.: Agricultural and Biological Chemistry, 48, 5, 1373-1374, 1984).

Je popsáno i použití enzymu z organismu Glomerella cingulata, kdy se použije s přídavkem KH2PO4, MgSO4, peptonu a sacharózy, reakční čas je jenom 24 hodin ve vodě při 27 °C (Tsuda Y.: Chemical and pharmaceutical bulletin, 35, 6, 2554-2557, 1987).

Obecně lze konstatovat, že redukce lze provést i v mírných podmínkách ve vodě pomocí enzymu, avšak je nutné počítat s delším reakčním časem a taky s racemizací pozice alfa karbonylu.

Redukce -C=C- vazby nenasycených esterů karboxylových kyselin

Redukce konjugované dvojné vazby byla popsána v publikaci (Falorni, M. a kol.: Tetrahedron Letters, 1999, 40, 4395-4396). V tomto případě probíhá aktivace nenasycené kyseliny kyanurchloridem v přítomnosti N-methylmorfolinu. Redukce intermediátu borohydridem sodným byla provedena ve vodě. Získaný materiál vykazoval 20 % nasycených vazeb. Jako důvod redukce C=C vazby je uvedeno bazické prostředí redukce.

Ještě vyšší podíl zredukované dvojné vazby byl popsán při redukci pentafluorfenylesteru skořicové kyseliny v publikaci (Papavassilopoulou, E. a kol.: Tetrahedron Letters, 2007, 48, 8323-8325). Dvojná vazba byla zredukována z 25 %.

Enantioselektivní redukce -C=C- vazby nenasyceného esteru pomocí borohydridu sodného s přídavkem chloridu kobaltnatého a azabisoxazolinového ligandu ve směsi ethanol/diglym byla popsána v publikaci (Geiger, C. a kol.: Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 249-254). V tomto případě nedochází k redukci karboxylové skupiny. Výtěžky reakcí přesahovaly 80 %.

Redukce -C=C- vazby elektronově vysoce deficientních alkenů pomocí 3-butyl-1methylimidazolinium borohydridu ve směsi acetonitril/voda (6:1) byla popsána v publikaci (Wang, J. a kol.: Tetrahedron Letters, 2008, 49, 6518-6520). Pro regeneraci činidla je používána aniontová metatheze s borohydridem sodným. Redukce probíhá s vysokým výtěžkem 75-92 %.

Obecně lze konstatovat, že redukce konjugované dvojné vazby může probíhat za podmínek používaných pro redukci esterů. V některých případech může být tato reakce provedena záměrně, ovšem mnohdy není žádoucí.

- 5 CZ 2022 - 466 A3

Obecně lze konstatovat, že oligosacharidy dle strukturního vzorce I nebyly dosud popsány. Zmíněny byly pouze glykosidy s dvojnou vazbou v poloze 4 a 5 glukózového cyklu, dále polysacharidy s -C=C- dvojnou vazbou v poloze 4 a 5 glukosaminového cyklu, dále oligosacharidy s -C=C- dvojnou vazbou v poloze 4 a 5 koncového uranového cyklu, kde je vždy přítomná karboxylová skupina. Zmíněny byly ještě redukované nasycené oligosacharidy kyseliny hyaluronové, které ale neobsahují dvojnou vazbu a jejich stupeň substituce nepřesahuje 50%.

Je překvapivé, že lze připravit nenasycené estery kyseliny hyaluronové štěpením polymeru v dimethylsulfoxidu v přítomnosti dusíkatých bází, protože oligosacharidy kyseliny hyaluronové v bazickém prostředí za zvýšené teploty podléhají rozkladu a odštěpují jV-acetylglukosamin z redukujícího konce (Muckenschnabel, I. akol.: Cancer Letters, 1998,131, 13-20). Při použití směsi rozpouštědel DMSO/voda (Příklad 8) nebo DMSO/methanol (Příklad 9) je reakce výrazně zpomalena. Lze tedy konstatovat, že využití čistého DMSO je pro štěpení polymeru klíčové.

Dále je překvapivé, že redukce esterů kyseliny hyaluronové borohydridem sodným probíhá za mírných podmínek v protickém prostředí (voda nebo methanol), protože toto činidlo se v protickém prostředí se obecně nepoužívá (Smith, Μ. B. MARCH’S ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY REACTIONS, MECHANISMS, AND STRUCTURE, 7th ed.; Wiley: USA, 2013, strana 1500) kvůli jeho nízké reaktivitě a rozkladu za vzniku vodíku a borátových esterů.

Dále je překvapivé, že za těchto podmínek bylo dosaženo prakticky kvantitativní konverze při použití malého přebytku (4 ekvivalenty) borohydridu sodného oproti 50% stupni substituce (Christner, J. E. a kol.: Biochemistry Journal, 167, 711-716, 1997) při použití výrazně většího množství činidla (20 ekvivalentů) pro redukci methylesteru kyseliny hyaluronové.

Dále je překvapivé, že nedochází k redukci konjugované dvojné vazby (Falomi, M. a kol.: Tetrahedron Letters, 1999, 40, 4395-4396, McGeary R. P.: Tetrahedron Letters, 39, 3319-3322, 1998).

Podstata vynálezu

Vynález se týká nenasycených oligosacharidů složených ze střídajících se glukózových a Nacetylglukosaminových jednotek, s nenasycenou glukózovou jednotkou na neredukujícím konci a redukovaným anomemím koncem, podle strukturního vzorce I:

NHCOCH

NHCOCH kde n = 0 až 10 jednotek.

Takto modifikovaný oligosacharid vykazuje zvýšenou odolnost vůči enzymatické degradaci a negativně ovlivňuje růst některých linií rakovinových buněk.

-6CZ 2022 - 466 A3

Dále se vynález týká způsobu přípravy oligosacharidu podle strukturního vzorce I, kde se v prvním kroku alkyluje karboxylová skupina kyseliny hyaluronové na ester, ve druhém kroku se ester štěpí za vzniku dvojné vazby v polohách 4 a 5 cyklu a ve třetím kroku se redukuje esterové skupiny a koncové anomerní centrum. Oligosacharid podle strukturního vzorce I lze připravit i jiným způsobem podle vynálezu, a to tak, že se v prvém kroku enzymaticky štěpí kyselina hyaluronová pomocí lyázy na nenasycený oligosacharid za vzniku dvojné vazby v polohách 4 a 5 cyklu, ve druhém kroku se nenasycený oligosacharid alkyluje na ester a ve třetím kroku se redukují esterové skupiny a koncové anomerní centrum za vzniku primárního alkoholu.

Pro přípravu oligosacharidu lze tedy použít následující dvě možnosti:

Možnost 1:

Vstupní materiál je kyselina hyaluronová o molekulové hmotnosti až 2 000 kg.mol^-1, která se v prvním kroku alkyluje na karboxylové skupině za vzniku alkylesteru polymerního hyaluronanu, ve druhém kroku se uskuteční selektivní chemické štěpení alkylovaného polysacharidu za vzniku nenasyceného oligosacharidu a ve třetím kroku se uskuteční redukce esterů karboxylových kyselin a anomerního konce na primární alkoholy.

Možnost 2:

Vstupní materiál je kyselina hyaluronová o molekulové hmotnosti až 2 000 kg.mol^-1, která se v prvním kroku enzymaticky štěpí za vzniku nenasycených oligosacharidů, pak se ve druhém kroku alkyluje na karboxylové skupině za vzniku alkylesterů oligosacharidů a ve třetím kroku se uskuteční redukce esterů karboxylových kyselin a anomerního konce na primární alkoholy.

Tyto dvě možnosti jsou detailněji rozebrány níže:

Možnost 1:

V prvním kroku se alkyluje karboxylová skupina polymerní kyseliny hyaluronové pomocí alkylačního činidla, například benzylbromidu, dimethylsulfátu nebo ethyljodidu, v dimethylsulfoxidu za přítomnosti báze, například diisopropylethylaminu nebo triethylaminu za vzniku alkylesteru. Tento krok probíhá s výhodou 20 až 120 hodin při teplotě 20 až 25 °C. Molární množství báze je s výhodou v rozmezí 1,7 až 6 ekvivalentů a molární množství alkylačního činidla je s výhodou v rozmezí 1,5 až 5 ekvivalentů vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové. Výchozí kyselina hyaluronová může mít molekulovou hmotnost v rozsahu 10 až 2 000 kg.mol^-1. Koncentrace kyseliny hyaluronové v DMSO je s výhodou v rozmezí 0,3 až 10 %hm.

Ve druhém kroku se uskuteční selektivní chemické štěpení roztoku esterifikované kyseliny hyaluronové v DMSO při teplotě 20 až 80 °C, s výhodou se zahříváním, na 1 až 116 hodin, v přítomnosti báze, například triethylaminu, N-methylmorfolinu, nebo diisopropylethylaminu, s výhodou v rozmezí 2 až 20 ekvivalentů vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové.

Ve třetím kroku se uskuteční redukce esterů karboxylových kyselin a anomerního konce na primární alkoholy, a to s výhodou tak, že se do roztoku esterifikovaného oligosacharidu kyseliny hyaluronové ve vodě, v methanolu, v DMSO nebo ve směsi methanol/pyridin přidá borohydrid sodný (NaBH4) v množství 1 až 20 ekvivalentů vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové a směs se míchá 1 až 140 hodin při teplotě 0 až 70 °C.

Je-li potřeba, převede se nativní kyselina hyaluronová před prvním krokem, alkylací, na formu rozpustnou v DMSO, například převedením na kyselou formu krokem okyselení s katexem, nebo převedením kyseliny hyaluronové na sůl s organickými protiionty (například tetrabutylammonium).

- 7 CZ 2022 - 466 A3

RX Báze DMSO

NaBH.

Solvent T

Schéma I - Možnost 1 kde R je Ci - C? - lineární nebo rozvětvený nebo aromatický uhlovodík a X je halogenidový nebo sulfátový zbytek.

Možnost 2:

V prvním kroku se polymemí kyselina hyaluronová enzymaticky štěpí pomocí enzymu hyaluronan lyázy ve vodě při 36 až 38 °C po dobu 16 až 92 hodin za vzniku nenasyceného oligosacharidu. Výchozí kyselina hyaluronová může mít molekulovou hmotnost v rozsahu 100 až 2 000 kg.mol¹. Lyáza je s výhodou vybrána ze skupiny zahrnující Streptoccus pneumoniae hyaluronan lyázu (SpHyl) a Streptococcus pyogenes hyaluronan lyázu (Hylpl) a aktivita lyázy je s výhodou v rozmezí 1,632 až 1,75 lU/ml. Štěpení může být úplné (až na disacharidy), s výhodou za použití SpHyl, nebo částečné (směs oligosacharidů).

Ve druhém kroku probíhá alkylace karboxylových skupin oligomemí kyseliny hyaluronové pomocí alkylačního činidla, například dimethylsulfátu, ethyljodidu nebo benzyl bromidu, v dimethylsulfoxidu za přítomnosti báze, například triethylaminu nebo diisopropyl-ethylaminu, za vzniku alkylesteru. Tento krok probíhá s výhodou 5 až 120 hodin při teplotě 20 až 25 °C, kde molámí množství alkylačního činidla je s výhodou v rozmezí 1,2 až 3 ekvivalenty vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové a molámí množství báze je s výhodou 1,2 až 3 molámího ekvivalentu vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové. Koncentrace roztoku oligomeru kyseliny hyaluronové v DMSO je s výhodou v rozmezí 5 až 30 %hm.

Ve třetím kroku se uskuteční redukce esterů karboxylových kyselin a anomemího konce na primární alkoholy, a to s výhodou tak, že se do roztoku esterifikovaného oligosacharidu kyseliny hyaluronové ve vodě, v methanolu, v DMSO nebo ve směsi methanol/pyridin přidá borohydrid sodný (NaBH4) v množství 1 až 20 ekvivalentů vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové a směs se míchá 1 až 140 hodin při teplotě 0 až 70 °C.

-8CZ 2022 - 466 A3

Schéma II - Možnost 2 kde R je Ci - C? - lineární nebo rozvětvený nebo aromatický uhlovodík a X je halogenidový nebo sulfátový zbytek.

Dále se vynález týká použití oligosacharidů složených ze střídajících se glukózových a Nacetylglukosaminových jednotek, s nenasycenou glukózovou jednotkou na neredukujícím konci a redukovaným anomemím koncem podle strukturního vzorce (I). Tyto materiály negativně ovlivňují růst některých linií rakovinových buněk, a přitom nemají negativní vliv na růst buněk standardních. Dále vykazují vysokou odolnost vůči degradaci některými enzymy, což může zvýšit efektivitu jejich transportu a prodloužit dobu jejich účinku. Proto je lze využít v materiálech a kompozicích proti rakovině, například, ale nejen, ve formě roztoku pro intravenózní podání (cestou injekce nebo infuze), nebo ve formě pevné tablety pro orální podání. Nenasycený oligosacharid podle vynálezu tedy lze použít pro přípravu materiálů a kompozic s antirakovinným účinkem, s výhodou s antirakovinným účinkem proti kolorektálnímu karcinomu u lidí.

Objasnění výkresů

Obr. 1 - Porovnání rychlosti enzymatické degradace roztoku materiálu připraveného podle příkladu 36 (plná čára) s nativním oligomerem kyseliny hyaluronové (přerušovaná čára) po aplikaci enzymu Streptoccus pneumoniae hyaluronanlyázy (SpHyl).

Obr. 2 - Porovnání rychlosti enzymatické degradace roztoku materiálu připraveného podle příkladu 36 (plná čára) s nativním oligomerem kyseliny hyaluronové (přerušovaná čára) po aplikaci enzymu bovinní testikulámí hyaluronanhydrolázy (BTH).

Obr. 3 - Vliv materiálů připravených podle příkladů 31,33,35 a 36 na viabilitu fibroblastů NHDF.

Obr. 4 - Vliv materiálů připravených podle příkladů 31, 33, 35 a 36 na viabilitu HT-29

Obr. 5 - Porovnání vlivu nativních nenasycených oligosacharidů HA a materiálů připravených podle příkladů 31,33,35 a 36 na viabilitu HT-29

-9CZ 2022 - 466 A3

Příklady uskutečnění vynálezu

Ac = acetyl

DMSO = dimethylsulfoxid

DS = stupeň substituce = 100 % * (molární množství modifikované jednotky oligosacharidu) / (molární množství všech jednotek oligosacharidu)

HA = kyselina hyaluronová

MeOH = methanol

Mw = molekulová hmotnost

NMR analýza = (700 MHz, D2O/DMSO-d6, δ ppm)

Hylp1 = Streptococcus pyogenes hyaluronan lyáza

SpHyl = Streptococcus pneumoniae hyaluronan lyáza

DMEM = Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium

FBS = fetální bovinní sérum

IPA = isopropylalkohol

Zde používaný výraz ekvivalent (ekv) se vztahuje, není-li uvedeno jinak, na opakující se jednotku příslušného polysacharidu nebo oligosacharidu, například na disacharid kyseliny hyaluronové. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak. Molekulová hmotnost výchozích polysacharidů je hmotnostně střední stanovená pomocí metody SECMALLS.

Hodnota průměrné Mw byla zjišťována porovnáním integrálu signálu dvojné vazby při 6,2 ppm a integrálu signálů acetylových skupin při 2,0 ppm podle vzorce Mw= O,4O7*[I2,o]/(3*[U,2]) kg.mol1

Příklad 1

Alkylace kyseliny hyaluronové s ethyl jodidem

Roztok kyseliny hyaluronové (5,9 g, Mw=10 kg.mol^-1) v demineralizované vodě (150 ml) byl ochlazen na 0 °C a míchán 2 hodiny s katexem (6 g) v H+ cyklu. Poté byl katex odfiltrován a roztok byl lyofilizován. Lyofilizát byl rozpuštěn v suchém DMSO (60 ml) pod dusíkovou atmosférou. Poté byl přidán triethylamin (4,8 ml, 2,2 ekv.) a ethyljodid (2,44 ml, 2 ekv) a reakční směs byla míchána 20 hodin při 20 °C. Poté byl produkt vysrážen přídavkem ethylacetátu (180 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (DMSO-d6) δ 4,25-4,05 (m, 2H, CH2); 1,75 (s, 3H, Ac); 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3). DS= 100%.

Příklad 2

Alkylace kyseliny hyaluronové s dimethylsulfátem

Roztok kyseliny hyaluronové (1 g, Mw=2000 kg.mol^-1) v demineralizované vodě (200 ml) byl ochlazen na 0 °C a míchán 2 hodiny s katexem (2 g) v H⁺ cyklu. Poté byl katex odfiltrován a roztok byl lyofilizován. Lyofilizát byl rozpuštěn v suchém DMSO (300 ml) pod dusíkovou atmosférou. Poté byl přidán diisopropylethylamin (1,5 ml, 1,7 ekv) a dimethylsulfát (0,375 ml, 1,5 ekv.) a reakční směs byla míchána 120 hodin při 25 °C. Poté byl produkt vysrážen přídavkem vody (200 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (DMSO-d6) δ 3,75 (s, 3H, CH2); 1,80 (s, 3H, Ac). DS= 98%.

Příklad 3

Alkylace kyseliny hyaluronové s benzylbromidem

- 10 CZ 2022 - 466 A3

Roztok kyseliny hyaluronové (1 g, Mw=400 kg.mol^-1) v demineralizované vodě (100 ml) byl ochlazen na 0 °C a míchán 2 hodiny s katexem (1 g) v H+ cyklu. Poté byl katex odfiltrován a roztok byl lyofilizován. Lyofilizát byl rozpuštěn v suchém DMSO (10 ml) pod dusíkovou atmosférou. Poté byl přidán diisopropylethylamin (2,77 ml, 6 ekv) a benzylbromid (1,57 ml, 5 ekv.) a reakční směs byla míchána 90 hodin při 20 °C. Poté byl produkt vysrážen přídavkem ethylacetátu (40 ml), promýván vodou a isopropylakoholem a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí Ή NMR (DMSO-d6) δ 7,51-7,25 (m, 5H, Ar-H); 5,23 (d, J = 12,55 Hz, 1H, ArCIl·); 5,12 (d, J = 12,55 Hz, 1H, ArCH2); 1,75 (s, 3H, Ac). DS= 100%.

Příklad 4

Alkylace kyseliny hyaluronové s ethyl jodidem

Roztok kyseliny hyaluronové (5,6 g, Mw=130 kg.mol^-1) v demineralizované vodě (160 ml) byl ochlazen na 0 °C a míchán 2 hodiny s katexem (6 g) v H+ cyklu. Poté byl katex odfiltrován a roztok byl lyofilizován. Lyofilizát byl rozpuštěn v suchém DMSO (60 ml) pod dusíkovou atmosférou. Poté byl přidán diisopropylethylamin (5,7 ml, 2,3 ekv) a ethyljodid (2,4 ml, 2,1 ekv) a reakční směs byla míchána 90 hodin při 20 °C. Poté byl produkt vysrážen přídavkem ethylacetátu (240 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (DMSO-d6) δ 4,25-4,05 (m, 2H, CH2); 1,75 (s, 3H, Ac); 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3). DS= 100%.

Příklad 5

Chemické štěpení ethylesterů kyseliny hyaluronové

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 1 (0,16 g) v suchém DMSO (7 ml) byl přidán triethylamin (1,14 ml, 20 ekv) a směs byla míchána při 20 °C po dobu 16 hodin. Poté byl produkt sražen přídavkem ethylacetátu (28 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí NMR (DMSO-d6): 5,92 (d, J = 3,9 Hz, 1H, H-C=C); 4,25-4,05 (m, 2H, CH2); 1,75 (s, 3H, Ac); 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3). Průměrná Mw= 6,12 kg.mol^-1.

Příklad 6

Chemické štěpení methylesterů kyseliny hyaluronové

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 2 (0,5 g) v suchém DMSO (5 ml) byl přidán triethylamin (0,35 ml, 2 ekv) a směs byla zahřívána na 80 °C po dobu 1 hodiny. Poté byl produkt sražen přídavkem ethylacetátu (20 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (DMSO-d6) δ 5,95 (d, J = 3,9 Hz, 1H, H-C=C); 3,86 (s, 3H, CH3); 1,75 (s, 3H, Ac). Průměrná Mw= 16,8 kg.mol^-1.

Příklad 7

Chemické štěpení benzylesterů kyseliny hyaluronové

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 3 (1 g) v suchém DMSO (10 ml) byl přidán triethylamin (1 ml, 3,4 ekv) a směs byla míchána při 50 °C po dobu 72 hodin. Poté byl produkt sražen přídavkem ethylacetátu (30 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí NMR (DMSO-d6): 7,55-7,30 (m, 5H, Ar-H); 6,02 (d, J = 3,9 Hz, 1H, H-C=C); 5,26 - 5,28 (m, 2H, ArCH2); 1,75 (s, 3H, Ac). Průměrná Mw= 2 kg.mol^-1.

Příklad 8

Chemické štěpení ethylesterů kyseliny hyaluronové ve směsi DMSO/voda

- 11 CZ 2022 - 466 A3

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 4 (0,5 g) ve směsi DMSO/voda (4:1, 5 ml) byl přidán triethylamin (0,5 ml, 3 ekv) a směs byla zahřívána na 50 °C po dobu 72 hodin. Poté byl produkt sražen přídavkem ethylacetátu (20 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí H NMR (DMSO-d6) δ 5,92 (d, J = 3,9 Hz, 1H, H-C=C); 4,25-4,05 (m, 2H, CH2); 1,75 (s, 3H, Ac); 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3). Průměrná Mw= 9,26 kg.mol^-1.

Příklad 9

Chemické štěpení ethylesterů kyseliny hyaluronové ve směsi DMSO/methanol

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 4 (0,2 g) ve směsi DMSO/methanol (4:1, 2 ml) byl přidán triethylamin (0,2 ml, 3 ekv) a směs byla zahřívána na 50 °C po dobu 72 hodin. Poté byl produkt sražen přídavkem ethylacetátu (20 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí H NMR (DMSO-d6) δ 5,92 (d, J = 3,9 Hz, 1H, H-C=C); 4,25-4,05 (m, 2H, CH2); 1,75 (s, 3H, Ac); 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3). Průměrná Mw= 3 kg.mol '.

Příklad 10

Chemické štěpení ethylesterů kyseliny hyaluronové

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 4 (1 g) v suchém DMSO (10 ml) byl přidán triethylamin (1 ml, 2,9 ekv) a směs byla zahřívána na 50 °C po dobu 92 hodin. Poté byl produkt sražen přídavkem ethylacetátu (100 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 6,25 (d, J = 4,2 Hz, 1H, H-C=C); 5,37-5,25 (m, 2H, CH2); 2,10-1,98 (m, 3H, Ac); 1,35-1,23 (m, 3H, CH3). Průměrná Mw= 1,2 kg.mol^-1.

Příklad 11

Chemické štěpení esterů kyseliny hyaluronové s chromatografickou separací

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 4 (1 g) v suchém DMSO (10 ml) byl přidán triethylamin (1 ml, 2,9 ekv) a směs byla zahřívána na 50 °C po dobu 116 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,6 ml) a produkt byl separován na HPLC koloně s reverzní fází v systému voda/methanol. Po odpaření byly produkty analyzovány pomocí 1H NMR (D2O) δ 6,25 (d, J = 4,2 Hz, 1H, H-C=C); 5,37-5,25 (m, 2H, CH2); 2,10-1,98 (m, 3H, Ac); 1,35-1,23 (m, 3H, CH3).

Příklad 12

Chemické štěpení esterů kyseliny hyaluronové pomocí N-methylmorfolinu

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 4 (0,2 g) v suchém DMSO (2 ml) byl přidán N-methylmorfolin (0,35 ml, 6,5 ekv) a směs byla zahřívána na 50 °C po dobu 112 hodin. Poté byl produkt sražen přídavkem ethylacetátu (20 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 6,25 (d, J = 4,2 Hz, 1H, H-C=C); 5,37-5,25 (m, 2H, CH2); 2,10-1,98 (m, 3H, Ac); 1,35-1,23 (m, 3H, CH3). Průměrná Mw= 5,5 kg.mol 1

Příklad 13

Chemické štěpení esterů kyseliny hyaluronové pomocí diisopropylethylaminu

Do roztoku alkylované HA připravené podle příkladu 4 (0,12 g) v suchém DMSO (7 ml) byl přidán diisopropylethylamin (0,2 ml, 3,8 ekv) a směs byla zahřívána na 50 °C po dobu 3 hodin. Poté byl produkt sražen přídavkem ethylacetátu (20 ml), promýván a sušen na vzduchu. Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 6,25 (d, J = 4,2 Hz, 1H, H-C=C); 5,37-5,25 (m, 2H, CH2); 2,10-1,98 (m, 3H, Ac); 1,35-1,23 (m, 3H, CH3). Průměrná Mw= 4 kg.mol 1

- 12 CZ 2022 - 466 A3

Příklad 14

Enzymatická degradace kyseliny hyaluronové s lyázou

Do roztoku nativní HA (5 g, 100 kg.mol^-1) v demineralizované vodě (250 ml) byl přidán roztok enzymu Streptococcus pneumoniae hyaluronan lyázy (0,25 ml, 408 IU, 50% v/v glycerol, 25 mM fosfátový pufr (NaxHyPO4), 250 mM NaCl, pH=8). Roztok byl míchán při 36 °C přes noc (16 hodin). Poté byl přefiltrován přes 0,2 mm nylonový filtr a filtr byl promyt demineralizovanou vodou (50 ml). Roztok byl zakoncentrován na objem 100 ml a poté byl lyofilizován. Výsledný produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,89 - 5,85 (m, 1H, H-C=C); 2,07 (s, 3H, Ac).

Příklad 15

Enzymatická degradace kyseliny hyaluronové s lyázou

Do roztoku nativní HA (1 g, 2000 kg.mol^-1) v octanovém pufru (200 ml, 50 mM CHXOONa, 50 mM NaCl, pH=6) byl přidán enzym Hylp1 (350 U). Roztok byl míchán při 38 °C po dobu 92 hodin. Poté byl vzorek převařen (100 °C), ochlazen, doplněn demineralizovanou vodou na objem 1l a ultrafiltrován. Takto připravený roztok byl částečně odpařen a lyofilizován. Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,86 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,39 - 3,33 (m, 3H, H-2); 2,10 - 2,00 (m, 12H, Ac). Průměrná Mw= 1,6 kg.mol^-1.

Příklad 16

Alkylace disacharidu kyseliny hyaluronové s ethyljodidem

Nenasycený disacharid, připravený podle příkladu 14 (0,4 g), byl rozpuštěn v suchém DMSO (1 ml). Poté byl přidán diisopropylethylamin (0,35 ml, 2 ekv) a ethyljodid (0,1 ml, 1,2 ekv) a reakční směs byla míchána při teplotě 20 °C po dobu 60 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,1 ml) a reakční směs byla dělena na C18 koloně ve směsi voda/methanol. Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 6,27-6,25 (m, H-C=C, 1H); 4,33-4,27 (m, 2H, CH2); 2,08 (2xs, 3H, Ac); 1,32, 1,31 (d x t, J = 7,1 Hz, 3H, CH3). DS=100%

Příklad 17

Alkylace disacharidu kyseliny hyaluronové s ethyljodidem

Nenasycený disacharid, přípravený podle příkladu 14 (0,4 g), byl rozpuštěn v suchém DMSO (1 ml). Poté byl přidán triethylamin (0,27 ml, 2 ekv) a ethyljodid (0,24 ml, 3 ekv) a reakční směs byla míchána při teplotě 25 °C po dobu 20 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,1 ml) a reakční směs byla dělena na C18 koloně ve směsi voda/methanol. Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (D2O) δ 6,27-6,25 (m, H-C=C, 1H); 4,33-4,27 (m, 2H, CH2); 2,08 (2xs, 3H, Ac); 1,32, 1,31 (d x t, J = 7,1 Hz, 3H, CH3). DS=100%.

Příklad 18

Alkylace disacharidu kyseliny hyaluronové s benzylbromidem

Nenasycený disacharid, připravený podle příkladu 14 (0,8 g) byl rozpuštěn v suchém DMSO (2 ml). Poté byl přidán diisopropylethylamin (0,7 ml, 2 ekv.) a benzylbromid (0,47 ml, 2 ekv.) a reakční směs byla míchána při teplotě 20 °C po dobu 16 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,2 ml) a reakční směs byla dělena na C18 koloně ve směsi voda/methanol. Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 7,50-7,40 (m, 5H, Ar); 6,28-6,26 (m, 1H, H-C=C); 5,31 (s, 2H, ArCH2); 2,07, 2,06 (2 x s, 3H, Ac). DS=100%. Výtěžek 0,76 g.

- 13 CZ 2022 - 466 A3

Příklad 19

Alkylace oligosacharidů kyseliny hyaluronové s benzylbromidem

Směs nenasycených oligosacharidů připravená podle příkladu 15 (0,1 g) byla rozpuštěna v suchém DMSO (1 ml). Poté byl přidán diisopropylethylamin (0,083 ml, 2 ekv) a benzylbromid (0,06 ml, 2 ekv) a reakční směs byla míchána při teplotě 25 °C po dobu 120 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,05 ml) a reakční směs byla dělena na C18 koloně ve směsi voda/methanol.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 7,60-7,37 (m, 20H, Ar); 6,28 (d, J = 4,3 Hz, 1H, H-C=C); 5,45-5,23 (m, 8H, ArCIl·); 2,10-1,94 (m, 12H, Ac). DS=93%. Výtěžek 0,07 g.

Příklad 20

Alkylace disacharidu kyseliny hyaluronové s dimethylsulfátem

Nenasycený disacharid, připravený podle příkladu 14 (0,2 g) byl rozpuštěn v suchém DMSO (1 ml). Poté byl přidán diisopropylethylamin (0,2 ml, 2 ekv.) a dimethylsulfát (0,1 ml, 2 ekv.) a reakční směs byla míchána při teplotě 20 °C po dobu 5 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,05 ml) a reakční směs byla dělena na C18 koloně ve směsi voda/methanol. Produkt byl analyzován pomocí H NMR (D2O) δ 6,27-6,24 (m, 1H, H-C=C); 3,84 (2 x s, 3H, OCH3); 2,07, 2,06 (2 x s, 3H, Ac). DS=100%. Výtěžek 0,21 g.

Příklad 21

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (130 mg) připravená podle příkladu 10 byla rozpuštěna v DMSO (5 ml). Dále byl přidán NaBH4 (130 mg, 10,5 ekv.) a reakční směs byla zahřívána na 70 °C po dobu 140 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (5 ml, 20%) a směs byla míchána 30 minut. Poté byl produkt sražen přídavkem 2-propanolu (20 ml) a ethyl-acetátu (30 ml), promýván a sušen na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 89%.

Příklad 22

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (252 mg) připravená podle příkladu 10 byla rozpuštěna v DMSO (5 ml). Dále byl přidán NaBH4 (243 mg, 10 ekv.) a reakční směs byla zahřívána na 50 °C po dobu 140 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (7,5 ml, 20%) a směs byla míchána 30 minut. Poté byl produkt sražen přídavkem 2-propanolu (30 ml), promýván a sušen na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 5H, H-2); 2,09-2,03 (7 x s, 21H, Ac). DS= 71%.

Příklad 23

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

- 14 CZ 2022 - 466 A3

Směs alkylovaných oligosacharidů (101 mg) připravená podle příkladu 10 byla rozpuštěna v H2O (1 ml). Dále byl přidán NaBH4 (22 mg, 2 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 19 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,08 ml, 99%) a směs byla míchána 30 minut. Poté byl produkt sražen přídavkem 2-propanolu (10 ml), promýván a sušen na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 62%.

Příklad 24

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (11 mg) připravená podle příkladu 10 byla rozpuštěna v H2O (0,7 ml). Dále byl přidán NaBH4 (20 mg, 20 ekv.) a reakční směs byla míchána při 0 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,02 ml, 99%) a směs byla míchána 30 minut. Poté byl produkt sražen přídavkem 2-propanolu (1 ml), promýván a sušen na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 89%.

Příklad 25

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (12 mg) připravená podle příkladu 10 byla suspendována v MeOH-d4 (0,7 ml). Dále byl přidán NaBH4 (13 mg, 12 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,01 ml, 99%). Sraženina byla filtrována a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 100%.

Příklad 26

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (101 mg) připravená podle příkladu 10 byla suspendována v MeOH (2 ml). Roztok byl ochlazen na 0 °C, byl přidán NaBH4 (94 mg, 10 ekv.) a reakční směs byla míchána při 0 °C po dobu 1 hodiny a poté při 25 °C po dobu 15 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,1 ml, 99%) a směs byla míchána 30 minut. Poté byl produkt sražen přídavkem 2-propanolu (10 ml), promýván a sušen na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 40%.

Příklad 27

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (11 mg) připravená podle příkladu 10 byla suspendována v sušeném MeOH (0,7 ml). Dále byl přidán NaBH4 (11 mg, 10 ekv.) a reakční směs byla míchána

- 15 CZ 2022 - 466 A3 při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,01 ml, 99%). Sraženina byla filtrována a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 51%.

Příklad 28

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (98 mg) připravená podle příkladu 10 byla suspendována v MeOH (2 ml) a pyridinu (0,2 ml). Dále byl přidán NaBH4 (97 mg, 10 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,1 ml, 99%) a směs byla míchána 30 minut. Sraženina byla filtrována a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 98%.

Příklad 29

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (19 mg) připravená podle příkladu 10 byla suspendována v MeOH (0,7 ml) a pyridinu (0,004 ml). Dále byl přidán NaBH4 (1,89 mg, 1 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 20 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,1 ml, 99%) a MeOH (0,5 ml). Sraženina byla filtrována a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 9%.

Příklad 30

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (10 mg) připravená podle příkladu 10 byla suspendována v MeOH (0,7 ml) a pyridinu (0,008 ml). Dále byl přidán NaBH4 (4 mg, 4 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 18 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,01 ml, 99%) a MeOH (0,5 ml). Sraženina byla filtrována a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 3H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 15H, Ac). DS= 97%.

Příklad 31

Redukce esterů oligomerů kyseliny hyaluronové

Směs alkylovaných oligosacharidů (200 mg) připravená podle příkladu 10 byla suspendována v MeOH (2 ml) a pyridinu (0,16 ml). Dále byl přidán NaBH4 (86 mg, 5 ekv.) a reakční směs byla míchána při 0 °C po dobu 20 minut a poté při 25 °C po dobu 18 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,125 ml, 99%) a MeOH (0,5 ml). Sraženina byla filtrována a sušena na vzduchu.

- 16 CZ 2022 - 466 A3

Příklad 32

Redukce esterů izolovaného disacharidu kyseliny hyaluronové

Izolovaný alkylovaný disacharid (103 mg) připravený podle příkladu 16 byl suspendován v MeOH (2 ml) a pyridinu (0,08 ml). Dále byl přidán NaBH4 (38 mg, 4 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,15 ml, 99%) a 2-propanol (5 ml). Sraženina byla centrifugována, promývána a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ= 5,10 (d, J = 4,08 Hz, 1H, H-C=C); 2,06 (s, 3H, Ac). DS= 95%.

Příklad 33

Redukce esterů izolovaného tetrasacharidu kyseliny hyaluronové

Izolovaný alkylovaný tetrasacharid (203 mg) připravený podle příkladu 11 byl suspendován v MeOH (4 ml) a pyridinu (0,16 ml). Dále byl přidán NaBH4 (76 mg, 4 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,15 ml, 99%) a 2-propanol (5 ml). Sraženina byla centrifugována, promývána a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 2,09-2,03 (2 x s, 6H, Ac). DS= 100%.

Příklad 34

Redukce esterů izolovaného hexasacharidu kyseliny hyaluronové

Izolovaný alkylovaný hexasacharid (204 mg) připravený podle příkladu 11 byl suspendován v MeOH (4 ml) a pyridinu (0,16 ml). Dále byl přidán NaBH4 (81 mg, 4 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,15 ml, 99%) a 2-propanol (5 ml). Sraženina byla centrifugována, promývána a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 2,09-2,03 (3 x s, 9H, Ac). DS= 100%.

Příklad 35

Redukce esterů izolovaného oktasacharidu kyseliny hyaluronové

Izolovaný alkylovaný oktasacharid (203 mg) připravený podle příkladu 11 byl suspendován v MeOH (4 ml) a pyridinu (0,16 ml). Dále byl přidán NaBH4 (76 mg, 4 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,15 ml, 99%) a 2-propanol (5 ml). Sraženina byla centrifugována, promývána a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 2H, H-2); 2,09-2,03 (5 x s, 12H, Ac). DS= 100%.

- 17 CZ 2022 - 466 A3

Příklad 36

Redukce směsi esterů vyšších sacharidů kyseliny hyaluronové

Směs esterů vyšších sacharidů (200 mg, 10-20 sacharidy) připravená podle příkladu 11 byla suspendována v MeOH (4 ml) a pyridinu (0,16 ml). Dále byl přidán NaBH4 (76 mg, 4 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,15 ml, 99%) a 2-propanol (5 ml). Sraženina byla centrifugována, promývána a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí NMR, H NMR (D2O) δ 5,13 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-1); 5,09 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C=C); 3,38 (dd, J = 9,4 Hz, 8,0 Hz, 1H, H-2); 3,32 (dd, J = 9,1 Hz, 8,0 Hz, 4H, H-2); 2,09-2,03 (m, 18H, Ac). DS= 100%.

Příklad 37

Redukce benzylesteru izolovaného disacharidu kyseliny hyaluronové

Benzylovaný disacharid (59 mg) připravený podle příkladu 18 byl rozpuštěn v MeOH (1 ml) a pyridinu (0,04 ml). Dále byl přidán NaBH4 (18 mg, 4 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,04 ml, 99%) a 2-propanol (4 ml). Sraženina byla centrifugována, promývána a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 1H NMR (D2O) δ= 5,10 (d, J = 4,08 Hz, 1H, H-C=C); 2,06 (s, 3H, Ac). Konverze 95%.

Příklad 38

Redukce methylesteru izolovaného disacharidu kyseliny hyaluronové

Methylovaný disacharid (56 mg) připravený podle příkladu 20 byl rozpuštěn v MeOH (1 ml) a pyridinu (0,04 ml). Dále byl přidán NaBH4 (19 mg, 3,5 ekv.) a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 2 hodin. Poté byla přidána kyselina octová (0,04 ml, 99%) a 2-propanol (4 ml). Sraženina byla centrifugována, promývána a sušena na vzduchu.

Produkt byl analyzován pomocí 'H NMR (D2O) δ= 5,10 (d, J = 4,08 Hz, 1H, H-C=C); 2,06 (s, 3H, Ac). Konverze = 89%.

Příklad 39

Porovnání enzymatické degradace redukovaného oligomeru HA připraveného podle příkladu 36 s nativním oligomerem HA10.

mg nativního nebo redukovaného oligosacharidu HA připraveného podle příkladu 36 bylo rozpuštěno v 0,8 ml roztoku obsahujícího 0,01 mol.L^-1 octanového pufru a 0,01 mol.L^-1 NaCl v D2O. Pak byla přidána kyselina octová na dosažení pH 5,3. Do této směsi bylo přidáno 800 jednotek enzymu BTH a směs se míchala 24 hodin při 37 °C. Finální roztok pak byl ochlazen na 20 °C a změřen na NMR. Hodnota průměrné molekulové hmotnosti oligosacharidu byla vypočtena na základě poměru integrálu signálů vodíků anomerního konce při 5,16 ppm a integrálu vodíků CH3 skupiny při 2,0 ppm.

Příklad 40

- 18 CZ 2022 - 466 A3 mg nativního nebo redukovaného oligosacharidů HA připraveného podle příkladu 36 bylo rozpuštěno v 0,5 ml D2O a poté byl přidán roztok enzymu Streptococcus pneumonia hyaluronan lyázy (0,005 ml, 8 IU, 50% v/v glycerol, 25 mM fosfátový pufr (NaxHyPO4), 250 mM NaCl, pH=8). Roztok byl míchán 24 hodin při 37 °C přes noc (16 hodin). Finální roztok pak byl ochlazen na 20 °C, zředěn D2O (0,2 ml) a změřen na NMR. Rozsah štěpení byl určen podle integrálu signálů vodíků vznikající dvojné vazby při 5,06 ppm a integrálu vodíků -CH3 skupiny při 2,0 ppm.

Příklad 41

Testování vlivu redukovaného oligosacharidu kyseliny hyaluronové připraveného podle příkladů 31, 33, 35, 36 na viabilitu NHDF fibroblastů.

Lidské fibroblasty NHDF byly kultivované v DMEM médiu s obsahem 10% FBS (5% CO2, 37°C). Cytotoxicita byla měřena prostřednictvím MTT testu. Po dosažení 80% konfluence byly buňky zpasážované a vyseté na 96-jamkovou desku v hustotě 5000 buněk na jamku. Po inkubaci do druhého dne bylo kultivační médium vyměněno za testované vzorky (CTRL = kultivační médium). Po 24, 48 a 72 hodinách od treatmentu buněk bylo přidáno 20 ul MTT (5 mg/ml) a následovala 2,5 hodinová inkubace. Na závěr bylo kultivační médium se vzorky z destičky vyklepnuto a byl přidán lyzační roztok (IPA: DMSO (1:1), Triton X-100 (10%). Po zlyzování buněk byla měřena absorbance na spektrometru Ensight (Perkin Elmer) při vlnové délce 570 nm, (690 nm pozadí).

Graf Změna viability NHDF (Obr. 3) vyjadřuje změnu viability buněk vztaženou ke kontrole v daném čase - tedy neovlivněná kontrola odpovídá hodnotě 0; pokud je hodnota kladná nebo záporná max. do -20 %, interpretuje se to tak, že látka nemá cytotoxický efekt.

Příklad 42

Testování vlivu redukovaných oligosacharidů kyseliny hyaluronové připravených podle příkladů 31, 33, 35 a 36 na viabilitu HT-29

Lidské buňky kolorektálního karcinomu HT-29 byly kultivované v DMEM médiu s obsahem 10% FBS (5% CO2, 37°C). Cytotoxicita byla měřena prostřednictvím MTT testu. Po dosažení 80% konfluence byly buňky zpasážované a vyseté na 96-jamkovou desku v hustotě 3000 buněk na jamku. Po inkubaci do druhého dne bylo kultivační médium vyměněno za testované vzorky (CTRL = kultivační médium). Po 24, 48 a 72 hodinách od treatmentu buněk bylo přidáno 20 ul MTT (5 mg/ml) a následovala 2,5 hodinová inkubace. Na závěr bylo kultivační médium se vzorky z destičky vyklepnuto a byl přidán lyzační roztok (IPA: DMSO (1:1), Triton X-100 (10%). Po zlyzování buněk byla měřena absorbance na spektrometru Ensight (Perkin Elmer) při vlnové délce 570 nm, (690 nm pozadí).

Graf Změna viability HT-29 (Obr. 4) vyjadřuje změnu viability buněk vztaženou ke kontrole v daném čase - tedy neovlivněná kontrola odpovídá hodnotě 0; pokud je hodnota kladná nebo záporná max. do -20 %, interpretuje se to tak, že látka nemá cytotoxický efekt.

Příklad 43

Porovnání vlivu nativních nenasycených oligosacharidů kyseliny hyaluronové a derivátů připravených podle příkladů 31, 33, 35 a 36 na viabilitu HT-29

Lidské buňky kolorektálního karcinomu HT-29 byly kultivované v DMEM médiu s obsahem 10% FBS (5% CO2, 37°C). Cytotoxicita byla měřena prostřednictvím MTT testu. Po dosažení 80% konfluence byly buňky zpasážované a vyseté na 96-jamkovou desku v hustotě 3000 buněk na jamku. Po inkubaci do druhého dne bylo kultivační médium vyměněno za testované vzorky (CTRL = kultivační médium). Po 72 hodinách od treatmentu buněk bylo přidáno 20 ul MTT (5 mg/ml) a

- 19 CZ 2022 - 466 A3 následovala 2,5 hodinová inkubace. Na závěr bylo kultivační médium se vzorky z destičky vyklepnuto a byl přidán lyzační roztok (IPA: DMSO (1:1), Triton X-100 (10%). Po zlyzování buněk byla měřena absorbance na spektrometru Ensight (Perkin Elmer) při vlnové délce 570 nm, (690 nm pozadí).

Graf Změna viability HT-29 (Obr. 5) vyjadřuje změnu viability buněk vztaženou ke kontrole v daném čase - tedy neovlivněná kontrola odpovídá hodnotě 0; pokud je hodnota kladná nebo záporná max. do -20 %, interpretuje se to tak, že látka nemá cytotoxický efekt.

Claims

1. Nenasycený oligosacharid podle strukturního vzorce (I),

(I) kde n = 0 až 10

2. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu definovaného v nároku 1, vyznačující se tím, že se v prvním kroku alkyluje karboxylová skupina kyseliny hyaluronové na ester, ve druhém kroku se ester štěpí za vzniku dvojné vazby v polohách 4 a 5 cyklu a ve třetím kroku se redukují esterové skupiny a koncové anomemí centrum.

3. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle nároku 2, vyznačující se tím, že v prvém kroku se připraví roztok kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti v rozmezí 10 až 2000 kg.mol¹ v DMSO, kde koncentrace roztoku je v rozmezí 0,3 až 10 %hm., pak se přidá báze v množství 1,7 až 6 molámího ekvivalentu vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové, pak se přidá alkylaění činidlo v množství 1,5 až 5 molámího ekvivalentu vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové a směs se nechá reagovat 20 až 120 hodin při teplotě 20 až 25 °C za vzniku esterifikované kyseliny hyaluronové.

4. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že báze je vybrána ze skupiny zahrnující diisopropylethylamin atriethylamin.

5. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle kteréhokoli z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že alkylaění činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující benzylbromid, dimethylsulfát a ethyljodid.

6. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle kteréhokoli z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že ve dmhém kroku se uskuteční selektivní chemické štěpení esterifikované kyseliny hyaluronové v dimethylsulfoxidu při teplotě 20 až 80 °C po dobu 1 až 116 hodin, v přítomnosti báze v rozmezí 2 až 20 ekvivalentů vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové.

7. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle nároku 6, vyznačující se tím, že báze ve dmhém kroku je vybrána ze skupiny zahrnující triethylamin, N-methylmorfolin a diisopropylethylamin.

8. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu definovaného v nároku 1, vyznačující se tím, že se v prvém kroku enzymaticky štěpí kyselina hyaluronová pomocí lyázy na nenasycený oligosacharid za vzniku dvojné vazby v polohách 4 a 5 cyklu, ve dmhém kroku se nenasycený oligosacharid alkyluje na ester a ve třetím kroku se redukují esterové skupiny a koncové anomemí centrum za vzniku primárního alkoholu.

9. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle nároku 8, vyznačující se tím, že molekulová hmotnosti výchozí kyseliny hyaluronové je v rozmezí 100 až 2000 kg.mol¹, lyáza je

-21 CZ 2022 - 466 A3 vybrána ze skupiny zahrnující Streptoccus pneumoniae hyaluronan lyázu a Streptococcus pyogenes hyaluronan lyázu a že štěpení probíhá ve vodě a s aktivitou lyázy v rozmezí 1,632 až 1,75 lU/ml při teplotě v rozmezí 36 až 38 °C a po dobu 16 až 92 hodin, za vzniku nenasyceného oligosacharidu.

10. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že se ve druhém kroku připraví roztok nenasyceného oligomeru kyseliny hyaluronové v DMSO, kde koncentrace roztoku je v rozmezí 5 až 30 %hm., pak se přidá báze v množství 1,2 až 3 molárního ekvivalentu vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové, pak se přidá alkylační činidlo v množství 1,2 až 3 molárního ekvivalentu vzhledem k disacharidu kyselině hyaluronové a směs se nechá reagovat 5 až 120 hodin při teplotě 20 až 25 °C za vzniku esterifikovaného oligosacharidu kyseliny hyaluronové.

11. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle nároku 10, vyznačující se tím, že báze je vybrána ze skupiny zahrnující triethylamin a diisopropylethylamin a/nebo alkylační činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující benzylbromid, dimethylsulfát a ethyljodid.

12. Způsob přípravy nenasyceného oligosacharidu podle kteréhokoli z nároků 2 až 11, vyznačující se tím, že se ve třetím kroku do roztoku esterifikovaného oligosacharidu kyseliny hyaluronové ve vodě, v DMSO, v methanolu nebo ve směsi methanol/pyridin přidá borohydrid sodný (NaBH4) v množství 1 až 20 molárních ekvivalentů vzhledem k disacharidu kyseliny hyaluronové při teplotě 0 až 70 °C a směs se míchá 1 až 140 hodin.

13. Použití nenasyceného oligosacharidu definovaného v nároku 1 pro přípravu materiálů a kompozic s antirakovinným účinkem.

14. Použití nenasyceného oligosacharidu definovaného v nároku 1 pro přípravu materiálů a kompozic s antirakovinným účinkem proti kolorektálnímu karcinomu u lidí.