CZ2021423A3 - Fluorescently labelled polymer for visualizing tumours, preparing and using it - Google Patents
Fluorescently labelled polymer for visualizing tumours, preparing and using it Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2021423A3 CZ2021423A3 CZ2021-423A CZ2021423A CZ2021423A3 CZ 2021423 A3 CZ2021423 A3 CZ 2021423A3 CZ 2021423 A CZ2021423 A CZ 2021423A CZ 2021423 A3 CZ2021423 A3 CZ 2021423A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- group
- groups
- general formula
- fluorescent
- fluorescent polymer
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 99
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims description 105
- 229920001109 fluorescent polymer Polymers 0.000 claims abstract description 111
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002675 image-guided surgery Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 102
- -1 polymethacrylamide Polymers 0.000 claims description 68
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 54
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 50
- 229920005684 linear copolymer Polymers 0.000 claims description 47
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 29
- WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2-thione Chemical group SC1=NCCS1 WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 28
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 28
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 21
- 125000001494 2-propynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])* 0.000 claims description 20
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 18
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 18
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 17
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 17
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 229920001114 fluorescent copolymer Polymers 0.000 claims description 16
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 claims description 14
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 13
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 11
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 11
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 10
- 229940059574 pentaerithrityl Drugs 0.000 claims description 10
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 10
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 10
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 10
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 9
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 9
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 8
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 8
- TXBCBTDQIULDIA-UHFFFAOYSA-N 2-[[3-hydroxy-2,2-bis(hydroxymethyl)propoxy]methyl]-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(CO)(CO)COCC(CO)(CO)CO TXBCBTDQIULDIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 claims description 7
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 1-aminopropan-2-ol Chemical compound CC(O)CN HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LSCNVPPLIVWHBT-UHFFFAOYSA-N C(=O)=C1C=NC(S1)=S Chemical group C(=O)=C1C=NC(S1)=S LSCNVPPLIVWHBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 6
- ZPWOOKQUDFIEIX-UHFFFAOYSA-N cyclooctyne Chemical group C1CCCC#CCC1 ZPWOOKQUDFIEIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 claims description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 6
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000004033 porphyrin derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 claims description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- BMOBFBQWISCVKX-UHFFFAOYSA-N 1-(2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl)ethanone Chemical compound CC(=O)N1CCSC1=S BMOBFBQWISCVKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 claims description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 125000003258 trimethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 claims description 2
- QRZUPJILJVGUFF-UHFFFAOYSA-N 2,8-dibenzylcyclooctan-1-one Chemical compound C1CCCCC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)C1CC1=CC=CC=C1 QRZUPJILJVGUFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 abstract description 10
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- ZUHQCDZJPTXVCU-UHFFFAOYSA-N C1#CCCC2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 Chemical group C1#CCCC2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZUHQCDZJPTXVCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropyl methacrylate Chemical compound CC(O)COC(=O)C(C)=C VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 7
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 7
- XCEBOJWFQSQZKR-UHFFFAOYSA-N dbco-nhs Chemical compound C1C2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C2N1C(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O XCEBOJWFQSQZKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 6
- PFHOSZAOXCYAGJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-cyano-4-methoxy-4-methylpentan-2-yl)diazenyl]-4-methoxy-2,4-dimethylpentanenitrile Chemical compound COC(C)(C)CC(C)(C#N)N=NC(C)(C#N)CC(C)(C)OC PFHOSZAOXCYAGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YNKQCPNHMVAWHN-UHFFFAOYSA-N 4-(benzenecarbonothioylsulfanyl)-4-cyanopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(C)(C#N)SC(=S)C1=CC=CC=C1 YNKQCPNHMVAWHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- MHYYGVVQFGATQF-UHFFFAOYSA-N S(=O)(=O)(O)C1=CC=CC=2C#CCCC3=C(C=21)C=CC=C3 Chemical group S(=O)(=O)(O)C1=CC=CC=2C#CCCC3=C(C=21)C=CC=C3 MHYYGVVQFGATQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- SENLDUJVTGGYIH-UHFFFAOYSA-N n-(2-aminoethyl)-3-[[3-(2-aminoethylamino)-3-oxopropyl]-[2-[bis[3-(2-aminoethylamino)-3-oxopropyl]amino]ethyl]amino]propanamide Chemical compound NCCNC(=O)CCN(CCC(=O)NCCN)CCN(CCC(=O)NCCN)CCC(=O)NCCN SENLDUJVTGGYIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(O)CNC(=O)C(C)=C OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PTBDIHRZYDMNKB-UHFFFAOYSA-N 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionic acid Chemical compound OCC(C)(CO)C(O)=O PTBDIHRZYDMNKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N Fluoroform Chemical compound FC(F)F XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- OCCYFTDHSHTFER-UHFFFAOYSA-N dbco-amine Chemical compound NCCC(=O)N1CC2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C12 OCCYFTDHSHTFER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 108010046019 histidyl-glutamyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-leucyl-alanyl-prolyl-tyrosyl-prolyl-tryptophyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 4
- AGGWFDNPHKLBBV-YUMQZZPRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-5-(carbamoylamino)pentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=O AGGWFDNPHKLBBV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- IRHYACQPDDXBCB-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrachloro-1,1,2,3,4,4-hexafluorobutane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)C(F)(Cl)C(F)(F)Cl IRHYACQPDDXBCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 3
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000005466 alkylenyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 3
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical group CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 3
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- VFXXTYGQYWRHJP-UHFFFAOYSA-N 4,4'-azobis(4-cyanopentanoic acid) Chemical compound OC(=O)CCC(C)(C#N)N=NC(C)(CCC(O)=O)C#N VFXXTYGQYWRHJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FLZUYXUBDVKWPO-UHFFFAOYSA-N 4-(2-oxopropyl)benzoic acid Chemical compound CC(=O)CC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 FLZUYXUBDVKWPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 2
- SBZDIRMBQJDCLB-UHFFFAOYSA-N 5-azidopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCN=[N+]=[N-] SBZDIRMBQJDCLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDQUODNBHKNYAC-UHFFFAOYSA-N DY-730 Chemical compound C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C(C)(C)C(C=CC=CC=C3C4=CC=C(C=C4OC(=C3)C(C)(C)C)N(CC)CC)=[N+](CCCCCC(O)=O)C2=C1 KDQUODNBHKNYAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GSUNDTMFNNPYFK-UHFFFAOYSA-N DY-750 Chemical compound OC(=O)CCCCCN1C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC1=C(C=C2C(N(C(C=C2C)(C)C)CC)=C2)C2=[O+]C(C(C)(C)C)=C1 GSUNDTMFNNPYFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 2
- ZJCCRDAZUWHFQH-UHFFFAOYSA-N Trimethylolpropane Chemical group CCC(CO)(CO)CO ZJCCRDAZUWHFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 108010022814 aspartyl-methionyl-prolyl-glycyl-threonyl-valyl-leucyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- NHFQNAGPXIVKND-UHFFFAOYSA-N dbco-maleimide Chemical compound C1C2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C2N1C(=O)CCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O NHFQNAGPXIVKND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 2
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 229920002187 poly[N-2-(hydroxypropyl) methacrylamide] polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 2
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 2
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 2
- 238000012712 reversible addition−fragmentation chain-transfer polymerization Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229920006301 statistical copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROGODJHHEBREAB-UHFFFAOYSA-N (2Z)-2-[(2E,4E,6E)-7-[1-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxohexyl]-3,3-dimethyl-5-sulfoindol-1-ium-2-yl]hepta-2,4,6-trienylidene]-1-ethyl-3,3-dimethylindole-5-sulfonate Chemical compound CC1(C)C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)\C1=C/C=C/C=C/C=C/C(C(C1=CC(=CC=C11)S(O)(=O)=O)(C)C)=[N+]1CCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ROGODJHHEBREAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NBMSMZSRTIOFOK-SFHVURJKSA-N (2s)-5-(carbamoylamino)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCNC(=O)N)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NBMSMZSRTIOFOK-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- CZWUESRDTYLNDE-UHFFFAOYSA-N (2z)-2-[(2e,4e,6e)-7-[1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindol-1-ium-2-yl]hepta-2,4,6-trienylidene]-1-ethyl-3,3-dimethylindole-5-sulfonate Chemical compound CC1(C)C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)\C1=C/C=C/C=C/C=C/C1=[N+](CCCCCC(O)=O)C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2C1(C)C CZWUESRDTYLNDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXKGIPZJYUNAIW-UHFFFAOYSA-N (4-aminophenyl)methanol Chemical compound NC1=CC=C(CO)C=C1 AXKGIPZJYUNAIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(Cl)=O)C=C1 NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODVRLSOMTXGTMX-UHFFFAOYSA-N 1-(2-aminoethyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound NCCN1C(=O)C=CC1=O ODVRLSOMTXGTMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PQLRKLNTODQYQC-UHFFFAOYSA-N 1h-benzo[e]indole Chemical compound C1=CC=CC2=C3CC=NC3=CC=C21 PQLRKLNTODQYQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDSLBLWCPSAZBL-UHFFFAOYSA-N 2-cyanopropan-2-yl benzenecarbodithioate Chemical compound N#CC(C)(C)SC(=S)C1=CC=CC=C1 IDSLBLWCPSAZBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSVOWVXHKOQYIP-UHFFFAOYSA-N 2-dodecylsulfanylcarbothioylsulfanyl-2-methylpropanenitrile Chemical compound CCCCCCCCCCCCSC(=S)SC(C)(C)C#N QSVOWVXHKOQYIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEGDMFMDAGDUOS-UHFFFAOYSA-N 2-ethylsulfanylcarbothioylsulfanyl-2-methyl-5-oxo-5-(2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl)pentanenitrile Chemical compound CCSC(=S)SC(C)(CCC(=O)N1CCSC1=S)C#N VEGDMFMDAGDUOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QPCKLXWQFRRTAR-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-[3-oxo-3-(2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl)propyl]prop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NCCC(=O)N1CCSC1=S QPCKLXWQFRRTAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DJBRKGZFUXKLKO-UHFFFAOYSA-N 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 DJBRKGZFUXKLKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMZSJIQGMAGSSO-UHFFFAOYSA-N 3-[[1-amino-2-[[1-amino-1-(2-carboxyethylimino)-2-methylpropan-2-yl]diazenyl]-2-methylpropylidene]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCNC(=N)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(=N)NCCC(O)=O NMZSJIQGMAGSSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RNTXYZIABJIFKQ-UHFFFAOYSA-N 4-cyano-4-dodecylsulfanylcarbothioylsulfanylpentanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCSC(=S)SC(C)(C#N)CCC(O)=O RNTXYZIABJIFKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CVKJOHUNVFCNJV-UHFFFAOYSA-N 4-oxo-4-pyridin-2-ylbutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C1=CC=CC=N1 CVKJOHUNVFCNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEHBUZYBKUOFIA-UHFFFAOYSA-N 5-cyclohexyl-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC(=O)C1CCCCC1 FEHBUZYBKUOFIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SPVVXXQOAJHFRK-UHFFFAOYSA-N CCCC(C[SH2]C(S)=S)C#N Chemical compound CCCC(C[SH2]C(S)=S)C#N SPVVXXQOAJHFRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- XWYKQUDFSPYHML-UHFFFAOYSA-N N(=[N+]=[N-])CCCNC(CCC(C)(SC(=S)SCC)C#N)=O Chemical compound N(=[N+]=[N-])CCCNC(CCC(C)(SC(=S)SCC)C#N)=O XWYKQUDFSPYHML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIYBTMZBAPYNRO-UHFFFAOYSA-N N-(3-azidopropyl)-4-ethylsulfanylcarbothioylsulfanyl-4-methylpentanamide Chemical compound N(=[N+]=[N-])CCCNC(CCC(C)(C)SC(=S)SCC)=O UIYBTMZBAPYNRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 101100490446 Penicillium chrysogenum PCBAB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001104043 Syringa Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007874 V-70 Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIRXXBPLVZFBKV-UHFFFAOYSA-N [2-cyano-5-oxo-5-(2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-3-yl)pentan-2-yl] benzenecarbodithioate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=S)SC(C#N)(C)CCC(=O)N1CCSC1=S QIRXXBPLVZFBKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ORXFTHUTCFVXJO-UHFFFAOYSA-N [5-(3-azidopropylamino)-2-cyano-5-oxopentan-2-yl] benzenecarbodithioate Chemical compound N(=[N+]=[N-])CCCNC(CCC(C)(C#N)SC(=S)C1=CC=CC=C1)=O ORXFTHUTCFVXJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002820 allylidene group Chemical group [H]C(=[*])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011717 athymic nude mouse Methods 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- ICCBZGUDUOMNOF-UHFFFAOYSA-N azidoamine Chemical compound NN=[N+]=[N-] ICCBZGUDUOMNOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- ZGRWZUDBZZBJQB-UHFFFAOYSA-M benzenecarbodithioate Chemical compound [S-]C(=S)C1=CC=CC=C1 ZGRWZUDBZZBJQB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- QDHFHIQKOVNCNC-UHFFFAOYSA-M butane-1-sulfonate Chemical compound CCCCS([O-])(=O)=O QDHFHIQKOVNCNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- QZHPTGXQGDFGEN-UHFFFAOYSA-N chromene Chemical compound C1=CC=C2C=C[CH]OC2=C1 QZHPTGXQGDFGEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N dimethylmethylene Chemical compound C[C]C IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- QFTYSVGGYOXFRQ-UHFFFAOYSA-N dodecane-1,12-diamine Chemical compound NCCCCCCCCCCCCN QFTYSVGGYOXFRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011846 endoscopic investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002674 endoscopic surgery Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005597 hydrazone group Chemical group 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 1
- 125000000814 indol-3-yl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C([*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WWECJGLXBSQKRF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;methanol Chemical compound OC.CN(C)C=O WWECJGLXBSQKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 229920001562 poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000012704 polymeric precursor Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0058—Antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/52—Amides or imides
- C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F220/56—Acrylamide; Methacrylamide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/52—Amides or imides
- C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/52—Amides or imides
- C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
- C08F220/585—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine and containing other heteroatoms, e.g. 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid [AMPS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/52—Amides or imides
- C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/52—Amides or imides
- C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
- C08F220/603—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen and containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen and nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/52—Amides or imides
- C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
- C08F220/606—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen and containing other heteroatoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Abstract
Předkládané řešení se týká fluorescenčního polymeru, na který je navázána fluorescenční značka v množství od 0,1 do 10 mol. %, a jehož fluorescence je aktivována v nádorové tkáni pro zajištění signifikantní vizualizace nádorové tkáně pro diagnostické postupy anebo pro obrazem řízenou navigovanou chirurgii. S výhodou je fluoresceční polymer směrován specifickými molekulami k nádorovým buňkám a nádorové neovaskulatuře. Předkládané řešení se dále týká způsobu výroby fluorescenčního polymeru a jeho použití jako fluorescenční sondy v lékařské diagnostice jako kontrastní látka pro vizualizaci nádorů, celotělové zobrazování a/nebo pro obrazem naváděnou chirurugii.The presented solution relates to a fluorescent polymer to which a fluorescent label is bound in an amount from 0.1 to 10 mol. %, and whose fluorescence is activated in tumor tissue to provide significant visualization of tumor tissue for diagnostic procedures or for image-guided, navigated surgery. Advantageously, the fluorescent polymer is targeted by specific molecules to tumor cells and tumor neovasculature. The presented solution further relates to a method of producing a fluorescent polymer and its use as a fluorescent probe in medical diagnostics as a contrast agent for tumor visualization, whole-body imaging and/or for image-guided surgery.
Description
Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů, způsob jeho přípravy a jeho použitíFluorescently labeled polymer for visualization of tumors, method of its preparation and its use
Oblast technikyField of technology
Vynález se týká směrovaného fluorescenčního polymeru s aktivovatelnou fluorescencí složeného z polymerního nosiče s postranními řetězci s fluorofory určeného pro vizualizaci nádorové tkáně. Využití polymeru je zaměřeno na zvýraznění nádorové tkáně pro následné chirurgické odstranění nebo neinvazivní sledování průběhu nádorového onemocnění.The invention relates to a directed fluorescent polymer with activatable fluorescence composed of a polymer carrier with side chains with fluorophores intended for visualization of tumor tissue. The use of the polymer is aimed at highlighting the tumor tissue for subsequent surgical removal or non-invasive monitoring of the progress of the cancer.
Dosavadní stav technikyCurrent state of the art
Precizní a úplná resekce celého nádoru bez zbytečného odstranění sousední zdravé tkáně je předpokladem úspěšného výsledku onkologické operace. Bohužel vizuální rozlišení mezi maligní a zdravou tkání pouhým okem je pro chirurga často velmi složité, až nemožné. Nicméně, radikální resekce s adekvátními negativními okraji je jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících prognózu pacientů například se spinocelulárním karcinomem hlavy a krku (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC). Obvykle je bezpečný okraj definován jako větší než 5,0 mm. V kontextu onkologické endoskopické chirurgie zůstává i nadále klíčovou otázkou přesné nastavení hranic nádoru. V tuto chvíli je možné pro zobrazování okrajů nádoru částečně využít neinvazivní zobrazování, jako je například autofluorescence (AF) nádorových tkání. Nicméně metoda využívající AF není přesná a využívá se jen u některých typů nádorových onemocnění. Metoda, která by spolehlivě fungovala pro vedení chirurga během operace v tuto chvíli neexistuje. Fluorescenční zobrazování (Fluorescence Imaging, FI) je založeno na osvětlení tkáně světlem, které excituje blízké infračervené (Near-infrared, NIR) nebo krátko-vlnné infračervené (Shortwave infrared, SWIR) fluorofory nebo kontrastní látky. Vzhledem k prostupnosti světla v NIR a SWIR oblasti tkáněmi, až několik cm, je možné tyto fluorofory použít i pro vizualizaci v rámci označení nádorových ložisek.Precise and complete resection of the entire tumor without unnecessary removal of adjacent healthy tissue is a prerequisite for a successful outcome of oncological surgery. Unfortunately, the visual distinction between malignant and healthy tissue with the naked eye is often very difficult, if not impossible, for the surgeon. However, radical resection with adequate negative margins is one of the most important factors influencing the prognosis of patients with, for example, Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Usually, the safe margin is defined as greater than 5.0 mm. In the context of oncological endoscopic surgery, the precise setting of tumor boundaries remains a key issue. At the moment, it is possible to partially use non-invasive imaging, such as autofluorescence (AF) of tumor tissues, for imaging tumor margins. However, the method using AF is not accurate and is only used for certain types of cancer. There is currently no method that works reliably to guide the surgeon during surgery. Fluorescence imaging (Fluorescence Imaging, FI) is based on the illumination of tissue with light that excites near-infrared (NIR) or short-wave infrared (Shortwave infrared, SWIR) fluorophores or contrast agents. Due to the permeability of light in the NIR and SWIR region through tissues, up to several cm, it is possible to use these fluorophores for visualization as part of marking tumor foci.
V posledních několika desetiletích byly různé polymerní materiály studovány jako biokompatibilní, neimunogenní a netoxické biomateriály pro medicínksé aplikace. Byly a jsou studovány biomateriály navržené jako vektory pro dopravu biologicky aktivních molekul, materiály pro tkáňové inženýrství a diagnostiku. Intenzivně se studují systémy pro cílenou dopravu a řízené uvolňování léčiv, tzv. drug delivery systémy (DDS), ve kterých jsou polymerní formy léčiv studovány jako nové formulace „klasických“ léčiv s cílem zajistit navýšenou terapeutickou funkci pro antineoplastickou, protizánětlivou a antimikrobiální léčbu při současném odstranění vedlejších účinků léčby. Mnoho popsaných DDS je založeno na vodorozpustných nebo amfifilních polymerních nosičích nesoucích aktivní molekuly s nízkou molekulovou hmotností, např. kovalentně vázané biologicky rozložitelnými spojky, určené pro řízené uvolňování a aktivaci nesených aktivních molekul v požadovaných tkáních nebo buňkách. Velká pozornost byla zaměřena na biokompatibilní, netoxické a neimunogenní kopolymery na bázi N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu (pHPMA), poly(ethylenglykol)u (PEG), poly (kaprolakton)u (PCL), poly (laktidová kyselina) / poly (kyselina laktid-ko-glykolid) (PLA / PLGA) a jejich kopolymery jako nosiče biologicky aktivních molekul a směrujících skupin. Obecně jsou polymerní nosiče bioaktivních molekul navrženy tak, aby optimalizovaly farmakokinetiku aktivních molekul, prodloužily dobu jejich krevní cirkulace, zlepšily lokalizaci v nádorech, zánětech a/nebo požadovaných buňkách, snížily vedlejší toxicitu a imunogenitu a solubilizovaly ve vodě nerozpustné aktivní molekuly. Aktivní nesené molekuly mohou být uvolňovány/aktivovány enzymatickou hydrolýzou, redukcí nebo hydrolýzou vyvolanou pH snížením pH ze 7,4 (krev) na 5 - 6,5 (endozomy / lysozomy; nádorové mikroprostředí; zánětlivé prostředí). Pro zvýšení akumulace v cílové tkáni, např. nádorové tkáně, a současné minimalizace vedlejších účinků jsou studovány cílené systémy obsahující směrující skupiny, např. protilátky nebo oligopeptidy, nebo systémy se strukturou a velikostí umožňující „pasivní“ cílení založené naIn the past few decades, various polymeric materials have been studied as biocompatible, non-immunogenic and non-toxic biomaterials for medical applications. Biomaterials designed as vectors for the transport of biologically active molecules, materials for tissue engineering and diagnostics have been and are being studied. Systems for the targeted transport and controlled release of drugs, so-called drug delivery systems (DDS), are intensively studied, in which polymeric forms of drugs are studied as new formulations of "classic" drugs with the aim of ensuring an increased therapeutic function for antineoplastic, anti-inflammatory and antimicrobial treatment while simultaneously elimination of side effects of treatment. Many described DDS are based on water-soluble or amphiphilic polymer carriers carrying low molecular weight active molecules, e.g. covalently bound by biodegradable linkers, intended for controlled release and activation of the carried active molecules in desired tissues or cells. Much attention has been focused on biocompatible, non-toxic and non-immunogenic copolymers based on N-(2hydroxypropyl)methacrylamide (pHPMA), poly(ethylene glycol) (PEG), poly (caprolactone) (PCL), poly (lactid acid) / poly (acid lactide-co-glycolide) (PLA / PLGA) and their copolymers as carriers of biologically active molecules and directing groups. In general, polymeric carriers of bioactive molecules are designed to optimize the pharmacokinetics of active molecules, prolong their blood circulation time, improve localization in tumors, inflammation and/or target cells, reduce secondary toxicity and immunogenicity, and solubilize water-insoluble active molecules. Active carrier molecules can be released/activated by enzymatic hydrolysis, reduction, or pH-induced hydrolysis by lowering the pH from 7.4 (blood) to 5 - 6.5 (endosomes / lysosomes; tumor microenvironment; inflammatory environment). To increase accumulation in the target tissue, e.g., tumor tissue, while minimizing side effects, targeted systems containing targeting groups, e.g., antibodies or oligopeptides, or systems with a structure and size enabling "passive" targeting based on
- 1 CZ 2021 - 423 A3 efektu EPR (zvýšená permeabilita a retence) za použití nosičů s vysokou molekulovou hmotností (HMW), např. hvězdicové polymery, nanočástice nebo micely.- 1 CZ 2021 - 423 A3 of the EPR effect (increased permeability and retention) using carriers with high molecular weight (HMW), e.g. star polymers, nanoparticles or micelles.
V nedávné době byla vyvinuta polymerní terapeutika a diagnostika založená na pHPMA, která mají zvýšenou akumulaci v pevných nádorech. U těchto systémů, terapeutik nesoucích protinádorová léčiva, např. doxorubicin, paclitaxel, byla zjištěna protirakovinná aktivita u různých nádorových modelů u myší. Polymerní systémy obsahující léčivo i fluorescenční značku navázanou napevno byly nejen terapeuticky aktivní, ale byly schopny sledovat vývoj nádoru pomocí fluorescenčního zobrazování (FI). V nedávné době byly popsány lineární pHPMA konstrukty obsahující NIR barvivo Dyomics-782 a EGF (epidermal growth factor) cílící oligopeptidy GE-7 a GE-11. Studie biodistribuce in vivo ukázala velmi slibné výsledky ve vizualizaci nádoru. Polymerní sonda byla lokalizována hlavně na hranici nádoru, což ukazuje potenciál pro obrazem řízenou chirurgii.Recently, pHPMA-based polymeric therapeutics and diagnostics have been developed that have increased accumulation in solid tumors. These systems, therapeutics carrying antitumor drugs, e.g., doxorubicin, paclitaxel, have been found to have anticancer activity in various tumor models in mice. Polymeric systems containing both the drug and a rigidly bound fluorescent label were not only therapeutically active, but were able to monitor tumor development using fluorescence imaging (FI). Recently, linear pHPMA constructs containing NIR dye Dyomics-782 and EGF (epidermal growth factor) targeting oligopeptides GE-7 and GE-11 have been described. The in vivo biodistribution study showed very promising results in tumor visualization. The polymer probe was mainly localized at the tumor border, showing the potential for image-guided surgery.
V nedávné době byly popsány vysokomolekulární dopravní systémy pro fluorescenční zobrazování a nádorovou chirurgii, například WO 2020/245447 A1 (fluorescenční polypeptidy). Tyto vysokomolekulární systémy slouží pro zobrazování nádorové tkáně a sice splňují podmínku biokompatibility a vyloučitelnosti, avšak žádný nepřináší selektivní zvýšení fluorescence lokálně v nádorové tkáni.Recently, high molecular weight delivery systems for fluorescence imaging and tumor surgery have been described, for example WO 2020/245447 A1 (fluorescent polypeptides). These high-molecular systems are used for imaging tumor tissue and although they meet the condition of biocompatibility and excludability, none of them bring a selective increase in fluorescence locally in the tumor tissue.
- 2 CZ 2021 - 423 A3- 2 CZ 2021 - 423 A3
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Předkládaný vynález se týká směrovaného fluorescenčního polymeru, který tvoří polymerní sondu s možností aktivace fluorescenčního signálu v místě nádorového ložiska. Fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu umožňuje cílenou akumulaci v nádorové tkáni a na ni navazující aktivaci fluorescenčního signálu pro vizualizaci nádorů. Samotný polymerní systém obsahuje polymerní nosič, fluorescenční značku navázanou vazbou, která je v nádorovém prostředí hydrolyticky, enzymaticky nebo reduktivně degrade vatelná, případně dále směrující skupinu k nádorovým nebo endoteliálním buňkám a případně zhášeč fluorescence. Výsledný fluorescenční polymer umožňuje amplifikaci signálu a dosažení významného kotrastu nádorová/zdravá tkáň v okolí nádoru tím, že dojde k aktivaci fluorescence dopravované značky až v nádorové tkáni. Zatímco výtěžek fluorescence fluorescenční značky významně klesne po navázání fluoroforu na polymerní nosič, a to z důvodu samozhášení fluorescenčních molekul lokalizovaných v blízkém okolí z důvodu nezářivého přenosu energie mezi fluorofory, po uvolnění značky z polymerního nosiče v nádorové tkáni se fluorescenční signál opět obnovuje, což vede k významnému nárůstu poměru signál versus šum právě v nádorovém prostředí. Tento překvapivý efekt zvýšení kontrastu fluorescenčního signálu mezi zdravou a nádorovou tkání nebyl dosud popsán. Kopolymery na bázi A-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) jsou vhodnými prekurzory pro přípravu popsaných fluorescenčních polymerů s aktivovatelnou fluorescencí. Podél řetězce tohoto kopolymeru jsou zavedeny fůnkční skupiny, na které lze navázat vhodné deriváty fluoroforů přes biodegradovatelné spojky a směrující skupiny. Celý systém podle předkládaného vynálezu tak umožňuje zvýšení vizualizace nádorových ložisek pro následnou chirurgickou resekci navigovanou fluorescenčním signálem. Dalším využitím je aplikace fluorescenčních polymerů pro sledování progrese a regrese nádorových onemocnění během léčby jinou terapií. S výhodou je možné fluorescenční polymery využít u nádorů, které nejsou lokalizovány v hloubce tkáně nebo které vyžadují endoskopické techniky, např. nádory hlavy a krku, prsou, kolorektální nádory a melanomy.The present invention relates to a directed fluorescent polymer, which forms a polymer probe with the possibility of activating a fluorescent signal at the site of a tumor. The fluorescent polymer according to the present invention enables targeted accumulation in tumor tissue and subsequent activation of a fluorescent signal for visualization of tumors. The polymer system itself contains a polymer carrier, a fluorescent label linked by a bond, which is hydrolytically, enzymatically or reductively degradable in the tumor environment, possibly further directing the group to tumor or endothelial cells, and possibly a fluorescence quencher. The resulting fluorescent polymer enables signal amplification and the achievement of a significant tumor/healthy tissue contrast in the vicinity of the tumor by activating the fluorescence of the transported label in the tumor tissue. While the fluorescence yield of the fluorescent label drops significantly after binding the fluorophore to the polymer carrier, due to the self-quenching of fluorescent molecules localized in the vicinity due to non-radiative energy transfer between the fluorophores, after the release of the label from the polymer carrier in the tumor tissue, the fluorescence signal is restored again, leading to to a significant increase in the signal versus noise ratio in the tumor environment. This surprising effect of increasing the fluorescence signal contrast between healthy and tumor tissue has not been described before. Copolymers based on A-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA) are suitable precursors for the preparation of the described fluorescent polymers with activatable fluorescence. Functional groups are introduced along the chain of this copolymer, to which suitable fluorophore derivatives can be attached via biodegradable links and directing groups. The entire system according to the present invention thus enables increased visualization of tumor foci for subsequent surgical resection guided by a fluorescent signal. Another use is the application of fluorescent polymers to monitor the progression and regression of cancer during treatment with another therapy. It is advantageous to use fluorescent polymers for tumors that are not localized in the depth of the tissue or that require endoscopic techniques, e.g. head and neck tumors, breast tumors, colorectal tumors and melanomas.
Předmětem předkládaného vynálezu je fluorescenční polymer využitelný pro vizualizaci nádorů, který obsahuje semitelechelický statistický lineární kopolymer, přičemž semitelechelický statistický lineární kopolymer je vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát a poly(A-(2hydroxypropyljmethakrylamid), ve kterém je od 0,1 do 10 mol. % monomerních jednotek, s výhodou 0,4 až 6 mol. % monomerníchjednotek, výhodněji 0,5 až 4 mol. % monomerníchjednotek, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek, statisticky nahrazeno monomemími jednotkami obecného vzorce (I)The subject of the present invention is a fluorescent polymer useful for tumor visualization, which contains a semitelechelic random linear copolymer, wherein the semitelechelic random linear copolymer is selected from the group including polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylate, polymethacrylate and poly(A-(2hydroxypropyljmethacrylamide), in which from 0, 1 to 10 mol % of monomer units, preferably 0.4 to 6 mol % of monomer units, more preferably 0.5 to 4 mol % of monomer units, based on the total number of monomer units, statistically replaced by monomer units of the general formula (I)
ΟΗ3η ΟΗ 3η
ðð
HNHN
A /And /
B fluoro for (I), kdeB fluoro for (I), where
A je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 7 ((Cl až C7)alkylenyl); -(CH2)P-(C(O)-NH-(CH2)r)P-;A is selected from the group consisting of a straight or branched carbon alkylenyl chain having from 1 to 7 carbons ((C1 to C7)alkylenyl); -(CH 2 ) P -(C(O)-NH-(CH 2 ) r ) P -;
-3CZ 2021 - 423 A3-3CZ 2021 - 423 A3
-(CH2)p-(C(O)-NH-(CH2)r)p-C(O)-; -(CH2)P-(C(O)-NH-(CH2)r)p-C(O)-NH-C6H4-CH2-O-C(O)-; a -(CH2)PC(O)-NH-(CH2)P-L-(CH2)p-(C(O)-NH-(CH2)r)p-C(O)-NH-C6H4-CH2-O-C(O)-, kde L je spojka obsahující triazolový můstek, vzniklý například reakcí propargylové nebo DBCO skupiny s azidovou skupinou; L tedy může mít například následující strukturu:-(CH2)p-(C(O)-NH-(CH2) r )pC(O)-; -(CH 2 ) P -(C(O)-NH-(CH 2 ) r )pC(O)-NH-C 6 H 4 -CH 2 -OC(O)-; a -(CH 2 ) P C(O)-NH-(CH2) P -L-(CH2)p-(C(O)-NH-(CH2)r)pC(O)-NH-C 6 H4- CH2-OC(O)-, where L is a coupling containing a triazole bridge, formed for example by the reaction of a propargyl or DBCO group with an azide group; Thus, L can have, for example, the following structure:
neboor
kde p je celé číslo v rozmezí od 1 do 5, a r je vybráno z 1, 2 a 3;where p is an integer ranging from 1 to 5, and r is selected from 1, 2 and 3;
přičemž jeden nebo více vodíkových atomů v CH2 skupinách substituentu A může být dále substituován stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny; s výhodou jsou těmito řetězci methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2-(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, -(CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NHC(=NH)(NH2), -(CH2)3NH-C(=O)(NH2); benzyl;wherein one or more hydrogen atoms in the CH 2 groups of the substituent A may be further substituted with the same or different side chains of a natural amino acid; these chains are preferably methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH 3 )(CH 2 CH 3 ), -CH 2 OH, -CH(OH)(CH 3 ), -CH 2 -(C 6 H 4 )OH, -(CH 2 ) 2 -S-CH 3 , CH 2 SH, -(CH 2 )4-NH 2 , -CH 2 COOH, -CH 2 C(O)NH 2 , -(CH 2 ) 2 COOH, -(CH 2 )2C(O)NH 2 , -(CH 2 ) 3 NHC(=NH)(NH 2 ), -(CH 2 ) 3 NH-C(=O)(NH 2 ); benzyl;
B je vybraný ze skupiny sestávající z vazby,B is selected from the group consisting of bond,
fluorofor (fluorofor nebo jeho aminoderivát, NCS ester nebo N-hydroxysukcinimidylový derivát) má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 ^-C nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1200 nm, a je kovalentně vázán k =CH-, nebofluorophore (fluorophore or its amino derivative, NCS ester or N-hydroxysuccinimidyl derivative) has a molecular weight in the range of 350 to 1500 g/mol, an excitation wavelength in the range of 300 to 850 ^-C nm and an emission wavelength in the range of 350 to 1200 nm, and is covalently bound to =CH-, or
-S-S- skupině substituentu B monomerní jednotky obecného vzorce I semitelechelického statistického lineárního kopolymeru přes svou primární aminoskupinu, nebo NCS skupinu, Nhydroxysukcinimidylovou skupinu, keto skupinu, aldehydovou skupinu nebo disulfidovou skupinu, přičemž skupiny vzniklé po navázání fluoro fóru jsou následně součástí skupiny B;-S-S- group of the substituent B of the monomer unit of the general formula I of the semitelechelic statistical linear copolymer through its primary amino group, or NCS group, Nhydroxysuccinimidyl group, keto group, aldehyde group or disulfide group, while the groups formed after the binding of fluorophore are subsequently part of group B;
přičemž když B je vazba, potom A je -(CH2)P-(C(O)-NH-(CH2)r)P-C(O)-; nebowherein when B is a bond, then A is -(CH 2 ) P -(C(O)-NH-(CH 2 ) r ) P -C(O)-; or
-(CH2)P-(C(O)-NH-(CH2)r)P-C(O)-NH-C6H4-CH2-O-C(O)-; nebo-(CH 2 ) P -(C(O)-NH-(CH 2 ) r ) P -C(O)-NH-C 6 H 4 -CH 2 -OC(O)-; or
-(CH2)P-C(O)-NH-(CH2)P-L-(CH2)P-(C(O)-NH-(CH2)r)P-C(O)-NH-C6H4-CH2-O-C(O)-;-(CH 2 ) P -C(O)-NH-(CH2) P -L-(CH2) P -(C(O)-NH-(CH2) r ) P -C(O)-NH-C6H4- CH 2 -OC(O)-;
a přičemž molekulová hmotnost Mn fluorescenčního polymeruje v rozmezí od 6000 do 100 000 g/mol, s výhodou od 10 000 do 60 000 g/mol, výhodněji od 15 000 do 40 000 g/mol (což odpovídá 100 až 280 monomerním jednotkám), výhodněji od 20 000 do 30 000 g/mol (což odpovídá 134 až 210 monomerním jednotkám).and wherein the molecular weight M n of the fluorescent polymer ranges from 6000 to 100,000 g/mol, preferably from 10,000 to 60,000 g/mol, more preferably from 15,000 to 40,000 g/mol (corresponding to 100 to 280 monomer units) , more preferably from 20,000 to 30,000 g/mol (corresponding to 134 to 210 monomer units).
Fluorofor je tedy k postrannímu řetězci semitelechelického statistického lineárního kopolymeru navázaný labilní hydrazonovou nebo disulfidovou vazbou nebo peptidovou spojkou (Val-Cit (NH-CH(C(CH3)2)-C(=O)-NH-CH((CH2)3-NH-C(=O)-NH2)-C(=O)-), Val-Cit-Aba spojkou (-NH-4CZ 2021 - 423 A3The fluorophore is thus attached to the side chain of the semitelechelic random linear copolymer by a labile hydrazone or disulfide bond or a peptide bond (Val-Cit (NH-CH(C(CH3) 2 )-C(=O)-NH-CH((CH 2 )3 -NH-C(=O)-NH 2 )-C(=O)-), Val-Cit-Aba coupling (-NH-4CZ 2021 - 423 A3
CH(C(CH3)2)-C(=O)-NH-CH((CH2)3-NH-C(=O)-NH2)-C(=O)-NH-C6H4-CH2-O-C(=O)-), která je v nádorovém prostředí hydrolyticky, enzymaticky a/nebo reduktivně degradovatelná.CH(C(CH3)2)-C(=O)-NH-CH((CH2)3-NH-C(=O)-NH2)-C(=O)-NH-C6H4-CH2-O-C(= O)-), which is hydrolytically, enzymatically and/or reductively degradable in the tumor environment.
Přirozenými aminokyselinami se rozumí histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, asparagová kyselina, asparagin, glutamová kyselina, serin, selenocystein. Postranními řetězci jsou řetězce navázané na alfa-uhlíku aminokyseliny.Natural amino acids are histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, arginine, cysteine, glutamine, glycine, proline, tyrosine, alanine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, serine, selenocysteine. Side chains are chains attached to the alpha-carbon of an amino acid.
Termín „alkylenyl“ značí dvouvazný lineární nebo rozvětvený uhlíkový řetězec, například -CH2, -(CH2)2—, -(CH2)5- nebo -(CH2)2—(CH(CH3))-CH2—.The term "alkylenyl" means a divalent linear or branched carbon chain, for example -CH 2 , -(CH 2 ) 2 -, -(CH 2 ) 5 - or -(CH 2 ) 2 -(CH(CH 3 ))-CH 2 -.
Fluoroforem je míněna organická molekula s alespoň jedním aromatickým jádrem schopná fluorescence, připojená k substituentu B kovalentní vazbou. Fluoroforem je fluorescenční značka nebo její derivát, obsahující amino skupinu, keto skupinu nebo S-S vazbu, přidané do struktury fluoroforu reakcí fluorescenční značky s vybranou oxokyselinou nebo činidlem obsahujícím aktivovaný disulfid, například reakcí s 3-(2-pyridyldithio)propionátem,By fluorophore is meant an organic molecule with at least one aromatic nucleus capable of fluorescence, attached to the substituent B by a covalent bond. A fluorophore is a fluorescent label or a derivative thereof, containing an amino group, a keto group or an S-S bond, added to the fluorophore structure by reacting the fluorescent label with a selected oxoacid or reagent containing an activated disulfide, for example by reacting with 3-(2-pyridyldithio)propionate,
5-cyklohexyl-5-oxopentanovou kyselinou, 4-(2-oxopropyl)benzenkarboxylovou kyselinou a 4-oxo-4-(2-pyridyl)butanovou kyselinou. Po navázání fluoroforu k substituentu B obecného vzorce (I) jsou skupiny vzniklé touto reakcí součástí výše definované skupiny B.5-cyclohexyl-5-oxopentanoic acid, 4-(2-oxopropyl)benzenecarboxylic acid and 4-oxo-4-(2-pyridyl)butanoic acid. After binding the fluorophore to the substituent B of the general formula (I), the groups formed by this reaction are part of the group B defined above.
Ve výhodném provedení je fluorofor vybraný ze skupiny zahrnující (2E)-2-[(E)-3-(7azaniumylidene-2-tert-butylchromen-4-yl)prop-2-enylidene]-1-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy6-oxohexyl]-3,3-dimethylindole-5-sulfonát (DY-615), 2-[3-[2-tert-butyl-7-[ethyl(3sulfonatopropyl)azaniumylidene]chromen-4-yl]prop-2-enylidene]-1-(5-carboxypentyl)-3,3dimethylindole-5-sulfonát sodný (DY-633), 3-(3-carboxypropyl)-2-[3-(9-ethyl-6,8,8-trimethyl-2phenylpyrano[3,2-g]quinolin-4-ylidene)prop-1-enyl]-3-methyl-1-(3-sulfonatopropyl)indol-1-ium5-sulfonát sodný (DY-676), 3-(3-carboxypropyl)-2-[3-[8,8-dimethyl-2-phenyl-6(sulfonatomethyl)-9-(3-sulfonatopropyl)pyrano[3,2-g]quinolin-4-ylidene]prop-1-enyl]-3-methyl1-(3-sulfonatopropyl)indol-1-ium-5-sulfonát sodný (DY-678), 2-[5-(2-tert-butyl-7diethylazaniumylidenechromen-4-yl)penta-2,4-dienylidene]-1-(5-carboxypentyl)-3,3dimethylindole-5-sulfonát (DY-730), 2-[5-(2-tert-butyl-9-ethyl-6,8,8-trimethylpyrano[3,2g]quinolin-4-ylidene)penta-1,3-dienyl]-1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethylindol-1-ium-5-sulfonát sodný (DY-750), 3-(3-carboxypropyl)-2-[5-(9-ethyl-6,8,8-trimethyl-2-phenylpyrano[3,2g]quinolin-4-ylidene)penta-1,3-dienyl]-3-methyl-1-(3-sulfonatopropyl)indol-1-ium-5-sulfonát sodný (DY-776), 2-[5-[4-tert-butyl-7-[ethyl(3-sulfonatopropyl)azaniumylidene]chromen-2yl]penta-2,4-dienylidene]-3-(3-carboxypropyl)-3-methyl-1-(3-sulfonatopropyl)indole-5-sulfonát sodný (DY-782), 1-[2-[dimethoxy(phenyl)methyl]phenoxy]-3,4-diphenylisoquinolin (CY-7), 1Hbenz[e]indolium, 2-[2-[3-[2-(1,3-dihydro-1,1,3-trimethyl-2H-benz[e]indol-2-ylidene)ethylidene]1 -cyclohexen-1 -yl]ethenyl]-3- [6-[(2,5-dioxo-1 -pyrrolidinyl)oxy]-6-oxohexyl] -1,1dimethylisoquinolin (CY-7.5), 4-[(2E)-2-[(2E,4E,6E)-7- [1,1 -dimethyl-3-(4sulfonatobutyl)benzo[e]indol-3-ium-2-yl]hepta-2,4,6-trienylidene]-1,1 -dimethylbenzo[e]indol-3yl]butane-1-sulfonát sodný (ICG), 2,3,5-trichloro-4-[2-[[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6oxohexyl]amino]-2-oxoethyl]sulfanyl-6-[6,7,7,19,19,20-hexamethyl-9,17-bis(sulfonatomethyl)2-oxa-20-aza-6-azoniapentacyclo[12.8.0.03,12.05,10.016,21]docosa-1(14),3,5,8,10,12,15,17,21nonaen-13-yl]benzoát (Alexa Fluor 610), popřípadě jejich deriváty obsahující funkční skupinu, vybranou z amino skupiny, isothiokyanátové skupiny a N-hydroxysukcinimidové skupiny. Popřípadě jsou fluorofory modifikovány oxokyselinami za využití amidické reakce aminoskupiny fluoroforu s aktivovaným karboxylem oxokyseliny, výsledným produktem je oxoderivát fluoroforu. Popřípadě je fluorofor modifikován cystaminem s využitím amidické vazby mezi cystamínem a fluoroforem. Popřípadě je fluorofor modifikován pomocí N-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulyl)-4-aminobenzyl (4-nitrophenyl) karbonátu nebo pomocí N-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulylu reakcí s jeho aminoskupinou.In a preferred embodiment, the fluorophore is selected from the group comprising (2E)-2-[(E)-3-(7azaniumylidene-2-tert-butylchromen-4-yl)prop-2-enylidene]-1-[6-(2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy6-oxohexyl]-3,3-dimethylindole-5-sulfonate (DY-615), 2-[3-[2-tert-butyl-7-[ethyl(3sulfonatopropyl)azaniumylidene]chromene Sodium -4-yl]prop-2-enylidene]-1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethylindole-5-sulfonate (DY-633), 3-(3-carboxypropyl)-2-[3-(9- Sodium ethyl 6,8,8-trimethyl-2-phenylpyrano[3,2-g]quinolin-4-ylidene)prop-1-enyl]-3-methyl-1-(3-sulfonatopropyl)indol-1-ium-5-sulfonate (DY-676), 3-(3-carboxypropyl)-2-[3-[8,8-dimethyl-2-phenyl-6(sulfonatomethyl)-9-(3-sulfonatopropyl)pyrano[3,2-g] Sodium quinolin-4-ylidene]prop-1-enyl]-3-methyl 1-(3-sulfonatopropyl)indol-1-ium-5-sulfonate (DY-678), 2-[5-(2-tert-butyl- 7-diethylazaniumylidenechromen-4-yl)penta-2,4-dienylidene]-1-(5-carboxypentyl)-3,3dimethylindole-5-sulfonate (DY-730), 2-[5-(2-tert-butyl-9- ethyl 6,8,8-trimethylpyrano[3,2g]quinolin-4-ylidene)penta-1,3-dienyl]-1-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethylindol-1-ium-5-sulfonate sodium (DY-750), 3-(3-carboxypropyl)-2-[5-(9-ethyl-6,8,8-trimethyl-2-phenylpyrano[3.2g]quinolin-4-ylidene)penta-1 Sodium ,3-dienyl]-3-methyl-1-(3-sulfonatopropyl)indol-1-ium-5-sulfonate (DY-776), 2-[5-[4-tert-butyl-7-[ethyl( Sodium 3-sulfonatopropyl)azaniumylidene]chromen-2yl]penta-2,4-dienylidene]-3-(3-carboxypropyl)-3-methyl-1-(3-sulfonatopropyl)indole-5-sulfonate (DY-782), 1-[2-[dimethoxy(phenyl)methyl]phenoxy]-3,4-diphenylisoquinoline (CY-7), 1Hbenz[e]indolium, 2-[2-[3-[2-(1,3-dihydro- 1,1,3-trimethyl-2H-benz[e]indol-2-ylidene)ethylidene]1-cyclohexen-1-yl]ethenyl]-3-[6-[(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl) oxy]-6-oxohexyl]-1,1dimethylisoquinoline (CY-7.5), 4-[(2E)-2-[(2E,4E,6E)-7- [1,1-dimethyl-3-(4sulfonatobutyl)benzo Sodium [e]indol-3-ium-2-yl]hepta-2,4,6-trienylidene]-1,1-dimethylbenzo[e]indol-3yl]butane-1-sulfonate (ICG), 2,3, 5-trichloro-4-[2-[[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6oxohexyl]amino]-2-oxoethyl]sulfanyl-6-[6,7,7,19,19, 20-Hexamethyl-9,17-bis(sulfonatomethyl)2-oxa-20-aza-6-azoniapentacyclo[12.8.0.03,12.05,10.016,21]docosa-1(14),3,5,8,10,12 . Optionally, fluorophores are modified with oxoacids using the amide reaction of the amino group of the fluorophore with the activated carboxyl of the oxoacid, the resulting product is an oxoderivative of the fluorophore. Optionally, the fluorophore is modified with cystamine using an amide bond between the cystamine and the fluorophore. Optionally, the fluorophore is modified with N-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulyl)-4-aminobenzyl (4-nitrophenyl) carbonate or with N-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulyl) by reaction with its amino group.
- 5 CZ 2021 - 423 A3- 5 CZ 2021 - 423 A3
Příkladem fluoroforu, který lze úspěšně navázat ke skupině B obecného vzorce (I), jsou komerčně dostupné: DY-782, DY-782-NHS ester, DY-728-karboxylová kyselina, DY-728-maleimid, DY728-amin, DY-728-azid, DY-676, DY-676-NHS ester, DY-676-karboxylová kyselina, DY-676maleimid, DY-676-amin, Cy7, Cy7-NHS ester, Cy7-amin, Cy7,5, Cy7,5-NHS ester, Cy7,5-amin, Cy7,5-azid. Fluorofor může být ke skupině B navázaný přes oligopeptidovou spojku o počtu aminokyselin 2 až 5 enzymaticky degradovatelnou lysosomálními enzymy, pH-sensitivní hydrolyticky degradovatelnou hydrazonovou vazbou nebo reduktivně biodegradovatelnou disulfidovou vazbu, které umožňující kontrolované uvolnění fluoroforu v nádorovém prostředí. Oligopeptidovou spojkou o počtu aminokyselin 2 až 5 může být například Val-Cit nebo Val-CitAba.An example of a fluorophore that can be successfully attached to group B of general formula (I) are commercially available: DY-782, DY-782-NHS ester, DY-728-carboxylic acid, DY-728-maleimide, DY728-amine, DY- 728-azide, DY-676, DY-676-NHS ester, DY-676-carboxylic acid, DY-676maleimide, DY-676-amine, Cy7, Cy7-NHS ester, Cy7-amine, Cy7.5, Cy7.5 -NHS ester, Cy7,5-amine, Cy7,5-azide. The fluorophore can be linked to group B via an oligopeptide link of 2 to 5 amino acids that can be enzymatically degradable by lysosomal enzymes, a pH-sensitive hydrolytically degradable hydrazone bond or a reductively biodegradable disulfide bond, which enables the controlled release of the fluorophore in the tumor environment. An oligopeptide linker of 2 to 5 amino acids can be, for example, Val-Cit or Val-CitAba.
Koncové skupiny výsledného fluorescenčního polymeru obsahují části molekul iniciátoru polymerizace a přenosového činidla. Iniciátorem může být například 2,2'-azobis[N-(2karboxyethyl)-2-methylpropionamidin] (V-70)) a přenosovým činidlem může být například N-(3azidopropyl)-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamid (CTA-N3)), popřípadě jejich deriváty vzniklé reakcí například s 2,2'-azobisisobutyronitrilem (AIBN). Koncové skupiny kopolymeru tudíž obsahují azidovou skupinu, která může být následně dále modifikována reakcí s dibenzocyklooktyn-maleinimidem (DBCO-MI) na další maleinimidovou reaktivní funkční skupinu, reakcí s dibenzocyklooktyn-karboxylem (DBCO-Cbx), který se následně modifikuje thiazolidin-2-thionem na thiazolidin-2-thionovou reaktivní funkční skupinu, reakcí s dibenzocyklooktyn-N-hydroxysukcinimidylesterem (DBCO-NHS) na Nhydroxysukcinimidylesterovou reaktivní funkční skupinu.The end groups of the resulting fluorescent polymer contain portions of the polymerization initiator and transfer agent molecules. The initiator can be, for example, 2,2'-azobis[N-(2carboxyethyl)-2-methylpropionamidine] (V-70)) and the transfer agent can be, for example, N-(3azidopropyl)-4-ethylsulfanylcarbothioylsulfanyl-4-methyl-pentanamide (CTA -N3)), or their derivatives formed by reaction with, for example, 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN). The end groups of the copolymer therefore contain an azide group, which can subsequently be further modified by reaction with dibenzocyclooctyne-maleimide (DBCO-MI) to another reactive maleimide functional group, by reaction with dibenzocyclooctyne-carboxyl (DBCO-Cbx), which is subsequently modified with thiazolidine-2- thione to the thiazolidine-2-thione reactive functional group, by reaction with dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester (DBCO-NHS) to the Nhydroxysuccinimidyl ester reactive functional group.
Výše definovaný fluorescenční polymer je při biodistribuci směrovaný do tkání pevných nádorů díky své vysoké molekulové hmotnosti a tím delší době cirkulace, během které se fluorescenční polymer akumuluje v pevných nádorech (EPR efekt - Enhanced Permeability and Retention Effect).During biodistribution, the fluorescent polymer defined above is directed to the tissues of solid tumors due to its high molecular weight and the longer circulation time during which the fluorescent polymer accumulates in solid tumors (EPR effect - Enhanced Permeability and Retention Effect).
V jednom provedení fluorescenční polymer dále obsahuje směrující skupiny pro posílení směrování fluorescenčního polymeru do nádorových tkání. Tyto směrující skupiny mohou být navázány na koncové skupiny lineárního řetězce fluorescenčního polymeru a/nebo mohou být navázány na postranní řetězce.In one embodiment, the fluorescent polymer further contains directing groups to enhance targeting of the fluorescent polymer to tumor tissues. These directing groups can be attached to the terminal groups of the linear chain of the fluorescent polymer and/or they can be attached to the side chains.
Směrující skupina pro směrování fluorescenčního polymeru k nádorovým buňkám nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia, je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20, a proteiny, s výhodou protilátky, výhodněji monoklonální protilátky, směrující k nádorovým buňkách nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia.The directing group for directing the fluorescent polymer to the tumor cells of head and neck tumors, breast tumors, melanomas and colorectal tumors or to tumor endothelium cells is selected from the group comprising oligopeptides with a number of amino acids from 3 to 20, and proteins, preferably antibodies, more preferably monoclonal antibodies targeting tumor cells of head and neck tumors, breast tumors, melanomas and colorectal tumors or tumor endothelial cells.
Ve výhodném provedení jsou oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20 vybrané ze skupiny, zahrnující YESIKVAVS, SIGYPLP, RGD a cRGD (nádorové endothelium), CPLHQRPMC (nádory prostaty), NPVVGYIGERPQYRDL zvaný GE7 a YHWYGYTPQNVI zvaný GE11 (k EGF receptoru), WHYPWFQNWAMA (buňky nádorů hlavy a krvu), DMPGTVLP (nádory prsu), CNGRC, cyklickým RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV. Oligopeptidy a proteiny, které směrují k nádorovým tkáním v těle, jsou odborníkovi v oboru známé.In a preferred embodiment, oligopeptides with a number of amino acids from 3 to 20 are selected from the group including YESIKVAVS, SIGYPLP, RGD and cRGD (tumor endothelium), CPLHQRPMC (prostate tumors), NPVVGYIGERPQYRDL called GE7 and YHWYGYTPQNVI called GE11 (to the EGF receptor), WHYPWFQNWAMA ( head and blood tumor cells), DMPGTVLP (breast tumors), CNGRC, cyclic RGDfK, HEWSYLAPYPWF and SYSMEHFRWGKPV. Oligopeptides and proteins that target tumor tissues in the body are known to those skilled in the art.
Ve výhodném provedení jsou monoklonální protilátky vybrané ze skupiny zahrnující herceptin, erbitux, daratuzumab, trastuzumab.In a preferred embodiment, the monoclonal antibodies are selected from the group including herceptin, erbitux, daratuzumab, trastuzumab.
V provedení, kde jsou směrující skupiny navázané na koncové skupiny lineárního řetězce fluorescenčního polymeru, jsou tyto směrující peptidy a/nebo proteiny navázány konjugací aminoskupiny nebo zavedené propargylové, DBCO nebo SH skupiny směrujícího peptidu/proteinu s azidovou, maleinimidovou, thiazolidin-2-thionovou nebo N-hydroxysukcinimidylesterovou koncovou skupinou lineárního řetězce fluorescenčního polymeru.In embodiments where the directing groups are attached to the terminal groups of the linear chain of the fluorescent polymer, these directing peptides and/or proteins are attached by conjugation of the amino group or introduced propargyl, DBCO, or SH groups of the directing peptide/protein with an azide, maleimide, thiazolidine-2-thione, or by the N-hydroxysuccinimidyl ester end group of the linear chain of the fluorescent polymer.
- 6 CZ 2021 - 423 A3- 6 CZ 2021 - 423 A3
V provedení, kde jsou směrující skupiny navázané na postranní řetězce fluorescenčního polymeru, obsahuje fluorescenční polymer definovaný výše rovněž monomerní jednotky obecného vzorce (Π) (II), kde A je definováno výše,In an embodiment where the directing groups are attached to the side chains of the fluorescent polymer, the fluorescent polymer defined above also contains monomeric units of the general formula (Π) (II) where A is defined above,
X je vazba,X is bond,
-S-S-, L, kde L je definované výše; a Z je směrující skupina pro směrování fluorescenčního polymeru k nádorovým buňkám nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia, rovněž definovaná výše, a připojená ke skupině X přes amidovou vazbu, maleinimid, azid, nebo propargyl, s výhodou je směrující skupina připojená ke skupině X přes azid nebo propargyl. Tyto směrující skupiny jsou tedy kovalentně navázané k =CH-, , -CH=CH-, CH=CH- ve struktuře DBCO, N3 nebo -S-S- skupině substituentu X monomerní jednotky obecného vzorce (II) semitelechelického statistického lineárního kopolymeru přes svou primární aminoskupinu, nebo zavedenou azidovou, propargylovou, DBCO nebo SH skupinu, přičemž skupiny vzniklé po navázání směrující skupiny jsou následně součástí skupiny X.-S-S-, L, where L is as defined above; and Z is a targeting group for directing the fluorescent polymer to tumor cells of head and neck tumors, breast tumors, melanomas, and colorectal tumors, or to tumor endothelial cells, also defined above, and attached to the X group via an amide, maleimide, azide, or propargyl bond, preferably the directing group is attached to the X group via azide or propargyl. These directing groups are thus covalently bound to =CH-, , -CH=CH-, CH=CH- in the DBCO structure, N3 or -S-S- group of the substituent X of the monomer unit of the general formula (II) of the semitelechelic random linear copolymer through its primary amino group , or an introduced azide, propargyl, DBCO or SH group, whereby the groups formed after the binding of the directing group are subsequently part of the X group.
V tomto provedení je množství monomerních jednotek obecného vzorce (II) od alespoň jedné monomerní jednotky do 8 mol. %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek.In this embodiment, the amount of monomer units of general formula (II) is from at least one monomer unit to 8 mol. %, based on the total number of monomer units.
Celkem je monomerní ch jednotek obecného vzorce (I) a (II) ve fluorescenčním polymeru nejvýše 10 mol. %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek.The total number of monomeric units of general formulas (I) and (II) in the fluorescent polymer is no more than 10 mol. %, based on the total number of monomer units.
Směrující skupina může být před konjugací s fluorescenčním polymerem popřípadě modifikována tak, aby obsahovala alespoň jednu skupinu, vybranou z -NH2, -SH, sDBCO (sulfodibenzocyklooktynová skupina), DBCO (dibenzocyklooktynová skupina), azid, propargyl, ke které je fluorescenční polymer kovalentně navázán pomocí fůnkční skupiny, s výhodou vybrané z X-hydroxysukcinimidylového esteru, thiozolidin-2-thionového amidu, malenimidu, azidu, DBCO, sDBCO, nebo propargylu. Modifikace oligopeptidů a proteinů s cílem zavést do struktury -NH2, -SH, sDBCO, DBCO nebo azid jsou odborníkovi v oboru známé.The directing group may optionally be modified prior to conjugation to the fluorescent polymer to contain at least one group selected from -NH2, -SH, sDBCO (sulfodibenzocyclooctyne group), DBCO (dibenzocyclooctyne group), azide, propargyl to which the fluorescent polymer is covalently attached by means of a functional group, preferably selected from X-hydroxysuccinimidyl ester, thiozolidine-2-thione amide, malenimide, azide, DBCO, sDBCO, or propargyl. Modifications of oligopeptides and proteins to introduce -NH 2 , -SH, sDBCO, DBCO or azide into the structure are known to those skilled in the art.
Ve výhodném provedení je semitelechelickým statistickým lineárním kopolymerem poly(V-(2hydroxypropyljmethakrylamid).In a preferred embodiment, the semitelechelic random linear copolymer is poly(V-(2-hydroxypropyl-methacrylamide).
Fluorescenční polymer může dále obsahovat od 0 do 9,9 mol. % monomerních jednotek obecného vzorce (III), vztaženo na celkový počet monomerních jednotek,The fluorescent polymer can further contain from 0 to 9.9 mol. % of monomer units of the general formula (III), based on the total number of monomer units,
CZ 2021 - 423 A3 ch3 CZ 2021 - 423 A3 ch 3
A /And /
HN (III), kde A je definováno výše a C je vybrané ze skupiny zahrnující -S-S-(CH2)2-OH , -C(=O)-NH(CH2)a-CH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; a -NH-C(=O)-CH3, přičemž a je celé číslo od 0 do 4, A je celé číslo od 0 do 3 a c je celé číslo od 1 do 4; a přičemž celkem je monomerních jednotek obecného vzorce (I), (II) a (III) ve fluorescenčním polymeru nejvýše 10 mol. %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek.HN (III) wherein A is as defined above and C is selected from the group consisting of -SS-(CH 2 ) 2 -OH, -C(=O)-NH(CH 2 ) and -CH 2 (OH); -C(=O)-NH-(CH 2 ) b -CH(OH)-CH 3 ; -C(=O)-NH-(CH 2 )b-CH(OH)-(CH 2 )c-CH 3 ; and -NH-C(=O)-CH 3 , wherein a is an integer from 0 to 4, A is an integer from 0 to 3, and c is an integer from 1 to 4; and while the total number of monomer units of the general formula (I), (II) and (III) in the fluorescent polymer is no more than 10 mol. %, based on the total number of monomer units.
S výhodou je substituent C vybraný ze skupiny zahrnující -C(=O)-NH-CH2(OH); -C(=O)-NHCH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)2-CH2(OH); -NH-C(=O)-CH3.Preferably, the substituent C is selected from the group consisting of -C(=O)-NH-CH2(OH); -C(=O)-NHCH(OH)-CH 3 ; -C(=O)-NH-(CH 2 ) 2 -CH 2 (OH); -NH-C(=O)-CH 3 .
Ve výhodném provedení je A vybraný ze skupiny zahrnující ethan-1,2-diyl (-CH2-CH2-); propan1,3-diyl (-CH2-CH2-CH2-); butan-l,4,-diyl (-CPEh-); pentan-l,5-diyl (-CH2)5-); hexan-1,6-diyl (CH2)6-); heptan-l,7-diyl (-CH2)7; -CH2-C(=O)-NH-CH2- (odvozený od dipeptidu Gly-Gly); -CH2C(=O)-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)-NH-CH2- (odvozený od tripeptidu Gly-Leu-Gly); -CH2C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH2- (odvozený od tripeptidu Gly-Phe-Gly); -CH2-C(=O)NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH2- (odvozený od tetrapeptidu Gly-Leu-Phe-Gly); -CH2-C(=O)-NH-CH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-C(=O)-NHCH(CH2Ph)-C(=O)-NH-CH2- (odvozený od pentapeptidu Gly-Phe-Leu-Phe-Gly); -(CH2)4-C(=O)NH-CH(C(CH3)2)-C(=O)-NH-CH((CH2)3-NH-C(=O)-NH2)-C(=O)-NH-C6H4-CH2-O- C(=O)(odvozený od N-(5-azidopentanoyl-valyl-citrulyl)-4-aminobenzyl carbonylu), -(CH2)4-C(=O)NH-CH(C(CH3)2)-C(=O)-NH-CH((CH2)3-NH-C(=O)-NH2)-C(=O)- (odvozený od N-(5azidopentanoyl-valyl-citrulylu).In a preferred embodiment, A is selected from the group consisting of ethane-1,2-diyl (-CH2-CH2-); propane 1,3-diyl (-CH 2 -CH 2 -CH 2 -); butane-1,4,-diyl (-CPEh-); pentane-1,5-diyl (-CH 2 ) 5 -); hexane-1,6-diyl (CH 2 ) 6 -); heptane-1,7-diyl (-CH 2 ) 7 ; -CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 - (derived from the dipeptide Gly-Gly); -CH 2 C(=O)-NH-CH(CH 2 -CH(CH 3 ) 2 )-C(=O)-NH-CH 2 - (derived from the tripeptide Gly-Leu-Gly); -CH 2 C(=O)-NH-CH(CH 2 Ph)-C(=O)-NH-CH 2 - (derived from the tripeptide Gly-Phe-Gly); -CH 2 -C(=O)NH-CH(CH2-CH(CH 3 ) 2 )-C(=O)-NH-CH(CH 2 Ph)-C(=O)-NH-CH2- (derived from the tetrapeptide Gly-Leu-Phe-Gly); -CH2-C(=O)-NH-CH(CH 2 Ph)-C(=O)-NH-CH(CH2-CH(CH 3 ) 2 )-C(=O)-NHCH(CH 2 Ph) -C(=O)-NH-CH 2 - (derived from the pentapeptide Gly-Phe-Leu-Phe-Gly); -(CH 2 ) 4 -C(=O)NH-CH(C(CH 3 ) 2 )-C(=O)-NH-CH((CH 2 ) 3 -NH-C(=O)-NH 2 )- C(=O)-NH-C 6 H4-CH2-O- C(=O)(derived from N-(5-azidopentanoyl-valyl-citrulyl)-4-aminobenzyl carbonyl), -(CH2) 4 -C( =O)NH-CH(C(CH 3 ) 2 )-C(=O)-NH-CH((CH 2 ) 3 -NH-C(=O)-NH 2 )-C(=O)- ( derived from N-(5-azidopentanoyl-valyl-citrulyl).
V jednom provedení je fluorescenčním polymerem lineární statistický kopolymer HPMA a monomerních jednotek obecného vzorce (I), popřípadě (II) a (III). Tento lineární statistický kopolymer lze zobrazit obecným vzorcem (IV), přičemž molekulová hmotnost Mn statistického lineárního kopolymeru je v rozmezí od 6 000 do 100 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 15 000 do 45 000 g/mol (což odpovídá 100 až 300 monomerním jednotkám), výhodněji je molekulová hmotnost v rozmezí od 20 000 do 40 000 g/mol (což odpovídá 134 až 280 monomerním jednotkám);In one embodiment, the fluorescent polymer is a linear random copolymer of HPMA and monomer units of general formula (I), or (II) and (III). This linear random copolymer can be represented by the general formula (IV), wherein the molecular weight M n of the random linear copolymer is in the range of 6,000 to 100,000 g/mol, preferably in the range of 15,000 to 45,000 g/mol (corresponding to 100 up to 300 monomer units), more preferably the molecular weight is in the range from 20,000 to 40,000 g/mol (corresponding to 134 to 280 monomer units);
(IV),(IV),
-8CZ 2021 - 423 A3 kde A, B, C a Z jsou definované výše, kde celkový počet monomerních jednotek ve fluorescenčním polymeru je v rozmezí od 100 do 300, zastoupení jednotek obecného vzorce (I) je v tomto statistickém lineárním kopolymeru od 0,1 do 10 mol %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek, což odpovídá počta 1 až 30 monomerních jednotek obecného vzorce (I), a zastoupení jednotek obecného vzorce (II) jev tomto statistickém lineárním kopolymeru od 0 do 8 mol %, vztaženo na počet monomerních jednotek, což odpovídá počta 0 až 24 monomerních jednotek obecného vzorce (II), a zastoupení jednotek obecného vzorce (III) je v tomto statistickém lineárním kopolymeru od 0 do 9,9 mol %, vztaženo na počet monomerních jednotek, což odpovídá počta 0 až 29 monomerních jednotek obecného vzorce (III), přičemž celkem je monomerních jednotek obecného vzorce (I) a (II) a (III) nejvýše 10 mol. %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek, což odpovídá maximálnímu celkovému počta 30 jednotek vzorce (I) + vzorce (II) + vzorce (III). Zbývající monomerní jednotky v počta cca od 270 do 298 jsou monomerní jednotky HPMA. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymeru obecného vzorce (IV) obsahují části molekul iniciátoru polymerizace a přenosového činidla, jak bylo uvedeno výše.-8CZ 2021 - 423 A3 where A, B, C and Z are defined above, where the total number of monomer units in the fluorescent polymer is in the range from 100 to 300, the representation of units of the general formula (I) in this statistical linear copolymer is from 0, 1 to 10 mol %, based on the total number of monomer units, which corresponds to the number of 1 to 30 monomer units of general formula (I), and the representation of units of general formula (II) in this statistical linear copolymer is from 0 to 8 mol %, based on the number of monomer units, which corresponds to the number of 0 to 24 monomer units of the general formula (II), and the representation of the units of the general formula (III) in this statistical linear copolymer is from 0 to 9.9 mol%, based on the number of monomer units, which corresponds to the number of 0 up to 29 monomer units of the general formula (III), while the total number of monomer units of the general formula (I) and (II) and (III) is no more than 10 mol. %, based on the total number of monomer units, which corresponds to a maximum total number of 30 units of formula (I) + formula (II) + formula (III). The remaining monomer units, numbering approximately from 270 to 298, are HPMA monomer units. The end groups of the resulting linear copolymer of general formula (IV) contain parts of the polymerization initiator and transfer agent molecules as mentioned above.
Fluorescenční polymer je semitelechelickým statistickým lineárním kopolymerem, který lze připravit radikálovou polymerizací. Koncové skupiny výsledného lineárního kopolymeru jsou zablokované například 2,2 '-azobisisobutyronitrilem (AIBN).The fluorescent polymer is a semitelechelic random linear copolymer that can be prepared by radical polymerization. The end groups of the resulting linear copolymer are blocked with, for example, 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN).
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy rovněž způsob přípravy fluorescenčního polymeru (fluorescenčního polymeru s aktivovatelnou fluorescencí a popřípadě s navázanou směrující skupinou), který obsahuje následující kroky:The subject of the present invention is therefore also a method of preparing a fluorescent polymer (fluorescent polymer with activatable fluorescence and possibly with an attached directing group), which includes the following steps:
a) poskytnutí monomerů fluorescenčního polymeru,a) provision of fluorescent polymer monomers,
b) polymerace těchto monomerů,b) polymerization of these monomers,
c) navázání fluoroforu na statistický lineární kopolymerc) linking the fluorophore to the statistical linear copolymer
d) volitelně navázání směrující struktury na fluorescenční polymer, přičemž směrující struktura je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy s počtem aminokyselin od 3 do 20 a proteiny, zejména monoklonální protilátky; přičemž směrující struktura může být navázána na konec lineárního řetězce a/nebo na postranní řetězce fluorescenčního polymery (jako součást monomerní jednotky obecného vzorce (II)).d) optionally linking the directing structure to a fluorescent polymer, wherein the directing structure is selected from the group including oligopeptides with the number of amino acids from 3 to 20 and proteins, especially monoclonal antibodies; whereby the directing structure can be attached to the end of the linear chain and/or to the side chains of the fluorescent polymer (as part of the monomer unit of general formula (II)).
ad a) Poskytnutí monomerů lineárního kopolymeru zahrnuje poskytnutí monomerů, které jsou vybrané ze skupiny zahrnující akrylamid, methakrylamid, akrylát, metakrylát, N-(2hydroxypropyljmethakrylamid (HPMA), a monomery obecného vzorce (V)and a) Providing linear copolymer monomers includes providing monomers selected from the group consisting of acrylamide, methacrylamide, acrylate, methacrylate, N-(2-hydroxypropylmethacrylamide (HPMA), and monomers of general formula (V)
A /And /
D (V), které jsou prekurzorem pro monomerní jednotky obecného vzorce (I), (II) a (III), přičemž A je definované výše;D (V), which is a precursor for the monomeric units of general formula (I), (II) and (III), where A is defined above;
a D je -karbonyl-thiazolin-2-thionová skupina (TT), (4-nitrofenyl)oxy skupina, (2,3,4,5,6pentafluorofenyljoxy skupina, (sukcinimidyl)oxy skupina, karboxylová, hydrazidová, azidová,and D is -carbonyl-thiazoline-2-thione group (TT), (4-nitrophenyl)oxy group, (2,3,4,5,6pentafluorophenyloxy group, (succinimidyl)oxy group, carboxyl, hydrazide, azide,
-9CZ 2021 - 423 A3 aktivovaná disulfidová skupina nebo NH2-skupina. Aminoskupina a hydrazidová skupina může být popřípadě chráněná chránící skupinou, například terc-butoxykarbonylovou (Boc) chránící skupinou. Karbonylem se rozumí -C(=O)- skupina.-9CZ 2021 - 423 A3 activated disulfide group or NH2-group. The amino group and the hydrazide group may optionally be protected by a protecting group, for example a tert-butoxycarbonyl (Boc) protecting group. Carbonyl means -C(=O)- group.
N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a další monomery akrylamidového, methakrylamidového, akrylátové a metakrylátové typu jsou komerčně dostupné. Poskytnutím těchto monomerů se tedy rozumí jejich komerční získání.N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA) and other monomers of the acrylamide, methacrylamide, acrylate, and methacrylate types are commercially available. The provision of these monomers therefore means their commercial acquisition.
Látky obecného vzorce (V) byly buď získány z komerčně dostupných zdrojů, např. methakryolyl6-aminopropylamin chráněný na aminových skupinách terc-butyloxykarbonylovými skupinami (MA-Pr-NH-Boc), nebo byly připraveny podle postupů uvedených literatuře (Etrych T., et al., N(2-Hydroxypropyl)methacrylamide-Based Polymer Conjugates with pH-Controlled Activation of Doxorubicin. I. New Synthesis, Physicochemical Characterization and Preliminary Biological Evaluation, J.Appl.Pol.Sci. 109, 3050-3061 (2008), V. Šubr, et al., Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups, React. Funct. Polym. 66 (12) (2006) 1525-1538. ). Poskytnutím látek obecného vzorce (V) se tedy rozumí buď jejich komerční získání nebo syntéza.Substances of the general formula (V) were either obtained from commercially available sources, e.g. methacryloyl6-aminopropylamine protected on the amine groups by tert-butyloxycarbonyl groups (MA-Pr-NH-Boc), or were prepared according to the procedures indicated in the literature (Etrych T., et al., N(2-Hydroxypropyl)methacrylamide-Based Polymer Conjugates with pH-Controlled Activation of Doxorubicin. I. New Synthesis, Physicochemical Characterization and Preliminary Biological Evaluation, J.Appl.Pol.Sci. 109, 3050-3061 (2008) , V. Šubr, et al., Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups, React. Funct. Polym. 66 (12) (2006) 1525-1538. ). The provision of substances of general formula (V) therefore means either their commercial acquisition or synthesis.
ad b) Polymerace monomerů statistického lineárního kopolymeru se provede řízenou radikálovou RAFT polymerizací (reversible addition-fragmentation chain transfer, tedy řízenou radikálovou polymerací s reverzibilně-fragmentačním přenosem řetězce) monomerů z kroku a) s obsahem od 0,1 do 10 mol. % monomerů obecného vzorce (V), a alespoň 90 mol. % (90 až 99,9 mol. %) monomerních jednotek, vybraných ze skupiny zahrnující N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA), akrylamid, methakrylamid, akrylát, metakrylát, s výhodou vybraných ze skupiny zahrnující HPMA, akrylamid, methakrylamid, nejvýhodněji HPMA. Reakce typicky probíhá při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, terc-butanol nebo jejich směsí.ad b) The polymerization of the monomers of the statistical linear copolymer is carried out by controlled radical RAFT polymerization (reversible addition-fragmentation chain transfer) of monomers from step a) with a content of 0.1 to 10 mol. % of monomers of the general formula (V), and at least 90 mol. % (90 to 99.9 mol. %) of monomer units, selected from the group including N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA), acrylamide, methacrylamide, acrylate, methacrylate, preferably selected from the group including HPMA, acrylamide, methacrylamide, most preferably HPMA. The reaction typically takes place at a temperature in the range of 30 to 100°C, preferably 40 to 80°C, and a solvent preferably selected from the group consisting of dimethylsulfoxide, dimethylacetamide, dimethylformamide, methanol, ethanol, dioxane, tetrahydrofuran, propanol, tert-butanol or their mixture.
Reakce je iniciována iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující zejména azoiniciátory 2,2'-azobis(2-methylpropionitril) (AIBN), 4,4'-azobis(4-kyanopentanová kyselina) (ACVA), 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylpentannitril) (V70), popřípadě za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou vybraného ze skupiny obsahující 2-kyano-2-propylbenzodithioát, 4-kyano-4-(thiobenzoylthio)pentanovou kyselinu, 2-kyano-2-propyldodecyltrithiokarbonát, 2kyano-2-propylethyltrithiokarbonát, 4-kyano-4[(dodecylsulfanylthiokarbonyl)sulfanyl]pentanovou kyselinu, [4-(3-azidopropylamino)-1 -kyano1-methyl-4-oxo-butyl]benzenekarbodithioát, N-(3-azidopropyl)-4-kyano-4-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-pentanamid, [1 -kyano-1 -methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3yl)butyl]benzenkarbodithioát a 2-ethylsulfanylkarbothioyl-sulfanyl-2-methyl-5-oxo-5-(2-thioxothiazolidin-3-yl)pentannitril. Molární hmotnost Mn takto připravených lineárních statistických kopolymerů je v rozmezí od 4000 do 100 000 g/mol, s výhodou 25 000 až 50 000 g/mol. Vzniklý semitelechelický lineární kopolymer obsahuje koncové reaktivní skupiny (například azidové a TT).The reaction is initiated by an initiator, preferably selected from the group including in particular the azoinitiators 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN), 4,4'-azobis(4-cyanopentanoic acid) (ACVA), 2,2'-azobis (4-methoxy-2,4-dimethylpentanenitrile) (V70), optionally in the presence of a transfer agent, preferably selected from the group containing 2-cyano-2-propylbenzodithioate, 4-cyano-4-(thiobenzoylthio)pentanoic acid, 2-cyano -2-propyldodecyltrithiocarbonate, 2-cyano-2-propylethyltrithiocarbonate, 4-cyano-4[(dodecylsulfanylthiocarbonyl)sulfanyl]pentanoic acid, [4-(3-azidopropylamino)-1-cyano1-methyl-4-oxo-butyl]benzenecarbodithioate, N- (3-Azidopropyl)-4-cyano-4-ethylsulfanylcarbothioylsulfanylpentanamide, [1-cyano-1-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3yl)butyl]benzenecarbodithioate and 2-ethylsulfanylcarbothioylsulfanyl-2- methyl 5-oxo-5-(2-thioxothiazolidin-3-yl)pentanenitrile. The Mn molar mass of linear random copolymers thus prepared is in the range from 4000 to 100,000 g/mol, preferably 25,000 to 50,000 g/mol. The resulting semitelechelic linear copolymer contains terminal reactive groups (for example, azide and TT).
Připravený lineární kopolymer z kroku b) se může popřípadě dále podrobit odstranění chránicích skupin, chránících hydrazidové skupiny postranních řetězců (například Boc-skupin). Odstranění chránicích skupin lze provést zavedenými postupy, které jsou odborníkovi v oboru známé, například odstranění Boc-skupiny pomocí kyseliny trifluoroctové nebo zahřátím kopolymeru ve vodě. Výsledný kopolymer/produkt se může skladovat bez rizika jeho dekompozice.The prepared linear copolymer from step b) can optionally be further subjected to the removal of protecting groups protecting the hydrazide groups of the side chains (for example, Boc groups). Deprotection can be accomplished by established procedures known to those skilled in the art, such as removal of the Boc group with trifluoroacetic acid or by heating the copolymer in water. The resulting copolymer/product can be stored without the risk of its decomposition.
Produktem tohoto kroku je tedy semitelechelický statistický lineární kopolymer, který obsahuje lineární polymer, vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát a poly(N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,1 do 10 mol. % monomerních jednotek statisticky nahrazeno monomerní jednotkou obecného vzorce (VI)The product of this step is thus a semitelechelic random linear copolymer, which contains a linear polymer selected from the group consisting of polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylate, polymethacrylate and poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide) in which from 0.1 to 10 mol. % monomer units statistically replaced by a monomer unit of the general formula (VI)
- 10 CZ 2021 - 423 A3 * A- 10 CZ 2021 - 423 A3 * A
D (ví), kde A a D jsou definovány výše.D (knows) where A and D are defined above.
ad c) navázání fluoroforu na skupinu D statistického lineárního kopolymeru z kroku b) se provede konjugací karbonyl-thiazolin-2-thionových skupin, (4-nitrofenyl)oxy skupin, (2,3,4,5,6pentafluorofenyljoxy skupin, (sukcinimidyl)oxy skupin, karboxylových, hydrazidových, azidových, aktivovaných disulfidových skupin a NH2-skupin (přičemž aminoskupina a hydrazidová skupina, v případě, že byla v předchozím kroku chráněna chránící skupinou, musí být před touto konjugací odchráněna) monomerních jednotek obecného vzorce (VI) semitelechelického statistického lineárního kopolymeru z kroku b), s nízkomolekulárním fluoro forem. Fluoro forem je fluorescenční značka nebo její derivát, které obsahují vhodné reaktivní skupiny (například aminovou, karboxylovou, aktivovanou karboxylovou, aktivovanou disulfidovou nebo keto skupinu) a které se mohou použít ve volné formě, nebo ve formě soli s kyselinou, např. HC1; přičemž nízkomolekulárním fluoroforemje fluorofor, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol. Fluorofor je vybrán podle excitačních a emisních vlnových délek, přičemž excitační vlnové délky jsou v rozsahu od 300 do 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu od 350 do 1 200 nm; případná molekula nízkomolekulárního fluoroforu jek lineárnímu kopolymeru navázána amidovou, disulfidovou nebo hydrazonovou vazbou.and c) binding of the fluorophore to group D of the statistical linear copolymer from step b) is carried out by conjugation of carbonyl-thiazoline-2-thione groups, (4-nitrophenyl)oxy groups, (2,3,4,5,6pentafluorophenyloxy groups, (succinimidyl) oxy groups, carboxyl, hydrazide, azide, activated disulfide groups and NH2-groups (while the amino group and the hydrazide group, in case it was protected by a protecting group in the previous step, must be protected from this conjugation) of monomeric units of the general formula (VI) of semitelechelic of the statistical linear copolymer from step b), with a low molecular weight fluoro form. A fluoro form is a fluorescent label or a derivative thereof that contains suitable reactive groups (eg amine, carboxyl, activated carboxyl, activated disulphide or keto group) and which can be used in free form or as a salt with an acid, eg HCl; wherein a low molecular weight fluorophore is a fluorophore having a molecular weight in the range of 350 to 1,500 g/mol. The fluorophore is selected according to excitation and emission wavelengths, with excitation wavelengths ranging from 300 to 850 nm and emission wavelengths ranging from 350 to 1200 nm; any molecule of a low-molecular-weight fluorophore linked to a linear copolymer by an amide, disulfide or hydrazone bond.
Produktem tohoto kroku je tedy semitelechelický statistický lineární kopolymer, obsahující monomerní jednotky obecného vzorce (I), (VI), a dále obsahujícího monomerní jednotky, vybrané ze skupiny zahrnující akrylamid, methakrylamid, akrylát, metakrylát a N-(2hydroxypropyljmethakrylamid.The product of this step is thus a semitelechelic random linear copolymer containing monomer units of general formula (I), (VI), and further containing monomer units selected from the group including acrylamide, methacrylamide, acrylate, methacrylate and N-(2-hydroxypropyl-methacrylamide).
ad dl) navázání směrující struktury na monomerní jednotky obecného vzorce (VI) semitelechelického statistického lineárního kopolymeru z kroku c) - krok konjugace směrující struktury se zavedenými amino skupinami, SH, azidovými, propargylovými sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami ke skupině D definované výše. Směrující struktura je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20, a proteiny, s výhodou protilátky, výhodněji monoklonální protilátky, směrující k nádorovým buňkách nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia, přičemž oligopeptidy jsou navázanány pomocí click reakci koncového azidu s DBZO skupinami na polymeru; protilátky jsou navázány click reakcí koncové maleinimidové skupiny semitelechelického fluorescenčního polymeru s thiolovou skupinou molekuly protilátky zavedenou mírnou redukcí.ad dl) linking the directing structure to the monomer units of the general formula (VI) of the semitelechelic random linear copolymer from step c) - step of conjugation of the directing structure with introduced amino groups, SH, azide, propargyl sulfodibenzocyclooctyne (sDBCO) or dibenzocyclooctyne (DBCO) groups to group D defined above. The targeting structure is selected from the group comprising oligopeptides with a number of amino acids from 3 to 20, and proteins, preferably antibodies, more preferably monoclonal antibodies, targeting tumor cells of head and neck tumors, breast tumors, melanomas and colorectal tumors or tumor endothelium cells, wherein oligopeptides are attached using a click reaction of the terminal azide with DBZO groups on the polymer; antibodies are linked by a click reaction of the terminal maleimide group of the semitelechelic fluorescent polymer with the thiol group of the antibody molecule introduced by mild reduction.
Ve výhodném provedení jsou oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20 vybrané ze skupiny, zahrnující YESIKVAVS, SIGYPLP, RGD a cRGD (nádorové endothelium), CPLHQRPMC (nádory prostaty), NPWGYIGERPQYRDL zvaný GE7 a YHWYGYTPQNVI zvaný GE11 (k EGF receptoru), WHYPWFQNWAMA (buňky nádorů hlavy a krvu), DMPGTVLP (nádory prsu), CNGRC, cyklickým RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV. Oligopeptidy a proteiny, které směrují k nádorovým tkáním v těle, jsou odborníkovi v oboru známé.In a preferred embodiment, oligopeptides with a number of amino acids from 3 to 20 are selected from the group including YESIKVAVS, SIGYPLP, RGD and cRGD (tumor endothelium), CPLHQRPMC (prostate tumors), NPWGYIGERPQYRDL called GE7 and YHWYGYTPQNVI called GE11 (to the EGF receptor), WHYPWFQNWAMA ( head and blood tumor cells), DMPGTVLP (breast tumors), CNGRC, cyclic RGDfK, HEWSYLAPYPWF and SYSMEHFRWGKPV. Oligopeptides and proteins that target tumor tissues in the body are known to those skilled in the art.
Ve výhodném provedení jsou monoklonální protilátky vybrané ze skupiny zahrnující herceptin, erbitux, daratuzumab, trastuzumab. Peptidové a proteinové struktury se zavedenými aminoIn a preferred embodiment, the monoclonal antibodies are selected from the group including herceptin, erbitux, daratuzumab, trastuzumab. Peptide and protein structures with introduced aminos
- 11 CZ 2021 - 423 A3 skupinami, azidovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami; skupiny fluorescenčního polymeru reagují s -NH2, propargylovými, sDBCO nebo DBCO skupinami přítomnými na směrující struktuře v řádu jednotek minut a vysokým výtěžkem a výsledný konjugát si zachovává neovlivněný biologický účinek.- 11 CZ 2021 - 423 A3 groups, azide, sulfodibenzocyclooctyne (sDBCO) or dibenzocyclooctyne (DBCO) groups; groups of the fluorescent polymer react with -NH2, propargyl, sDBCO, or DBCO groups present on the directing structure in minutes and in high yield, and the resulting conjugate retains its biological activity unaffected.
ad d2) navázání směrující struktury na konce semitelechelického statistického lineárního fluorescenčního polymeru z kroku c)and d2) linking the directing structure to the ends of the semitelechelic statistical linear fluorescent polymer from step c)
- krok konjugace směrující struktury s amino skupinami, zavedenými SH, azidovými, propargylovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami ke koncové skupině lineárního polymeru, kterou může být meleinimidylová skupina, TT skupina, azid, propargyl, DBCO, nebo sDBCO. Směrující struktura je definovaná výše.- a step of conjugation of the directing structure with amino groups introduced by SH, azide, propargyl, sulfodibenzocyclooctyne (sDBCO) or dibenzocyclooctyne (DBCO) groups to the terminal group of the linear polymer, which can be a meleinimidyl group, a TT group, azide, propargyl, DBCO, or sDBCO. The routing structure is defined above.
Případné nezreagované skupiny D (thiazolidin-2-thionové skupiny, (2,3,4,5,6pentafluorofenyl)oxy skupiny, (sukcinimidyl)oxy skupiny) se mohou odstranit reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); NH2-(CH2)b-CH(OH)CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4, s výhodou s 1-aminopropan-2-olem, a/nebo se případné nezreagované NH2 skupiny mohou odstranit reakcí s acetythiazolidin-2-thionem, a/nebo se případné nezreagované disulfidové skupiny odstraní reakcí s 2-Hydroxyethanethiolem;Any unreacted D groups (thiazolidine-2-thione groups, (2,3,4,5,6pentafluorophenyl)oxy groups, (succinimidyl)oxy groups) can be removed by reaction with an amino alcohol selected from the group consisting of NH2-(CH2)a- CH 2 (OH); NH2-(CH2)b-CH(OH)CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; where a is an integer from 0 to 4, b is an integer from 0 to 3 and c is from 1 to 4, preferably with 1-aminopropan-2-ol, and/or any unreacted NH2 groups can be removed by reaction with acetythiazolidin- 2-thione, and/or any unreacted disulfide groups are removed by reaction with 2-Hydroxyethanethiol;
za vzniku skupiny C, vybrané ze skupiny zahrnující karboxyl; hydrazid; azid; -S-S-(CH2)2-OH, C(=O)-NH-(CH2)a-CH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)(CH2)c-CH3; a -NH-C(=O)-CH3, přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je celé číslo od 1 do 4, s výhodou za vzniku skupiny -C(=O)-NH-CH2(OH), -C(=O)-NH-CH(OH)CH3, -C(=O)-NH-(CH2)2-CH2(OH) nebo -NH-C(=O)-CH3. Karboxyly, hydrazidy a azidy není nutné odstraňovat.to form a group C selected from the group consisting of carboxyl; hydrazide; azide; -S-S-(CH2)2-OH, C(=O)-NH-(CH2)a-CH2(OH); -C(=O)-NH-(CH 2 ) b -CH(OH)-CH 3 ; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)(CH2)c-CH3; and -NH-C(=O)-CH3, wherein a is an integer from 0 to 4, b is an integer from 0 to 3, and c is an integer from 1 to 4, preferably forming the group -C(=O) -NH-CH2(OH), -C(=O)-NH-CH(OH)CH3, -C(=O)-NH-(CH2)2-CH2(OH) or -NH-C(=O) -CH3. Carboxyls, hydrazides and azides do not need to be removed.
Produktem tohoto kroku je fluorescenční polymer dle předkládaného vynálezu, tedy semitelechelický statistický lineární kopolymer, obsahující monomerní jednotky obecného vzorce (I), popřípadě (II), a popřípadě (III), definované výše, a dále obsahujícího monomerní jednotky, vybrané ze skupiny zahrnující akrylamid, methakrylamid, akrylát, metakrylát a N-(2hydroxypropyl)methakrylamid.The product of this step is a fluorescent polymer according to the present invention, i.e. a semitelechelic random linear copolymer, containing monomeric units of the general formula (I), optionally (II), and optionally (III), defined above, and further containing monomeric units selected from the group comprising acrylamide , methacrylamide, acrylate, methacrylate and N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále hvězdicový fluorescenční polymer, který obsahuje multivalentní nosič, ke kterému je navázaný alespoň jeden fluorescenční polymer dle předkládaného vynálezu, přičemž multivalentní nosič je vybraný ze skupiny zahrnující poly(amidoaminový) dendrimer druhé nebo třetí generace, 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer nebo dendron druhé až čtvrté generace; polyoly o počtu hydroxylových skupin od 2 do 8, glycerol, penta-erythritol, bis(2-hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan, dipentaerythritol.The subject of the present invention is also a star-shaped fluorescent polymer that contains a multivalent carrier to which at least one fluorescent polymer according to the present invention is bound, wherein the multivalent carrier is selected from the group including poly(amidoamine) dendrimer of the second or third generation, 2,2-bis( second to fourth generation hydroxymethyl)propion dendrimer or dendron; polyols with the number of hydroxyl groups from 2 to 8, glycerol, penta-erythritol, bis(2-hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methane, dipentaerythritol.
V jednom provedení je hvězdicovým fluorescenčním polymerem kopolymer obecného vzorce (VII), který obsahuje multivalentní nosič a alespoň jeden fluorescenční polymer obecného vzorce (IV), definovaný výše.In one embodiment, the star fluorescent polymer is a copolymer of general formula (VII) that contains a multivalent carrier and at least one fluorescent polymer of general formula (IV), defined above.
- 12 CZ 2021 - 423 A3- 12 CZ 2021 - 423 A3
kde multivalentním nosičem je poly(amidoaminový) (PAMAM) dendrimer (například s jádrem etylendiaminovým, 1,4-diaminobutanovým, 1,6-diaminohexanovým, 1,12-diaminododekanovým, cystaminovým ) druhé nebo třetí generace nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer nebo dendron (například s trimethylol propanovým jádrem) druhé až čtvrté generace; polyoly o počtu hydroxylových skupin od 2 do 8, například ethylenglykol, polyethylenglycol, trimethyllolpropan (l,l,l-tris(hydroymethyl)propan), glycerol, penta-erythritol, bis(2hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan, dipentaerythritol;where the multivalent carrier is a poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimer (for example with an ethylenediamine, 1,4-diaminobutane, 1,6-diaminohexane, 1,12-diaminododecane, cystamine) dendrimer of the second or third generation or 2,2-bis(hydroxymethyl )propion dendrimer or dendron (for example, with a trimethylol propane core) of the second to fourth generation; polyols with the number of hydroxyl groups from 2 to 8, for example ethylene glycol, polyethylene glycol, trimethylolpropane (1,1,1-tris(hydroymethyl)propane), glycerol, penta-erythritol, bis(2hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methane, dipentaerythritol;
přičemž A, B, C a Z jsou definovány výše;wherein A, B, C and Z are as defined above;
Y je vybrané ze skupiny sestávající z primární aminoskupiny; primární hydroxy skupiny; alkynové skupiny o počtu uhlíků od 3 do 6, např. propargylu; a cyklooktynové skupiny, která může být popřípadě dále nezávisle substituována jednou nebo více skupinami vybranými z alkylové skupiny o počtu uhlíků od 1 do 6 a arylu o počtu uhlíků 6, např. DBCO;Y is selected from the group consisting of a primary amino group; primary hydroxy groups; alkyne groups with a number of carbons from 3 to 6, e.g. propargyl; and a cyclooctyne group, which may optionally be further independently substituted by one or more groups selected from an alkyl group having 1 to 6 carbons and an aryl having 6 carbons, e.g. DBCO;
W je amidická vazba mezi primární amino skupinou Y multivalentního nosiče a karboxylovou koncovou skupinou polymeru obecného vzorce (IV); nebo esterová vazba mezi primární hydroxy skupinou Y multivalentního nosiče a karboxylovou koncovou skupinou polymeru obecného vzorce (IV) nebo triazolová spojka, vzniklá reakcí azidové koncové skupiny polymeru obecného vzorce (IV) a alkynové nebo cykloalkynové skupiny Y dendrimeru nebo dendronu (multivalentního nosiče).W is an amide bond between the primary amino group Y of the multivalent carrier and the carboxyl terminal group of the polymer of general formula (IV); or an ester bond between the primary hydroxy group Y of the multivalent support and the carboxyl end group of the polymer of the general formula (IV) or a triazole coupling, formed by the reaction of the azide end group of the polymer of the general formula (IV) and the alkyne or cycloalkyne group Y of the dendrimer or dendron (multivalent support).
Hvězdicovitý fluorescenční kopolymer tedy sestává z centrální molekuly nosiče (například PAMAM dendrimeru, 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimeru nebo dendronu nebo polyolu) na jehož koncové skupiny je navázán alespoň jeden řetězec fluorescenčního polymeru, s výhodou lineárního statistického kopolymeru obecného vzorce (IV), definovaného výše. Koncové skupiny multivalentního nosiče jsou amino skupiny, hydroxy skupiny nebo alkynové skupiny o počtu uhlíků od 3 do 6, např. propargyl, nebo cyklooktynové skupiny, která může být popřípadě dále nezávisle substituována jednou nebo více skupinami vybranými z alkylové skupiny o počtu uhlíků od 1 do 6 a arylu o počtu uhlíků 6, např. DBCO, a fluorescenční polymer (například lineární kopolymer vzorce (IV) je k nim navázán přes amidickou, esterovou nebo triazolovou spojku.A star-shaped fluorescent copolymer therefore consists of a central carrier molecule (for example PAMAM dendrimer, 2,2-bis(hydroxymethyl)propion dendrimer or dendron or polyol) to the end groups of which at least one chain of fluorescent polymer is bound, preferably a linear statistical copolymer of the general formula (IV ), defined above. End groups of the multivalent carrier are amino groups, hydroxy groups or alkyne groups with a number of carbons from 3 to 6, e.g. propargyl, or a cyclooctyne group, which can optionally be further independently substituted by one or more groups selected from an alkyl group with a number of carbons from 1 to 6 and an aryl with a carbon number of 6, e.g. DBCO, and a fluorescent polymer (for example, a linear copolymer of formula (IV) is attached to them via an amide, ester or triazole linkage.
S výhodou hvězdicovitý fluorescenční kopolymer obsahuje od 2 do 48 navázaných řetězců fluorescenčního polymeru, výhodněji 3 až 32 navázaných řetězců fluorescenčního polymeru, nej výhodněji 4 až 24 navázaných řetězců fluorescenčního polymeru. V nej výhodnějším provedení je fluorescenčním polymerem lineární statistický kopolymer obecného vzorce (IV).Preferably, the star-shaped fluorescent copolymer contains from 2 to 48 linked fluorescent polymer chains, more preferably 3 to 32 linked fluorescent polymer chains, most preferably 4 to 24 linked fluorescent polymer chains. In the most preferred embodiment, the fluorescent polymer is a linear statistical copolymer of general formula (IV).
Molární hmotnost Mn hvězdicového fluorescenčního kopolymeru je s výhodou v rozmezí od 60 000 do 1 000 000 g/mol, s výhodou 70 000 až 400 000 g/mol. Molární hmotnost každého řetězce fluorescenčního polymeru, navázaného na multivalentní nosič, je od 6000 do 100 000 g/mol, s výhodou 40 000 až 70 000 g/mol, zatímco molární hmotnost samotného multivalentního nosiče,The molar mass of the Mn star fluorescent copolymer is preferably in the range of 60,000 to 1,000,000 g/mol, preferably 70,000 to 400,000 g/mol. The molar mass of each chain of the fluorescent polymer bound to the multivalent carrier is from 6000 to 100,000 g/mol, preferably 40,000 to 70,000 g/mol, while the molar mass of the multivalent carrier itself,
- 13 CZ 2021 - 423 A3 který je součástí hvězdicovitého fluorescenčního kopolymeru, nepřesahuje 50 000 g/mol. Tím je zajištěno, že po rozpadu hvězdicovitého fluorescenčního kopolymeru na multivalentní nosič a fluorescenční polymer v nádorové tkáni a po uvolnění fluoro fóru, mají všechny výsledné fragmenty molekulovou hmotnost pod limitem renální filtrace, a jsou tedy dobře odstranitelné z organismu renální filtrací.- 13 CZ 2021 - 423 A3, which is part of the star-shaped fluorescent copolymer, does not exceed 50,000 g/mol. This ensures that after the disintegration of the star-shaped fluorescent copolymer into a multivalent carrier and a fluorescent polymer in the tumor tissue and after the release of the fluorophore, all the resulting fragments have a molecular weight below the renal filtration limit and are therefore easily removed from the body by renal filtration.
Způsob přípravy hvězdicového polymeru obecného vzorce (VII) je znázorněn ve Schématu 1.The method of preparing the star polymer of general formula (VII) is shown in Scheme 1.
Schéma 1. Schéma přípravy hvězdicovitého kopolymeru, kde n je celé číslo v rozmezí od 1 do 48, kde Y je primární aminoskupina, hydroxyskupina, C3-C6 alkynová skupina nebo cyklooktynová skupina poly(amidoaminového) nebo 2,2-bis(hydroxymethyl)propionového dendrimeru nebo dendronu nebo polyolu;Scheme 1. Schematic of the preparation of a star copolymer, where n is an integer ranging from 1 to 48, where Y is a primary amino group, a hydroxy group, a C3-C6 alkyne group, or a cyclooctyne group of poly(amidoamine) or 2,2-bis(hydroxymethyl)propion of a dendrimer or dendron or polyol;
V je azidová nebo TT koncová reaktivní skupina zavedená přenosovým činidlem na konec polymerního řetězce fluorescenčního polymeru obecného vzorce (IV) při RAFT polymeraci;V is an azide or TT terminal reactive group introduced by a transfer agent to the end of the polymer chain of the fluorescent polymer of general formula (IV) during RAFT polymerization;
W je amidická vazba, esterová vazba nebo triazolová spojka, vzniklá reakcí azidu polymeru obecného vzorce (IV) a alkynové skupiny nebo cykloalkynové skupiny multivalentního nosiče.W is an amide bond, an ester bond or a triazole bond formed by the reaction of the azide of the polymer of general formula (IV) and the alkyne group or cycloalkyne group of the multivalent carrier.
Příklady schematických struktur multivalentních nosičů pro přípravu hvězdicovitých fluorescenčních polymerů jsou uvedené ve Schématu 2 níže:Examples of schematic structures of multivalent carriers for the preparation of star-shaped fluorescent polymers are shown in Scheme 2 below:
- 14 CZ 2021 - 423 A3- 14 CZ 2021 - 423 A3
(ϋ)(ϋ)
- 15 CZ 2021 - 423 A3- 15 CZ 2021 - 423 A3
- 16CZ 2021 - 423 A3 mh2 - 16CZ 2021 - 423 A3 mh 2
(v)(in)
Schéma 2: Příklady struktur multivalentních nosičů pro syntézu hvězdicovitého fluorescenčního kopolymeru: i) schematické zobrazení bis-MPA dendronu s DBCO skupinami, ii) PAMAM dendrimeru s amino skupinami, iii) bis-MPA dendrimeru s propargylovými skupinami, iv) polyolů o počtu hydroxylů od 4 do 8; a v) příklad struktury hvězdicovitého fluorescenčního kopolymeru s nosičem PAMAM dendrimeru, ve kterém jsou řetězce obsahující lineární fluorescenční polymer vyznačeny schematicky vlnovkou. Maximální počet řetězců lineárního fluorescenčního polymeru, které je možné navázat na multivalentní nosič (například dendrimer), je rovný počtu koncových skupin multivalentního nosiče (v tomto případě 16 koncových amino skupin dendrimeru).Scheme 2: Examples of structures of multivalent carriers for the synthesis of star-shaped fluorescent copolymer: i) schematic representation of bis-MPA dendron with DBCO groups, ii) PAMAM dendrimer with amino groups, iii) bis-MPA dendrimer with propargyl groups, iv) polyols with hydroxyl number from 4 to 8; and v) an example of the structure of a star-shaped fluorescent copolymer with a PAMAM dendrimer support, in which the chains containing the linear fluorescent polymer are marked schematically with a wavy line. The maximum number of linear fluorescent polymer chains that can be attached to a multivalent carrier (for example, a dendrimer) is equal to the number of terminal groups of the multivalent carrier (in this case, 16 terminal amino groups of the dendrimer).
Předmětem předkládaného vynálezu je také způsob přípravy hvězdicovitého fluorescenčního polymeru definovaného výše, obsahující následující kroky:The subject of the present invention is also a method of preparing the star-shaped fluorescent polymer defined above, comprising the following steps:
i) poskytnutí multivalentního nosiče, vybraného ze skupiny zahrnující poly(amidoaminový) dendrimer druhé nebo třetí generace, 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer nebo dendron druhé až čtvrté generace; polyoly o počtu hydroxylových skupin od 2 do 8, glycerol, pentaerythritol, bis(2-hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan, dipentaerythritol, porfirinové deriváty; zakončeného skupinami Y, vybranými z primárních aminoskupin, keto skupin, azidových skupin, hydroxy skupin, alkynových skupin o počtu uhlíků od 3 do 6, např. propargylu; a cyklooktynových skupin, které mohou být popřípadě dále nezávisle substituovány jednou nebo více skupinami vybranými z alkylové skupiny o počtu uhlíků od 1 do 6 a arylu o počtu uhlíků 6, např. DBCO.i) providing a multivalent carrier selected from the group consisting of second or third generation poly(amidoamine) dendrimer, 2,2-bis(hydroxymethyl)propion dendrimer or second to fourth generation dendron; polyols with the number of hydroxyl groups from 2 to 8, glycerol, pentaerythritol, bis(2-hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methane, dipentaerythritol, porphyrin derivatives; terminated by groups Y selected from primary amino groups, keto groups, azide groups, hydroxy groups, alkyne groups with a number of carbons from 3 to 6, e.g. propargyl; and cyclooctyne groups, which may optionally be further independently substituted by one or more groups selected from an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and an aryl having 6 carbon atoms, e.g. DBCO.
Uvedené multivalentní nosiče jsou komerčně dostupné, popřípadě lze koncové DBCO skupiny připravit reakcí koncových primárních amino skupin s DBCO-NHS. Poskytnutím je tedy míněno komerční získání multivaletního nosiče, popřípadě následované úpravou jeho koncových skupin.Said multivalent carriers are commercially available, optionally terminal DBCO groups can be prepared by reaction of terminal primary amino groups with DBCO-NHS. The provision therefore means the commercial acquisition of a multivalent carrier, possibly followed by the modification of its end groups.
ii) příprava statistického lineárního kopolymeru, který obsahuje lineární polymer, vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát a poly(V-(2hydroxypropyljmethakrylamid), ve kterém je od 0,1 do 10 mol. % monomerních jednotek statisticky nahrazeno monomerní jednotkou obecného vzorce (VI), který obsahuje koncové reaktivní skupiny (například azidové, DBCO, hydrazidové, amino skupiny a TT); tato příprava je popsaná výše v rámci přípravy lineárního fluorescenčního polymeru;ii) preparation of a random linear copolymer which contains a linear polymer selected from the group consisting of polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylate, polymethacrylate and poly(V-(2hydroxypropyljmethacrylamide), in which from 0.1 to 10 mol.% of the monomer units are statistically replaced by a monomer unit of general formula (VI) which contains terminal reactive groups (for example, azide, DBCO, hydrazide, amino groups and TT), this preparation is described above under the preparation of a linear fluorescent polymer;
- 17CZ 2021 - 423 A3 iii) krok roubování koncových reaktivních funkčních skupin (například azidových nebo TT) statistického lineárního kopolymeru připraveného v kroku ii) ke skupinám Y multivalentního nosiče z kroku i), za vzniku hvězdicovitého polymeru, který ve svých ramenech obsahuje statistický lineární kopolymer, vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát a poly( N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,1 do 10 mol. % monomerních jednotek statisticky nahrazeno monomerní jednotkou obecného vzorce (VI). Roubovací reakce polymerů na multivalentní nosiče probíhá v rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, dimethylformamid, methanol a ethanol. Molární hmotnost Mn takto připravených hvězdicovitých polymerů je v rozmezí od 60 000 do 1 000 000 g/mol, s výhodou 100 000 až 400 000 g/mol.- 17CZ 2021 - 423 A3 iii) step of grafting terminal reactive functional groups (for example, azide or TT) of the statistical linear copolymer prepared in step ii) to the Y groups of the multivalent carrier from step i), to form a star-shaped polymer, which contains in its arms a statistical linear copolymer, selected from the group including polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylate, polymethacrylate and poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide), in which from 0.1 to 10 mol. % monomer units statistically replaced by a monomer unit of the general formula (VI). The grafting reaction of polymers onto multivalent carriers takes place in a solvent preferably selected from the group including dimethylsulfoxide, dimethylacetamide, dimethylformamide, methanol and ethanol. The molar mass Mn of the star-shaped polymers prepared in this way is in the range from 60,000 to 1,000,000 g/mol, preferably from 100,000 to 400,000 g/mol.
iv) navázání fluoroforu na skupinu D statistického lineárního kopolymeru z kroku iii) konjugací karbonyl-thiazolin-2-thionových skupin, (4-nitrofenyl)oxy skupin, (2,3,4,5,6- pentafluorofenyl)oxy skupin, (sukcinimidyl)oxy skupin, karboxylových, hydrazidových, azidových, aktivovaných disulfidových skupin nebo NH2-skupin monomerních jednotek obecného vzorce (VI) s aminovou, karboxylovou, aktivovanou karboxylovou, aktivovanou disulfidovou nebo keto skupinou fluoroforu; přičemž fluorofor i jeho navázání ke skupině D jsou popsány výše; za vzniku fluorescenčního hvězdicovitého kopolymeru, obsahujícího monomerní jednotky obecného vzorce (I) a (VI) a dále obsahujícího monomerní jednotky, vybrané ze skupiny zahrnující akrylamid, methakrylamid, akrylát, metakrylát a N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid;iv) linking the fluorophore to group D of the statistical linear copolymer from step iii) by conjugation of carbonyl-thiazoline-2-thione groups, (4-nitrophenyl)oxy groups, (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)oxy groups, (succinimidyl )oxy groups, carboxyl, hydrazide, azide, activated disulfide groups or NH2-groups of monomer units of the general formula (VI) with an amine, carboxyl, activated carboxyl, activated disulfide or keto group of the fluorophore; wherein both the fluorophore and its attachment to group D are described above; to form a fluorescent star-shaped copolymer containing monomeric units of general formula (I) and (VI) and further containing monomeric units selected from the group including acrylamide, methacrylamide, acrylate, methacrylate and N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide;
Navázání fluoroforu na skupinu D se provede konjugací volných hydrazidových skupin, amino skupin, aktivovaných sidulfidových skupin nebo thiazolidin-2-thionových (TT) skupin monomerních jednotek obecného vzorce (VI) statistického lineárního kopolymeru, popsaného výše, s nízkomolekulární fluorescenční značkou nebo jejím derivátem (fluoroforem), která obsahuje vhodné reaktivní skupiny (například aminovou, carboxylovou, aktivovanou karboxylovou nebo keto skupinu) a která se může použít ve volné formě, nebo ve formě soli s kyselinou, např. HCl; přičemž nízkomolekulárním fluoroforem je fluorofor, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol. Fluorofor je vybrán podle excitačních a emisních vlnových délek, přičemž excitační vlnové délky jsou v rozsahu od 300 do 850 nm a emisní vlnové délky v rozsahu od 350 do 1 200 nm; případná molekula nízkomolekulárního fluoroforu je k lineárnímu kopolymeru navázána amidovou, disulfidovou nebo hydrazonovou vazbou.The binding of the fluorophore to the D group is carried out by conjugation of free hydrazide groups, amino groups, activated sidulfide groups or thiazolidine-2-thione (TT) groups of the monomeric units of the general formula (VI) of the random linear copolymer described above with a low-molecular fluorescent label or its derivative ( fluorophore) which contains suitable reactive groups (for example an amine, carboxyl, activated carboxyl or keto group) and which can be used in free form or in the form of a salt with an acid, for example HCl; wherein a low molecular weight fluorophore is a fluorophore having a molecular weight in the range of 350 to 1,500 g/mol. The fluorophore is selected according to excitation and emission wavelengths, with excitation wavelengths ranging from 300 to 850 nm and emission wavelengths ranging from 350 to 1200 nm; any low molecular weight fluorophore molecule is bound to the linear copolymer by an amide, disulfide or hydrazone bond.
v) volitelně navázání směrující struktury definované výše (oligopeptidů s počtem aminokyselin od 3 do 20 nebo proteinu, zejména monoklonální protilátky), na skupiny D monomerní jednotky obecného vzorce (VI) fluorescenčního hvězdicovitého kopolymeru z kroku iv).v) optionally binding the directing structure defined above (oligopeptides with the number of amino acids from 3 to 20 or protein, especially monoclonal antibodies), to groups D of the monomer unit of the general formula (VI) of the fluorescent star-shaped copolymer from step iv).
Navázání směrující struktury (peptidové struktury se zavedenými amino skupinami, azidovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami) se provede reakcí skupiny D monomerní jednotky obecného vzorce (VI) s -NH2, propargylovými, sDBCO nebo DBCO skupinami přítomnými na směrující struktuře. Reakce probíhá v řádu jednotek minut a s vysokým výtěžkem a výsledný konjugát si zachovává neovlivněný biologický účinek.Binding of the directing structure (peptide structures with introduced amino, azide, sulfodibenzocyclooctyne (sDBCO) or dibenzocyclooctyne (DBCO) groups) is carried out by reacting the D group of the monomer unit of general formula (VI) with -NH2, propargyl, sDBCO or DBCO groups present on the directing structure . The reaction takes place in the order of minutes and with a high yield, and the resulting conjugate retains its biological effect unaffected.
vi) volitelně navázání směrující skupiny na konce lineárního řetězce fluorescenčního hvězdicovitého polymeru z kroku iv) nebo v);vi) optionally attaching a directing group to the linear chain ends of the fluorescent star polymer from step iv) or v);
Navázání směrující struktury (peptidové struktury s amino skupinami nebo zavedenými azidovými, maleinimidylovými, propargylovými, sulfodibenzocyklooktynovými (sDBCO) nebo dibenzocyklooktynovými (DBCO) skupinami) se provede reakcí koncové skupiny, TT skupina, azidová, propargylová, DBCO nebo sBCO skupina nebo SH skupina, se skupinami přítomnými na směrující struktuře. Reakce probíhá v řádu jednotek minut a s vysokým výtěžkem a výsledný konjugát si zachovává neovlivněný biologický účinek.Binding of the directing structure (peptide structures with amino groups or introduced azide, maleinimidyl, propargyl, sulfodibenzocyclooctyne (sDBCO) or dibenzocyclooctyne (DBCO) groups) is carried out by reaction of the terminal group, TT group, azide, propargyl, DBCO or sBCO group or SH group, with groups present on the directing structure. The reaction takes place in the order of minutes and with a high yield, and the resulting conjugate retains its biological effect unaffected.
- 18 CZ 2021 - 423 A3 vii) Případné nezreagované thiazolidin-2-thionové skupiny, (4-nitrofenyl)oxy skupiny, (2,3,4,5,6pentafluorofenyl)oxy skupiny, (sukcinimidyl)oxy skupiny se mohou odstranit reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); NH2-(CH2)b-CH(OH)CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, Z? je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4;, s výhodou s 1 -aminopropan-2-olem, a/nebo se nezreagované NH2 skupiny mohou odstranit reakcí s acetythiazolidin-2-thionem. Aktivované disulfidové skupiny se odstraní pomocí reakce s merkaptoethanolem. Karboxyly, hydrazidy a azidy není nutné odstraňovat.- 18 CZ 2021 - 423 A3 vii) Any unreacted thiazolidine-2-thione groups, (4-nitrophenyl)oxy groups, (2,3,4,5,6pentafluorophenyl)oxy groups, (succinimidyl)oxy groups can be removed by reaction with an amino alcohol selected from the group consisting of NH 2 -(CH 2 ) and -CH 2 (OH); NH2-(CH2)b-CH(OH)CH3; NH 2 -(CH 2 ) b -CH(OH)-(CH 2 ) c -CH 3 ; where a is an integer from 0 to 4, Z? is an integer from 0 to 3 and is from 1 to 4;, preferably with 1-aminopropan-2-ol, and/or the unreacted NH 2 groups can be removed by reaction with acetylthiazolidin-2-thione. Activated disulfide groups are removed by reaction with mercaptoethanol. Carboxyls, hydrazides and azides do not need to be removed.
Předkládaný vynález se dále týká použití fluorescenčních sond pro vizualizaci nádorů pro diagnostické potřeby a pro obrazem naváděnou chirurugii.The present invention further relates to the use of fluorescent probes for visualization of tumors for diagnostic purposes and for image-guided surgery.
Fluorescenční sondou se rozumí fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu definovaný výše, hvězdicovitý fluorescenční polymer podle předkládaného vynálezu, definovaný výše, a dále rovněž statistický lineární fluorescenční kopolymer, vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát a poly(A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), ve kterém je od 0,1 do 10 mol. % monomerních jednotek, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek, statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce (la) fluorofor (la), kdeFluorescent probe means a fluorescent polymer according to the present invention defined above, a star-shaped fluorescent polymer according to the present invention defined above, and also a statistical linear fluorescent copolymer selected from the group including polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylate, polymethacrylate and poly(A-(2-hydroxypropyl) )methacrylamide) in which from 0.1 to 10 mol. % of monomer units, based on the total number of monomer units, statistically replaced by monomer units of the general formula (la) fluorophore (la), where
A je vybraný ze skupiny sestávající z lineárního nebo rozvětveného uhlíkového alkylenylového řetězce s počtem uhlíků od 1 do 7 ((Cl až C7)alkylenyl); -(CH2)P-(C(O)-NH-(CH2)r)p-;A is selected from the group consisting of a straight or branched carbon alkylenyl chain having from 1 to 7 carbons ((C1 to C7)alkylenyl); -(CH2) P- (C(O)-NH-(CH2) r )p-;
-(CH2)p-(C(O)-NH-(CH2)r)p-C(O)-; -(CH2)p-(C(O)-NH-(CH2)r)p-C(O)-NH-C6H4-CH2-O-C(O)-; a (CH2)p-C(O)-NH-(CH2)p-L-(CH2)p-(C(O)-NH-(CH2)r)p-C(O)-NH-C6H4-CH2-O-C(O)-, kde L je spojka obsahující triazolový můstek, vzniklý například reakcí propargylové nebo DBCO skupiny s azidovou skupinou; L tedy může mít například následující strukturu:-(CH 2 )p-(C(O)-NH-(CH 2 )r)pC(O)-; -(CH 2 )p-(C(O)-NH-(CH 2 ) r )pC(O)-NH-C 6 H 4 -CH 2 -OC(O)-; and (CH2)pC(O)-NH-(CH2)pL-(CH2)p-(C(O)-NH-(CH2)r)pC(O)-NH-C 6 H4-CH2-OC(O )-, where L is a coupling containing a triazole bridge, formed for example by the reaction of a propargyl or DBCO group with an azide group; Thus, L can have, for example, the following structure:
N=N neboN=N or
- 19CZ 2021 - 423 A3- 19 CZ 2021 - 423 A3
kde p je celé číslo v rozmezí od 1 do 5, a r je vybráno z 1, 2 a 3;where p is an integer ranging from 1 to 5, and r is selected from 1, 2 and 3;
přičemž jeden nebo více vodíkových atomů v CH2 skupinách substituentu A může být dále substituován stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny; s výhodou jsou těmito řetězci methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH2(C6H4)OH, -(CH2)2-S-CH3, -CH2SH, -(CH2)4-NH2, -CH2COOH, -CH2C(O)NH2, -(CH2)2COOH, (CH2)2C(O)NH2, -(CH2)3NH-C(=NH)(NH2), -(CH2)3NH-C(=O)(NH2); benzyl;wherein one or more hydrogen atoms in the CH 2 groups of the substituent A may be further substituted with the same or different side chains of a natural amino acid; these chains are preferably methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH 3 )(CH 2 CH 3 ), -CH 2 OH, -CH(OH)(CH 3 ), -CH 2 (C 6 H 4 )OH, -(CH 2 ) 2 -S-CH 3 , -CH 2 SH, -(CH 2 ) 4 -NH 2 , -CH 2 COOH, -CH 2 C(O)NH 2 , -(CH 2 ) 2 COOH, (CH 2 ) 2 C(O)NH 2 , -(CH 2 ) 3 NH-C(=NH)(NH 2 ), -(CH 2 ) 3 NH-C(=O)(NH 2 ); benzyl;
B je vybraný ze skupiny sestávající z vazby, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-,B is selected from the group consisting of the bond, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-,
a přičemž fluorofor má molekulovou hmotnost v rozmezí od 350 do 1 500 g/mol, excitační vlnovou délku v rozmezí od 300 do 850 nm a emisní vlnovou délku v rozmezí od 350 do 1 200 nm, a je ^-č kovalentně vázán k-ΝΗ-, -C(=O)-, =CH-, nebo-S-S-skupině substituentu B monomerní jednotky obecného vzorce (la) semitelechelického statistického lineárního kopolymeru přes svou primární aminoskupinu, nebo NCS skupinu, N-hydroxysukcinimidylovou skupinu, keto skupinu nebo disulfidovou skupinu, přičemž skupiny vzniklé po navázání fluoro fóru jsou následně součástí skupiny B;and wherein the fluorophore has a molecular weight in the range of 350 to 1500 g/mol, an excitation wavelength in the range of 300 to 850 nm, and an emission wavelength in the range of 350 to 1200 nm, and is ^-ch covalently bonded to -ΝΗ -, -C(=O)-, =CH-, or -S-S-group of the substituent B of the monomer unit of the general formula (la) of the semitelechelic random linear copolymer via its primary amino group, or NCS group, N-hydroxysuccinimidyl group, keto group or disulfide group, whereby the groups formed after the fluoro forum are subsequently formed are part of group B;
a přičemž molekulová hmotnost Mn statistického lineárního fluorescenčního kopolymeru je v rozmezí od 6000 do 100 000 g/mol.and wherein the molecular weight M n of the statistical linear fluorescent copolymer is in the range of 6000 to 100,000 g/mol.
V jednom provedení fluorescenční sonda může nést kombinaci fluoro fóru, jehož fluorescence se aktivuje v nádoru, a směrující skupiny pro navýšení specifity vizualizace nádorové tkáně. V tomto provedení obsahuje statistický lineární fluorescenční kopolymer dále alespoň jednu směrující skupinu pro směrování fluorescenční sondy do nádorových tkání, která je vybraná ze skupiny zahrnující oligopeptidy o počtu aminokyselin od 3 do 20 a proteiny pro směrování fluorescenčního polymeru k nádorovým buňkám nádorů hlavy a krku, prsním nádorům, melanomům a kolorektálním nádorům nebo k buňkám nádorového endothelia. Směrující skupina může být navázána na koncovou skupinu lineárního řetězce fluorescenční sondy nebo může být součástí monomerní jednotky (Ila)In one embodiment, the fluorescent probe may carry a combination of a fluorophore whose fluorescence is activated in the tumor and a targeting group to increase the specificity of tumor tissue visualization. In this embodiment, the statistical linear fluorescent copolymer further contains at least one directing group for directing the fluorescent probe to tumor tissues, which is selected from the group including oligopeptides with the number of amino acids from 3 to 20 and proteins for directing the fluorescent polymer to tumor cells of head and neck tumors, breast tumors, melanomas and colorectal tumors or to tumor endothelium cells. The directing group can be attached to the terminal group of the linear chain of the fluorescent probe or it can be part of the monomeric unit (Ila)
-20CZ 2021 - 423 A3-20CZ 2021 - 423 A3
CH3CH3
UOUO
HNHN
AAND
B 'z (Ila), kde A a B jsou definovány výše;B' of (Ila), where A and B are as defined above;
Z je směrující skupina pro směrování fluorescenčního polymeru do nádorových tkání, kovalentně ^-č navázaná k -NH-, -C(=O)-, =CH-, nebo -S-S- skupině substituentu B monomerní jednotky obecného vzorce (Ila) semitelechelického statistického lineárního kopolymeru přes svou primární aminoskupinu, nebo keto skupinu nebo disulfidovou skupinu, přičemž skupiny vzniklé po navázání směrující skupiny jsou následně součástí skupiny B;Z is a directing group for directing the fluorescent polymer to tumor tissues, covalently bonded to the -NH-, -C(=O)-, =CH-, or -S-S- group of the substituent B of the monomer unit of the general formula (Ila) semitelechelic statistical of a linear copolymer through its primary amino group, or a keto group or a disulfide group, whereby the groups formed after the linking of the directing group are subsequently part of group B;
přičemž množství monomerníchjednotek obecného vzorce (Ila) ve fluorescenčním polymeruje od alespoň jedné monomerní jednotky do 8 mol. %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek fluorescenční sondy;whereby the amount of monomer units of the general formula (Ila) in the fluorescent polymer is from at least one monomer unit to 8 mol. %, based on the total number of monomeric units of the fluorescent probe;
přičemž celkem je monomerních jednotek obecného vzorce (la) a (Ila) ve fluorescenční sondě nejvýše 10 mol. %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek.while the total number of monomer units of general formula (Ia) and (Ila) in the fluorescent probe is no more than 10 mol. %, based on the total number of monomer units.
V jednom provedení může statistický lineární fluorescenční kopolymer dále obsahovat alespoň jednu monomerní jednotku obecného vzorce (lila)In one embodiment, the statistical linear fluorescent copolymer may further comprise at least one monomeric unit of the general formula (IIIa)
CH3n CH 3n
(lila), kde(lilac) where
A je definováno výše;A is defined above;
C je vybrané ze skupiny zahrnující -C(=O)-NH-(CH2)a-CH2(OH); -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)CH3; -C(=O)-NH-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; a -NH-C(=O)-CH3, přičemž a je celé číslo od 0 do 4, Z? je celé číslo od 0 do 3 a c je celé číslo od 1 do 4, -S-S-(CH2)2-OH ;C is selected from the group consisting of -C(=O)-NH-(CH 2 ) and -CH 2 (OH); -C(=O)-NH-(CH 2 ) b -CH(OH)CH 3 ; -C(=O)-NH-(CH 2 ) b -CH(OH)-(CH 2 ) c -CH 3 ; and -NH-C(=O)-CH 3 , where a is an integer from 0 to 4, Z? is an integer from 0 to 3 and is an integer from 1 to 4, -SS-(CH 2 ) 2 -OH ;
přičemž množství monomerních jednotek obecného vzorce (lila) v semitelechelickém lineárním fluorescenčním kopolymeru je od alespoň jedné monomerní jednotky do 9,9 mol. %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek fluorescenčního polymeru;wherein the amount of monomer units of the general formula (IIIa) in the semitelechelic linear fluorescent copolymer is from at least one monomer unit to 9.9 mol. %, based on the total number of monomeric units of the fluorescent polymer;
-21 CZ 2021 - 423 A3 a přičemž celkem je monomerních jednotek obecného vzorce (la), (Ila) a (lila) ve statistickém lineárním fluorescenčním kopolymeru nejvýše 10 mol. %, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek.-21 CZ 2021 - 423 A3 and while the total number of monomer units of the general formula (Ia), (Ila) and (Ila) in the statistical linear fluorescent copolymer is no more than 10 mol. %, based on the total number of monomer units.
Fluorescenční sondou dále může být i hvězdicovitý fluorescenční polymer, který obsahuje multivalentní nosič, ke kterému je navázaný alespoň jeden statistický lineární fluorescenční kopolymer, obsahující monomerní jednotky obecného vzorce (la), popřípadě (Ila) a popřípadě (lila), definované výše.The fluorescent probe can also be a star-shaped fluorescent polymer that contains a multivalent carrier to which at least one statistical linear fluorescent copolymer containing monomer units of the general formula (Ia), or (Ila) or (Ila) defined above is bound.
Multivalentní nosič je vybraný ze skupiny zahrnující poly(amidoaminový) dendrimer druhé nebo třetí generace, 2,2-bis(hydroxymethyl)propionový dendrimer nebo dendron druhé až čtvrté generace; polyoly o počtu hydroxylových skupin od 2 do 8, glycerol, penta-erythritol, bis(2hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methan, dipentaerythritol, porfirinové deriváty.The multivalent carrier is selected from the group consisting of a second or third generation poly(amidoamine) dendrimer, a 2,2-bis(hydroxymethyl)propion dendrimer, or a second to fourth generation dendron; polyols with the number of hydroxyl groups from 2 to 8, glycerol, penta-erythritol, bis(2hydroxyethyl)aminotris(hydroxymethyl)methane, dipentaerythritol, porphyrin derivatives.
Způsob přípravy fluorescenčních sond podle předkládaného vynálezu je analogický způsobům přípravy fluorescenčního polymeru a hvězdicovitého fluorescenčního polymeru popsaným výše. Vstupní monomery jsou vybrané ze skupiny zahrnující akrylamid, methakrylamid, akrylát, metakrylát, X-(2-hydroxypropyl)methakrylamid a monomer obecného vzorce (Va)The method of preparing fluorescent probes according to the present invention is analogous to the methods of preparing fluorescent polymer and star-shaped fluorescent polymer described above. The input monomers are selected from the group including acrylamide, methacrylamide, acrylate, methacrylate, X-(2-hydroxypropyl)methacrylamide and monomer of general formula (Va)
HNHN
AAND
D (Va);D (Va);
kde A je definované výše a D je vybrané ze skupiny zahrnující karbonyl-thiazolin-2-thionovou skupinu, (4-nitrofenyl)oxy skupinu, (2,3,4,5,6-pentafluorofenyl)oxy skupinu, (sukcinimidyl)oxy skupinu, karboxylovou skupinu, hydrazidovou skupinu, azidovou skupinu, disulfidovou skupinu a NH2-skupinu, přičemž aminoskupina a hydrazidová skupina může být popřípadě chráněná chránící skupinou.where A is as defined above and D is selected from the group consisting of carbonyl-thiazoline-2-thione group, (4-nitrophenyl)oxy group, (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)oxy group, (succinimidyl)oxy group , a carboxyl group, a hydrazide group, an azide group, a disulfide group and an NH2-group, whereby the amino group and the hydrazide group can optionally be protected by a protecting group.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy použití fluorescenční sondy podle předkládaného vynálezu v lékařské diagnostice, celotělovém zobrazování a/nebo fluorescenčně naváděné chirurgii, s výhodou při diagnostice a monitorování úspěšnosti léčby u nádorových onemocnění, onemocnění krvetvorného systému (leukémie, lymfomy, selhání krvetvorby) a imunitního systému. Fluorescenční sondy podle předkládaného vynálezu lze využít například v technikách celotělového zobrazování založených na detekci fluorescence pro detekci nádorové tkáně; ve fluorescencí naváděné chirurgii pro označení a zobrazení fluorescence v cílových strukturách orgánů a tělesných tkání.The subject of the present invention is therefore the use of the fluorescent probe according to the present invention in medical diagnostics, whole-body imaging and/or fluorescence-guided surgery, preferably in the diagnosis and monitoring of the success of treatment in cancer diseases, diseases of the hematopoietic system (leukemia, lymphomas, hematopoietic failure) and the immune system . Fluorescent probes according to the present invention can be used, for example, in whole-body imaging techniques based on fluorescence detection for the detection of tumor tissue; in fluorescence-guided surgery for marking and imaging fluorescence in target structures of organs and body tissues.
Fluorescenční sondy jsou tedy aktivovatelné lineární i hvězdicovité fluorescenční polymery podle předkládaného vynálezu, ve kterých je fluoro for vázán k polymernímu nosiči biologicky degradevatelnou amidickou, hydrazonovou nebo disulfidovou vazbou, a umožňují významně prodloužit dobu cirkulace vázaného fluoro fóru v organismu, což umožňuje na vysokomolekulárním polymerním nosiči dopravit fluoro for do nádoru a zde ho v jeho původní formě uvolnit. Další výhodou těchto aktivovatelných fluorescenčních sond podle vynálezu je aktivace fluorescence, která je daná uvolněním fluoroforu z polymernícho nosiče.Thus, the fluorescent probes are activatable linear and star-shaped fluorescent polymers according to the present invention, in which the fluorophore is bound to the polymer carrier by a biologically degradable amide, hydrazone or disulfide bond, and they allow to significantly extend the circulation time of the bound fluorophore in the organism, which enables on a high-molecular polymer carrier deliver the fluorophore to the tumor and release it here in its original form. Another advantage of these activatable fluorescent probes according to the invention is the activation of fluorescence, which is given by the release of the fluorophore from the polymer carrier.
-22 CZ 2021 - 423 A3-22 CZ 2021 - 423 A3
Polymerní aktivovatelné fluorescenční sondy podle vynálezu se dále vyznačují tím, že vazba fluoroforu k polymernímu řetězci je poměrně stálá, uvolní se do 10 % fluoroforu za 24 h v průběhu transportu v krevním řečišti a tělních tekutinách, a je hydrolyticky, enzymaticky nebo reduktivně štěpitelná v prostředí nádoru a uvnitř cílových nádorových buněk v lysosomech. To znamená, že fluorofor je transportován krevním řečištěm v neaktivní, málo fluorescenčně aktivní formě, a k jeho uvolnění a aktivaci fluorescence dojde především až po vstupu do nádorové tkáně nebo po průniku do cílových nádorových buněk. Aktivace fluoroforu až v cílových buňkách vede k výnamnému nárůstu fluorescence v nádoru, k nárůstu kontrastu nádorová/zdravá tkáň a tedy k jednoznačné vizualizaci nádorové tkáně. Vazbou fluoroforu na polymerní řetězec dojde k výraznému zvýšení molekulové hmotnosti kontrastní látky a tím k prodloužení doby jeho cirkulace v krevním oběhu a tedy i ke zvýšení jeho biologické využitelnosti (bioavailability). Za cílený transport do nádoru či nádorových buněk je odpovědný polymerní nosič připravený s výhodou na bázi kopolymerů HPMA, jehož molekulová hmotnost a tedy i účinnost akumulace v nádorové tkáni může být řízena změnami ve struktuře polymerního nosiče (lineární polymer, vysokomolekulární biodegradovatelný hvězdicovitý polymer). Vzhledem ke zvýšené molekulové hmotnosti polymerního nosiče je celý konjugát díky EPR efektu akumulován v pevných nádorech. Polymerní sondy mohou být s výhodou směrovány také aktivně pomocí navázaných směrujících struktur, oligopeptidů a proteinů, což dále zvyšuje selektivitu akumulace v nádorové tkáni a podporuje navýšení kontrastu nádorová/zdravá tkáň.The polymer activatable fluorescent probes according to the invention are further characterized by the fact that the binding of the fluorophore to the polymer chain is relatively stable, it releases up to 10% of the fluorophore in 24 h during transport in the bloodstream and body fluids, and is hydrolytically, enzymatically or reductively cleavable in the tumor environment and inside target tumor cells in lysosomes. This means that the fluorophore is transported through the bloodstream in an inactive, low-fluorescence-active form, and its release and activation of fluorescence mainly occur after entering the tumor tissue or after penetration into the target tumor cells. Activation of the fluorophore only in the target cells leads to a significant increase in fluorescence in the tumor, to an increase in the tumor/healthy tissue contrast and thus to a clear visualization of the tumor tissue. By binding the fluorophore to the polymer chain, there will be a significant increase in the molecular weight of the contrast agent and thus an increase in its circulation time in the bloodstream and thus an increase in its bioavailability. Responsible for the targeted transport to the tumor or tumor cells is a polymer carrier prepared preferably based on HPMA copolymers, whose molecular weight and thus the efficiency of accumulation in the tumor tissue can be controlled by changes in the structure of the polymer carrier (linear polymer, high molecular weight biodegradable star-shaped polymer). Due to the increased molecular weight of the polymer carrier, the entire conjugate is accumulated in solid tumors due to the EPR effect. Polymeric probes can advantageously also be directed actively by means of linked directing structures, oligopeptides and proteins, which further increases the selectivity of accumulation in tumor tissue and supports an increase in tumor/healthy tissue contrast.
ShrnutíSummary
Předmětem vynálezu je směrovaný a aktivovatelný fluorescenční polymer a hvězdicovitý fluorescenční polymer pro zvýšení vizualizace pevných nádorů. Díky jejich hydrodynamické velikosti v roztoku a směrování k receptorům na nádorových buňkách jsou významně akumulovány v pevných nádorech, čímž dochází k významnému obohacení nádorové tkáně o přítomný fluorofor. Navíc dojde v prostředí nádorové tkáně k uvolnění neseného fluoroforu, což má za následek zvýšení fluorescenční signálu díky snížení zhášení fluorescence, které je spojeno s navázáním fluoroforu na polymerní systém. V důsledku dochází k velmi významnému zvýšení fluorescenčního kontrastu mezi nádorovou a nenádorovou tkání, což významně přispívá k vizualizaci nádorové tkáně při naváděné chirurugii nádorů. Zvýšení kontrastu významně posouvá hranice navigované chirurgie vzhledem k současnému stavu.The subject of the invention is a directional and activatable fluorescent polymer and a star-shaped fluorescent polymer for enhancing the visualization of solid tumors. Due to their hydrodynamic size in solution and targeting to receptors on tumor cells, they are significantly accumulated in solid tumors, resulting in a significant enrichment of the tumor tissue with the present fluorophore. In addition, the carried fluorophore will be released in the tumor tissue environment, which results in an increase in the fluorescence signal due to a decrease in fluorescence quenching, which is associated with the binding of the fluorophore to the polymer system. As a result, there is a very significant increase in the fluorescence contrast between tumor and non-tumor tissue, which significantly contributes to the visualization of tumor tissue during guided tumor surgery. Contrast enhancement significantly advances the boundaries of guided surgery compared to the current state.
Objasnění výkresůClarification of drawings
Obr. 1: Intenzita fluorescence fluoroforu před a po hydrolýze konjugátu pol-PYR-Cy7 v Příkladu 10.Giant. 1: Fluorescence intensity of the fluorophore before and after hydrolysis of the pol-PYR-Cy7 conjugate in Example 10.
Obr. 2: Rychlost uvolňování fluoroforu z konjugátů s DY-676 připojenému k polymeru pHsensitivními spojkami s různou strukturou v Příkladu 11.Giant. 2: Rate of release of fluorophore from conjugates with DY-676 attached to the polymer by pH-sensitive linkers with different structures in Example 11.
Obr. 3: Obrázky z konfokální mikroskopie - Příklad 13.Giant. 3: Confocal microscopy images - Example 13.
Obr. 4: In vivo fluorescenční zobrazování polymerních systému s fluorescenční značkou Dyomic 676; A - polymerní system se značkou vázanou napevno amidickou vazbou k nedegradované spojce; B- polymerní system se značkou vázanou přes hydrazonovou spojku tvořenou OPB-Dy676 - Příklad 14Giant. 4: In vivo fluorescence imaging of polymeric systems with fluorescent label Dyomic 676; A - polymer system with a label firmly bound by an amide bond to a non-degraded linker; B- polymer system with a label bound via a hydrazone coupling formed by OPB-Dy676 - Example 14
Příklady provedení vynálezuExamples of embodiments of the invention
Příklady provedení syntézy meziproduktů a konjugátů podle vynálezuExamples of the synthesis of intermediates and conjugates according to the invention
Příklad 1: Syntéza polymerních prekurzorůExample 1: Synthesis of polymer precursors
- 23 CZ 2021 - 423 A3- 23 CZ 2021 - 423 A3
Kopolymer poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) byl připraven řízenou roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA (93 mol%, 100 mg ) a 3-(3-Methacrylamidopropanoyl)thiazolidine-2thionu (Ma-AP-TT) (7 mol%, 14,0 mg) prováděnou v přítomnosti iniciátoru 2,2'-azobis(4methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) (V70) a přenosového činidla 4-kyano-4thiobenzoylsulfanylpentanové kyseliny (CTA). Polymerizační směs byla rozpuštěna v tercbutylalkoholu (751 μL), CTA rozpuštěno v 10 % obj. DMA (83 μL) a vše přeneseno do skleněné ampule, kde byla směs probublávána Ar a ampule uzavřena. Po 24 hodinách při 40 °C byl polymer izolován vysrážením do acetonu/diethylether, sraženina byla poté promyta diethyletherem a sušena ve vakuu. Koncové dithiobenzoátové skupiny byly z kopolymeru odstraněny reakcí s AIBN (10-ti násobný molární přebytek) v DMSO (15% roztok polymeru) pod argonovou atmosférou 3 h při 70 ° C v uzavřené ampuli. Polymerní konjugát byl izolován srážením do acetonu. Sraženina byla promyta diethyletherem a sušena ve vakuu do sucha. Připravený konjugát poly(HPMA-co-Ma-APTT) měl M„= 28 000 g/mol, D = 1.05, obsah TT 5,9 mol%.The copolymer poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) was prepared by controlled solution radical copolymerization of HPMA (93 mol%, 100 mg) and 3-(3-Methacrylamidopropanoyl)thiazolidine-2thione (Ma-AP-TT) (7 mol% , 14.0 mg) performed in the presence of the initiator 2,2'-azobis(4methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) (V70) and the transfer agent 4-cyano-4thiobenzoylsulfanylpentanoic acid (CTA). The polymerization mixture was dissolved in tert-butyl alcohol (751 μL), CTA dissolved in 10% v/v DMA (83 μL) and all transferred to a glass ampoule where the mixture was bubbled with Ar and the ampoule sealed. After 24 h at 40 °C, the polymer was isolated by precipitation into acetone/diethyl ether, the precipitate was then washed with diethyl ether and dried in vacuo. The terminal dithiobenzoate groups were removed from the copolymer by reaction with AIBN (10-fold molar excess) in DMSO (15% polymer solution) under an argon atmosphere for 3 h at 70 °C in a sealed ampoule. The polymer conjugate was isolated by precipitation into acetone. The precipitate was washed with diethyl ether and dried in vacuo to dryness. The prepared poly(HPMA-co-Ma-APTT) conjugate had M„ = 28,000 g/mol, D = 1.05, TT content 5.9 mol%.
Prekurzor pro click reakci byl připraven reakcí poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) (100 mg, 39.3 μmol) s DBCO-NH2 (5.5 mg, 19.9 μmol) v DMA (1 ml) za přítomnosti báze DIPEA (3.4 μl, 19.9 μmol). Průběh reakce sledován pomocí HPLC. U některých polymerů připravených pro navázání značek amidickou vazbou byl polymer poly(HPMA-co-Ma-AP-TT-co-MA-AP-DBCO) vyseparován a v případě polymerů pro vazbu značky přes click chemii byly zbylé TT skupiny na polymeru odstraněny přídavkem 1-aminopropan-2-olu (3.0 μl, 39.3 μmol). Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) byl vysrážen do směsi aceton/diethylether a přesrážen z MeOH, promyt diethyletherem a sušen. Stejné polymerní prekurzory byly použity i pro směrované konjugáty s fluoroforem vázaným buď enzymaticky štěpitelně nebo kontrolní konjugáty s pevně vázaným fluoroforem.The precursor for the click reaction was prepared by reacting poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) (100 mg, 39.3 μmol) with DBCO-NH2 (5.5 mg, 19.9 μmol) in DMA (1 mL) in the presence of DIPEA base (3.4 μL , 19.9 μmol). The progress of the reaction was monitored using HPLC. In the case of some polymers prepared for binding of labels by amide bond, the polymer poly(HPMA-co-Ma-AP-TT-co-MA-AP-DBCO) was separated, and in the case of polymers for binding of the label via click chemistry, the remaining TT groups on the polymer were removed by adding 1-aminopropan-2-ol (3.0 μl, 39.3 μmol). The polymer precursor poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) was precipitated into acetone/diethyl ether and reprecipitated from MeOH, washed with diethyl ether and dried. The same polymer precursors were also used for directional conjugates with either an enzymatically cleavable fluorophore or control conjugates with a rigidly bound fluorophore.
Polymerní prekurzory poly(HPMA-co-Ma-X-TT), kde X = GG, GLG, GFG, GLFG, GFLFG, a poly(HPMA-co-Ma-XX-NH-NH-Boc), kde XX= -CH2-CH2-(C=O)- (ethyl); -CH2-CH2-CH2(C=O)- (propyl); -CH2)4-(C=O)- (butyl); -CH2)5-(C=O)- (pentyl); -CH2)6-(C=O)- (hexyl); -CH2)7(C=O)- (heptyl); GG, GLG, GFG, GLFG, GFLFG, byly připraveny analogicky dle tohoto postupu.Polymer precursors poly(HPMA-co-Ma-X-TT), where X = GG, GLG, GFG, GLFG, GFLFG, and poly(HPMA-co-Ma-XX-NH-NH-Boc), where XX= - CH 2 -CH 2 -(C=O)-(ethyl); -CH 2 -CH 2 -CH 2 (C=O)-(propyl); -CH 2 ) 4 -(C=O)-(butyl); -CH 2 ) 5 -(C=O)-(pentyl); -CH 2 ) 6 -(C=O)-(hexyl); -CH 2 ) 7 (C=O)-(heptyl); GG, GLG, GFG, GLFG, GFLFG, were prepared analogously according to this procedure.
Pro vazbu konjugátů s fluorescenčními značkami vázanými přes pH-sensitivní hydrazonové spojky byl použit prekurzory poly(HPMA-co-Ma-XX-NH-NH-Boc), kde byly odstraněny Boc chránící skupiny v TFA a po 10 min vysrážen polymer poly(HPMA-co-Ma-XX-NH-NH2) do diethyletheru, přesrážen z MeOH a sušen. Pro syntézu směrovaných konjugátů s pH-sensitivní hydrazonovou vazbou byla část hydrazidových skupin odreagována s DBCO-NHS a pro následnou click reakci s peptidem byl použit poly(HPMA-co-MaXX-NH-NH2-co-MaXX-NH-NH-DBCO).Poly(HPMA-co-Ma-XX-NH-NH-Boc) precursors were used for the binding of conjugates with fluorescent labels bound via pH-sensitive hydrazone couplings, where the Boc protecting groups were removed in TFA and the poly(HPMA) polymer was precipitated after 10 min -co-Ma-XX-NH-NH2) into diethyl ether, precipitated from MeOH and dried. For the synthesis of directed conjugates with a pH-sensitive hydrazone bond, part of the hydrazide groups was unreacted with DBCO-NHS, and for the subsequent click reaction with the peptide, poly(HPMA-co-MaXX-NH-NH2-co-MaXX-NH-NH-DBCO) was used .
Disulfidický polymer byl připraven reakcí poly(HPMA- co-MaXX-NH-NH2) se sukcinimidyl 3-(2pyridyldithio)propionátem) (SPDS) za vzniku polymerního prekurzoru poly(HPMA-co-Ma-XXNH-NH-PDS).The disulfide polymer was prepared by reacting poly(HPMA-co-MaXX-NH-NH2) with succinimidyl 3-(2pyridyldithio)propionate) (SPDS) to form the polymer precursor poly(HPMA-co-Ma-XXNH-NH-PDS).
Charakteristika připravených polymerních prekurzorů je uvedená v Tabulce 1.The characteristics of the prepared polymer precursors are shown in Table 1.
Tabulka 1.Table 1.
- 24 CZ 2021 - 423 A3- 24 CZ 2021 - 423 A3
Příklad 2: Syntéza hvězdicovitého polymeru s triazolovou spcjkouExample 2: Synthesis of a star-shaped polymer with a triazole spcjka
Syntéza hvězdicovitého kopolymeru probíhala ve dvou krocích. Nejprve byl připraven reaktivní kopolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-N3 s využitím přenosového činidla azid-CTA, N(3-azidopropyl)-7-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-7-methyl-pentanamidu, obsahující azidovou skupinu, a to obdobným způsobem jako reaktivní kopolymer v Příkladu 1. Dále byly odstraněny Boc skupiny pomocí povaření ve vodě a následně reagoval polymer s bisMPA dendrimerem obsahujícím koncové DBCO nebo propargylové skupiny s p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH2)-N3 v metanolu po dobu 2 h. Výsledný hvězdicovitý polymerní konjugát byl vysrážen do acetonu a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného hvězdicovitého polymerního konjugátu: A'/„=250 000 g/mol, £>=1,20, obsah hydrazidových skupin= 8 % mol. Změnou poměru polymery/dendrimerové jádro a změnou generace dendrimeru je možné řídit polymerních systémů v širokém rozsahu. Obdobně je možné pro přípravu hvězdicovitých konjugátů využít i derivatizovaným bis-MPA dendronem nebo PAMAM dendrimerem, na které jsou zavedenyThe synthesis of the star-shaped copolymer took place in two steps. First, a reactive copolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-N3 was prepared using the transfer agent azide-CTA, N(3-azidopropyl)-7-ethylsulfanylcarbothioylsulfanyl-7-methyl-pentanamide, containing an azide group, in a similar manner to the reactive copolymer in Example 1. Further, the Boc groups were removed by boiling in water and the polymer was subsequently reacted with a bisMPA dendrimer containing terminal DBCO or propargyl groups sp(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH 2 )-N3 in methanol for 2 h. The resulting star-shaped polymer conjugate was precipitated into acetone and dried to constant weight. Characterization of the resulting star-shaped polymer conjugate: A'/„=250,000 g/mol, £>=1.20, content of hydrazide groups=8% mol. By changing the polymer/dendrimer core ratio and changing the dendrimer generation, it is possible to control polymer systems in a wide range. Similarly, for the preparation of star-shaped conjugates, it is also possible to use a derivatized bis-MPA dendron or a PAMAM dendrimer, on which they are introduced
DBCO nebo propargylové skupiny. Hvězdicovité kopolymery s polymery obsahující jiné spojky byly připraveny obdobných způsobem.DBCO or propargyl groups. Star-shaped copolymers with polymers containing other linkers were prepared in a similar manner.
Schéma 3. Syntéza a struktura hvězdicovitých kopolymerůScheme 3. Synthesis and structure of star copolymers
-25 CZ 2021 - 423 A3-25 CZ 2021 - 423 A3
Příklad 3: Syntéza hvězdicovitého korjugátu s esterovou spcjkouExample 3: Synthesis of a star-shaped conjugate with an ester spcjka
Syntéza hvězdicovitého kopolymeru probíhala ve třech krocích. V první kroku byl modifikován pentaerythritol pomocí dibenzocyclooctyn-N-hydroxysuccinimidylového esteru. Dále byl připraven reaktivní kopolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-N3 s využitím přenosového činidla azid-CTA, X-(3-azidopropyl)-7-ethylsulfanylkarbothioylsulfanyl-7-methyl-pentanamidu, obsahující azidovou skupinu, a to obdobným způsobem jako reaktivní kopolymer v Příkladu 1. Dále byly odstraněny Boc skupiny pomocí povaření ve vodě a následně reagoval polymer s pentaerythritolem obsahujícím koncové DBCO skupiny s p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH2)-N3 v metanolu po dobu 2 h. Výsledný hvězdicovitý polymerní konjugát byl vysrážen do acetonu a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného hvězdicovitého polymerního konjugátu: A/w= 1 80 000 g/mol, £>=1,25, obsah hydrazidových skupin= 8 % mol. Hvězdicovité kopolymery s polymery obsahující jiné polyoly byly připraveny obdobných způsobem.The synthesis of the star-shaped copolymer took place in three steps. In the first step, pentaerythritol was modified using dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester. Furthermore, a reactive copolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-N3 was prepared using the transfer agent azide-CTA, X-(3-azidopropyl)-7-ethylsulfanylcarbothioylsulfanyl-7-methyl-pentanamide, containing an azide group , in a manner similar to the reactive copolymer in Example 1. Further, the Boc groups were removed by boiling in water and subsequently the polymer was reacted with pentaerythritol containing the terminal DBCO groups sp(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH2)-N3 in methanol for 2 h. The resulting star-shaped polymer conjugate was precipitated into acetone and dried to constant weight. Characterization of the resulting star-shaped polymer conjugate: A/ w = 1,80,000 g/mol, £>=1.25, content of hydrazide groups = 8% mol. Star-shaped copolymers with polymers containing other polyols were prepared in a similar manner.
Schéma 4: Příklad struktury hvězdicovitého kopolymeru založeném na pentaerythritolu a lineárním kopolymeru.Scheme 4: An example of the structure of a star-shaped copolymer based on pentaerythritol and a linear copolymer.
Příklad 4: Syntéza hvězdicovitého korjugátu s amidovou spcjkouExample 4: Synthesis of a star-shaped conjugate with an amide spcjka
Syntéza tohoto hvězdicovitého konjugátu probíhala ve dvou krocích. Nejprve byl připraven reaktivní kopolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-TT s využitím přenosového činidla TTCTA, [l-kyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl)butyl]benzenkarbodithioátu, obsahující TT skupinu, a to obdobným způsobem jako kopolymer v Příkladu 1. V druhém kroku bis-MPA dendrimer obsahující amino skupiny reagoval s p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NH-NH)-TT v metanolu po dobu 2 h. Výsledný hvězdicovitý polymerní konjugát byl vysrážen do acetonu a sušen do konstantní hmotnosti. Charakterizace výsledného hvězdicovitého polymerního konjugátu: A£w=220 000 g/mol, £>=1,18, obsah hydrazidových skupin = 8 % mol. Změnou poměruThe synthesis of this star-shaped conjugate took place in two steps. First, the reactive copolymer p(HPMA-co-Ma-Pentyl-NHNH-Boc)-TT was prepared using the transfer agent TTCTA, [l-cyano-l-methyl-4-oxo-4-(2-thioxothiazolidin-3-yl )butyl]benzenecarbodithioate, containing a TT group, in a similar way to the copolymer in Example 1. In the second step, the bis-MPA dendrimer containing amino groups was reacted with sp(HPMA-co-Ma-Pentyl-NH-NH)-TT in methanol for 2 h. The resulting star-shaped polymer conjugate was precipitated into acetone and dried to constant weight. Characterization of the resulting star-shaped polymer conjugate: A£ w =220,000 g/mol, £>=1.18, content of hydrazide groups = 8% mol. By changing the ratio
-26CZ 2021 - 423 A3 polymery/dendrimerové jádro a změnou generace dendrimeru je možné řídit polymerních systémů v širokém rozsahu. Obdobně je možné pro přípravu hvězdicovitých konjugátů možné využít i bis-MPA dendron nebo PAMAM dendrimer s aminoskupinami.-26CZ 2021 - 423 A3 polymers/dendrimer core and by changing the dendrimer generation, it is possible to control a wide range of polymer systems. Similarly, it is possible to use bis-MPA dendron or PAMAM dendrimer with amino groups for the preparation of star-shaped conjugates.
Schéma 5: Příklad struktury bis-MPA dendronu 2. generace s lineárním kopolymerem navázaným přes amidovou vazbu. Maximální počet řetězců lineárního kopolymeru, které je možné navázat na dendron, je rovný počtu koncových skupin dendronu (v tomto případě 4 koncových amino skupin).Scheme 5: Example of a 2nd generation bis-MPA dendron structure with a linear copolymer linked via an amide bond. The maximum number of linear copolymer chains that can be attached to a dendron is equal to the number of terminal groups of the dendron (in this case 4 terminal amino groups).
Příklad 5: Příprava derivátů fluore fórůExample 5: Preparation of fluorophore derivatives
Příprava derivátu Az-Val-Cit-Aba-DY-67 6 a Az-Val-Cit-DY-676Preparation of the derivative Az-Val-Cit-Aba-DY-67 6 and Az-Val-Cit-DY-676
5-Azidopentanoyl-valyl-citrulín (Az-Val-Cit-OH)5-Azidopentanoyl-valyl-citrulline (Az-Val-Cit-OH)
Derivát dipeptidu byl připraven syntézou peptidů na pevné fázi na 2-chlorotrityl chloridové pryskyřici (0,5 g, substituce 1 mmol/g) reakcí 0,2 M roztoků aminokyselin (Fmoc-Cit-OH, FmocVal-OH, 5-azidopentanová kyselina). Produkt byl odštěpen z pryskyřice 30% roztokem HFIP v DCM, výtěžek reakce byl 121 mg (0.23 mmol, 46%) azido-peptidového derivátu. ESI MS (vypočteno 399,5, naměřeno 422,5 M+Na). Dle HPLC je patrný 1 pík v tr=l,39 min.The dipeptide derivative was prepared by solid-phase peptide synthesis on 2-chlorotrityl chloride resin (0.5 g, substitution 1 mmol/g) by reacting 0.2 M solutions of amino acids (Fmoc-Cit-OH, FmocVal-OH, 5-azidopentanoic acid) . The product was cleaved from the resin with a 30% solution of HFIP in DCM, yielding 121 mg (0.23 mmol, 46%) of the azido-peptide derivative. ESI MS (calcd 399.5, found 422.5 M+Na). According to HPLC, 1 peak is visible at r = 1.39 min.
N-(5-Azidcpentanoyl-valyl-citrulyí)-DY-676 (Az-Val-Cit-DY-676)N-(5-Azidepentanoyl-valyl-citrullyl)-DY-676 (Az-Val-Cit-DY-676)
-27CZ 2021 - 423 A3-27CZ 2021 - 423 A3
Az-Val-Cit-OH (0,5 mg, 1,2 pmol) a aminoderivát DY-676 (1 mg, 1,2 pmol) byly rozpuštěny v DMA (0,5 mb) s DIC (0,3 pL, 1,8 pmol) a HOBt (0,3 mg, 1,8 pmol). Průběh reakce byl sledován 5 HPLC. Po 24 h odreagovala barvička i spojka a dle HPLC vznikl jeden pík odpovídající produktu Az-Val-Cit-DY-676.Az-Val-Cit-OH (0.5 mg, 1.2 pmol) and the amino derivative DY-676 (1 mg, 1.2 pmol) were dissolved in DMA (0.5 mb) with DIC (0.3 pL, 1.8 pmol) and HOBt (0.3 mg, 1.8 pmol). The progress of the reaction was monitored by 5 HPLC. After 24 h, the dye and the coupler reacted and, according to HPLC, there was one peak corresponding to the product Az-Val-Cit-DY-676.
N-(5-Azidopentanoyl-valyl<átrulyt)-4-aminobenzyl alkohol (Az-Val-Cit-Aba)N-(5-Azidopentanoyl-valyl<atrolyte)-4-aminobenzyl alcohol (Az-Val-Cit-Aba)
Az-Val-Cit-OH (80 mg, 0.2 mmol), 4-aminobenzyl alkohol (26 mg, 0.21 mmol), 1hydroxybenzotriazol (35 mg, 0.23 mmol) a DIC (36 pL, 0.23 mmol) byly rozpuštěny v 2 mL směsi DMF: DCM (3:2), reakční směs míchána 1 h při 0 °C a pak necháno reagovat 16 h při 25 °C.Az-Val-Cit-OH (80 mg, 0.2 mmol), 4-aminobenzyl alcohol (26 mg, 0.21 mmol), 1-hydroxybenzotriazole (35 mg, 0.23 mmol), and DIC (36 μL, 0.23 mmol) were dissolved in a 2 mL mixture DMF: DCM (3:2), the reaction mixture was stirred for 1 h at 0 °C and then allowed to react for 16 h at 25 °C.
Rozpouštědlo bylo zahuštěno za sníženého tlaku a produkt byl izolován srážením do diethyletheru, odfiltrován a vyčištěn na preparativním HPLC (Chromolith C18, lineární gradient voda-acetonitril 0-100 %). Výtěžek reakce byl 53 mg (0,11 mmol, 55 %) bílého prášku. ESI MS (vypočteno 504,6, naměřeno M+H=505,6). Na HPLC je vidět jeden pík v tr=l ,74 min.The solvent was concentrated under reduced pressure and the product was isolated by precipitation into diethyl ether, filtered and purified on preparative HPLC (Chromolith C18, linear gradient water-acetonitrile 0-100%). The reaction yield was 53 mg (0.11 mmol, 55%) of a white powder. ESI MS (calcd 504.6, measured M+H=505.6). One peak at vt r =1 .74 min is visible on HPLC.
-28 CZ 2021 - 423 A3-28 CZ 2021 - 423 A3
N-(5-Azidcpentanoyl-valyl-citrulyi)-4-aminobenzyl (4-nitrophenyi) carbonate (Az-Val-Cit-AbaNpc)N-(5-Azidecpentanoyl-valyl-citruly)-4-aminobenzyl (4-nitrophenyi) carbonate (Az-Val-Cit-AbaNpc)
Az-Val-Cit-Aba (50 mg, 0,1 mmol) byl rozpuštěn v DMA (0,15 mL), 4-nitrophenyl chloroformate (60 mg, 0,3 mmol) rozpuštěn v DCM (0,5 mL), roztoky byly smíchány a byl přidán pyridin (0,15 mL). Průběh reakce byl sledován pomocí HPLC, produkt vyizolován na preparativním HPLC (Chromolith C18, lineární gradient voda-acetonitril 0-100 %), výtěžek reakce byl 50 mg (75 mmol, 10 75 %) bílého prášku. ESI MS (vypočteno 669,7, naměřeno M+H=670,7). Na HPLC je jeden pík v tr=2,55 min.Az-Val-Cit-Aba (50 mg, 0.1 mmol) was dissolved in DMA (0.15 mL), 4-nitrophenyl chloroformate (60 mg, 0.3 mmol) was dissolved in DCM (0.5 mL), the solutions were mixed and pyridine (0.15 mL) was added. The progress of the reaction was monitored by HPLC, the product was isolated on preparative HPLC (Chromolith C18, linear gradient water-acetonitrile 0-100%), the yield of the reaction was 50 mg (75 mmol, 10 75%) of a white powder. ESI MS (calcd 669.7, measured M+H=670.7). On HPLC, there is one peak at t r =2.55 min.
N-[N’-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrulyt)-4-aminobenzyloxycarbonyt] DY-676N-[N'-(5-Azidopentanoyl-valyl-citrullate)-4-aminobenzyloxycarbonate] DY-676
Az-Val-Cit-Aba-Npc (0,8 mg, 1,2 pmol) a aminoderivát DY-676 (1 mg, 1,2 pmol) bylo rozpuštěno v DMA (0,5 mL) s DIPEA (0,25 pL, 1,4 pmol). Průběh reakce byl sledován HPLC. Po 24 hAz-Val-Cit-Aba-Npc (0.8 mg, 1.2 pmol) and the amino derivative DY-676 (1 mg, 1.2 pmol) were dissolved in DMA (0.5 mL) with DIPEA (0.25 pL, 1.4 pmol). The progress of the reaction was monitored by HPLC. After 24 h
-29CZ 2021 - 423 A3 odreagovala barvička i spojka a dle HPLC vznikl jeden pík odpovídající produktu Az-Val-Cit-AbaDY-676.-29CZ 2021 - 423 A3 the dye and the coupler reacted and, according to HPLC, one peak corresponding to the product Az-Val-Cit-AbaDY-676 was formed.
Obdobným způsobem byly připraveny i deriváty s dalšími fluorescenčními značkami (Dyomics782, Dyomics-633, Dyomics-781, Dyomics-776, Dyomics-777, Dyomics-778, Dyomics 780, Cyanine-7, Cyanine-7.5, Cysanine-5, Cyanine-5.5, indocyaninegreen).Derivatives with other fluorescent labels (Dyomics782, Dyomics-633, Dyomics-781, Dyomics-776, Dyomics-777, Dyomics-778, Dyomics 780, Cyanine-7, Cyanine-7.5, Cysanine-5, Cyanine- 5.5, indocyanine green).
Příklad 6: Derivatizace ketokyselinExample 6: Derivatization of ketoacids
Karboxylové ketokyseliny, jako například 5-cyklohexyl-5-oxopentanová (COP), 4-(2-oxopropyl)benzenkarboxylová (OPB) a 4-oxo-4-(2-pyridyl)butanová (PYR) byly aktivovány reakcí s thiazolidin-2-thionem, tuto reakci znázorňuje Schéma 6.Carboxylic keto acids such as 5-cyclohexyl-5-oxopentanoic (COP), 4-(2-oxopropyl)benzenecarboxylic (OPB) and 4-oxo-4-(2-pyridyl)butanoic (PYR) were activated by reaction with thiazolidine-2 -thione, this reaction is shown in Scheme 6.
oO
DOC, DMAPDOC, DMAP
-18 °C (4 °C), THF, 20 h-18 °C (4 °C), THF, 20 h
Schéma 6Scheme 6
Bylo naváženo 100 mg (0,56 mmol) kyseliny OPB a 132 mg (0,67 mmol, l,2x mol. ekv. vůči ketokyselině) ΛξΑ'-dicyklohexylkarbodiimidu DCC, tyto navážky byly rozpuštěny v 0,78 ml tetrahydrofuranu (THF) (2,45 dm3-mol-1). Dále bylo naváženo 39,4 mg (0,59 mmol, l,05x mol. ekv. vůči ketokyselině) thiazolidin-2-thionu TT a 2 mg (katalytické množství) 4-(dimethylamino)pyridinu (DMAP), tyto navážky byly rozpuštěny v 0,30 ml THF (1,12 dnT-moF1).100 mg (0.56 mmol) of OPB acid and 132 mg (0.67 mmol, 1.2x mol. equiv. to the keto acid) of ΛξΑ'-dicyclohexylcarbodiimide DCC were weighed, these weights were dissolved in 0.78 ml of tetrahydrofuran (THF) (2.45 dm 3 -mol -1 ). Next, 39.4 mg (0.59 mmol, 1.05 x mol. equiv. to the keto acid) of thiazolidine-2-thione TT and 2 mg (catalytic amount) of 4-(dimethylamino)pyridine (DMAP) were weighed, these weights were dissolved in 0.30 mL THF (1.12 dnT-moF 1 ).
Následně byly roztoky ochlazeny na -18 °C a po dvaceti minutách smíchány. Za stálého míchání byla udržována tato teplota po dobu jedné hodiny, dalších dvacet hodin teplota 4 °C. Následně byla reakční směs filtrací zbavena A, A'-dicyklohexylmočoviny, filtrát byl odpařen za sníženého tlaku a rozpuštěn v ethyl-acetátu. Tento postup byl ještě jednou zopakován a produkt byl vyčištěn dvojnásobnou krystalizací ve směsi ethyl-acetát : dichlormethan (obj. 1/1). Výtěžky těchto reakcí se pohybují mezi 30 a 50 %.Subsequently, the solutions were cooled to -18 °C and mixed after twenty minutes. With constant stirring, this temperature was maintained for one hour, and the temperature was 4°C for the next twenty hours. Subsequently, the reaction mixture was freed from A, A'-dicyclohexylurea by filtration, the filtrate was evaporated under reduced pressure and dissolved in ethyl acetate. This procedure was repeated once more and the product was purified by double crystallization in a mixture of ethyl acetate:dichloromethane (vol. 1/1). The yields of these reactions range between 30 and 50%.
Tentýž postup byl proveden s COP a PYR.The same procedure was performed with COP and PYR.
Takto aktivované kyseliny byly poté derivatizovány amino-derivátem fluorescenční molekuly, např. Cyanine7 (Cy7) nebo Dyomics 676 (DY-676). Bylo naváženo 1,39 mg (4,65 pmol) kyseliny COP a 3,35 mg (4,65 pmol, 1,0 mol. ekv. vůči ketokyselině) Cy7. Obě navážky byly rozpuštěny v 1,193 ml (256,5 dm3-mol-1) rozpouštědla (dimethylformamid - methanol, obj. 3/1) a poté smíchány. K roztoku byl přidán 2,6M roztok hydroxidu sodného (1,10 mol. ekv. vůči ketokyselině). Za stálého míchání probíhala reakce při pokojové teplotě po dobu tří hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí HPLC a TLC (ethyl-acetát). Reakce byla ukončena odpařením rozpouštědla. Výtěžky těchto reakcí se pohybují mezi 94 a 99 %.The activated acids were then derivatized with an amino derivative of a fluorescent molecule, e.g. Cyanine7 (Cy7) or Dyomics 676 (DY-676). 1.39 mg (4.65 pmol) of COP acid and 3.35 mg (4.65 pmol, 1.0 mol eq. to the keto acid) of Cy7 were weighed. Both weights were dissolved in 1.193 ml (256.5 dm 3 -mol -1 ) of solvent (dimethylformamide - methanol, vol. 3/1) and then mixed. A 2.6M solution of sodium hydroxide (1.10 mol. equiv. to the keto acid) was added to the solution. The reaction was carried out at room temperature for three hours with constant stirring. The progress of the reaction was monitored using HPLC and TLC (ethyl acetate). The reaction was terminated by evaporation of the solvent. The yields of these reactions range between 94 and 99%.
Tentýž postup byl proveden s OPB a PYR.The same procedure was performed with OPB and PYR.
Příklad 7: Příprava azido-derivátů peptiduExample 7: Preparation of peptide azido derivatives
Oligopeptidy GE-7, GE-11, CNGRC, cyklický RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV byly připraveny syntézou na pevné fázi za využití mikrovlnného peptidového syntetizátoru standardní Fmoc metodou od C-konce peptidu za využití N-Fmocchráněné aminokyseliny (2,5 eq.), DIC (2,5 eq.) jako aktivátoru a Oxymy (2,5 eq.) jako báze vOligopeptides GE-7, GE-11, CNGRC, cyclic RGDfK, HEWSYLAPYPWF and SYSMEHFRWGKPV were prepared by solid-phase synthesis using a microwave peptide synthesizer using the standard Fmoc method from the C-terminus of the peptide using an N-Fmoc-protected amino acid (2.5 eq.), DIC (2.5 eq.) as activator and Oxymy (2.5 eq.) as base in
-30CZ 2021 - 423 A3-30CZ 2021 - 423 A3
DMF. Po navázání poslední N-Fmoc-aminokyseliny a odstranění Fmoc skupiny byla navázána 5azidopentanová kyselina (2,5 eq.), PyBOP (2,5 eq.) jako aktivátor a DIPEA (5 eq.) jako báze.DMF. After binding of the last N-Fmoc-amino acid and removal of the Fmoc group, 5-azidopentanoic acid (2.5 eq.), PyBOP (2.5 eq.) as an activator, and DIPEA (5 eq.) as a base were attached.
Příklad 8: Příprava polymerních konjugátů obsahujících fluorescenční značku polymeranalogickou reakcíExample 8: Preparation of polymer conjugates containing a fluorescent label by polymer analogue reaction
Polymerní konjugát poly(HPMA-co-Ma-GFLG-DY-676) s aminolyticky vázanou barvičkou přes GFLG spojku byl připraven reakcí amino-derivátu barvičky (2 mg) s polymerním prekurzorem poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide-co- N-methacryloylglycyl-leucylphenylalanyl-glycine thiazolidine-2-thione) (poly(HPMA-co-Ma-GLFG-TT) (98 mg) v 1 mL DMA za přítomnosti báze DIPEA (eq. k barvičce). Reakce byla sledována na HPLC a po navázáni veškeré volné barvičky byly zbylé TT skupiny na polymeru odstraněny přídavkem 1-aminopropan-2-olu (eq. k TT na počátku reakce). Reakční směs byla přečištěna gelovou filtrací (Sephadex LH20) a polymerní frakce zahuštěna a vysrážena do směsi aceton/diethylether a promyta diethyletherem, sraženina sušena do konstatní hmotnosti. Byl stanoven obsah barvičky a změřena molární hmotnost pomocí SEC připraveného polymerního konjugátu.The polymer conjugate poly(HPMA-co-Ma-GFLG-DY-676) with an aminolytically bound dye via a GFLG linker was prepared by reacting the amino derivative of the dye (2 mg) with the polymer precursor poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide-co- N-methacryloylglycyl-leucylphenylalanyl-glycine thiazolidine-2-thione) (poly(HPMA-co-Ma-GLFG-TT) (98 mg) in 1 mL DMA in the presence of DIPEA base (eq. to the dye). The reaction was monitored by HPLC and after binding all the free dye, the remaining TT groups on the polymer were removed by the addition of 1-aminopropan-2-ol (eq. to TT at the beginning of the reaction). The reaction mixture was purified by gel filtration (Sephadex LH20) and the polymer fraction was concentrated and precipitated into an acetone mixture /diethyl ether and washed with diethyl ether, the precipitate dried to constant weight.The dye content was determined and the molar mass was measured by SEC of the prepared polymer conjugate.
Stejně byl připraven i kontrolní polymerní konjugát poly(HPMA-co-Ma-AP-DY-676) s pevně vázanou barvičkou bez degradovatelné sekvence z polymerního prekurzoru poly(N-(2hydroxypropyl)methacrylamide-co-methacrylamidopropanoyl)thiazolidine-2-thione) (poly(HPMA-co-Ma-AP-TT). Obsahy fluorescenčních značek v polymerních konjugátech jsou uvedeny v Tabulce 2.A control polymer conjugate poly(HPMA-co-Ma-AP-DY-676) with a tightly bound dye without a degradable sequence was also prepared from the polymer precursor poly(N-(2hydroxypropyl)methacrylamide-co-methacrylamidopropanoyl)thiazolidine-2-thione) (poly(HPMA-co-Ma-AP-TT). The contents of fluorescent labels in the polymer conjugates are shown in Table 2.
Polymerní konjugát poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO-Az-ValCit-Aba-DY-676) byl připraven dvoukrokovou syntézou. V prvním kroku byl (poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) převeden napoly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) reakcí s DBCO-NH2 v přítomnosti báze DIPEA (eq. k DBCONH2).V druhém kroku byl k prekurzoru poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) (48,6 mg) rozpuštěném v 300 μl DMA přidán roztok modifikované barvičky Az-Val-Cit-Aba-DY-676 za vzniku triazolového můstku. Po vymizení píku volné barvičky dle HPLC, byla reakční směs vysrážena do směsi aceton/diethylether 2:1, sraženina promyta diethyletherem a sušena. Sraženina byla rozpuštěna v MeOH a přečištěna gelovou filtrací (Sephadex LH20). Polymerní frakce byla zahuštěna a vysrážena do diethyletheru. Byl stanoven obsah barvičky a změřena molární hmotnost pomocí SEC připraveného polymerního konjugátu.The polymer conjugate poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO-Az-ValCit-Aba-DY-676) was prepared by a two-step synthesis. In the first step, (poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) was converted to poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) by reaction with DBCO-NH2 in the presence of DIPEA base (eq. to DBCONH2). In the second step, to the precursor poly(HPMA-co-Ma-AP-DBCO) (48.6 mg) dissolved in 300 μl of DMA, a solution of the modified dye Az-Val-Cit-Aba-DY-676 was added to form a triazole bridge. After the disappearance of the peak of the free dye according to HPLC, the reaction mixture was precipitated into acetone/diethyl ether 2:1, the precipitate washed with diethyl ether and dried. The precipitate was dissolved in MeOH and purified by gel filtration (Sephadex LH20). The polymer fraction was concentrated and precipitated into diethyl ether. The dye content was determined and molar mass measured by SEC of prepared polymer conjugate.
Příklad 9: Příprava konjugátů s pH senzitivní vazbouExample 9: Preparation of conjugates with a pH-sensitive bond
Polymerní konjugát s pH senzitivní vazbou poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=COP-DY-676) byl připraven reakcí keto kyselinou modifikované barvičky COP-Dy-676 (2 mg) a polymerního prekurzoru poly(HPMA-co-Ma-Pentyl-NH-NH2) (98 mg) v 1 mL MeOH s 40 μL kyseliny octové a za stálého míchání probíhala při pokojové teplotě 48 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí HPLC a TLC (CHCb/MeOH/kyselina octová - 8/2/1). Poté byly produkty reakce purifikovány sloupcovou gelovou chromatografií pomocí gelu Sephadex LH-20, jako mobilní fáze byl použit methanol. Frakce produktu byly zahuštěny odpařením methanolu za sníženého tlaku a vysráženy do ethyl-acetátu, centrifugovány a sušeny do konstantní hmotnosti. Výtěžky těchto reakcí se pohybují mezi 50 a 70 %. Následně byl spektrofotometricky stanoven obsah fluoroforu a změřena molární hmotnost pomocí SEC.The polymer conjugate with a pH-sensitive bond poly(HPMA-co-Ma-Heptyl-NH-NH=COP-DY-676) was prepared by the reaction of the keto acid-modified dye COP-Dy-676 (2 mg) and the polymer precursor poly(HPMA-co -Ma-Pentyl-NH-NH2) (98 mg) in 1 mL of MeOH with 40 μL of acetic acid and stirred at room temperature for 48 h. The progress of the reaction was monitored by HPLC and TLC (CHClb/MeOH/acetic acid - 8/2/1). Then the reaction products were purified by column gel chromatography using Sephadex LH-20 gel, methanol was used as the mobile phase. The product fractions were concentrated by evaporation of methanol under reduced pressure and precipitated into ethyl acetate, centrifuged and dried to constant weight. The yields of these reactions range between 50 and 70%. Subsequently, the fluorophore content was determined spectrophotometrically and the molar mass was measured using SEC.
Příklad 10: Příprava směrovaných konjugátůExample 10: Preparation of directed conjugates
Peptidem směrované konjugáty byly připraveny click reakcí azido-derivátu peptidu GE-7 s polymerním prekurzorem s DBCO skupinami, který byl připraven z prekurzoru poly(HPMA-coMa-GFLG-TT) převedeného na poly(HPMA-co-Ma-GFLG-TT-co-Ma-GFLG-DBCO) reakcí s 0,5-4mol% DBCO-NH2 v přítomnosti báze DIPEA (eq. k DBCO-NH2). Po vazbě fluoroforu, viz Příklad 8, byl navázán azido-derivát peptidu, a to nekatalyzovanou click reakcí v DMA. Stejně byly připraveny i další směrované konjugáty azido-deriváty peptidů GE-11, CNGRC, cyklickýmPeptide-directed conjugates were prepared by click reaction of an azido-derivative of the GE-7 peptide with a polymeric precursor with DBCO groups, which was prepared from the precursor poly(HPMA-coMa-GFLG-TT) converted to poly(HPMA-co-Ma-GFLG-TT- co-Ma-GFLG-DBCO) by reaction with 0.5-4 mol% DBCO-NH2 in the presence of DIPEA base (eq. to DBCO-NH2). After binding the fluorophore, see Example 8, the azido-derivative of the peptide was bound by an uncatalyzed click reaction in DMA. In the same way, other directed conjugates of azido-derivative peptides GE-11, CNGRC, were prepared by cyclic
- 31 CZ 2021 - 423 A3- 31 CZ 2021 - 423 A3
RGDfK, HEWSYLAPYPWF a SYSMEHFRWGKPV. Kontrolní směrovaný konjugát s pevně vázanou barvičkou byl připraven z poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) obnobně jako je popsáno výše.RGDfK, HEWSYLAPYPWF and SYSMEHFRWGKPV. A control directed conjugate with tightly bound dye was prepared from poly(HPMA-co-Ma-AP-TT) as described above.
Peptidem směrované konjugáty s pH senzitivní vazbou byly připraveny stejně jako v Příkladu 9 a dále na zbylé hydrazidové skupiny byl navázán DBCO-NHS v přítomnosti báze DIPEA (eq. k DBCO-NHS) v metanolu. Azido-derivát peptidu byl potom click reakcí přes DBCO připojen k polymernímu konjugátu.Peptide-directed conjugates with a pH-sensitive bond were prepared as in Example 9, and further DBCO-NHS was bound to the remaining hydrazide groups in the presence of DIPEA base (eq. to DBCO-NHS) in methanol. The azido-derivative of the peptide was then attached to the polymer conjugate by a click reaction via DBCO.
Protilátkou směrované konjugáty byly připraveny ze semitelechelického prekurzoru poly(HPMAco-Ma-Pentyl-NH-NH-Boc)-TT, končeného reaktivní TT skupinou připraveného s využitím přenosového činidla TT-CTA jako v Příkladu 4. Koncová TT skupina byla reakcí s N-(2aminoethyl)maleimidem převedena na maleiimid, který byl využit, po odchránění Boc chránící skupiny a navázání fluoroforu, pro reakci s redukovanou protilátkou rituximabem.Antibody-directed conjugates were prepared from the semitelechelic precursor poly(HPMAco-Ma-Pentyl-NH-NH-Boc)-TT, terminated with a reactive TT group prepared using the transfer reagent TT-CTA as in Example 4. The terminal TT group was reacted with N- (2-aminoethyl)maleimide was converted to maleimide, which was used, after deprotection of the Boc protecting group and attachment of the fluorophore, for reaction with the reduced antibody rituximab.
Protilátka byla redukována mírnou redukcí dithiothreitolem v PBS pufru a po redukci byla vyčištěna od volného dithiothreitolu na koloně PD10. Následně byla smíchána s polymerním konjugátem nesoucím hydrazonově vázanou fluorescenční značku a koncovou maleinimidovou skupinu.The antibody was reduced by gentle reduction with dithiothreitol in PBS buffer and after reduction was purified from free dithiothreitol on a PD10 column. It was subsequently mixed with a polymer conjugate bearing a hydrazone-linked fluorescent label and a terminal maleimide group.
Připravené směrované konjugáty, viz Tabulka 2, byly charakterizovány, byl stanoven obsah barvičky a pomocí aminokyselinové analýzy stanoven obsah peptidu/protilátky. Molární hmotnost nemohla být změřena, a to vzhledem k interakci lazeru použitého v detektorech GPC s fluoroforem, což znemožňovalo stanovení těchto charakteristik.The prepared targeted conjugates, see Table 2, were characterized, the dye content was determined and the peptide/antibody content was determined by amino acid analysis. The molar mass could not be measured due to the interaction of the laser used in the GPC detectors with the fluorophore, which made it impossible to determine these characteristics.
Příklad 11: Zhášení fluorescence na polymeruExample 11: Fluorescence quenching on a polymer
Zhášení fluorescence bylo experimentálně provedeno změřením intenzity fluorescence fluorescenčního polymeru poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=COP-DY-676) ve fosfátovém pufru (0,3M, pH 7,4) o koncentraci fluorescenčního polymeru 0,1 g^dm 3 a intenzity fluorescence tohoto roztoku po totální hydrolýze. Ta byla dosažena přidáním koncentrované k. octové (¼ původního objemu) k původnímu roztoku. Toto ředění bylo kompenzováno vynásobením této intenzity 1,25x. Bylo zjištěno, že po navázání dochází k významnému snížení fluorescence navázaných fluoroforů, a fluorescence je opět obnovena po uvolnění z polymeru, viz Obr. 1. Obdobně byl proveden experiment s polymerními konjugáty s hydrazonově vázanými deriváty OPB a PYR fluorescenční značky DY-676 a dále shodnými deriváty dalších fluorescenčních značek, např. DY-782, Cy-7, DY-767, a dále s fluorescenční značkou DY-676 nebo CY-7 vázanou přes enzymaticky štěpitelné spojky GLG, GFG, GLFG, GFLFG, GFLG, Val-Cit a Val-Cit-Aba, kde bylo rovněž pozorováno významné zhášení fluorescenčního signálu po vazbě na polymer a následná aktivace fluorescence po inkubaci s modelovým lysosomálním enzymem katepsinem B.Fluorescence quenching was experimentally performed by measuring the fluorescence intensity of the fluorescent polymer poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=COP-DY-676) in a phosphate buffer (0.3M, pH 7.4) with a fluorescent polymer concentration of 0.1 g^dm 3 and fluorescence intensity of this solution after total hydrolysis. This was achieved by adding concentrated vinegar (¼ of the original volume) to the original solution. This dilution was compensated for by multiplying this intensity by 1.25x. It was found that after binding there is a significant decrease in the fluorescence of the bound fluorophores, and the fluorescence is restored again after release from the polymer, see Fig. 1. An experiment was similarly carried out with polymer conjugates with hydrazone-bound OPB and PYR derivatives of the fluorescent label DY-676 and also with identical derivatives of other fluorescent labels, e.g. DY-782, Cy-7, DY-767, and then with the fluorescent label DY- 676 or CY-7 bound via enzymatically cleavable linkers GLG, GFG, GLFG, GFLFG, GFLG, Val-Cit and Val-Cit-Aba, where significant quenching of the fluorescence signal upon binding to the polymer and subsequent activation of fluorescence upon incubation with the model was also observed by the lysosomal enzyme cathepsin B.
Aktivace fluorescenčního signálu je možné využít pro zvýšení fluorescence v rámci nádorové tkáně u nádorových buněk, kde dochází po pasivní nebo aktivní akumulaci k uvolnění fluoroforu buď díky sníženému pH nádorové tkáně nebo díky aktivitě lysosomálních enzymů po vstupu konjugátů do nádorových buněk. Tato aktivace signálu následně vede k významnému nárůstu kontrastu fluorescenčního signálu v nádorovém prostředí a mimo něj. Nárůst kontrastu lze využít v rámci navigované nádorové chirurgie, kdy zlepšený kontast nádorová/nenádorová tkáň umožní chirurgovi jasné zvýraznění nádorové masy a tedy přesnou resekci této tkáně.The activation of the fluorescent signal can be used to increase the fluorescence within the tumor tissue in tumor cells, where after passive or active accumulation, the fluorophore is released either due to the reduced pH of the tumor tissue or due to the activity of lysosomal enzymes after the conjugates enter the tumor cells. This activation of the signal subsequently leads to a significant increase in the contrast of the fluorescent signal in the tumor environment and beyond. The increase in contrast can be used within the framework of navigated tumor surgery, when the improved tumor/non-tumor tissue contrast will allow the surgeon to clearly highlight the tumor mass and therefore to perform a precise resection of this tissue.
Příklad 12: Uvolňování fluoroforů zpolymerních systémůExample 12: Release of fluorophores from polymer systems
Uvolňování fluoroforů bylo měřeno pomocí HPLC. Fluorescenční polymery s hydrazonově vázaným fluroforem byly inkubovány ve fosfátovém pufru (0,3M, pH 7,4) o koncentraci 0,1 g^dm 3 při 37 °C. V časech 0, ½, 1, 2, 4, 6, 8 a 10 hodin bylo měřeno množství uvolněného fluoroforu. Z Obr. 2 je patrné, že rychlost uvolnění fluoroforu je závislé na pH a na typu spojky. Štěpení ve fyziologickém pH 7,4, je oproti štěpení v kyselém pH, simulujícím nádorovou tkáň, pomalejší.Fluorophore release was measured by HPLC. Fluorescent polymers with a hydrazone-linked fluorophore were incubated in phosphate buffer (0.3M, pH 7.4) at a concentration of 0.1 g^dm 3 at 37°C. At 0, ½, 1, 2, 4, 6, 8 and 10 hours, the amount of released fluorophore was measured. From Fig. 2 it can be seen that the release rate of the fluorophore is dependent on the pH and the type of coupling. Cleavage at physiological pH 7.4 is slower than cleavage at acidic pH, simulating tumor tissue.
- 32 CZ 2021 - 423 A3- 32 CZ 2021 - 423 A3
Významné zvýšení intenzity fluorescence způsobené uvolněním fluoroforu z polymeru tedy nastane až v nádorové tkáni, kde dojde ke zvýšení kontrastu mezi nádorovou a zdravou tkání. Fluorescenční polymery s fluorescenční značkou vázanou přes enzymaticky degradovatelné spojky byly inkubovány ve fosfátovém pufru (KH2PO4, NaOH, pH=6,0, 0,001 M EDTA a 0,01 M 5 glutathionu)) o koncentraci 0,1 g^dm 3 při 37 °C za přítomnosti katepsinu B (2*107 mol l-1).A significant increase in the fluorescence intensity caused by the release of the fluorophore from the polymer will therefore only occur in the tumor tissue, where there will be an increase in the contrast between the tumor and healthy tissue. Fluorescent polymers with a fluorescent label bound via enzymatically degradable linkers were incubated in phosphate buffer (KH2PO4, NaOH, pH=6.0, 0.001 M EDTA and 0.01 M 5 glutathione)) at a concentration of 0.1 g^dm 3 at 37° C in the presence of cathepsin B (2*10 7 mol l -1 ).
V časech 0, 1, 2, 8 a 24 hodin bylo měřeno množství uvolněného fluoroforu. Po štěpení katepsinem B bylo zjištěno uvolňování fluoroforu a významné navýšení fluorescence.At times 0, 1, 2, 8 and 24 hours, the amount of released fluorophore was measured. After cleavage with cathepsin B, the release of the fluorophore and a significant increase in fluorescence were detected.
Příklad 13: Fyzikální charakterizace konjugátůExample 13: Physical characterization of conjugates
Obsah fluoroforu byl stanoven spektrofotometricky a byl určen obsah fluoroforou v konjugátech: pol-COP-Cy7 (ε = 91 000 dm3^mol-^cm-1) 0,4 hm. %, pol-OPB-Cy7 (ε = 83 000 dm3^mol-^cm-1) 1,8 hm. % a pol-PYR-Cy7 (ε = 60 000 dm3^mol-bcm-1) 0,4 hm. %.The fluorophore content was determined spectrophotometrically and the fluorophore content in the conjugates was determined: pol-COP-Cy7 (ε = 91,000 dm 3 ^mol - ^cm -1 ) 0.4 wt. %, pol-OPB-Cy7 (ε = 83,000 dm 3 ^mol - ^cm -1 ) 1.8 wt. % and pol-PYR-Cy7 (ε = 60,000 dm 3 ^mol -b cm -1 ) 0.4 wt. %.
Tabulka 2Table 2
- 33 CZ 2021 - 423 A3- 33 CZ 2021 - 423 A3
Příklad 14: In vitro testováníExample 14: In Vitro Testing
Buňky s fluorescenčním polymerem poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=OPB-Cy7) o koncentraci 5 mg^dm 3 byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 6 a 24 h. Poté byla měřena fluorescence pomocí konfokálního mikroskopu. Z Obr. 3. je patrné, že v čase 24 h dojde k významnému vzrůstu fluorescence díky odštěpení fluoroforu, jelikož měl polymerní konjugát dostatek času proniknout do buněk. Naopak v čase 6 h je zřejmé, že ještě nedošlo k hydrolýze či enzymatickému štěpení spojek a tedy k uvolnění.Cells with the fluorescent polymer poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=OPB-Cy7) at a concentration of 5 mg^dm 3 were incubated at 37 °C for 6 and 24 h. Then fluorescence was measured using a confocal microscope . From Fig. 3. it is noticeable that in 24 h there will be a significant increase in fluorescence due to the cleavage of the fluorophore, as the polymer conjugate had enough time to penetrate the cells. On the contrary, at the time of 6 h, it is clear that no hydrolysis or enzymatic cleavage of the couplings has yet occurred, and therefore no release.
Příklad 15: In vivo testováníExample 15: In vivo testing
Byl proveden in vivo pokus na athymických nahých myších (Hs1Cpb:NMRI-Foxn1nu) nesoucích kolorektální nádor DLD-1. Myši byly injekovány fluorescenčními polymery poly(HPMA-co-MaAP-DY-676) nebo poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=OPB-DY676), které měly navázanou fluorescenční značku buď amidickou vazbou k nedegradovatelé spojce v bočním řetězci polymerního nosiče, nebo pH-sensitivní spojkou (hydrazonová vazba). Po 24 h bylo pomocí neinvazivního zobrazovacího systému myšky vyšetřeny, Obr. 4. Bylo zjištěno, že zatímco v myškách s napevno vázanou značkou je fluorescence rozprostřena velmi homogenně v rámci těla myšky se mírně zvýšenou intenzitou v místě nádoru (Obr. 4A), tak u myšek s podaným pHsensitivním fluorescenčním polymerem (Obr. 4B) bylo zjištěno, že fluorescence je převážně lokalizována v nádorové tkáni a že kontrast vzhledem k zdravé tkáni je významně vyšší než u stabilního systému.An in vivo experiment was performed on athymic nude mice (Hs1Cpb:NMRI-Foxn1 nu ) bearing DLD-1 colorectal tumor. Mice were injected with the fluorescent polymers poly(HPMA-co-MaAP-DY-676) or poly(HPMA-co-Ma-Acap-NH-NH=OPB-DY676), which had a fluorescent label attached either by an amide bond to a non-degradable linker in the lateral chains of the polymer carrier, or by a pH-sensitive link (hydrazone bond). After 24 h, the mice were examined using a non-invasive imaging system, Fig. 4. It was found that while in mice with a fixed label the fluorescence is spread very homogeneously within the body of the mouse with a slightly increased intensity at the tumor site (Fig. 4A), so in mice with administered pH-sensitive fluorescent polymer (Fig. 4B) it was found , that the fluorescence is mainly localized in the tumor tissue and that the contrast with respect to the healthy tissue is significantly higher than in the stable system.
Claims (14)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2021-423A CZ2021423A3 (en) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | Fluorescently labelled polymer for visualizing tumours, preparing and using it |
PCT/CZ2022/050088 WO2023036351A1 (en) | 2021-09-13 | 2022-09-09 | Fluorescently labelled polymer for tumour visualization, method of its preparation and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2021-423A CZ2021423A3 (en) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | Fluorescently labelled polymer for visualizing tumours, preparing and using it |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ2021423A3 true CZ2021423A3 (en) | 2023-03-22 |
Family
ID=83689850
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2021-423A CZ2021423A3 (en) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | Fluorescently labelled polymer for visualizing tumours, preparing and using it |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ2021423A3 (en) |
WO (1) | WO2023036351A1 (en) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220236280A1 (en) | 2019-06-07 | 2022-07-28 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Method and device for imaging fluorescent proteins in near- and short-wave infrared |
EP4013834A1 (en) * | 2019-10-09 | 2022-06-22 | I.T.A. Intertact S.R.O. | Fluorescent polymer, fluorescent probe and conjugation kit for advanced functional analysis of cells in haematology, immunology and microbiology, method of preparation and use thereof |
CZ309067B6 (en) * | 2019-10-18 | 2022-01-12 | Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. | Process of preparing polymeric carriers for pH-controlled release of drugs and their conjugates with drugs |
-
2021
- 2021-09-13 CZ CZ2021-423A patent/CZ2021423A3/en unknown
-
2022
- 2022-09-09 WO PCT/CZ2022/050088 patent/WO2023036351A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2023036351A1 (en) | 2023-03-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6270981B2 (en) | Methods for the production and synthesis of amino acid linking groups conjugated to compounds used for targeted imaging of tumors | |
Ulbrich et al. | Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers | |
JP4675028B2 (en) | Trimethyl lock type tetrapartate prodrug | |
US8703114B2 (en) | Conjugate of a polymer, an anti-angiogenesis agent and a targeting moiety, and uses thereof in the treatment of bone related angiogenesis conditions | |
Ljubimova et al. | Nanoconjugate based on polymalic acid for tumor targeting | |
Dvořák et al. | High-molecular weight HPMA copolymer–adriamycin conjugates | |
AU2017265310B2 (en) | Multi-arm polymeric targeting anti-cancer conjugate | |
EP2682131B1 (en) | Switching-type fluorescent nanoparticle probe, and fluorescent molecular imaging method using same | |
CA2438326A1 (en) | Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues | |
AU2015317444B2 (en) | uPAR targeting peptide for use in peroperative optical imaging of invasive cancer | |
Dal Pozzo et al. | Conjugates of a novel 7-substituted camptothecin with RGD-peptides as αvβ3 integrin ligands: an approach to tumor-targeted therapy | |
EP3969063B1 (en) | Modified cyanine dyes and conjugates thereof | |
CN101257928A (en) | Optical imaging contrast agents | |
US11851421B2 (en) | Near-infrared cyanine dyes and conjugates thereof | |
US20060147378A1 (en) | Azulene dimer-quenched, near-infrared fluorescent probes | |
CN108586579B (en) | Quasi-peptide, derivative, salt, preparation method and application thereof | |
ES2717836T3 (en) | Multifunctional drug delivery system based on polymic acid | |
CZ2021423A3 (en) | Fluorescently labelled polymer for visualizing tumours, preparing and using it | |
US10828380B2 (en) | Conjugate of polysarcosine and NIR contrast agent for photoacoustic imaging | |
EP4401795A1 (en) | Fluorescently labelled polymer for tumour visualization, method of its preparation and use thereof | |
US11129909B2 (en) | Conjugate and block copolymer containing fluorescent chromophore and preparation method therefor and use thereof | |
JP6700750B2 (en) | Compound and contrast agent for optical imaging containing the compound | |
Yang et al. | The impact of the HPMA polymer structure on the targeting performance of the conjugated hydrophobic ligand | |
US20240131199A1 (en) | Ph responsive cyanine dyes and conjugates thereof | |
JP2020513050A (en) | Protease-activated contrast agent for in vivo imaging |