CZ20213A3 - Sada primerů, set a způsob detekce Microdochium bolleyi - Google Patents

Sada primerů, set a způsob detekce Microdochium bolleyi Download PDF

Info

Publication number
CZ20213A3
CZ20213A3 CZ20213A CZ20213A CZ20213A3 CZ 20213 A3 CZ20213 A3 CZ 20213A3 CZ 20213 A CZ20213 A CZ 20213A CZ 20213 A CZ20213 A CZ 20213A CZ 20213 A3 CZ20213 A3 CZ 20213A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
primers
bolleyi
seq
pcr
collection
Prior art date
Application number
CZ20213A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309500B6 (cs
Inventor
Pavel Matušinský
Matušinský Pavel Mgr., Ph.D
Božena Sedláková
Sedláková Božena RNDr., Ph.D
Dominik Bleša
Dominik Mgr Bleša
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Univerzita Palackého v Olomouci
Agrotest Fyto, S.R.O.
Agrotest fyto, s.r.o
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci, Univerzita Palackého v Olomouci, Agrotest Fyto, S.R.O., Agrotest fyto, s.r.o filed Critical Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci
Priority to CZ2021-3A priority Critical patent/CZ309500B6/cs
Publication of CZ20213A3 publication Critical patent/CZ20213A3/cs
Publication of CZ309500B6 publication Critical patent/CZ309500B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Předkládané řešení poskytuje sadu primerů pro detekci a/nebo kvantifikaci Microdochium bolleyi zahrnující pár primerů MbPOLII_F: GCAGGCTTGTGGTCTGGTCA (SEQ ID NO. 1) MbPOLII_R: GTTCGGCTCCTCGCTGTTATCC (SEQ ID NO. 2 a/nebo pár primerů MbRT_ITS_F: CGGTGCTGGAAACAGTGCTGCCA (SEQ ID NO. 3) MbRT_ITS_R: CGATGCCAGAACCAAGAGATCC (SEQ ID NO. 4). Dále řešení poskytuje set pro PCR detekci a způsob detekce využívající uvedenou sadu primerů

Description

Sada primerů, set a způsob detekce Microdochium bolleyi
Oblast techniky
Vynález se týká sady primerů, setu a způsobu stanovení endofýtické houby Microdochium bolleyi v obilovinách a trávách.
Dosavadní stav techniky
Většina rostlin, ať již planě rostoucích či kulturních, téměř vždy interaguje s houbami. Tyto symbiózy bývají trojího typu: mutualistické, parazitické nebo neutrální. Nej rozšířenější mutualistická asociace s houbami je nazývána mykorhizní symbiózou. Velmi častou je ale také tzv. endofytická symbióza, kdy houba kolonizuje rostlinná pletiva bez vyvolání příznaků onemocnění. Endofýtické houby naopak pomáhají rostlině přežít i tam, kde na rostliny negativně působí biotické stresory (patogeny, herbivoři), a také abiotické faktory prostředí, jako nedostatek vody, přístupných živin či nepříznivé teploty. Tito endofyté představují skupinu kosmopolitních hub, většinou ze skupiny askomycet obsahující různé řády jako Helotiales, Pleosporales, Sordariales a Xylariales
Microdochium bolleyi (Sprague) de Hoog and Hermanides-Nijhof, (Ascomycota, Xylariales) je houba žijící endofyticky zejména v kořenech obilovin a trav. M. bolleyii patří do skupiny nej rozšířenějších kořenových endofytů, tzv. dark septate endophytes (DSE), tedy takových, kteří mají tmavé přepážko váné hyfy. Endofýté této skupiny na rozdíl od mykorhizní symbiózy obvykle neovlivňují příjem živin hostitelem, ale mohou hrát významnou roli v toleranci rostliny k suchu, nepříznivým teplotám, a také v obraných procesech před patogeny. Tak je tomu i v případě druhu M. bolleyi, který kupříkladu na kořenech pšenice nevyvolává žádné příznaky onemocnění, ale právě naopak chrání svého hostitele proti celé řadě patogenů, jako jsou například původci černání kořenů a baží stébel Gaeumannomyces granimis, původci pravého stéblolamu Oculimacula sp., patogen kořenů a listů obilovin Bipolaris sorokiniana nebo patogeny z rodu Fusarium sp. M. bolley je také účinné v potlačení škodlivého vlivu parazitických háďátek (Heterodera avenae) na pšenici.
V některých konkrétních případech vztahu hostitel-endofýt není zcela zřetelná hranice mezi endofytickým a parazitickým způsobem interakce. U zemědělsky využívaných trávníků jako zdroj píce pro krmení hospodářských zvířat či jinak člověkem využívaných druhů trav, bylo zdokumentováno, že M. bolleyi působí jako parazit a způsobuje onemocnění rostlin. Příkladem je travní druh psineček výběžkatý (Agrostis stolonifera L.). Je to důležitý zástupce trav, který se vysévá na pastvinách, kde dobře odolává narušování půdy dobytkem a do trávníků, kde snáší nízké sečení. Často je užíván na golfových hřištích. U tohoto druhu trávy způsobuje houba M. bolleyi hnilobu bazálních částí stébel s významnými ekonomickými ztrátami.
Jak je z výše uvedeného zřejmé, je M. bolleyi významným druhem houby, který má praktické využití pro zlepšení vlastností obilovin, či naopak je patogenem trav např. v golfových trávnících. Z tohoto důvodu je potřebná správná diagnostika výskytu této houby, ať již pro potvrzení úspěšného uchycení uměle infikovaných kmenů do obilovin, tak pro diagnostiku onemocnění u trav. Pro příbuzné výhradně parazitické druhy stejného rodu, např. Microdochium nivale a Microdochium majus, jsou již diagnostické metody na bázi PCR a qPCR dostupné, ale pro M. bolleyi se takové metody dosud nepodařilo vyvinout.
Pro druh M. bolleyi je dosud používáno kultivačních či mikroskopických technik, či technik založených na DNA čipech (PCT/EP2014/073768). Nevýhodou DNA čipů je vlastní hybridizační reakce mezi DNA sondami na čipu a analyzovaným vzorkem. Podmínky hybridizační reakce musí být obecně nastaveny tak, aby docházelo k hybridizaci celé řady komplementárních vláken DNA vzorku se sondami. Tím klesá specifičnost k danému diagnostikovanému druhu. Při kvantifikaci pomocí DNA čipu pak dochází k redukci hybridizační kinetiky a signál není lineární k množství
- 1 CZ 2021 - 3 A3 navázané DNA. Při velkém množství hybridizujících úseků DNA dochází k saturaci čipu. Naopak při nízkých koncentracích nevzniká žádný signál, i přesto, že je DNA navázána. Metody pro kvalitativní a kvantitativní detekci M. bolleyi pomoci PCR a qPCR zatím dostupné nejsou.
Předkládaný vynález si klade za cíl vyvinout rychlou a efektivní metodu kvalitativní a kvantitativní detekce houby M. bolleyi.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je sada primerů, set pro PCR a způsob detekce Microdochium bolleyi. Vyvinutý způsob s využitím uvedené sady primerů umožňuje nejen samotné kvalitativní zjištění přítomnosti M. bolleyi, ale i kvantifikaci množství této houby ve vzorku. To dosavadní způsoby detekce nedovolovaly. Při kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) je množství syntetizovaných produktů zaznamenáváno průběžně v reálném čase. Ke kvantifikaci se používají fluorescenční barviva, přičemž úroveň fluorescence je přímo úměrná množství amplifíkovaných produktů. Fluorescence je měřena v každém cyklu reakce. Obecně jsou fluorescenční barviva dělena do dvou kategorií: specifická a nespecifická dle způsobu vazby na DNA. Nespecifická detekce např. s barvivém SybrGreen využívá schopnosti interkalačních barviv vázat se na jakoukoli dsDNA. Specifita této metody je tedy závislá na specifičnosti použitých primerů.
Sada primerů podle předkládaného vynálezu zahrnuje:
pár primerů
MbPOLII_F: GCAGGCTTGTGGTCTGGTCA (SEQ ID NO. 1)
MbPOLII_R: GTTCGGCTCCTCGCTGTTATCC (SEQ ID NO. 2) a/nebo pár primerů
MbRTITSF: CGGTGCTGGAAACAGTGCTGCCA (SEQ ID NO. 3)
MbRT_ITS_R: CGATGCCAGAACCAAGAGATCC (SEQ ID NO. 4).
Páry oligonukleotidových primerů jsou určeny k amplifikaci určených fragmentů DNA houby M. bolleyi, bez současné amplifikace necílových sekvencí např. DNA hostitele nebo DNA jiných organismů přítomných v analyzovaném vzorku. Tyto primery dovolují odlišit druh M. bolleyi od jiných druhů hub, včetně jiných druhů stejného rodu.
Primery MbPOLIIF a MbPOLIIR jsou určeny pro amplifikaci úseku genu RPB2 (RNA polymerase II second largest subunit). Amplifikovaný fragment má velikost 600 bp, a je zejména snadno stanovitelný horizontální elektroforézou v agarozovém gelu po obarvení ethidium bromidem.
Příslušný úsek genu s polohou úseků, na které nasedají primery MbPOLII F a MbPOLII R, má sekvenci:
cggtacacct ttgcgtctac cttgtcccac ttgcgcagaa caaacactcc cgtcggccga gatggcaagc ttgccaaacc tcgccagctg cacaacacgc actggggtct tgtctgtccg
121 gccgagacgc ccgaagggca ggcttgtggt ctggtcaaga acctttctct catgtgctca
181 atcagcgtgg gaacctcaac ggaacccatt atcgactaca tgatcacgag gaacatggag
241 gtgcttgagg agtacgagcc actacgatac ccgaacgcaa caaagatctt cctgaacgga
301 tcgtggattg gcgtgcacca ggatcccaag acgttggtgc gcgacgtcca gcaacttcgt
361 cgcaacaatc agattcctgc agaggtttcg ctcattcgtg acatcagaga ccgtgagttc
-2CZ 2021 - 3 A3
421 aagatatttt ctgacgccgg tcgtgtcatg cgccccctgt ttgtggtgga gcaagaggac
481 aacccagaca ctggggtgga gaaaggttcc ttggtgctca ataaggagca tatcaggaag
541 ctcgagaacg accaggctca cggtgctggg agcgaggagt actttggctg gcaaggcctg
601 gtcaacgaag gtgtgattga atacttggac gccgaagaag aggagacctc gatgatctgc
661 atgaccgctg aggatctcga gaccttccgg ctggcgaaac aaggccacga catgacaacg
721 gataacagcg aggagccgaa caagcgagtg aagactcgga tgaacccgac aacgcacatg
781 tacactcact gcgaaatcca ccccagtatg cttctgggca tctgcgccag catcattcca (SEQ ID NO. 5)
Primery MbRTITSF a MbRTITSR jsou určeny pro amplifikaci úseku genu ribosomal RNA gene internal transcribed spacer 1. Amplifikovaný fragment má velikosti 14 bp, a je zejména snadno stanovitelný při real-time PCR interkalačním barvivém, např. barvivém SybrGreen.
Příslušný úsek genu s polohou úseků, na které nasedají primery MbRT ITS F a MbRT ITS R, má sekvenci:
taaaaaatcg taacaaggtc tccgtaggtg aacctgcgga gggatcattt actgagtttt taactctcca aaccatgtga acttaccact gttgcctcgg tggtcggtgc tggaaacagt
121 gctgccaccg gtggactact aaactcttgt taatttttgt caaatctgaa tcaaactaag
181 aaataagtta aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc
241 gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac
301 attgcgccca ttagtattct agtgggcatg cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc
361 ctagcttagt gttgggagac tgcctaatac gcagctcctc aaaaccagtg gcggagtctg
421 ttcgtgctct gagcgtagta attttttatc tcgcttctgc aagccggcca gacgacagcc
481 ataaaccgca ccctctcggg gggcactttt ttaatggttg acctcggatc aggtaggaat
541 acccgctgaa cttaagcata tcaaaa (SEQ ID NO. 6)
Předmětem předkládaného vynálezu je dále set pro PCR detekci houby M. bolleyi, který obsahuje:
alespoň jeden pár primerů vybraných z páru primerů
MbPOLII_F: GCAGGCTTGTGGTCTGGTCA (SEQ ID NO. 1)
MbPOLII_R: GTTCGGCTCCTCGCTGTTATCC (SEQ ID NO. 2) a
páru primerů
MbRTITSF: CGGTGCTGGAAACAGTGCTGCCA (SEQ ID NO. 3)
MbRT_ITS_R: CGATGCCAGAACCAAGAGATCC (SEQ ID NO. 4);
směs dNTP, polymerázu, hořečnatou sůl (např. chlorid hořečnatý), nukleáz-prostou vodu pro PCR, pufr (např. Tris pufr), a popřípadě fluorescenční barvivo, kterým je s výhodou interkalační barvivo.
Dále je předmětem vynálezu použití sady primerů vybrané z
-3 CZ 2021 - 3 A3 páru primerů
MbPOLII_F: GCAGGCTTGTGGTCTGGTCA (SEQ ID NO. 1)
MbPOLIIR: GTTCGGCTCCTCGCTGTTATCC (SEQ ID NO. 2);
páru primerů
MbRTITSF: CGGTGCTGGAAACAGTGCTGCCA (SEQ ID NO. 3)
MbRT_ITS_R: CGATGCCAGAACCAAGAGATCC (SEQ ID NO. 4);
a obou párů primerů;
pro detekci houby M. bolleyi ve vzorcích obilovin a/nebo trav metodou PCR.
Dále je předmětem vynálezu způsob detekce houby M. bolleyi ve vzorcích obilovin a/nebo trav, obsahující kroky:
- izolace DNA ze vzorku; a
- provedení amplifikace DNA metodou PCR s použitím sady primerů vybrané z páru primerů
MbPOLII F: GCAGGCTTGTGGTCTGGTCA (SEQ ID NO. 1)
MbPOLII_R: GTTCGGCTCCTCGCTGTTATCC (SEQ ID NO. 2);
páru primerů
MbRT ITS_F: CGGTGCTGGAAACAGTGCTGCCA (SEQ ID NO. 3)
MbRT_ITS_R: CGATGCCAGAACCAAGAGATCC (SEQ ID NO. 4);
a obou párů primerů.
S výhodou je detekční PCR reakce prováděna s následujícími reakčními podmínkami:
Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů
úvodní denaturace 94 5 min 1
denaturace 95 30 35
annealing 66,7 20
elongace 72 45
závěrečná elongace 72 5 min 1
Uchování 10 - 1
S výhodou je kvantifikační PCR reakce prováděna s následujícími reakčními podmínkami:
Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů
úvodní denaturace 94 10 min 1
denaturace 95 10 40
annealing 60 30
elongace a snímání fluorescence 72 20
-4CZ 2021 - 3 A3
Objasnění výkresů
Obrázek 1. Křivka tání s primery MbRT_ITS_F/R (Příklad 4). Vrchol je tvořen signálem DNÁM bolleyi. Křivky pod prahem detekovatelnosti náležejí druhům M nivale a M. majus. Nezvlněné křivky jsou kontroly bez templátu.
Obrázek 2. Graf relativního množství DNA endofytu v neinokulovaných (bez M. bolleyi', MbO) a inokulovaných (s obsahem M. bolleyi', Mb V rostlin pšenice podrobených analýze s primery MbRTITSF/R (Příklad 6). Byly analyzovány vždy tři rostliny každé varianty společně a vzorek byl rozdělen na kořenovou a listovou část. Výsledek reakce je vyjádřen průměrnou relativní kvantifikací DNA M. bolley v pletivech rostlin.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Ověření navržených párů primerů PCR na kmenech M. bolleyi
V rámci vyvíjení vynálezu bylo testováno více párů primerů, které byly navrženy pro úseky DNA houby M. bolleyi, které byly původci stanoveny jako vhodné cílové úseky. Kromě primerů MbPOLII F (SEQ ID NO. 1) a MbPOLII R (SEQ ID NO. 2) (dohromady je pár označován jako MbPOLII_F/R) a primerů MbITSF (TGGAAACAGTGCTGCCACCGG, SEQ ID NO. 7) a MbITSR (GGGTGCGGTTTATGGCTGTCG, SEQ ID NO. 8) (dohromady je pár označován jako MbITSF/R) byly navrženy a testovány také primery MbLSUF/R (CTTCTGGTCCGAATTGTAA, SEQ ID NO. 9 / AACAGTTATGCTCTTACTC, SEQ ID NO. 10) nasedající na rDNA úseku velké podjednotky (large subunit) a primery MbBETF/R (CCGGCAACAACTGGGCCAAG, SEQ ID NO. 11/ AGGGAATGGCACCATGTTG, SEQ ID NO. 12) nasedající na sekvenci beta-tubulinu.
V prvním testu byly primery použity k rozpoznání druhu M. bolleyi zc vzorků houbových kultur získaných sběrem v terénu.
Z kořenů pšenice bylo získáno 6 izolátůM. bolleyi (Tab. 1). Z těchto sběrů byly na Petriho miskách na živném médiu (4 % Potato Dextrose Agar) vypěstovány monosporické izoláty.
Mycelium bylo špachtlí sejmuto a byla z něj izolována DNA. Mycelium bylo drceno v porcelánových třecích miskách za pomoci tekutého dusíku. Dále bylo k izolaci DNA využito kitu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagene). PCR proběhla v reakční směsi uvedené v Tab. 2 za reakčních podmínek uvedených v Tab. 3. Výsledek reakce (pozitivní/negativní) je uveden v tabulce 1 pro jednotlivé páry primerů.
Tab. 1 Seznam izolátůM. bolleyi získaných z kořenů pšenice. Výsledky PCR detekce: pozitivní výsledek reakce vyznačující se viditelným proužkem na gelu je označen znaménkem + (plus), negativní odezva znaménkem - (minus).
Číslo Označení MbPOLII F/R MbITSF/R MbLSUF/R MbBETF/R
1 20Mb 1 +/+/+ +/+/+ -/-/- +/+/+
2 20Mb2 +/+/+ +/+/+ -/-/- +/+/+
3 20Mb3 +/+/+ +/+/+ -l-l- +/+/+
4 20Mb4 +/+/+ +/+/+ -l-l- +/+/+
5 20Mb5 +/+/+ +/+/+ -l-l- +/+/+
6 20Mb6 +/+/+ +/+/+ -l-l- +/+/+
Tab. 2 Reakční směs v celkovém objemu 20 uL
-5CZ 2021 - 3 A3
Chemikálie Konečná koncentrace Objem
PCR nukleaze free voda - 12,6 pL
lOmMdNTP 0,2 mM 0,4 pL
25 mM MgCl2 2,5 mM 2,0 pL
Pufr 750 mM Tris-HCl 200 mM (NH4)2SO4 75 mM 20 mM 2,0 pL
10 pM Primer SEQ ID: 1 0,2 pM 0,4 pL
10 pM Primer SEQ ID: 2 0,2 pM 0,4 pL
5 U/l pL Taq Polymeráza 1,0 U 0,2 pL
DNA vzorku 1-5 ng 2,0 pL
Celkem - 20 pL
Tab. 3 Reakční podmínky PCR
Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů
úvodní denaturace 94 5 min 1
denaturace 95 30 35
annealing 66,7 20
elongace 72 45
závěrečná elongace 72 5 min 1
uchování 10 - 1
Závěr: Všechny izolátyM. bolleyi (6 ks) vykazovaly po PCR s primery MbPOLIIF/R, MbITSF/R a MbBETF/R za uvedených reakčních podmínek pozitivní odezvu (Tab. 1). Reakce s primery MbLSUF/R vykázala negativní odezvu, tyto primery byly z dalších testů vyřazeny.
Příklad 2: Ověření detekce M. bolleyi ve tkáni pšenice a B. distachyon (kořeny, listy)
Ve skleníku byl založen experiment s pšenicí setou a trávou Brachypodium distachyon. Jak u pšenice, tak u B. distachyon byla polovina rostlin prostorově izolována a inokulována endofytem M. bolleyi. 30 dní po inokulaci byly odebrány rostliny jak infikované, tak bez infekce. Listy a kořeny pšenice a B. distachyon byly podrobeny molekulární analýze za použití primerů MbPOLII_F/R, MbITSF/R a MbBETF/R.
Rostlinný materiál byl drcen v porcelánových třecích miskách za použití tekutého dusíku. Poté byla izolována celková DNA pomocí kitu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagene). PCR proběhla v reakční směsi uvedené v Tab. 5 za reakčních podmínek uvedených v Tab. 6). Reakce byla provedena třikrát. Výsledky jsou shrnuty v Tab. 4
Tab. 4 Seznam neinokulovaných a inokulovaných (M. bolleyi) rostlin pšenice a B. distachyon podrobených analýze s primery. Pozitivní výsledek reakce vyznačující se viditelným proužkem na gelu je označen znaménkem + (plus), negativní odezva znaménkem - (minus)
-6CZ 2021 - 3 A3
Číslo Rostlina Analyzovaná část rostliny Inokulace M. bolleyi MbPOLIIF/R MbITSF/R* MbBETF/ R*
1 Pšenice kořen Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
2 Pšenice kořen Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
3 Pšenice kořen Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
4 Pšenice list Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
5 Pšenice list Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
6 Pšenice list Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
7 Pšenice kořen Ne -/-/+
8 Pšenice kořen Ne +/-/- +/-/-
9 Pšenice kořen Ne +/+/-
10 Pšenice list Ne +/+/-
11 Pšenice list Ne
12 Pšenice list Ne +/+/+
13 B. distachyon kořen Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
14 B. distachyon kořen Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
15 B. distachyon kořen Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
16 B. distachyon list Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
17 B. distachyon list Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
18 B. distachyon list Ano +/+/+ +/+/+ +/+/+
19 B. distachyon kořen Ne +/+/+
20 B. distachyon kořen Ne +/+/+
21 B. distachyon kořen Ne -/-/+ -/-/+
22 B. distachyon list Ne +/+/-
23 B. distachyon list Ne
24 B. distachyon list Ne +/+/+
* U primerů označených hvězdičkou docházelo k výrazné tvorbě artefaktů, nežádoucí amplifikaci lokusů DNA o různé velikosti (pravděpodobně interakce primerů s DNA hostitele a případnými dalšími organismy vyskytujících se ve vzorku)
Tab. 5 Reakční směs v celkovém objemu 20 uL
Chemikálie Konečná koncentrace Objem
PCR nukleaze free voda - 12,6 pL
lOmMdNTP 0,2 mM 0,4 pL
25 mM MgCl2 2,5 mM 2,0 pL
Pufir 750 mM Tris-HCl 200 mM (NH4)2SO4 75 mM 20 mM 2,0 pL
10 pM Primer SEQ ID: 1 0,2 pM 0,4 pL
10 pM Primer SEQ ID: 2 0,2 pM 0,4 pL
5 U/l pL Taq Polymeráza 1,0 U 0,2 pL
DNA vzorku 1-5 ng 2,0 pL
Celkem - 20 pL
-7 CZ 2021 - 3 A3
Tab. 6 Reakční podmínky PCR
Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů
úvodní denaturace 94 5 min 1
denaturace 95 30 35
annealing 66,7 20
elongace 72 45
závěrečná elongace 72 5 min 1
uchování 10 - 1
Závěr: Vzorky rostlin inokulované endofytem M. bolleyi vykazovaly po PCR s primery MbPOLII_F/R za uvedených reakčních podmínek pozitivní odezvu, zatímco rostliny, které nebyly tímto endofýtem infikovány, vykazovaly odezvu negativní (Tab. 4). Primery MbPOLIIF/R nevykazovaly tvorbu artefaktů. Primery MbITSF/R vykazovaly falešné slabě pozitivní odezvy i u některých negativních vzorků a vytvářely velké množství artefaktů. Reakce s primery MbBETF/R vykazovala významně falešně pozitivní výsledky.
Příklad 3: Ověření specifity vybraných PCR primerů na škále houbových patogenů
Pro potvrzení specifity primerů MbPOLII_F/R byla provedena molekulární analýza u celé řady druhů hub jednak příbuzných M. bolleyi a jednak potenciálně se vyskytujících na obilovinách a travách. Houbové kultury byly získány terénním sběrem a kultivací na Petriho miskách a dále z českých sbírek mikroorganismů (viz Tab. 7).
PCR proběhla v reakční směsi uvedené v Tab. 8 za reakčních podmínek uvedených v Tab. 9.
Tab. 7 Seznam druhů hub podrobených analýze s primery MbPOLII_F/R (pozitivní výsledek reakce vyznačující se viditelným proužkem na gelu je označen znaménkem + (plus), negativní odezva znaménkem - (minus)). Pro potvrzení přítomnosti DNA byla u všech vzorků provedena kontrolní PCR reakce s univerzálními primery ITS1/ITS4. Reakce byly opakovány vždy třikrát.
Druh Zdroj Kód Hosůtel PCR ITS 1/4 MbPOLII_F/R
M. bolleyi Vlastní sběr 20Mb 1 Tritium aestivum +/+/+ +/+/+
M. bolleyi Vlastní sběr 20Mb2 Tritium aestivum +/+/+ +/+/+
M. bolleyi Vlastní sběr 20Mb3 Tritium aestivum +/+/+ +/+/+
M. bolleyi Vlastní sběr 20Mb4 Tritium aestivum +/+/+ +/+/+
M. bolleyi Vlastní sběr 20Mb5 Tritium aestivum +/+/+ +/+/+
M. bolleyi Vlastní sběr 20Mb6 Tritium aestivum +/+/+ +/+/+
Microdochium nivale Vlastní sběr 13M30 Tritium aestivum +/+/+
Microdochium nivale Vlastní sběr 17M323 Tritium aestivum +/+/+
Microdochium nivale Vlastní sběr 13M205 Tritium aestivum +/+/+
Microdochium majus Vlastní sběr 13M195 Tritium aestivum +/+/+
Microdochium majus Vlastní sběr 14M71 Tritium aestivum +/+/+
Microdochium majus Vlastní sběr 17M271 Tritium aestivum +/+/+
Cochliobolus sativus Vlastní sběr 07CS4.3 Hordeum vulgare +/+/+
Ramularia collo-cygni Vlastní sběr 20CZR19 Hordeum vulgare +/+/+
Oculimacula yallundae Vlastní sběr 15OY119 Tritium aestivum +/+/+
-8CZ 2021 - 3 A3
Druh Zdroj Kód Hostitel PCRITS1/4 MbPOLII_F/R
Oculimacula acuformis Vlastní sběr 15OA103 Tritium aestivum +/+/+
Rhizoctonia cerealis Vlastní sběr 20CC88 Tritium aestivum +/+/+
Gaeumannomyces graminis var. tritici CCM F-575 Tritium aestivum +/+/+
Rhynchoporium. secalis Vlastní sběr 18RhS04 Hordeum vulgare +/+/+
Pyrenophora teres Vlastní sběr 17PTT52 Hordeum vulgare +/+/+
Pyrenophora maculata Vlastní sběr 14PTM01 Hordeum vulgare +/+/+
Pyrenophora triticirepentis Vlastní sběr 19DTR6 Tritium aestivum +/+/+
Tilletia tritici Vlastní sběr 06TCAR33 Tritium aestivum +/+/+
T. controversa Vlastní sběr 06TCO02 Tritium aestivum +/+/+
Fusarium graminearum Vlastní sběr 20FG01 Tritium aestivum +/+/+
F. culmorum Vlastní sběr 19FCBd Tritium aestivum +/+/+
Druh Zdroj Kód Hostitel PCRITS1/4 MbPOLII_F/R
F. avenaceum CPPF CPPF-161 Tritium aestivum +/+/+
F. poae CPPF CPPF-51 Tritium aestivum +/+/+
F. langsethiae Vlastní sběr 12FL4.00 Avena sativa +/+/+
F. sporotrichioides CPPF CPPF-146 Tritium aestivum +/+/+
F. tricinctum CPPF CPPF-254 Tritium aestivum +/+/+
F. oxysporum Vlastní sběr 19FOX06 Zea mays +/+/+
Zymoseptoria tritici Vlastní sběr ST-KMB Tritium aestivum +/+/+
Penicillium sp. Vlastní sběr 20PEN_sp. Hordeum vulgare +/+/+
CPPF - Sbírka fytopatogenních hub, VÚRV Praha Ruzyně, CZ
CCM - Česká sbírka mikroorganismů Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, CZ
Tab. 8 Reakční směs v celkovém objemu 20 uL
Chemikálie Konečná koncentrace Objem
PCR nukleaze free voda - 12,6 pL
WmMdNTP 0,2 mM 0,4 pL
25 mM MgCl2 2,5 mM 2,0 pL
Pufir 750 mM Tris-HCl 200 mM (NH4)2SO4 75 mM 20 mM 2,0 pL
10 pM Primer SEQ ID: 1 0,2 pM 0,4 pL
10 pM Primer SEQ ID: 2 0,2 pM 0,4 pL
5 U/l pL Taq Polymeráza 1,0 U 0,2 pL
DNA vzorku 1-5 ng 2,0 pL
Celkem - 20 pL
-9CZ 2021 - 3 A3
Tab. 9 Reakční podmínky PCR
Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů
úvodní denaturace 94 5 min 1
denaturace 95 30 35
annealing 66,7 20
elongace 72 45
závěrečná elongace 72 5 min 1
uchování 10 - 1
Závěr: Vzorky obsahující DNA M. bolleyi se po PCR s primery MbPOLII_F/R za uvedených reakčních podmínek vyznačovaly pozitivní odezvou, ostatní testované druhy zůstaly bez odezvy (Tab. 7).
Příklad 4: Ověření navržených párů primerů pro qPCR na kmenech M. bolleyi
Byly připraveny 4 vzorky DNA získané ze čtyř izolátů M. bolleyi a DNA dvou izolátů M. nivale a dvou izolátů M. majus (Tab 12). Mycelium hub jsme v tekutém dusíku homogenizovali nájemný prášek. Pomocí Qiagene DNeasy Plant Mini Kitu jsme vyizolovali DNA, kterou jsme dále testovali pomocí metody Real-time PCR na přístroji CFX Connect Real-Time PCR Detection System. Reakční podmínky a složení reakční směsi jsou uvedeny v tabulkách 10 a 11. Testovali jsme využití primerů MbRT ITS F (SEQ ID NO. 3) a MbRT ITS R (SEQ ID NO. 4) (dohromady je pár označován jako MbRT_ITS_F/R) k rozpoznání druhu M. bolleyi. Současně byly navrženy a testovány i další čtyři páry primerů MbRTLSUlF/R (CTTTGCCTTGCGGATCATCC, SEQ ID NO. 13 / GGAGGAGTCACATTCCTGA, SEQ ID NO. 14) a MbRTLSU2F/R (CGGATCATCCGGTGTTCTCA, SEQ ID NO. 15 / TGAAGTCTTTATCCGGCCGCC, SEQ ID NO. 16) (odvozené od rDNA úseku velké podjednotky, large subunit) a MbRTPOLIF/R (GGTGGAGAAAGGTTCCTTGGTG, SEQ ID NO. 17 / TTGCCAGCCAAAGTACTCCTCG, SEQ ID NO. 18) a MbRTPOL2F/R (GATTGAATACTTGGACGCTGAA, SEQ ID NO. 19 / TTGTTTCGCCAGCCGGAAGGTC, SEQ ID NO. 20) (odvozeno od sekvence polymerázy II).
Tab. 10 Složení reakční směsi (15 μΐ)
Chemikálie Konečná koncentrace Objem
PCR nukleaze free voda - 5,9 μΐ
SYBR Green Master Mix (2x) Ix 7,5 μΐ
primer ID3 (10 μΜ) 0,2 μΜ 0,3 μΐ
primer ID4 (10 μΜ) 0,2 μΜ 0,3 μΐ
templátová DNA 10ng 1,0 μΐ
Celkem - 15 μΕ
Tab. 11 Reakční podmínky
Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů* *
úvodní denaturace 94 10 min 1
denaturace 95 10 40
annealing 60 30
elongace 72 20*
* v tomto kroku snímání fluorescence ** po skončení posledního cyklu následuje analýza křivky tání
-10 CZ 2021 - 3 A3
Křivka tání
Vzhledem k tomu, že jsme použili metodu založenou na SyberGreen, je nutno ověřit zdanedochází 5 ke vzniku nespecifických produktů nebo primer dimerů. Ktomu lze využít tzv. křivku tání.
Nespecifické produkty mívají obvykle jinou (většinou nižší) teplotu tání. Křivka by měla mít pro každý PCR produkt jeden vrchol. Správnost reakce dokladuje obrázek 1, kde skutečně primery MbRTITSF/R vyznačují se jediným vrcholem a nespecifické produkty náležející druhům M. nivale άΜ. majus nejsou amplifikovány.
Tab. 12 Výsledné hodnot Cq po provedené qPCR s pěti páry primerů.
Cq (průměr ze tří technických opakování)
č. Druh Kód MbRT_ITS F/R MbRTLSUl F/R MbRTLSU2 F/R MbRTPOLl F/R MbRTPOL2 F/R
1 M. bolleyi 20Mb 1 11,75 13,83 13,09 18,22 19,18
2 M. bolleyi 20Mb2 11,38 13,87 12,53 18,01 18,93
3 M. bolleyi 20Mb3 11,00 13,70 13,00 17,80 18,88
4 M. bolleyi 20Mb4 11,39 13,76 13,21 17,78 19,11
5 Microdochium nivale 17M323 34,56 29,59 16,81 33,84 >40
6 Microdochium nivale 13M205 34,17 29,48 16,99 33,73 >40
7 Microdochium majus 13M195 34,37 29,38 17,16 33,62 >40
8 Microdochium majus 14M71 34,25 29,52 17,01 33,76 >40
Závěr: Nejpříznivějších hodnot Cq bylo uM bolleyi dosaženo použitím primerů MbRT_ITS_F/R.
Ostatní primery vykazovaly vyšší hodnoty Cq (Tab 12). Primery MbRT_ITS_F/R také nevykazují falešně pozitivní výsledky u příbuznýc druhů tj M. nivale άΜ. majus.
Příklad 5: Ověření specifity vybraných qPCR primerů na škále houbových patogenů
Pro potvrzení specifity primerů MbRT_ITS_F/R byla provedena molekulární analýza u celé řady druhů hub jednak příbuzných M. bolleyi a jednak potenciálně se vyskytujících na obilovinách a travách (Tab. 15). Houbové kultury byly získány terénním sběrem a kultivací na Petriho miskách a dále z českých sbírek mikroorganismů.
PCR proběhla v reakční směsi a za reakčních podmínek uvedených v Tab. 13 a 14.
Tab. 13 Složení reakční směsi (15 pl)
Chemikálie Konečná koncentrace Objem
PCR nukleaze free voda - 5,9 pl
SYBR Green Master Mix (2x) Ix 7,5 pl
primer ID: 3 (10 pM) 0,2 pM 0,3 pl
primer ID: 4 (10 μΜ) 0,2 pM 0,3 pl
templátová DNA lOng 1,0 pl
Celkem - 15 pL
Tab. 14 Reakční podmínky
Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů* *
úvodní denaturace 94 10 min 1
denaturace 95 10 40
-11 CZ 2021 - 3 A3
annealing 60 30
elongace 72 20*
* v tomto kroku snímání fluorescence ** po skončení posledního cyklu následuje analýza křivky tání
Tab. 15 Seznam druhů hub podrobených kvantitativní analýze sprimery MbRT ITS F/R (pozitivní výsledek reakce vyznačující se hodnotami Cq nižšími než 30). Hodnoty Cq v tabulce jsou průměrem ze tří provedených technických opakování.
Druh Zdroj Kód Hostitel Cq průměr
M. bolleyi * Vlastní sběr 20Mb 1 Tritium aestivum 17,25
Microdochium nivale Vlastní sběr 13M30 Tritium aestivum 36,55
Microdochium majus Vlastní sběr 17M271 Tritium aestivum 37,52
Druh Zdroj Kód Hostitel Cq průměr
Cochliobolus sativus Vlastní sběr 07CS4.3 Hordeum vulgare 37,54
Ramularia collo-cygni Vlastní sběr 20CZR19 Hordeum vulgare 36,69
Oculimacula yallundae Vlastní sběr 15OY119 Tritium aestivum 31,44
Oculimacula acuformis Vlastní sběr 15OA103 Tritium aestivum 32,28
Rhizoctonia cerealis Vlastní sběr 20CC88 Tritium aestivum 35,29
Gaeumannomyces graminis var. tritici CCM F-575 Tritium aestivum >40
Pyrenophora teres Vlastní sběr 17PTT52 Hordeum vulgare 37,46
Pyrenophora tritici-repentis Vlastní sběr 19DTR6 Tritium aestivum 39,09
Tilletia tritici Vlastní sběr 06TCAR3 3 Tritium aestivum 36,95
Fusarium graminearum Vlastní sběr 20FG01 Tritium aestivum 36,48
F. culmorum Vlastní sběr 19FCBd Tritium aestivum 38,03
F. avenaceum CPPF CPPF-161 Tritium aestivum 37,11
F. poae CPPF CPPF-51 Tritium aestivum 35,62
F. langsethiae Vlastní sběr 12FL4.00 Avena sativa 35,21
F. sporotrichioides CPPF CPPF-146 Tritium aestivum 37,59
F. tricinctum CPPF CPPF-254 Tritium aestivum 38,15
F. oxysporum Vlastní sběr 19FOX06 Zea mays 37,26
Zymoseptoria tritici Vlastní sběr ST-KM B Tritium aestivum 35,42
* DNA M. bolleyi byla před qPCR 30x naředěna, aby byla potvrzena účinnost reakce i za nižších koncentrací vstupní DNA
CPPF - Sbírka fytopatogenních hub, VÚRV Praha Ruzyně, CZ
CCM - Česká sbírka mikroorganismů Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, CZ
Závěr: Vzorky obsahující DNÁM bolleyi se po qPCR s primery MbRTITSF/R za uvedených reakčních podmínek vyznačovaly pozitivní odezvou, ostatní testované druhy zůstaly bez odezvy s hodnotami Cq vyššími než 30 (Tab. 15).
Příklad 6: Ověření detekce M bolleyi ve tkáni hostitele pšenice
Ve skleníku byl založen experiment s pšenicí setou. Polovina rostlin byla prostorově izolována a inokulována endofytem M. bolleyi. 30 dní po inokulaci byly odebrány 3 rostliny inokulované a 3
-12 CZ 2021 - 3 A3 bez inokulace. Listy a kořeny pšenice byly podrobeny molekulární analýze za použití primerů MbRTITSF/R.
Rostlinný materiál byl drcen v porcelánových třecích miskách za použití tekutého dusíku. Poté byla izolována celková DNA pomocí kitu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagene). PCR proběhla v následující reakční směsi za uvedených reakčních podmínek (Tab. 16 a 17). Reakce byla provedena třikrát.
Při kvantifikaci je nezbytné zařadit vnitřní kontrolu, která nám pomůže určit, do jaké míry bylo u testovaných vzorků použito srovnatelné množství vstupní DNA. Jako vnitřní kontrola jsou používány obvykle geny, jejichž počet kopií v genomu jsou víceméně stejné u všech testovaných vzorků. Používají se tzv. referenční geny, tj. nejčastěji „housekeeping“ geny. Zde byl použit gen pro fenylalanin amonium-lyázu (PAL).
Výpočet s použitím referenčního genu potom probíhá následovně 2 ACtl - ACt2, kde ACtl= Ct (target 1)- Ct(ref 1), AQ2= Ct (target 2)- Ct(ref 2). Kde target 1 je cílový gen u vzorku 1, target 2 cílový gen u vzorku 2, ref 1 je referenční kontrola vzorku 1 a ref 2 je referenční kontrola vzorku 2. Pro přesnější kvantifikaci je třeba při výpočtu zohlednit účinnost vlastní reakce. PCR naší reakce byla vypočtena na 96,31% efektivity.
Tab. 16 Složení reakční směsi (15 μΐ)
Chemikálie Konečná koncentrace Objem
PCR nukleaze free voda - 5,9 μΐ
SYBR Green Master Mix (2x) Ix 7,5 μΐ
primer ID3 (10 μΜ) 0,2 μΜ 0,3 μΐ
primer ID4 (10 μΜ) 0,2 μΜ 0,3 μΐ
templátová DNA 10ng 1,0 μΐ
Celkem - 15 μί
Tab. 17 Reakční podmínky
Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů* *
úvodní denaturace 94 10 min 1
denaturace 95 10 40
annealing 60 30
elongace 72 20*
* v tomto kroku snímání fluorescence ** po skončení posledního cyklu následuje analýza křivky tání
Závěr: Vzorky rostlin inokulované endofýtem M. bolleyi vykazovaly po qPCR s primery MbRT_ITS_F/R za uvedených reakčních podmínek pozitivní odezvu, zatímco rostliny, které nebyly tímto endofýtem inokulovány vykazovaly odezvu pod prahem detekovatelnosti (Obr. 2). V kořenech inokulovaných rostlin se nacházelo 12,5x více DNA M. bolleyi ve srovnání s nadzemními částmi (listy).
Průmyslová využitelnost
Využití vynálezu je jednak v rostlinolékařství při diagnostice endofýtu M. bolleyi což umožní potvrzení správného uchycení inokula u obilovin nebo cílenou volbu účinné ochrany u trav. Vynález má využití v rostlinolékařství a v oboru molekulární biologie.

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Sada primerů pro detekci houby M. bolleyi, vyznačující se tím, že obsahuje: pár primerů
    MbPOLII_F: GCAGGCTTGTGGTCTGGTCA (SEQ ID NO. 1)
    MbPOLII R: GTTCGGCTCCTCGCTGTTATCC (SEQ ID NO. 2) a/nebo pár primerů
    MbRTITSF: CGGTGCTGGAAACAGTGCTGCCA (SEQ ID NO. 3)
    MbRT_ITS_R: CGATGCCAGAACCAAGAGATCC (SEQ ID NO. 4).
  2. 2. Použití sady primerů podle nároku 1 pro detekci houby M. bolleyi ve vzorcích obilovin a/nebo trav metodou PCR.
  3. 3. Set pro PCR detekci houby M. bolleyi, vyznačující se tím, že obsahuje sadu primerů podle nároku 1, směs dNTP, polymerázu, hořečnatou sůl, nukleáz-prostou vodu pro PCR, pufr, a popřípadě fluorescenční barvivo, kterým je s výhodou interkalační barvivo.
  4. 4. Způsob detekce houby M. bolleyi ve vzorcích obilovin a/nebo trav, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:
    - izolace DNA ze vzorku; a
    - provedení amplifíkace DNA metodou PCR s použitím sady primerů podle nároku 1.
  5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že je PCR reakce prováděna se sadou primerů obsahující primery MbPOLII F a MbPOLII R, za reakčních podmínek:
  6. 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že je kvantifikační PCR reakce prováděna se sadou primerů obsahující primery MbRT ITS F a MbRT ITS R, za reakčních podmínek:
    Kroky reakce Teplota [°C] Čas [s] Počet cyklů úvodní denaturace 94 10 min 1 denaturace 95 10 annealing 60 30 40 elongace a snímání fluorescence 72 20
    - 14CZ 2021 - 3 A3
CZ2021-3A 2021-01-05 2021-01-05 Sada primerů, set a způsob detekce Microdochium bolleyi CZ309500B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-3A CZ309500B6 (cs) 2021-01-05 2021-01-05 Sada primerů, set a způsob detekce Microdochium bolleyi

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-3A CZ309500B6 (cs) 2021-01-05 2021-01-05 Sada primerů, set a způsob detekce Microdochium bolleyi

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20213A3 true CZ20213A3 (cs) 2022-07-13
CZ309500B6 CZ309500B6 (cs) 2023-03-01

Family

ID=82321220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2021-3A CZ309500B6 (cs) 2021-01-05 2021-01-05 Sada primerů, set a způsob detekce Microdochium bolleyi

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ309500B6 (cs)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2871243B1 (en) * 2013-11-06 2018-03-21 Omya International AG Nucleic acids and methods for detecting pathogens and beneficial microorganisms

Also Published As

Publication number Publication date
CZ309500B6 (cs) 2023-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1766083B1 (en) Method for the detection of fusarium graminearum
Torres-Calzada et al. A species-specific polymerase chain reaction assay for rapid and sensitive detection of Colletotrichum capsici
Pouzoulet et al. A method to detect and quantify Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum DNA in grapevine-wood samples
Chen et al. Development and evaluation of specific PCR and LAMP assays for the rapid detection of Phytophthora melonis
Chandelier et al. Early detection of Cryphonectria parasitica by real-time PCR
Li et al. Simultaneous detection and quantification of Phytophthora nicotianae and P. cactorum, and distribution analyses in strawberry greenhouses by duplex real-time PCR
Gusberti et al. Quantification of Venturia inaequalis growth in Malus× domestica with quantitative real-time polymerase chain reaction
Mazzaglia et al. Development of a polymerase chain reaction (PCR) assay for the specific detection of Biscogniauxia mediterranea living as an endophyte in oak tissues
Ling et al. An improved real-time PCR system for broad-spectrum detection of Didymella bryoniae, the causal agent of gummy stem blight of cucurbits
Chen et al. Simultaneous detection of three wheat pathogenic fungal species by multiplex PCR
Bhat et al. Specific detection of Phytophthora cactorum in diseased strawberry plants using nested polymerase chain reaction
CA2726699C (en) Nucleic acids and methods for detecting turfgrass pathogenic fungi
Birithia et al. Identification of root-knot nematode species occurring on tomatoes in Kenya: use of isozyme phenotypes and PCR-RFLP
JP5522820B2 (ja) イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー
Bodles et al. Multiplex real-time PCR detection of pathogen colonization in the bark and wood of Picea sitchensis clones differing in resistance to Heterobasidion annosum
Zouhar et al. Quantification of Tilletia caries and Tilletia controversa mycelium in wheat apical meristem by real-time PCR.
RU2720255C1 (ru) Способы и наборы для выявления мучнистой росы
KR101681645B1 (ko) 무에 시들음병을 일으키는 푸자리움 옥시스포룸 라파니 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 푸자리움 옥시스포룸 라파니 검출 방법
CZ20213A3 (cs) Sada primerů, set a způsob detekce Microdochium bolleyi
Shishido et al. PCR-based assays to detect and quantify Phomopsis sclerotioides in plants and soil
KR100560996B1 (ko) 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 진단용 디엔에이표지인자
Hilje-Rodríguez et al. A multiplex qPCR TaqMan-assay to detect fungal antagonism between Trichoderma atroviride (Hypocreaceae) and Botrytis cinerea (Sclerotiniaceae) in blackberry fruits using a de novo tef1-α-and an IGS-sequence based probes
CZ34829U1 (cs) Sada primerů a set pro detekci Microdochium bolleyi
Lee et al. Rapid detection of a downy mildew pathogen, Peronospora destructor, in infected onion tissues and soils by loop-mediated isothermal amplification
US20220162666A1 (en) Soil Pathogen Testing