CZ2021400A3 - A strain producing clostripain-like protein for use in an admixture with recombinant collagenase ColG and ColH to isolate pancreatic islets of Langerhans - Google Patents
A strain producing clostripain-like protein for use in an admixture with recombinant collagenase ColG and ColH to isolate pancreatic islets of Langerhans Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2021400A3 CZ2021400A3 CZ2021-400A CZ2021400A CZ2021400A3 CZ 2021400 A3 CZ2021400 A3 CZ 2021400A3 CZ 2021400 A CZ2021400 A CZ 2021400A CZ 2021400 A3 CZ2021400 A3 CZ 2021400A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- clostripain
- collagenase
- protein
- isolation
- colh
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12Y304/22008—Clostripain (3.4.22.8)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Geneticky modifikovaný bakteriální kmen E. coli uložený v České sbírce mikroorganismů pod číslem CCM 9176 s vneseným plazmidem pET28 obsahující gen pro clostripainovou peptidázu mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, produkující enzym peptidázu, a jeho použití.Genetically modified E. coli bacterial strain deposited in the Czech Collection of Microorganisms under the number CCM 9176 with the introduced plasmid pET28 containing the gene for clostripain peptidase having the amino acid sequence SEQ ID NO:1, producing the peptidase enzyme, and its use.
Description
Vynález se týká přípravy rekombinantních proteinů v bakterii E. coli, jejich následné purifikace a použití směsi purifikovaných proteinů pro izolaci Langerhansových ostrůvků (LO) z tkáně slinivky břišní. Konkrétně se jedná o dva druhy kolagenáz (ColG a ColH) a hlavně nového druhu clostripainu, který synergicky působí se dvěma zmíněnými kolagenázami při izolaci LO.The invention relates to the preparation of recombinant proteins in the bacterium E. coli, their subsequent purification and the use of a mixture of purified proteins for the isolation of islets of Langerhans (LO) from pancreatic tissue. Specifically, these are two types of collagenases (ColG and ColH) and mainly a new type of clostripain, which acts synergistically with the two mentioned collagenases in the isolation of LO.
Dosavadní stav technikyCurrent state of the art
Izolace Langerhansových ostrůvků (LO) má ve srovnání se separací jiných buněčných typů svá daná specifika. Nesmí při ní docházet k úplnému rozdělení stejných buněčných typů. V rámci této separace tkáňových buněk se stále hledá vyvážený postup, při kterém je nutná desintegrace tkání, ale zároveň protichůdný proces, udržení stejného buněčného klastru (LO) při sobě. Na tomto poli dochází ke značným pokrokům a do dnešní doby byly nastaveny procesy izolace LO a byla vytipována a vyzkoušena řada enzymů, díky kterým lze izolovat LO v poměrně dobré kvalitě. Stále existuje spousta oblastí, kde je nutné zlepšení. Jednou z hlavních je produkce standardizovaných šarží enzymů kolagenázy a pomocných enzymů jako je clostripain a neutrální proteázy a míchání jejich směsí. Prozatím nebyla vytvořena žádná specifická směs enzymů, která by byla rutinně používána pro izolaci LO. Důvodem jsou na jedné straně prozatím stále nedostatečné detailní informace o složení pankreatické tkáně a na straně druhé nedostatečná znalost synergie jednotlivých enzymů kolagenáz, clostripainu a jiných proteáz, při desintegraci tkáně slinivky. Enzymy jsou často detailně popsány po biochemické stránce a jednotlivě samy o sobě, ale chybí množství dat o tom, jak mohou působit in vivo při procesu izolace LO.Isolation of the islets of Langerhans (LO) has its specific characteristics compared to the separation of other cell types. It must not result in a complete division of the same cell types. Within this separation of tissue cells, a balanced procedure is still sought, in which tissue disintegration is necessary, but at the same time the opposite process, keeping the same cell cluster (LO) together. Considerable progress is being made in this field, and to date LO isolation processes have been set up and a number of enzymes have been identified and tested, thanks to which LO can be isolated in relatively good quality. There are still plenty of areas where improvement is needed. One of the main ones is the production of standardized batches of collagenase enzymes and auxiliary enzymes such as clostripain and neutral proteases and mixing their mixtures. So far, no specific enzyme mixture has been developed that is routinely used for LO isolation. The reason is, on the one hand, still insufficient detailed information on the composition of pancreatic tissue and, on the other hand, insufficient knowledge of the synergy of individual collagenase enzymes, clostripain and other proteases, during pancreatic tissue disintegration. Enzymes are often described in detail biochemically and individually in their own right, but there is a lack of data on how they may act in vivo in the LO isolation process.
Kolagenázy jsou proteázy rozkládající kolagen, které jsou hojně používány v kosmetice, potravinářství, průmyslu, ale i v medicíně. Pro terapeutické účely, jakým je například i izolace LO, se používají mikrobiální kolagenázy, které na rozdíl od eukaryotických kolagenáz dovedou štěpit kolagen na více místech. Pro kvalitní optimalizaci a vyvážení izolace LO je potřeba najít vhodný poměr používaných enzymů, které mají synergický efekt působení.Collagenases are collagen-degrading proteases that are widely used in cosmetics, food, industry, and medicine. For therapeutic purposes, such as the isolation of LO, microbial collagenases are used, which, unlike eukaryotic collagenases, can cleave collagen in multiple places. For high-quality optimization and balancing of LO isolation, it is necessary to find a suitable ratio of the enzymes used, which have a synergistic effect.
K izolaci LO se původně využívala směs enzymů izolovaných z lyzátu bakterie Clostridium histolyticum, kdy se jednalo o směs až 12 různých enzymů podílejících se na degradaci tkáně. Tato směs ale dle kvality přečištění obsahovala také různé balastní proteiny jako pigmenty nebo endotoxiny. Tyto proteiny mohly být pro proces izolace LO nežádoucí mohou dokonce mít prozánětlivý účinek (Berney et al., 2001; Vargas et al., 1998). Ač tyto směsi byly a jsou produkovány vždy stejným způsobem, jejich charakter vede k nejednoznačným a neinterpretovatelným výsledkům. Tím se ztěžuje jejich kvalitní použití v medicíně. Takové směsi enzymů, které jsou parciálně purifikované, se pro izolace využívají dodnes, jsou však snahy používat vysoce purifikované enzymy přímo z produkčních bakterií, nebo využít produkce rekombinantních proteinů v dobře popsaných systémech, jako jsou bakterie E. coli (Ducka et al., 2009; Volpe et al., 2016), Bacillus (Jung et al., 1996) atd. Produkce rekombinantních proteinů však sebou nese také úskalí, jelikož nevznikají ve svém přirozeném organismu, mají různé tagy. Z toho důvodu byly optimalizovány (Alipour et al., 2014) například kodony pro produkci klostridiální kolagenázy v E. coli.A mixture of enzymes isolated from the lysate of the bacterium Clostridium histolyticum was originally used to isolate LO, when it was a mixture of up to 12 different enzymes involved in tissue degradation. However, depending on the quality of purification, this mixture also contained various ballast proteins such as pigments or endotoxins. These proteins could be undesirable for the LO isolation process and may even have a pro-inflammatory effect (Berney et al., 2001; Vargas et al., 1998). Although these mixtures were and are always produced in the same way, their nature leads to ambiguous and uninterpretable results. This makes their quality use in medicine difficult. Such enzyme mixtures, which are partially purified, are still used for isolation today, but there are efforts to use highly purified enzymes directly from production bacteria, or to use the production of recombinant proteins in well-described systems such as E. coli bacteria (Ducka et al., 2009 ; Volpe et al., 2016), Bacillus (Jung et al., 1996), etc. However, the production of recombinant proteins also entails pitfalls, as they do not occur in their natural organism, they have different tags. For that reason, for example, the codons for the production of clostridial collagenase in E. coli were optimized (Alipour et al., 2014).
Již v devadesátých letech bylo prokázáno, že kolagenáza třídy I a II (ColH a ColG) stačí k úspěšné izolaci LO z tkáně slinivky břišní (Vos-Scheperkeuter et al., 1997; Gerrit H.J. Wolters et al., 1995). Přidáváním dalších purifikovaných enzymů by docházelo vzhledem k náročnosti procesu výroby, k prodražení celého postupu izolace LO. Několik biotechnologických firem se zaměřilo na purifikaci bakteriálních kolagenáz a tím přispěly k rozšíření metody izolace a transplantace LOAlready in the 1990s, it was shown that collagenase class I and II (ColH and ColG) are sufficient to successfully isolate LO from pancreatic tissue (Vos-Scheperkeuter et al., 1997; Gerrit H.J. Wolters et al., 1995). Adding more purified enzymes would increase the cost of the entire LO isolation process due to the complexity of the production process. Several biotechnological companies focused on the purification of bacterial collagenases and thereby contributed to the expansion of the LO isolation and transplantation method
- 1 CZ 2021 - 400 A3 pacientům trpícím diabetem. V první řadě, produkce těchto purifikovaných enzymů v průmyslovém měřítku přispěla k tomu, aby se metoda mohla stát rutinní medicínskou praxí. Ovšem stále je spousta aspektů, které lze vylepšovat, jedním z nich je právě lepší specifita a čistota, ke které může přispívat synergický efekt přídatných enzymů jakými jsou např. clostripain.- 1 CZ 2021 - 400 A3 to patients suffering from diabetes. In the first place, the production of these purified enzymes on an industrial scale contributed to the fact that the method could become a routine medical practice. However, there are still many aspects that can be improved, one of them is precisely better specificity and purity, to which the synergistic effect of additional enzymes such as clostripain can contribute.
Pro kompletní izolaci a oddělení LO od okolní tkáně potřebuje kolagenáza ColG a ColH působit společně ve specifickém poměru a vyžaduje synergický efekt přídatných enzymů jako jsou neurální proteázy nebo termolyzin (O’Gorman et al., 2005; G. H.J. Wolters et al., 1992). I když jsou schopny kolagenázy ColH a ColG štěpit tkáň slinivky samostatně, případně samotné pouze s příměsí neutrálních proteáz, existují studie na efektivní poměry těchto dvou forem kolagenáz C. histolyticum. Uvádí se, že ideální poměr ColH a ColG je 0,64:1,0 (Brandhorst et al., 2008), z čehož vyplývá, že zásadní je pro štěpení v této kombinaci právě ColG. I když samotná ColH s příměsí neutrálních proteáz je schopna štěpit tkáň slinivky. Poměr dvou zmiňovaných kolagenáz určuje také množství neutrálních proteáz nutných k izolaci LO. Tyto poměry také určují kvalitu desintegrace tkání, která vede ke kvalitě a vyšší životaschopnosti (viabilitě) ostrůvků, která je vyžadována pro úspěšnost samotné transplantace.For complete isolation and separation of LO from the surrounding tissue, collagenase ColG and ColH need to act together in a specific ratio and require the synergistic effect of additional enzymes such as neural proteases or thermolysin (O'Gorman et al., 2005; G.H.J. Wolters et al., 1992). Although ColH and ColG collagenases are capable of cleaving pancreatic tissue independently, or alone with the addition of neutral proteases, there are studies on the effective ratios of these two forms of C. histolyticum collagenases. The ideal ratio of ColH to ColG is reported to be 0.64:1.0 (Brandhorst et al., 2008), suggesting that ColG is essential for cleavage in this combination. Although ColH alone with admixture of neutral proteases is capable of cleaving pancreatic tissue. The ratio of the two mentioned collagenases also determines the amount of neutral proteases required to isolate LO. These ratios also determine the quality of tissue disintegration, which leads to the quality and higher viability of the islets, which is required for the success of the transplant itself.
Ideální pro izolaci LO je kromě použití specifických poměrů ColG a ColH také použití speciálně míchaných směsí obsahujících podpůrné lytické proteiny. Kromě neutrálních proteáz, termolyzinu a dispázy (používaná v experimentech s prasečími slinivkami) je dalším důležitým enzymem clostripain, který je zodpovědný za tryptickou aktivitu ve směsích pro izolaci LO. Experimenty s izolacemi LO z prasečích slinivek naznačují, že u purifikovaných kolagenáz, které vykazovaly vysokou tryptickou aktivitu a nízkou aktivitu neutrálních proteáz, docházelo k vyššímu výtěžku LO. Další experimenty na potkanech prokázaly, že použití clostripainu vede ke zkrácení času digesce tkáně a nedochází k porušení LO jako při použití jiných směsí (Klock et al., 1996). Základem pro izolaci LO je tedy použití správné proporce nejrůznějších specifických enzymů, které se mohou lišit také tím, jakým způsobem jsou produkovány. Existuje více studií, které potvrzují, že přítomnost clostripainu zvyšuje výnos a kvalitu LO při jejich izolaci (Brandhorst et al., 2009). Na rozdíl od synergického efektu clostripainu a neutrálních proteáz, jeho použití s termolyzinem nemá žádný pozitivní efekt. Ovšem použití různých enzymů se může lišit také vzhledem k materiálu pro izolaci (slinivka prasat, krys nebo humánní materiál). U izolace LO ze slinivky břišní humánního původu docházelo k lepší izolaci při použití clostripainu (Stáhle et al., 2015). Mechanismus působení clostripainu není do důsledku popsaný dodnes, dle hypotéz pomáhá svou aktivitou degradaci elastinu jako součásti extracelulární matrix.In addition to using specific ColG and ColH ratios, specially mixed mixtures containing supporting lytic proteins are ideal for LO isolation. In addition to neutral proteases, thermolysin and dispase (used in pig pancreas experiments), another important enzyme is clostripain, which is responsible for tryptic activity in LO isolation mixtures. Experiments with LO isolations from porcine pancreas indicated that purified collagenases that showed high tryptic activity and low neutral protease activity had a higher yield of LO. Further experiments in rats have shown that the use of clostripain leads to a reduction in the time of tissue digestion and does not cause a violation of the LO as with the use of other mixtures (Klock et al., 1996). The basis for the isolation of LO is therefore the use of the correct proportion of various specific enzymes, which can also differ in the way they are produced. There are several studies that confirm that the presence of clostripain increases the yield and quality of LO when isolated (Brandhorst et al., 2009). Unlike the synergistic effect of clostripain and neutral proteases, its use with thermolysin has no positive effect. However, the use of different enzymes may also differ depending on the material for isolation (pig pancreas, rat or human material). In the isolation of LO from the pancreas of human origin, better isolation occurred when clostripain was used (Stáhle et al., 2015). The mechanism of action of clostripain has not yet been fully described, according to hypotheses, its activity helps the degradation of elastin as part of the extracellular matrix.
Kromě použití kolagenáz a proteolytických enzymů, pocházejících přímo z produkčních organismů, lze využít k produkci dobře definované systémy pro rekombinantní proteiny. Příprava takových kmenů nemusí být snadná, jelikož protein nemusí být v cílovém organismu dobře produkován. Již v roce 1996 byla připravena kolagenáza ColH z C. histolyticum, produkovaná v bakterii Bacillus subtilis, jelikož je k C. histolyticum více příbuzný než běžně užívaná E. coli (Jung et al., 1996). Ovšem také v E. coli byla připravena funkční rekombinantní kolagenáza (Ducka et al., 2009), kterou lze použít pro izolaci LO.In addition to the use of collagenases and proteolytic enzymes, originating directly from the production organisms, well-defined systems for recombinant proteins can be used for production. The preparation of such strains may not be easy, as the protein may not be well produced in the target organism. Already in 1996, collagenase ColH from C. histolyticum was prepared, produced in the bacterium Bacillus subtilis, as it is more closely related to C. histolyticum than the commonly used E. coli (Jung et al., 1996). However, functional recombinant collagenase was also prepared in E. coli (Ducka et al., 2009), which can be used for LO isolation.
Takto připravené enzymy byly úspěšně použity pro izolaci LO v experimentech (Brandhorst et al., 2003; Loganathan et al., 2018) a nebyly pozorovány žádné velké signifikantní rozdíly mezi purifikovanou kolagenázou a rekombinantní verzí proteinu. Některé vlastnosti LO byly lepší při použití clostridiální kolagenázy a jiné u té produkované v E. coli. Ovšem použitý poměr kolagenáz je stále předmětem výzkumů a možnost variant poměrů a kombinací s jinými enzymy (clostripain, neutrální proteázy) zvyšují počet všech možných kombinací pro izolaci LO.The enzymes thus prepared were successfully used for LO isolation in experiments (Brandhorst et al., 2003; Loganathan et al., 2018) and no significant significant differences were observed between the purified collagenase and the recombinant version of the protein. Some properties of LO were better when using clostridial collagenase and others with that produced in E. coli. However, the collagenase ratio used is still the subject of research, and the possibility of ratio variants and combinations with other enzymes (clostripain, neutral proteases) increase the number of all possible combinations for LO isolation.
Podobně jako rekombinantní kolagenázy byl připraven i rekombinantní clostripain, ovšem ten je odlišný od enzymu produkovaného podle tohoto vynálezu. Jedná se o protein, který má, podobně jako protilátky, lehký a těžký aminokyselinový řetězec a lze jej nalézt v proteinových databázích pod přístupovým číslem WP_138210406.1. Tento protein byl také připraven jako rekombinantní, ale vzhledem k jeho povaze musela být zvolena složitější příprava než u běžných bakteriálníchSimilar to recombinant collagenase, recombinant clostripain was also prepared, but it is different from the enzyme produced according to this invention. It is a protein that, like antibodies, has a light and heavy amino acid chain and can be found in protein databases under the accession number WP_138210406.1. This protein was also prepared as a recombinant, but due to its nature, a more complex preparation had to be chosen than for common bacterial
- 2 CZ 2021 - 400 A3 proteinů. (Kim et al., 2007; Witte et al., 1994). Existuje několik studií, při kterých byl použit klostridiální purifikovaný nebo rekombinantní purifikovaný clostripain, jenž zvýšil efektivitu izolace LO (Brandhorst et al., 2019; Dendo et al., 2015; Stáhle et al., 2015), ale vždy se jednalo o protein zmíněný výše (WP_138210406.1).- 2 CZ 2021 - 400 A3 proteins. (Kim et al., 2007; Witte et al., 1994). There are several studies in which clostridial purified or recombinant purified clostripain was used, which increased the efficiency of LO isolation (Brandhorst et al., 2019; Dendo et al., 2015; Stáhle et al., 2015), but it was always the protein mentioned above (WP_138210406.1).
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Podstatou vynálezu je kmen Escherichia coli CCM 9176, produkující v plazmidu pET28 rekombinantní protein identifikovaný jako clostripain. Dále způsob produkce, purifikace a použití tohoto proteinu (clostripainu Clos) ve směsi s rekombinantní kolagenázou G a H (ColG a ColH) pro izolaci Langerhansových ostrůvků. Při použití přídavku clostripainu produkovaného z kmene CCM 9176 dochází vždy k zisku vyššího počtu LO při izolaci než při použití samotné surové kolagenázy nebo směsi rekombinantních kolagenáz produkovaných kmeny CCM 9174 a CCM 9175. Součástí příkladů je také produkce kolagenázy G a kolagenázy H produkované kmeny E. coli CCM 9174 a CCM 9175 vytvořenými v laboratoři, s nimiž lze zaručit tento synergický účinek.The essence of the invention is the strain Escherichia coli CCM 9176, producing in the pET28 plasmid a recombinant protein identified as clostripain. Furthermore, the method of production, purification and use of this protein (clostripain Clos) in a mixture with recombinant collagenase G and H (ColG and ColH) for the isolation of islets of Langerhans. When using the addition of clostripain produced by strain CCM 9176, a higher number of LOs is always obtained in the isolation than when using crude collagenase alone or a mixture of recombinant collagenases produced by strains CCM 9174 and CCM 9175. Examples also include the production of collagenase G and collagenase H produced by strains E. coli CCM 9174 and CCM 9175 created in the laboratory with which this synergistic effect can be guaranteed.
Pomocí bioinformatických nástrojů byly v genomu bakterie C. histolyticum (=Hathewaya histolytica) identifikovány geny pro kolagenázu typu I a typu II (ColG a ColH) a také geny pro podjednotky clostripainu, využívaného běžně ve směsích pro izolaci LO (WP_138210406.1). Dále byl identifikován gen, který některé databáze označily automatickou anotací jako clostripain, ale sekvenčně se liší od běžně používaných clostripainů používaných ve studiích s izolacemi LO. Sekvence tohoto clostripain-like proteinu označeného jako clostripain CCM 9176 je znázorněna na obrázku 1 (SEQ ID NO: 1). Tento gen byl naklonován do expresního plazmidu pomocí restrikčního klonování (Ncol a BamHI) a histidinová kotva byla umístěna na C-konec proteinové sekvence. Místo pro odštěpení tagu nebylo integrováno, jelikož protein je funkční i bez odstranění. Teoretický izoelektrický bod proteinu včetně his-tagu je 8,31 a molekulová hmotnost (mw) je 45,7 kDa. Po analýze sekvence aminokyselin vyplývá, že protein obsahuje cystein-peptidázovou doménu patřící do peptidázové rodiny C11 (obrázek 4), která je označovaná jako clostripainová rodina enzymů a obsahuje chymotripsin-like specifické sekvence (Barrett & Rawlings, 2014).Using bioinformatic tools, genes for collagenase type I and type II (ColG and ColH) and also genes for subunits of clostripain, commonly used in mixtures for LO isolation, were identified in the genome of the bacterium C. histolyticum (=Hathewaya histolytica) (WP_138210406.1). Furthermore, a gene was identified that was annotated automatically by some databases as clostripain, but sequenced differently from the commonly used clostripains used in studies with LO isolates. The sequence of this clostripain-like protein designated as clostripain CCM 9176 is shown in Figure 1 (SEQ ID NO: 1). This gene was cloned into an expression plasmid using restriction cloning (NcoI and BamHI) and a histidine anchor was placed at the C-terminus of the protein sequence. The tag cleavage site was not integrated, as the protein is functional even without removal. The theoretical isoelectric point of the protein including the his-tag is 8.31 and the molecular weight (mw) is 45.7 kDa. After analysis of the amino acid sequence, it appears that the protein contains a cysteine-peptidase domain belonging to the peptidase family C11 (Figure 4), which is referred to as the clostripain family of enzymes and contains chymotrypsin-like specific sequences (Barrett & Rawlings, 2014).
Clostripain má pozitivní vliv na použití směsi kolagenáz pro izolaci LO a byl zkoušen s rekombinantními kolagenázami, produkovanými v E. coli kmen CCM 9174 a CCM 9175. Jedná se o kolagenázy ColG a ColH (SEQ ID NO: 2 a 3, obrázek 2 a 3) původem z C. histolyticum a produkované z plazmidu pET28 pomocí expresních buněk E. coli. V případě ColH se jedná o protein, na jehož C-konci je přidána histidinová kotva, která nemá místo pro odštěpení aminokyselinové sekvence. Produkovaný protein má předpokládanou molekulovou hmotnost 114 kDa a izoelektrický bod 5,68. V případě kolagenázy označené ColG je his-tag na N-konci proteinu a za ním následuje štěpné místo pro trombin, kterým lze kotvu odštěpit. Oba proteiny vykazují biochemickou aktivitu i bez odštěpení histidinové kotvy. ColG má molekulovou hmotnost 123 kDa a teoretický izoelektrický bod 5,58. Všechny postupy jsou optimalizovány tak, aby při produkci a purifikaci proteinů byly použity shodné podmínky. Nedochází sice k produkci a přečištění vysoce purifikovaných enzymů, ale procesy jsou snadno proveditelné pro všechny zmíněné proteiny.Clostripain has a positive effect on the use of a mixture of collagenases for LO isolation and was tested with recombinant collagenases produced in E. coli strain CCM 9174 and CCM 9175. These are collagenases ColG and ColH (SEQ ID NO: 2 and 3, Figure 2 and 3 ) originating from C. histolyticum and produced from plasmid pET28 using E. coli expression cells. In the case of ColH, it is a protein with a histidine anchor added to its C-terminus, which does not have a site for cleavage of the amino acid sequence. The protein produced has a predicted molecular weight of 114 kDa and an isoelectric point of 5.68. In the case of ColG-tagged collagenase, the his-tag is at the N-terminus of the protein, followed by a cleavage site for thrombin to cleave the anchor. Both proteins show biochemical activity even without cleavage of the histidine anchor. ColG has a molecular weight of 123 kDa and a theoretical isoelectric point of 5.58. All procedures are optimized to use identical conditions for protein production and purification. Although highly purified enzymes are not produced and purified, the processes are easily performed for all mentioned proteins.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Celý proces, exprese a purifikace a zapracování je navržen tak, aby byl shodný u všech proteinů, kolagenázy G, kolagenázy H a hlavně nově popsaného clostripainu, který má zásadní pozitivní efekt na izolaci LO. To znamená, že níže popsaný postup lze použít pro všechny bakteriální kultury (E coli CCM 9174, CCM 9175 a CCM 9176) a všechny produkované a purifikované proteiny (ColG, ColH a Clostripain).The whole process, expression and purification and incorporation is designed to be the same for all proteins, collagenase G, collagenase H and especially the newly described clostripain, which has a major positive effect on LO isolation. This means that the procedure described below can be used for all bacterial cultures (E coli CCM 9174, CCM 9175 and CCM 9176) and all produced and purified proteins (ColG, ColH and Clostripain).
Příprava konzervy bakteriální kultury: Práce s bakteriální kulturou probíhá sterilně, při pipetování kultur se používají špičky s filtrem. Do 50 ml LB média (trypton 5 g/l, yeast extract 10 g/l, NaClPreparation of canned bacterial culture: Work with bacterial culture is carried out sterilely, tips with a filter are used when pipetting cultures. Up to 50 ml of LB medium (tryptone 5 g/l, yeast extract 10 g/l, NaCl
- 3 CZ 2021 - 400 A3 g/l, pH 7) se přidá 50 μΐ zásobního roztoku kanamycinu (finální koncentrace 0,05 mg/ml) a 20 μΐ kultury obsahující plazmid pET28 pro produkci Clostripainu nebo ColH nebo ColG. Kultivuje se ve 200 ml Erlenmayerově baňce, v inkubátoru na třepačce, při 37 °C přes noc (14 až 18 hodin). Druhý den se kultura centrifuguje (3500 x g, 20 min, 4 °C), supernatant se odstraní. Pelet se rozpustí v 1 ml vychlazeného 10% glycerolu a po 200 μl rozdělí do sterilních zkumavek, které budou sloužit jako zásobní konzervy. Připravené konzervy se dají zamrazit do -80 °C a takto se dlouhodobě uchovávají. Z nich se vychází při přípravě všech proteinů (ColG, ColH a Clos).- 3 CZ 2021 - 400 A3 g/l, pH 7) 50 μΐ of kanamycin stock solution (final concentration 0.05 mg/ml) and 20 μΐ of culture containing plasmid pET28 for production of Clostripain or ColH or ColG are added. It is cultivated in a 200 ml Erlenmayer flask, in an incubator on a shaker, at 37 °C overnight (14 to 18 hours). The next day, the culture is centrifuged (3500 x g, 20 min, 4 °C), the supernatant is removed. The pellet is dissolved in 1 ml of cooled 10% glycerol and divided into sterile tubes of 200 μl each, which will serve as storage cans. Prepared preserves can be frozen down to -80 °C and can be stored this way for a long time. They are used in the preparation of all proteins (ColG, ColH and Clos).
Produkce kolagenáz a clostripainu: Při přípravě produkční kultury se do 600 ml LB média přidá 600 μl zásobního roztoku kanamycinu a zaočkuje 50 μl zásobní kultury v glycerolu, kultivuje se ve 2 l Erlenmayerově baňce. Kultivace probíhá v termoboxu při 37 °C za intenzivního třepání. Kultura se nechá růst do OD6oo= 0,5 po dobu přibližně 3 hodiny. Po dosažení cílené optické denzity se indukuje exprese přidáním IPTG do finální koncentrace 0,2 mM. Po přidání induktoru se kultura následně kultivuje při 22 °C po dobu 18 hodin a stále intenzivně aeruje. Druhý den ráno se sklidí narostlá kultura pomocí centrifugace. Centrifuguje se při 3500 rpm, 20 min, 4 °C. Supernatant se slije a k peletům se přidá 10 až 100 ml vychlazeného sonikačního pufru (do každé kyvety 10 ml), chladí se ledem. Centrifugační kyvety se opláchnou dalšími 10 ml sonikačního pufru a zbytek buněk se přenese k hlavní frakci buněčného peletu ve vhodné nádobě.Production of collagenases and clostripain: When preparing the production culture, add 600 μl of kanamycin stock solution to 600 ml of LB medium and inoculate 50 μl of the stock culture in glycerol, culture in a 2 l Erlenmayer flask. Cultivation takes place in a thermobox at 37 °C with intensive shaking. The culture is allowed to grow to OD 600 = 0.5 for approximately 3 hours. After reaching the targeted optical density, expression is induced by adding IPTG to a final concentration of 0.2 mM. After the addition of the inducer, the culture is then cultured at 22°C for 18 hours and still intensively aerated. The next morning, the grown culture is harvested by centrifugation. Centrifuge at 3500 rpm, 20 min, 4 °C. The supernatant is pooled and 10 to 100 ml of cooled sonication buffer (10 ml in each cuvette) is added to the pellets, cooled with ice. Centrifuge cuvettes are rinsed with an additional 10 ml of sonication buffer and the rest of the cells are transferred to the main fraction of the cell pellet in a suitable container.
Zpracování kultury po expresi proteinů: Pro uvolnění proteinů z buněk se sonikují 3x10 min na ledu, nebo se buňky desintegrují jiným vhodným způsobem, po každých 10 minutách se udělá 5 min pauza, aby se lyzát příliš nezahříval. Sonikuje se na 70% výkonu, při vyšších hodnotách se lyzát velmi rychle zahřívá. Po skončení sonikace se lyzát přenese do ultracentrifugačních zkumavek (Beckman coulter). Centrifuguje se při 1400 x g, 30 min, 4 °C. Získaný supernatant se přefiltruje přes 0,22 μm filtr s PES membránou, aby během purifikace větší časti buněčných zbytků neucpaly chromatografickou kolonu. Pelet se uschová do lednice pro pozdější analýzu na SDSPAGE.Culture processing after protein expression: To release proteins from the cells, sonicate 3x10 min on ice, or disintegrate the cells in another suitable way, after every 10 min a 5 min break is made so that the lysate does not heat up too much. Sonicate at 70% power, at higher values the lysate heats up very quickly. After sonication, the lysate is transferred to ultracentrifuge tubes (Beckman coulter). Centrifuge at 1400 x g, 30 min, 4°C. The obtained supernatant is filtered through a 0.22 μm filter with a PES membrane so that during the purification, larger parts of the cell residues do not clog the chromatographic column. The pellet is stored in the refrigerator for later SDSPAGE analysis.
Přečištění proteinů: Purifikace proteinu s histidinovou kotvou se provádí pomocí metalochelatační chromatografie. Používá se např. kolona HisTrap HP 5ml (naplněná a nabitá Ni Sepharose High Perfomance). Metodika ekvilibrace kolony, nanesení vzorku a eluce vzorku je pro všechny systémy stejná. Používané pufry a vodu je nutné před purifikací 10 až 15 min odvzdušnit v ultrazvukové lázni. Níže používaná zkratka CV, znamená objem kolony (column volume). Kolona je ekvilibrována minimálně 5 CV pufru pro nastavení vhodných podmínek pro purifikaci (50mM Tris, 300mM NaCl, 10mM imidazol, pH 7,5). Po ekvilivbraci kolony je na ni nanesen lyzát obsahující požadovaný solubilní protein (ColG, nebo ColH, nebo Clostripain). Po nanesení celého objemu na kolonu dojde k zachycení proteinu na koloně pomocí histidinové kotvy a odstranění balastních proteinů. Kolona je promyta opět ekvilibračním pufem (3 CV), pro dodatečné odstranění nezachycených nečistot. Na kolonu je nanesen 8% eluční pufr (50mM Tris, 300mM NaCl, 500mM imidazol, pH 7,5) pro odstranění slabě se vázajících proteinů. Clostripain zůstává zachycený na koloně, část se sice může odmýt, ale dochází k přečištění produktu. Ve druhém kroku je na kolonu nanesen 50% roztok elučního pufru (50mM Tris, 300mM NaCl, 500mM imidazol, pH 7,5), který zapříčiní uvolnění clostripainu z kolony. Tato frakce (obrázek 5) je použita při dalším postupu.Protein purification: Purification of a protein with a histidine anchor is performed using metallochelation chromatography. For example, a HisTrap HP 5ml column (filled and charged with Ni Sepharose High Performance) is used. The methodology of column equilibration, sample loading and sample elution is the same for all systems. The used buffers and water must be deaerated in an ultrasonic bath for 10 to 15 minutes before purification. The abbreviation CV used below stands for column volume. The column is equilibrated with at least 5 CV buffer to set suitable conditions for purification (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.5). After equilibration of the column, a lysate containing the required soluble protein (ColG, or ColH, or Clostripain) is applied to it. After applying the entire volume to the column, the protein is captured on the column using a histidine anchor and the ballast proteins are removed. The column is washed again with equilibration buffer (3 CV) for additional removal of untrapped impurities. An 8% elution buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.5) is applied to the column to remove weakly binding proteins. Clostripain remains trapped on the column, although some may be washed away, but the product is purified. In the second step, a 50% elution buffer solution (50mM Tris, 300mM NaCl, 500mM imidazole, pH 7.5) is applied to the column, which causes the release of clostripain from the column. This fraction (Figure 5) is used in the next step.
Krok následující po purifikaci je odstranění imidazolu a převod do finálního pufru (50mM Tris, 300mM NaCl, pH 7,5), k tomu se použije chromatografická kolona HiTrap Desalting 5 ml (náplň je na bázi dextranu - Sephadex G-25 Superfine). Metoda pracuje na principu SEC (size exclusion chromatography). V případě, že dojde k tvorbě sraženiny v purifikovaném vzorku, je nutné ho před výměnou pufru přefiltrovat přes 0,45 μm filtr. Pro práci s HiTrap Desalting kolonou lze opět použít injekční stříkačku nebo peristaltickou pumpu. Injekční stříkačka se naplní pufrem pro výměnu v objemu 25 ml (50mM Tris, 300mM NaCl, pH 7,5) a připojí se Luer Lock nástavec. K nástavci se připojí kolona tak, aby nedošlo ke vstupu vzduchu do kolony („drop to drop“). Kolona se ekvilibruje 25 ml pufru při průtoku 5 ml/min (maximální doporučený průtok pro kolonu je 10 ml/min, a tlak 0,25 bar = 25 kPa). V případě, že se do kolony dostane vzduch, proplachuje seThe step following purification is the removal of imidazole and transfer to the final buffer (50mM Tris, 300mM NaCl, pH 7.5), for this a HiTrap Desalting chromatographic column of 5 ml is used (the filling is based on dextran - Sephadex G-25 Superfine). The method works on the principle of SEC (size exclusion chromatography). If a precipitate forms in the purified sample, it must be filtered through a 0.45 μm filter before changing the buffer. Again, a syringe or peristaltic pump can be used to work with the HiTrap Desalting column. The syringe is filled with 25 mL exchange buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 7.5) and a Luer Lock attachment is attached. The column is connected to the extension in such a way that no air enters the column ("drop to drop"). The column is equilibrated with 25 ml of buffer at a flow rate of 5 ml/min (the maximum recommended flow rate for the column is 10 ml/min, and a pressure of 0.25 bar = 25 kPa). If air gets into the column, it is purged
- 4 CZ 2021 - 400 A3 tak dlouho, dokud bublina nevyjde ven (otočení kolony během proplachu odstraní vzduch efektivněji).- 4 CZ 2021 - 400 A3 until the bubble comes out (turning the column during flushing removes air more effectively).
Na obrázku 5 je fotka gelu po provedené SDS PAGE jednotlivých purifikovaných frakcí clostripainu. Clostripain je přítomen ve všech frakcích, nejčistší je však frakce A10. Koncentrace elučního pufru použitá pro frakci A10 byla použita jako finální eluční koncentrace.Figure 5 shows a photo of the gel after SDS PAGE of individual purified clostripain fractions. Clostripain is present in all fractions, but the A10 fraction is the purest. The elution buffer concentration used for fraction A10 was used as the final elution concentration.
Odstranění imidazolu ze vzorku: Vzorek se na kolonu nanáší injekční stříkačkou 2 až 5 ml. Stříkačka se naplní pufrem pro výměnu a opět připojí bez průniku vzduchu do kolony. Vzorek z kolony se eluuje objemem pufru v závislosti na objemu nanášeného vzorku. V eluátu je poté přítomen požadovaný protein v novém pufru bez imidazolu. Lze také využít klasickou dialýzu proti stejnému pufru s vhodnou dialyzační hadicí s odpovídající porozitou. Dialyzuje se proti 10 x většímu objemu pufru, aby došlo k odstranění nežádoucího imidazolu.Removal of imidazole from the sample: The sample is applied to the column with a 2 to 5 ml syringe. The syringe is filled with exchange buffer and reattached to the column without air penetration. The sample from the column is eluted with a volume of buffer depending on the volume of the applied sample. The desired protein is then present in the eluate in a new imidazole-free buffer. Classical dialysis against the same buffer can also be used with a suitable dialysis hose with corresponding porosity. It is dialyzed against a 10x volume of buffer to remove unwanted imidazole.
Lyofilizace: Po odstranění imidazolu a po převodu do vhodného pufru, se vzorek přefiltruje přes 0,22 μm PES filtr. Do nové eppendorfky se odebere 50 až 100 μ! vzorku pro další analýzy charakterizující finální produkt (měření koncentrace proteinů - Bradford, určení čistoty produktu - SDS-PAGE, aktivita enzymu). Přefiltrovaný vzorek se sterilně plní do zvážených vialek dle požadovaného množství jednotek potřebných v jedné vialce. Naplněné vialky se dají zamrazit na - 80 °C, alespoň na 1 hodinu. Po namražení lyofilizátoru a zmrznutí vzorku se dají vialky lyofilizovat. Pokud je objem vzorku do 10 ml, vzorek je zlyofilizován do 24 h. Po ukončení lyofilizace se zváží vialka s lyofilizátem a určí se hmotnost produktu.Lyophilization: After removal of imidazole and transfer to a suitable buffer, the sample is filtered through a 0.22 μm PES filter. 50 to 100 μ are taken into the new eppendorf tube! sample for further analyzes characterizing the final product (measurement of protein concentration - Bradford, determination of product purity - SDS-PAGE, enzyme activity). The filtered sample is sterilely filled into weighed vials according to the required amount of units needed in one vial. Filled vials can be frozen at -80°C for at least 1 hour. After freezing the lyophilizer and freezing the sample, the vials can be lyophilized. If the sample volume is up to 10 ml, the sample is lyophilized within 24 h. After lyophilization, the vial with the lyophilisate is weighed and the weight of the product is determined.
Objasnění výkresůClarification of drawings
Obrázek 1 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci clostripainového proteinu podle vynálezu produkovaného kmenem E. coli CCM 9176. Geneticky modifikovaný kmen zachovává sekvenci zjištěnou sekvenací kmene Clostridium histolyticum CCM 8656, popsaného v české přihlášce vynálezu zn. PV 2017-537, na niž byl udělen patent CZ 308157.Figure 1 shows the amino acid sequence of the clostripain protein according to the invention produced by the strain E. coli CCM 9176. The genetically modified strain retains the sequence determined by the sequencing of the strain Clostridium histolyticum CCM 8656, described in the Czech invention application PV 2017-537, for which patent CZ 308157 was granted.
Obrázek 2 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci kolagenázy ColG produkovanou kmenem E. coli CCM 9174. Geneticky modifikovaný kmen zachovává sekvenci zjištěnou sekvenací kmene Clostridium histolyticum CCM 8656, popsaného v české přihlášce vynálezu zn. PV 2017-537, na niž byl udělen patent CZ 308157.Figure 2 shows the amino acid sequence of collagenase ColG produced by strain E. coli CCM 9174. The genetically modified strain retains the sequence determined by sequencing of strain Clostridium histolyticum CCM 8656, described in the Czech invention application PV 2017-537, for which patent CZ 308157 was granted.
Obrázek 3 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci ColH produkovanou kmenem E. coli CCM 9175. Geneticky modifikovaný kmen zachovává sekvenci zjištěnou sekvenací kmene Clostridium histolyticum CCM 8656, popsaného v české přihlášce vynálezu zn. PV 2017-537, na niž byl udělen patent CZ 308157.Figure 3 shows the amino acid sequence of ColH produced by the strain E. coli CCM 9175. The genetically modified strain retains the sequence determined by the sequencing of the strain Clostridium histolyticum CCM 8656, described in the Czech invention application PV 2017-537, for which patent CZ 308157 was granted.
Obrázek 4 představuje schematické znázornění peptidázové domény predikované v proteinu clostripain podle vynálezu.Figure 4 presents a schematic representation of the peptidase domain predicted in the clostripain protein of the invention.
Obrázek 5 je fotografie gelu po provedené SDS PAGE jednotlivých purifikovaných frakcí clostripainu. Clostripain je přítomen ve všech frakcích, nejčistší je však frakce A10. Koncentrace elučního pufru použitá pro frakci A10 byla použita jako finální eluční koncentrace.Figure 5 is a photograph of a gel after SDS PAGE of individual purified clostripain fractions. Clostripain is present in all fractions, but the A10 fraction is the purest. The elution buffer concentration used for fraction A10 was used as the final elution concentration.
Příklady uskutečnění vynálezuExamples of implementation of the invention
1. Příklad kultivace/produkce ve fermentoru:1. Example of cultivation/production in a fermenter:
Při přípravě produkční kultury se do 10 litrů LB média přidá 10 ml zásobního roztoku kanamycinu a zaočkuje se 10 ml zásobní kultury v glycerolu, kultivuje se v objemu 10 l ve fermentoru přiWhen preparing the production culture, 10 ml of the kanamycin stock solution is added to 10 liters of LB medium and 10 ml of the stock culture is inoculated in glycerol, cultivated in a volume of 10 l in a fermenter at
- 5 CZ 2021 - 400 A3 teplotě 37 °C za intenzivního míchání a vzdušnění. Kultura se nechá růst do OD600 = 0,5. Po dosažení cílené optické denzity se indukuje exprese přidáním IPTG do finální koncentrace 0,2 mM. Po přidání induktoru se kultura následně kultivuje při 22 °C po dobu 18 hodin a stále intenzivně aeruje. Druhý den ráno se narostlá kultura centrifuguje v 0,5 l kyvetách při 3500 x g, 20 min, 4 °C. Supernatant se slije a k peletům se přidá 10 až 100 ml vychlazeného sonikačního pufru (do každé kyvety 10 ml) do falkony, která se chladí ledem.- 5 CZ 2021 - 400 A3 at a temperature of 37 °C with intensive mixing and aeration. The culture is allowed to grow to OD600 = 0.5. After reaching the targeted optical density, expression is induced by adding IPTG to a final concentration of 0.2 mM. After the addition of the inducer, the culture is then cultured at 22°C for 18 hours and still intensively aerated. The next morning, the grown culture is centrifuged in 0.5 L cuvettes at 3500 x g, 20 min, 4 °C. The supernatant is pooled and 10 to 100 mL of chilled sonication buffer (10 mL per cuvette) is added to the pellets in an ice-cooled falcon.
2. Příklad purifikace pomocí centrifugace:2. Example of purification by centrifugation:
Protino Ni-NTA Agarose lze využít pro purifikaci na běžné centrifuze bez nutnosti použití FPLC apod. Při ekvilibraci se resuspenduje Protino Ni-NTA Agarose důkladným protřepáním. Ihned se odebere potřebné množství suspenze do vhodné zkumavky (objem se volí min. 10 x větší, než je objem agarózových kuliček - gelu. Například pro 1 ml gelu se použijí 12 ml zkumavky). Gel se sedimentuje centrifugací při 500 x g, 5 minut. Přidá se 10 objemů ekvilibračního pufru (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazol) pro kalibraci gelu. Opakovaným otočením zkumavky se její obsah promíchá. Gel se sedimentujeme při 500 x g, 5 minut. Opatrně se odebere supernatant do odpadní nádobky. Pro navázání proteinů ke gelu se aplikuje přefiltrovaný bakteriální lyzát s obsahem požadovaných proteinů. Celá suspenze se jemně míchá po dobu 30 až 60 min (vznik vazby mezi His-tag proteiny a Ni2+ ionty). Gel se sedimentuje centrifugací 500 x g, 5 minut. Opatrně se odebere supernatant do odpadní nádobky. Přidá se 10 objemů oplachového pufru (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazol) pro oplach gelu. Opakovaným otočením zkumavky se její obsah promíchá. Gel se sedimentuje při 500 x g, 5 minut. Opatrně se odebere supernatant do odpadní nádobky a opakuje se oplachovací krok. Pro eluci proteinu se k sedimentovanému gelu přidá 1 objem elučního pufru (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazol). Suspenze se jemně míchá 2 min při pokojové teplotě. Dojde k uvolnění navázaných Histag proteinů (Clostripain, nebo ColG nebo ColH) z gelu. Gel se sedimentuje při 500 x g, 5 minut. Opatrně se odebere supernatant s požadovanými proteiny do nové zkumavky. Eluované proteiny se skladují na ledu. Eluční kroky se opakují celkem 5 x. Eluované frakce se odebírají vždy do nové zkumavky. Ze vzorku se odstraní imidazol dialýzou, ultrafiltrací nebo pomocí odsolovací kolony (HiTrap desalting).Protino Ni-NTA Agarose can be used for purification in ordinary centrifuges without the need to use FPLC, etc. During equilibration, Protino Ni-NTA Agarose is resuspended by thorough shaking. The necessary amount of suspension is immediately taken into a suitable test tube (the volume is selected at least 10 times larger than the volume of the agarose beads - gel. For example, 12 ml test tubes are used for 1 ml of gel). The gel is sedimented by centrifugation at 500 xg, 5 minutes. Add 10 volumes of equilibration buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazole) to calibrate the gel. Repeated inversion of the test tube mixes its contents. The gel is sedimented at 500 xg, 5 minutes. Carefully remove the supernatant into the waste container. Filtered bacterial lysate containing the required proteins is applied to bind the proteins to the gel. The entire suspension is gently mixed for 30 to 60 min (bonding between His-tag proteins and Ni 2+ ions). The gel is sedimented by centrifugation at 500 xg, 5 minutes. Carefully remove the supernatant into the waste container. Add 10 volumes of wash buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole) to wash the gel. Repeated inversion of the test tube mixes its contents. The gel is sedimented at 500 xg, 5 minutes. The supernatant is carefully collected in a waste container and the rinsing step is repeated. For protein elution, 1 volume of elution buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole) is added to the sedimented gel. The suspension is gently stirred for 2 min at room temperature. The bound Histag proteins (Clostripain, or ColG or ColH) will be released from the gel. The gel is sedimented at 500 xg, 5 minutes. Carefully remove the supernatant with the desired proteins into a new tube. Eluted proteins are stored on ice. The elution steps are repeated a total of 5 times. The eluted fractions are always collected in a new tube. Imidazole is removed from the sample by dialysis, ultrafiltration or using a desalting column (HiTrap desalting).
3. Izolace LO ze slinivky břišní na experimentálních zvířatech (potkani wistar):3. Isolation of LO from the pancreas of experimental animals (wistar rats):
Potkaní slinivky byly ošetřeny kontrolní kolagenázou (Sigma Aldrich) a kolagenázou produkovanou kmeny E. coli CCM 9174 a CCM 9175 s přídavkem clostripainu produkovaného kmenem E. coli CCM 9176. Byl použit objem 15 ml roztoku směsi s kolagenázovou aktivitou 2 U/ml. Poměr enzymů činil ColG:ColH:Clos (5:5:1). Digesce probíhá v teplotě 37 °C po dobu 10 až 40 minut dle stavu pankreatu a jednotlivé buněčné tkáně jsou následně separovány pomocí diskontinuální gradientové centrifugace. Izolované ostrůvky byly kultivovány v CMRL-1066 médiu doplněném o 10% FBS, 5% HEPES, 1% Glutamax a 1% penicilinu-streptomycinu v zvlhčovacím inkubátoru v 37 °C a 5% atmosféře CO2. Kvalita izolovaných LO byla stanovena pomocí vitálního barvení a stimulovanou sekrecí inzulinu.Rat pancreases were treated with control collagenase (Sigma Aldrich) and collagenase produced by strains E. coli CCM 9174 and CCM 9175 with the addition of clostripain produced by strain E. coli CCM 9176. A volume of 15 ml of the mixture solution with a collagenase activity of 2 U/ml was used. The enzyme ratio was ColG:ColH:Clos (5:5:1). Digestion takes place at a temperature of 37 °C for 10 to 40 minutes, depending on the state of the pancreas, and individual cellular tissues are subsequently separated using discontinuous gradient centrifugation. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 medium supplemented with 10% FBS, 5% HEPES, 1% Glutamax, and 1% penicillin-streptomycin in a humidified incubator at 37°C and 5% CO2. The quality of isolated LOs was determined using vital staining and stimulated insulin secretion.
4. Izolace LO ze slinivky břišní na experimentálních zvířatech v jiných poměrech A:4. Isolation of LO from the pancreas of experimental animals in other ratios A:
Potkaní slinivky byly ošetřeny kontrolní kolagenázou (Sigma Aldrich) a kolagenázou ColH podle vynálezu s přídavkem clostripainu Clos podle vynálzu. Byl použit objem 15 ml roztoku směsi s kolagenázovou aktivitou 2 U/ml. Poměr kolagenáz činil ColH:Clos (5:2). Digesce probíhá dle příkladu č. 3.Rat pancreases were treated with control collagenase (Sigma Aldrich) and collagenase ColH according to the invention with the addition of clostripain Clos according to the invention. A volume of 15 ml of the mixture solution with a collagenase activity of 2 U/ml was used. The collagenase ratio was ColH:Clos (5:2). Digestion takes place according to example No. 3.
5. Izolace LO ze slinivky břišní na experimentálních zvířatech v jiných poměrech B:5. Isolation of LO from the pancreas of experimental animals in other ratios B:
Potkaní slinivky byly ošetřeny kontrolní kolagenázou (Sigma Aldrich) a kolagenázou CCM 9174 a CCM 9175 s přídavkem clostripainu CCM 9176. Byl použit objem 15 ml roztoku směsiRat pancreases were treated with control collagenase (Sigma Aldrich) and collagenase CCM 9174 and CCM 9175 supplemented with clostripain CCM 9176. A volume of 15 mL of the mixture solution was used
- 6 CZ 2021 - 400 A3 s kolagenázovou aktivitou 2 U/ml. Poměr kolagenáz činil ColG:ColH:Clos (7:4:2). Digesce probíhá dle příkladu č. 3.- 6 CZ 2021 - 400 A3 with collagenase activity 2 U/ml. The ratio of collagenases was ColG:ColH:Clos (7:4:2). Digestion takes place according to example No. 3.
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Směs rekombinantní kolagenázy G a H obsahující nový typ clostripainu lze využít pro zefektivnění izolace LO. Nový typ rekombinantního clostripainu produkovaný bakterií E. coli CCM 9176 může být přidán také do směsí surových kolagenáz anebo být využit do jiných směsí rekombinantních kolagenáz, než je výše zmíněná směs CCM 9174 a CCM 9175.A mixture of recombinant collagenase G and H containing a new type of clostripain can be used to make LO isolation more efficient. The new type of recombinant clostripain produced by E. coli CCM 9176 can also be added to crude collagenase mixtures or used in other recombinant collagenase mixtures than the aforementioned CCM 9174 and CCM 9175 mixture.
Seznam sekvencí:List of sequences:
SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 1
Clostripain podle vynálezu ClosClostripain according to the invention Clos
MENKKFKKWTILIYTDGNNEMEDIMFKSMNDCKSVEVKEDINLVMQIGLLGESKLYNK NKFSGVRRYYLNAKEPMLLENLGKANMGDPNILYNFIRWGIKEFPAHHYMVIISGHGTS FVGALTDTSLDKNYIMGIPEMIKAISLGCKELKSIIDILVLDMCFMNSIEILYELSQYESIDR MITYTDTAPYGGLGYKKLVEAIEKNCNLKDIDLFTKNLITNLNFNLTAYDLDKFKLELIK KKFSYLAFNYLNNKERSKNPLDIINSIHPSNPYYSFNNTYYDYFNEINGTIKSTIIHDKSKF NGINSSIKIENKDINNLIAFYRKLEFSRENSWTDLLYNNSNTQKRDINKVKVRTPTSSLTTT HYILQFNPKDPNSSSVDKLAAALEHHHHHHMENKKFKKWTILIYTDGNNEMEDIMFKSMNDCKSVEVKEDINLVMQIGLLGESKLYNK NKFSGVRRYYLNAKEPMLLENLGKANMGDPNILYNFIRWGIKEFPAHHYMVIISGHGTS FVGALTDTSLDKNYIMGIPEMIKAISLGCKELKSIIDILVLDMCFMNSIEILYELSQYESIDR MITYTDTAPYGGLGYKKLVEAIEKNCNLKDIDLFTKNLITNLNFNLTAYDLDKFKLELIK KKFSYLAFNYLNNKERSKNPLDIINSIHPSNPYYSFNNTYYDYFNEINGTIKSTIIHDKSKF NGINSSIKIENKDINNLIAFYRKLEFSRENSWTDLLYNNSNTQKRDINKVKVRTPTSSLTTT HYILQFNPKDPNSSSVDKLAAALEHHHHHH
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 2
Sekvence produkované kolagenázy ColGSequence produced by collagenase ColG
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMEPIENTNDTSIKNVEKLRNAPNEENSKKVEDSKNDKVE HVKNIEEAKVEQVAPEVKSKSTLRSASIANTNSEKYDFEYLNGLSYTELTNLIKNIKWNQI NGLFNYSTGSQKFFGDKNRVQAIINALQESGRTYTANDMKGIETFTEVLRAGFYLGYYN DGLSYLNDRNFQDKCIPAMIAIQKNPNFKLGTAVQDEVITSLGKLIGNASANAEVVNNC VPVLKQFRENLNQYAPDYVKGTAVNELIKGIEFDFSGAAYEKDVKTMPWYGKIDPFINE LKALGLYGNITSATEWASDVGIYYLSKFGLYSTNRNDIVQSLEKAVDMYKYGKIAFVAM ERITWDYDGIGSNGKKVDHDKFLDDAEKHYLPKTYTFDNGTFIIRAGDKVSEEKIKRLY WASREVKSQFHRVVGNDKALEVGNADDVLTMKIFNSPEEYKFNTNINGVSTDNGGLYIE PRGTFYTYERTPQQSIFSLEELFRHEYTHYLQARYLVDGLWGQGPFYEKNRLTWFDEGT AEFFAGSTRTSGVLPRKSILGYLAKDKVDHRYSLKKTLNSGYDDSDWMFYNYGFAVAH YLYEKDMPTFIKMNKAILNTDVKSYDEIIKKLSDDANKNTEYQNHIQELADKYQGAGIPL VSDDYLKDHGYKKASEVYSEISKAASLTNTSVTAEKSQYFNTFTLRGTYTGETSKGEFK DWDEMSKKLDGTLESLAKNSWSGYKTLTAYFTNYRVTSDNKVQYDVVFHGVLTDNAD ISNNKAPIAKVTGPSTGAVGRNIEFSGKDSKDEDGKIVSYDWDFGDGATSRGKNSVHAY KKAGTYNVTLKVTDDKGATATESFTIEIKNEDTTTPITKEMEPNDDIKEANGPIVEGVTV KGDLNGSDDADTFYFDVKEDGDVTIELPYSGSSNFTWLVYKEGDDQNHIASGIDKNNSK VGTFKSTKGRHYVFIYKHDSASNISYSLNIKGLGNEKLKEKENNDSSDKATVIPNFNTTM QGSLLGDDSRDYYSFEVKEEGEVNIELDKKDEFGVTWTLHPESNINDRITYGQVDGNKV SNKVKLRPGKYYLLVYKYSGSGNYELRVNKMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMEPIENTNDTSIKNVEKLRNAPNEENSKKVEDSKNDKVE HVKNIEEAKVEQVAPEVKSKSTLRSASIANTNSEKYDFEYLNGLSYTELTNLIKNIKWNQI NGLFNYSTGSQKFFGDKNRVQAIINALQESGRTYTANDMKGIETFTEVLRAGFYLGYYN DGLSYLNDRNFQDKCIPAMIAIQKNPNFKLGTAVQDEVITSLGKLIGNASANAEVVNNC VPVLKQFRENLNQYAPDYVKGTAVNELIKGIEFDFSGAAYEKDVKTMPWYGKIDPFINE LKALGLYGNITSATEWASDVGIYYLSKFGLYSTNRNDIVQSLEKAVDMYKYGKIAFVAM ERITWDYDGIGSNGKKVDHDKFLDDAEKHYLPKTYTFDNGTFIIRAGDKVSEEKIKRLY WASREVKSQFHRVVGNDKALEVGNADDVLTMKIFNSPEEYKFNTNINGVSTDNGGLYIE PRGTFYTYERTPQQSIFSLEELFRHEYTHYLQARYLVDGLWGQGPFYEKNRLTWFDEGT AEFFAGSTRTSGVLPRKSILGYLAKDKVDHRYSLKKTLNSGYDDSDWMFYNYGFAVAH YLYEKDMPTFIKMNKAILNTDVKSYDEIIKKLSDDANKNTEYQNHIQELADKYQGAGIPL VSDDYLKDHGYKKASEVYSEISKAASLTNTSVTAEKSQYFNTFTLRGTYTGETSKGEFK DWDEMSKKLDGTLESLAKNSWSGYKTLTAYFTNYRVTSDNKVQYDVVFHGVLTDNAD ISNNKAPIAKVTGPSTGAVGRNIEFSGKDSKDEDGKIVSYDWDFGDGATSRGKNSVHAY KKAGTYNVTLKVTDDKGATATESFTIEIKNEDTTTPITKEMEPNDDIKEANGPIVEGVTV KGDLNGSDDADTFYFDVKEDGDVTIELPYSGSSNFTWLVYKEGDDQNHIASGIDKNNSK VGTFKSTKGRHYVFIYKHDSASNISYSLNIKGLGNEKLKEKENNDSSDKATVIPNFNTTM QGSLLGDDSRDYYSFEVKEEGEVNIELDKKDEFGVTWTLHPESNINDRITYGQVDGNKV SNKVKLRPGKYYLLVYKYSGSGNYELRVNK
SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 3
Sekvence produkované kolagenázy ColHSequence produced by collagenase ColH
MVQNESKRYTVSYLKTLNYYDLVDLLVKTEIENLPDLFQYSSDAKEFYGNKTRMSFIMD EIGRRAPQYTEIDHKGIPTLVEVVRAGFYLGFHNKELNEINKRSFKERVIPSILAIQKNPNFMVQNESKRYTVSYLKTLNYDLVDLLVKTEIENLPDLFQYSSDAKEFYGNKTRMSFIMD EIGRRAPQYTEIDHKGIPTLVEVVRAGFYLGFHNKELNEINKRSFKERVIPSILAIQKNPNF
- 7 CZ 2021 - 400 A3- 7 CZ 2021 - 400 A3
KLGTEVQDKIVSATGLLAGNETAPPEVVNNFTPILQDCIKNIDRYALDDLKSKALFNVLA APTYDITEYLRATKEKPENTPWYGKIDGFINELKKLALYGKNDNNSWIIDNGIYHIAPLG KLHSNNKIGIETLTEVMKVYPYLSMQHLQSADQIKRHYDSKDAEGNKIPLDKFKKEGKE KYCPKTYTFDDGKVIIKAGARVEEEKVKRLYWASKEVNSQFFRVYGIDKPLEEGNPDDI LTMVIYNSPEEYKLNSVLYGYDTNNGGMYIEPEGTFFTYEREAQESTYTLEELFRHEYTH YLQGRYAVPGQWGRTKLYDNDRLTWYEEGGAELFAGSTRTSGILPRKSIVSNIHNTTRN NRYKLSDTVHSKYGASFEFYNYACMFMDYMYNKDMGILNKLNDLAKNNDVDGYDNY IRDLSSNYALNDKYQDHMQERIDNYENLTVPFVADDYLVRHAYKNPNEIYSEISEVAKL KDAKSEVKKSQYFSTFTLRGSYTGGASKGKLEDQKAMNKFIDDSLKKLDTYSWSGYKT LTAYFTNYKVDSSNRVTYDVVFHGYLPNEGDSKNSLPYGKINGTYKGTEKEKIKFSSEG SFDPDGKIVSYEWDFGDGNKSNEENPEHSYDKVGTYTVKLKVTDDKGESSVSTTTAEIK DLSENKLPVIYMHVPKSGALNQKVVFYGKGTYDPDGSIAGYQWDFGDGSDFSSEQNPS HVYTKKGEYTVTLRVMDSSGQMSEKTMKIKITDPVYPIGTEKEPNNSKETASGPIVPGIP VSGTIENTSDQDYFYFDVITPGEVKIDINKLGYGGATWVVYDENNNAVSYATDDGQNLS GKFKADKPGRYYIHLYMFNGSYMPYRINIEGSVGRDPNSSSVDKLAAALEHHHHHHKLGTEVQDKIVSATGLLAGNETAPPEVVNNFTPILQDCIKNIDRYALDDLKSKALFNVLA APTYDITEYLRATKEKPENTPWYGKIDGFINELKKLALYGKNDNNSWIIDNGIYHIAPLG KLHSNNKIGIETLTEVMKVYPYLSMQHLQSADQIKRHYDSKDAEGNKIPLDKFKKEGKE KYCPKTYTFDDGKVIIKAGARVEEEKVKRLYWASKEVNSQFFRVYGIDKPLEEGNPDDI LTMVIYNSPEEYKLNSVLYGYDTNNGGMYIEPEGTFFTYEREAQESTYTLEELFRHEYTH YLQGRYAVPGQWGRTKLYDNDRLTWYEEGGAELFAGSTRTSGILPRKSIVSNIHNTTRN NRYKLSDTVHSKYGASFEFYNYACMFMDYMYNKDMGILNKLNDLAKNNDVDGYDNY IRDLSSNYALNDKYQDHMQERIDNYENLTVPFVADDYLVRHAYKNPNEIYSEISEVAKL KDAKSEVKKSQYFSTFTLRGSYTGGASKGKLEDQKAMNKFIDDSLKKLDTYSWSGYKT LTAYFTNYKVDSSNRVTYDVVFHGYLPNEGDSKNSLPYGKINGTYKGTEKEKIKFSSEG SFDPDGKIVSYEWDFGDGNKSNEENPEHSYDKVGTYTVKLKVTDDKGESSVSTTTAEIK DLSENKLPVIYMHVPKSGALNQKVVFYGKGTYDPDGSIAGYQWDFGDGSDFSSEQNPS HVYTKKGEYTVTLRVMDSSGQMSEKTMKIKITDPVYPIGTEKEPNNSKETASGPIVPGIP VSGTIENTSDQDYFYFDVITPGEVKIDINKLGYGGATWVVYDENNNAVSYATDDGQNLS GKFKADKPGRYYIHLYMFNGSYMPYRINIEGSVGRDPNSSSVDKLAAALEHHHHHH
Přehled literaturyLiterature review
Alipour, H., Raz, A., Dinparast Djadid, N., Rami, A., & Mahdian, S. M. A. (2014). Codon optimization of Col H gene encoding Clostridium histolyticum collagenase to express in Escherichia coli. Codon Optimization of Col H Gene Encoding Clostridium Histolyticum Collagenase to Express in Escherichia Coli. https://doi.org/10.7287/peeij.preprints.754Alipour, H., Raz, A., Dinparast Djadid, N., Rami, A., & Mahdian, S. M. A. (2014). Codon optimization of Col H gene encoding Clostridium histolyticum collagenase to express in Escherichia coli. Codon Optimization of Col H Gene Encoding Clostridium Histolyticum Collagenase to Express in Escherichia Coli. https://doi.org/10.7287/peeij.preprints.754
Barrett, A. J., & Rawlings, N. D. (2014). Evolutionary Lines of Cysteine Peptidases. Biological Chemistry. https://doi.org/ 10.1515/bchm.2001.382.5.727Barrett, A.J., & Rawlings, N.D. (2014). Evolutionary Lines of Cysteine Peptidases. Biological Chemistry. https://doi.org/ 10.1515/bchm.2001.382.5.727
Berney, T., Molano, R. D., Cattan, P., Pileggi, A., Vizzardelli, C., Oliver, R., Ricordi, C., & Inverardi, L. (2001). Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. https://doi.org/10.1097/00007890-200101150-00020Berney, T., Molano, R.D., Cattan, P., Pileggi, A., Vizzardelli, C., Oliver, R., Ricordi, C., & Inverardi, L. (2001). Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. https://doi.org/10.1097/00007890-200101150-00020
Brandhorst, H., Brandhorst, D., Hesse, F., Ambrosius, D., Brendel, M., Kawakami, Y., & Bretzel, R. G. (2003). Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. https://doi.org/10.2337/diabetes.52.5.1143Brandhorst, H., Brandhorst, D., Hesse, F., Ambrosius, D., Brendel, M., Kawakami, Y., & Bretzel, R.G. (2003). Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. https://doi.org/10.2337/diabetes.52.5.1143
Brandhorst, H., Friberg, A., Andersson, H. H., Felldin, M., Foss, A., Salmela, K., Lundgren, T., Tibell, A., Tufveson, G., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2009). The importance of tryptic-like activity in purified enzyme blends for efficient islet isolation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0b013e31819499f0Brandhorst, H., Friberg, A., Andersson, H.H., Felldin, M., Foss, A., Salmela, K., Lundgren, T., Tibell, A., Tufveson, G., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2009). The importance of tryptic-like activity in purified enzyme blends for efficient islet isolation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0b013e31819499f0
Brandhorst, H., Johnson, P. R., Monch, J., Kurfurst, M., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2019). Comparison of Clostripain and Neutral Protease as Supplementary Enzymes for Human Islet Isolation. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1177/0963689718811614Brandhorst, H., Johnson, P.R., Monch, J., Kurfurst, M., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2019). Comparison of Clostripain and Neutral Protease as Supplementary Enzymes for Human Islet Isolation. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1177/0963689718811614
Brandhorst, H., Raemsch-Guenther, N., Raemsch, C., Friedrich, O., Huettler, S., Kurfuerst, M., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2008). The ratio between collagenase class I and class II influences the efficient islet release from the rat pancreas. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0b013e31816050c8Brandhorst, H., Raemsch-Guenther, N., Raemsch, C., Friedrich, O., Huettler, S., Kurfuerst, M., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2008). The ratio between collagenase class I and class II influences the efficient islet release from the rat pancreas. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0b013e31816050c8
Dendo, M., Maeda, H., Yamagata, Y., Murayama, K., Watanabe, K., Imura, T., Inagaki, A., Igarashi, Y., Katoh, Y., Ebina, M., Fujimori, K., Igarashi, K., Ohuchi, N., Satomi, S., & Goto, M. (2015). Synergistic Effect of Neutral Protease and Clostripain on Rat Pancreatic Islet Isolation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0000000000000662Dendo, M., Maeda, H., Yamagata, Y., Murayama, K., Watanabe, K., Imura, T., Inagaki, A., Igarashi, Y., Katoh, Y., Ebina, M., Fujimori, K., Igarashi, K., Ohuchi, N., Satomi, S., & Goto, M. (2015). Synergistic Effect of Neutral Protease and Clostripain on Rat Pancreatic Islet Isolation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0000000000000662
Ducka, P., Eckhard, U., Schonauer, E., Kofler, S., Gottschalk, G., Brandstetter, H., & Nuss, D.Ducka, P., Eckhard, U., Schonauer, E., Kofler, S., Gottschalk, G., Brandstetter, H., & Nuss, D.
- 8 CZ 2021 - 400 A3 (2009) . A universal strategy for high-yield production of soluble and functional clostridial collagenases in E. coli. Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253009-1953-4- 8 CZ 2021 - 400 A3 (2009) . A universal strategy for high-yield production of soluble and functional clostridial collagenases in E. coli. Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253009-1953-4
Jung, C. M., Matsushita, O., Katayama, S., Minami, J., Ohhira, I., & Okabe, A. (1996). Expression of the colH gene encoding Clostridium histolyticum collagenase in Bacillus subtilis and its application to enzyme purification. Microbiology and Immunology. https://doi.org/10.1111/j.13480421.1996.tb01161.xJung, C.M., Matsushita, O., Katayama, S., Minami, J., Ohhira, I., & Okabe, A. (1996). Expression of the colH gene encoding Clostridium histolyticum collagenase in Bacillus subtilis and its application to enzyme purification. Microbiology and Immunology. https://doi.org/10.1111/j.13480421.1996.tb01161.x
Kim, C. K., Lee, S. Y., Kwon, O. J., Lee, S. M., Nah, S. Y., & Jeong, S. M. (2007). Secretory expression of active clostripain in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2007.07.936Kim, C.K., Lee, S.Y., Kwon, O.J., Lee, S.M., Nah, S.Y., & Jeong, S.M. (2007). Secretory expression of active clostripain in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2007.07.936
Klock, G., Kowalski, M. B., Hering, B. J., Eiden, M. E., Weidemann, A., Langer, S., Zimmermann, U., Federlin, K., & Bretzel, R. G. (1996). Fractions from commercial collagenase preparations: Use in enzymic isolation of the islets of Langerhans from porcine pancreas. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1016/0963-6897(96)00023-1Klock, G., Kowalski, M.B., Hering, B.J., Eiden, M.E., Weidemann, A., Langer, S., Zimmermann, U., Federlin, K., & Bretzel, R.G. (1996). Fractions from commercial collagenase preparations: Use in enzymic isolation of the islets of Langerhans from porcine pancreas. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1016/0963-6897(96)00023-1
Loganathan, G., Subhashree, V., Breite, A. G., Tucker, W. W., Narayanan, S., Dhanasekaran, M., Mokshagundam, S. P., Green, M. L., Hughes, M. G., Williams, S. K., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., & Balamurugan, A. N. (2018). Beneficial effect of recombinant rC1rC2 collagenases on human islet function: Efficacy of low-dose enzymes on pancreas digestion and yield. American Journal of Transplantation. https://doi.org/10.1111/ajt.14542Loganathan, G., Subhashree, V., Breite, A.G., Tucker, W.W., Narayanan, S., Dhanasekaran, M., Mokshagundam, S.P., Green, M.L., Hughes, M.G., Williams, S.K., Dwulet, F.E., McCarthy, M. R.C., & Balamurugan, A.N. (2018). Beneficial effect of recombinant rC1rC2 collagenases on human islet function: Efficacy of low-dose enzymes on pancreas digestion and yield. American Journal of Transplantation. https://doi.org/10.1111/ajt.14542
O’Gorman, D., Kin, T., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., & Lakey, J. R. T. (2005). Multilot analysis of custom collagenase enzyme blend in human islet isolations. Transplantation Proceedings. https://doi.org/10.1016/j.transproceed.2005.09.139O’Gorman, D., Kin, T., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A.M.J., & Lakey, J.R.T. (2005). Multilot analysis of custom collagenase enzyme blend in human islet isolations. Transplantation Proceedings. https://doi.org/10.1016/j.transproceed.2005.09.139
Stáhle, M., Foss, A., Gustafsson, B., Lempinen, M., Lundgren, T., Rafael, E., TufVeson, G., Korsgren, O., & Friberg, A. (2015). Clostripain, the Missing Link in the Enzyme Blend for Efficient Human Islet Isolation. Transplantation Direct.Stahle, M., Foss, A., Gustafsson, B., Lempinen, M., Lundgren, T., Rafael, E., TufVeson, G., Korsgren, O., & Friberg, A. (2015). Clostripain, the Missing Link in the Enzyme Blend for Efficient Human Islet Isolation. Transplant Direct.
https://doi.org/10.1097/txd.0000000000000528https://doi.org/10.1097/txd.0000000000000528
Vargas, F., Vives-Pi, M., Somoza, N., Armengol, P., Alcalde, L., Marti, M., Costa, M., Serradell, L., Dominguez, O., Fernández-Llamazares, J., Julian, J. F., Sanmarti, A., & Pujol-Borrell, R. (1998). Endotoxin contamination may be responsible for the unexplained failure of human pancreatic islet transplantation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/00007890-19980315000020Vargas, F., Vives-Pi, M., Somoza, N., Armengol, P., Alcalde, L., Marti, M., Costa, M., Serradell, L., Dominguez, O., Fernández-Llamazares , J. , Julian , J.F. , Sanmarti , A. , & Pujol-Borrell , R. (1998). Endotoxin contamination may be responsible for the unexplained failure of human pancreatic islet transplantation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/00007890-19980315000020
Volpe, L., Salamone, M., Giardina, A., & Ghersi, G. (2016). Optimization of a Biotechnological Process for Production and Purification of Two Recombinant Proteins: Col G and Col H. Chemical Engineering Transactions. https://doi.org/10.3303/CET1649011Volpe, L., Salamone, M., Giardina, A., & Ghersi, G. (2016). Optimization of a Biotechnological Process for Production and Purification of Two Recombinant Proteins: Col G and Col H. Chemical Engineering Transactions. https://doi.org/10.3303/CET1649011
Vos-Scheperkeuter, G. H., Van Suylichem, P. T. R., Vonk, M. W. A., Wolters, G. H. J., & Van Schilfgaarde, R. (1997). Histochemical Analysis of the Role of Class I and Class IIVos-Scheperkeuter, G.H., Van Suylichem, P.T.R., Vonk, M.W.A., Wolters, G.H.J., & Van Schilfgaarde, R. (1997). Histochemical Analysis of the Role of Class I and Class II
Clostridium Histolyticum Collagenase in the Degradation of Rat Pancreatic Extracellular Matrix for Islet Isolation. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1177/096368979700600407Clostridium Histolyticum Collagenase in the Degradation of Rat Pancreatic Extracellular Matrix for Islet Isolation. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1177/096368979700600407
Witte, V., Wolf, N., Diefenthal, T., Reipen, G., & Dargatz, H. (1994). Heterologous expression of the clostripain gene from Clostridium histolyticum in Escherichia coli and Bacillus subtilis: Maturation of the clostripain precursor is coupled with self-activation. Microbiology. https://doi.org/10.1099/13500872-140-5-1175Witte, V., Wolf, N., Diefenthal, T., Reipen, G., & Dargatz, H. (1994). Heterologous expression of the clostripain gene from Clostridium histolyticum in Escherichia coli and Bacillus subtilis: Maturation of the clostripain precursor is coupled with self-activation. Microbiology. https://doi.org/10.1099/13500872-140-5-1175
Wolters, G. H.J., Vos -Scheperkeuter, G. H., van Deijnen, J. H. M., & van Schilfgaarde, R. (1992).Wolters, G.H.J., Vos-Scheperkeuter, G.H., van Deijnen, J.H.M., & van Schilfgaarde, R. (1992).
- 9 CZ 2021 - 400 A3- 9 CZ 2021 - 400 A3
An analysis of the role of collagenase and protease in the enzymatic dissociation of the rat pancreas for islet isolation. Diabetologia. https://doi.org/10.1007/BF00429093An analysis of the role of collagenase and protease in the enzymatic dissociation of the rat pancreas for islet isolation. Diabetology. https://doi.org/10.1007/BF00429093
Wolters, Gerrit H.J., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., & Van Schilfgaarde, R. (1995).Wolters, Gerrit H.J., Vos-Scheperkeuter, G.H., Lin, H.C., & Van Schilfgaarde, R. (1995).
Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. https://doi.org/10.2337/diab.44.2.227Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. https://doi.org/10.2337/diab.44.2.227
Claims (4)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2021-400A CZ309541B6 (en) | 2021-08-30 | 2021-08-30 | A strain producing clostripain-like protein for use in an admixture with recombinant collagenase ColG and ColH to isolate pancreatic islets of Langerhans |
PCT/CZ2022/050081 WO2023030562A1 (en) | 2021-08-30 | 2022-08-23 | Genetically modified bacterial strain e. coli producing clostripain peptidase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2021-400A CZ309541B6 (en) | 2021-08-30 | 2021-08-30 | A strain producing clostripain-like protein for use in an admixture with recombinant collagenase ColG and ColH to isolate pancreatic islets of Langerhans |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ2021400A3 true CZ2021400A3 (en) | 2023-03-29 |
CZ309541B6 CZ309541B6 (en) | 2023-03-29 |
Family
ID=83438874
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2021-400A CZ309541B6 (en) | 2021-08-30 | 2021-08-30 | A strain producing clostripain-like protein for use in an admixture with recombinant collagenase ColG and ColH to isolate pancreatic islets of Langerhans |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ309541B6 (en) |
WO (1) | WO2023030562A1 (en) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2193354A1 (en) * | 1995-04-25 | 1996-10-31 | Catherine Lee | Composition containing collagenase and chymopapain for isolating hepatocytes and pancreatic islet cells |
CZ308157B6 (en) * | 2017-09-13 | 2020-01-29 | MB PHARMA s.r.o. | Clostridium histolyticum strain, collagenase prepared using this strain and its use |
-
2021
- 2021-08-30 CZ CZ2021-400A patent/CZ309541B6/en unknown
-
2022
- 2022-08-23 WO PCT/CZ2022/050081 patent/WO2023030562A1/en active Search and Examination
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2023030562A1 (en) | 2023-03-09 |
CZ309541B6 (en) | 2023-03-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2013337574B2 (en) | Cytochrome P450 and cytochrome P450 reductase polypeptides, encoding nucleic acid molecules and uses thereof | |
US11542489B2 (en) | Expression vector encoding a Paenibacillus polymxa neutral protease | |
EP0907723A1 (en) | Enzyme composition for tissue dissociation | |
JP2953477B2 (en) | Recombinant proteinase from Clostridium histolyticum and its use for isolation of cells and cell populations | |
NO323623B1 (en) | Isolated and purified TNF <alpha> converting enzyme (TACE) polypeptide with the ability to convert TNF <alpha> from the 26 kD mold to the 17 kD mold, isolated and purified antibodies, method for demonstrating the TACE inhibitory activity of a molecule, isolated nucleic acid, expression vector, host cell, process for producing a TNF <alpha> converting enzyme (TACE) polypeptide, use of TNF <alpha> converting enzyme (TACE) polypeptide to produce a drug for the treatment of tumors, inflammation or fertility disorders. | |
Loganathan et al. | Human pancreatic tissue dissociation enzymes for islet isolation: Advances and clinical perspectives | |
CZ2021400A3 (en) | A strain producing clostripain-like protein for use in an admixture with recombinant collagenase ColG and ColH to isolate pancreatic islets of Langerhans | |
US11220666B2 (en) | Bacterial strain clostridium histolyticum and methods of use thereof | |
Greimann et al. | Reconstitution of RNA exosomes from human and Saccharomyces cerevisiae: cloning, expression, purification, and activity assays | |
US10047353B2 (en) | Grimonitia-hollisae-derived recombinant collagenase and enzyme agent for cell and tissue dissociation | |
EP3221448B1 (en) | Process for producing recombinant trypsin | |
KR20010109348A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase B, isoforms and muteins thereof, and their use | |
Leontovyc et al. | A Preliminary Characterization of a Novel Recombinant Clostridial Collagenase Blend. | |
Loganathan et al. | Journal of Transplantation Technologies & Research | |
CN101280022B (en) | Fused protein of D-aminoacid oxidase, carrier and application thereof | |
CZ36714U1 (en) | Thermostable endolysin and coding sequence | |
KR100770665B1 (en) | Hyperthermophilic Prolyloligopeptidase and Methods of Preparation Thereof |