CZ2019262A3 - Zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků - Google Patents

Abstract

Zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků podle tohoto vynálezu zahrnuje dávkovač (3) pro kontinuální dávkování vzorků do separační kapiláry (4), který má průtokové potrubí (28) pro průtok základního elektrolytu. Dávkovač (3) je napojen na výstup plnícího zařízení (27). Zařízení dále zahrnuje bezkontaktní vodivostní detektor (5), kterým prochází separační kapilára (4) a je vyvedena do koncové nádoby (6) opatřené vysokonapěťovou elektrodou (7) a připojena na zdroj (10) podtlaku. V dávkovači (3) je uspořádána zemnící elektroda (17) a zároveň je propojen s měřičem (18) doby mezi dvěma kapkami průtoku základního elektrolytu.

Description

Zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků

Oblast techniky

Technické řešení se týká oblasti separačních technik, konkrétně zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků.

Dosavadní stav techniky

Analýza klinických vzorků jako je krev, moč, mozkomíšní mok; environmentální analýza pitných, povrchových a průmyslových vod a v neposlední řadě analýza potravin a nápojů včetně monitorování procesů v průběhu jejich zpracování, to se vše standardně provádí mimo místo výskytu a odběru vzorku. Vzorky jsou z místa jejich odběru přepraveny do vzdálených analytických laboratoří, kde jsou nejprve laboratorně zpracovány postupy jako je filtrace, extrakce, ředění, úprava pH a mnohé další. Těmito dílčími kroky jsou převedeny do formy vhodné pro následnou instrumentální chemickou analýzu, která je provedena pomocí chromatografických, spektrálních nebo elektrochemických technik. Celý tento, tzv. off-line proces je od odběru vzorku, přes jeho uložení, převoz, uskladnění, laboratorní zpracování do formy vhodné pro instrumentální analýzu, vlastní přístrojovou analýzu až po vyhodnocení a zpracování získaných dat časově náročný.

Celou řadu chemických látek jako jsou minerály, aminokyseliny, sacharidy, nízkomolekulámí organické kyseliny a většinu léčiv lze v komplexních matricích stanovovat pomocí kapilární elektroforézy. Předností elektroforetické analýzy prováděné v kapilárách o malém vnitřním průměru je vysoká účinnost separačního procesu, která je důležitá pro analýzu komplexních vzorků jako je krev, moč, mikrodialyzáty tkání, potraviny, minerální a odpadní vody. Během elektroforetické separace lze požadovaný analyt snadno oddělit od ostatních složek komplexního vzorku za krátkou dobu i na krátké separační dráze a následně jej pomocí univerzálního detektoru kvantifikovat, což je hlavní předností této instrumentální techniky. Vedle toho je elektroforetická separace charakteristická malými požadavky na množství vzorku i malými nároky na jeho laboratorní úpravu. Z těchto důvodů představuje elektroforéza silný nástroj pro klinickou analýzu mikrolitrových objemů tělních tekutin, což splňuje současné požadavky na málo invazivní způsoby odběru vzorků; a dokonce je kompatibilní s moderními mikrodialyzačními technikami vzorkování živých tkání, orgánů prováděných pro účely humánní medicíny nebo při šetrných experimentech na malých laboratorních organismech. Mikrodialyzační vzorkování je realizováno prostřednictvím miniaturních několika milimetrových mikrodialyzačních sond vybavených selektivní membránou, které jsou implementovány přímo do studované živé tkáně nebo orgánu. Mikrodialyzační sondou kontinuálně protéká fyziologický roztok, který je přes selektivní membránu obohacován o studované metabolity z živé tkáně. Účinnost mikrodialýzy je zajištěna pouze při malých průtokových rychlostech a výsledkem jsou mikrolitrová množství odebraného mikrodialyzátu, ve kterých je potřeba provést chemickou analýzu.

V mnoha oblastech lidské činnosti vyvstává aktuální potřeba provádět alespoň orientační chemickou analýzu přímo v místě výskytu a odběru vzorku. Typickými příklady může být analýza krve, moče, popřípadě mikrodialyzátů tkání přímo u lůžka pacienta pro potřebu rychlého stanovení diagnózy nebo pro účely průběžného monitorování zdravotního stavu, dále při fyziologických a farmakologických studiích. Taková zařízení však nejsou známá.

Úkolem tohoto vynálezu je proto vytvoření zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků, které by umožňovalo chemickou analýzu přímo v místě výskytu a odběru vzorku, a to i malého množství

- 1 CZ 2019 - 262 A3 vzorku, se kterým se obtížně manipuluje a vhodnějším přístupem se jeví přímá analýza roztoku vytékajícího z mikrodialyzační sondy, kterou je právě možné realizovat prostřednictvím elektroforetické separace prováděné v kapilárách o malém vnitřním průměru.

Podstata vynálezu

Vytčený úkol je vyřešen pomocí zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků podle tohoto vynálezu. Zařízení zahrnuje separační kapiláru, bezkontaktní vodivostní detektor, vysokonapěťovou elektrodu, zemnicí elektrodu, řídicí a vyhodnocovací jednotku pro sběr a vyhodnocení dat a plnicí zařízení pro transport základního elektrolytu anglicky background electrolyte neboli BGE do separační kapiláry.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že zařízení dále zahrnuje dávkovač pro sekvenční dávkování vzorků do separační kapiláry, který má průtokové potrubí pro průtok základního elektrolytu tvořené vstupní větví napojenou na rezervoár základního elektrolytu, který je součástí plnicího zařízení, výstupní větví pro odtok základního elektrolytu, a střední větví, ve které je proti sobě uspořádána dávkovači kapilára pro přívod vzorku a separační kapilára. Kapiláry jsou proti sobě uspořádané tak, že výstupní ústí dávkovači kapiláry je otevřené ve směru proti průtoku základního elektrolytu, základní elektrolyt tedy protéká proti výstupnímu ústí dávkovači kapiláry, a vstupní ústí separační kapiláry je umístěno přímo proti výstupnímu ústí dávkovači kapiláry. Tok základního elektrolytu tak od vstupního ústí separační kapiláry odklání roztok vzorku tekoucí z dávkovači kapiláry. Mezi ústími kapilár je mezera o šířce 1 = od 300 do 800 pm. Vstup dávkovači kapiláry je vyústěn mimo průtokové potrubí a je upraven pro vstup vzorku, výstup separační kapiláry je vyústěn mimo průtokové potrubí a je vyveden do koncové nádoby opatřené vysokonapěťovou elektrodou a připojené na zdroj podtlaku. Před vstupem do koncové nádoby prochází separační kapilára bezkontaktním vodivostním detektorem.

Před nadávkováním kapalného vzorku do separační kapiláry je na definovanou dobu zastaven tok základního elektrolytu představující řídicí kapalinu. U vstupního ústí separační kapiláry se vytvoří zóna kapalného vzorku, z níž je vzorek do separační kapiláry nadávkován prostřednictvím vytvořeného podtlaku v koncové nádobě. Po nadávkování vzorku do separační kapiláry je tok základního elektrolytu průtokovým potrubím obnoven, vzorek je od vstupu do separační kapiláry odplaven a následně je v separační kapiláře s nadávkovaným vzorkem zahájena elektroforetická separace zapnutím vysokonapěťového zdroje, resp. přivedením napětí na vysokonapěťovou elektrodu. Ve výstupní větvi průtokového potrubí je umístěna zemnicí elektroda a zároveň je výstupní větev propojena s měřičem doby mezi dvěma kapkami průtoku základního elektrolytu. Zařízení je výhodně sestaveno ve formě kompaktního a mobilního přístroje a umožňuje provádět elektroforetickou analýzu přímo v místě odběru kapalného vzorku v tzv. uspořádání on-line. Součástí zařízení může být USB digitální mikroskop pro sledování toku kapalin v průtokovém potrubí v místě, kde jsou proti sobě uspořádána výstupní ústí dávkovači kapiláry a vstupní ústí separační kapiláry. Mikroskopem sledované místo je osvětlováno vestavěnou LED zářivkou a před proměnlivým externím osvětlením chráněno clonou.

Součástí zařízení ve výhodném provedení je měřič doby mezi dvěma kapkami základního elektrolytu s optickým senzorem pro určení průtokové rychlosti základního elektrolytu průtokovým potrubím. Z měřiče dále vychází odpad vytvořený jako výstup základního elektrolytu. Měřič je uspořádán v samostatném pouzdře. Je realizován na dvou deskách s tištěným plošným spojem a spojen kabelem s optickým senzorem padající kapky. Údajem měřiče je nespecifikovaný počet pulsů naměřený v době mezi dvěma kapkami. Vztah mezi uvedeným údajem a průtokovou rychlostí základního elektrolytu musí být určen experimentálně.

-2 CZ 2019 - 262 A3

Plnicí zařízení je s výhodou opatřeno přívodem základního elektrolytu z reservoáru základního elektrolytu přes čisticí filtr, piezoelektrickou mikropumpu, ventil základního elektrolytu, pomocný ventil a zpětný ventil.

Zdroj podtlaku je ve výhodném uspořádání napojen na reservoár podtlaku a přes vakuový ventil dále napojen do koncové nádobky. Vytváření podtlaku v definovaných časových intervalech zajišťuje načasování nadávkování kapalného vzorku do separační kapiláry před zahájením elektroforetické separace.

S výhodou je na vstup dávkovači kapiláry napojena mikrodialyzační souprava sestávající z mikrodialyzační sondy a zásobníku nosné kapaliny. Mikrodialyzační sonda je jednou z výhodných možností, jakým způsobem lze připravit či upravit analyzovaný vzorek před samotnou elektroforetickou separací. Zařízení umožňuje převádět neboli sekvenovat kontinuální tok roztoku vzorku z mikrodialyzační sondy na dávky vhodné pro dávkování do elektroforetické, tedy separační kapiláry.

Jednotlivé součásti zařízení jsou ovládány elektronicky a jsou napájeny běžným síťovým zdrojem. Řídicí a vyhodnocovací jednotka je ve výhodném provedení napojena na zásobník nosné kapaliny, piezoelektrickou mikropumpu, ventil základního elektrolytu, pomocný ventil, bezkontaktní vodivostní detektor, vysokonapěťovou elektrodu, vakuový ventil a zdroj podtlaku. Řídicí a vyhodnocovací jednotka obsahuje software pro sběr a vyhodnocení dat a pro ovládání pohyblivých prvků zařízení.

Výhody zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků podle tohoto vynálezu spočívají zejména vtom, že umožňuje přímou chemickou analýzu malého množství kapalného vzorku, a to i v místě výskytu a odběru vzorku, se kterým se obtížně manipuluje. Přímou chemickou analýzu je právě možné realizovat prostřednictvím elektroforetické separace prováděné v kapilárách o malém vnitřním průměru.

Objasnění výkresů

Uvedený vynález bude blíže objasněn na následujících vyobrazeních, kde:

obr. 1 znázorňuje schéma zařízení, obr. 2 znázorňuje schéma dávkovače, obr. 3 znázorňuje schéma dávkovacího procesu, obr. 4 znázorňuje graf doby dávkování vzorku do separační kapiláry, obr. 5 znázorňuje elektroferogramy testovací směsi kationtů, obr. 6 znázorňuje tabulku se statistickým hodnocení ploch píků testovaných analytů z deseti opakovaných měření.

Příklady uskutečnění vynálezu

Zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků podle tohoto vynálezu, jehož schéma je znázorněné na obr. 1, zahrnuje jako vstupní část mikrodialyzační sondu 2, jíž kontinuálně protéká nosná kapalina ze

-3 CZ 2019 - 262 A3 zásobníku 1 nosné kapaliny. Mikrodialyzační sonda 2 je napojena na vstup 31 dávkovači kapiláry 25. Dávkovači kapilára 25 je uspořádána v průtokovém potrubí 28. jakožto součásti dávkovače 3 pro sekvenční dávkování vzorků do separační kapiláry 4. Průtokové potrubí 28, kterým protéká základní elektrolyt, je tvořeno vstupní větví 22, střední větví 21 a výstupní větví 24. Střední větev 21 je vodorovně orientovaná, vstupní větev 22 je zalomená nahoru a výstupní větev 24 ie zalomená dolů, jak je znázorněno na obr. 2. Na vstupní větev 22 je napojen výstup plnicího zařízení 27, odkud dochází ke vstupu základního elektrolytu do průtokového potrubí 28. Ve střední větvi 21 průtokového potrubí 28 je umístěna dávkovači kapilára 25 a také separační kapilára 4. Ve výstupní větvi 24 je umístěna zemnicí elektroda 17.

Dávkovači kapilára 25 a separační kapilára 4 jsou tenké kapiláry s malým vnitřním průměrem uspořádané proti sobě. Výstupní ústí 29 dávkovači kapiláry 25 a vstupní ústí 30 separační kapiláry 4 jsou naproti sobě a mezi nimi je vytvořena mezera m. Základní elektrolyt, který vstupuje do průtokového potrubí 28 vstupní větví 22, obtéká dávkovači kapiláru 25, jejíž výstupní ústí 29 je otevřeno ve směru proti průtoku základního elektrolytu, separační kapiláru 4, jejíž vstupní ústí 30 je otevřeno ve směru průtoku základního elektrolytu, a protéká také mezerou m mezi kapilárami 4, 25. Vstup 31 dávkovači kapiláry 25 a výstup 26 separační kapiláry 4 jsou vyústěny mimo průtokové potrubí 28 na opačných stranách střední větve 21.

Plnicí zařízení 27 zaústěné do vstupní větve 22 průtokového potrubí 28 sestává z rezervoáru 11 základního elektrolytu, který je vytvořen jako plastová nádoba, dále sestává z čisticího filtru 12, piezoelektrické mikropumpy 13. ventilu 14 základního elektrolytu, což je třícestný elektromagneticky ovládaný ventil, pomocného ventilu 15, což je třícestný automaticky či ručně ovládaný ventil, a ze zpětného ventilu 16. Piezoelektrická mikropumpa 13, ventil 14 základního elektrolytu a pomocný ventil 15 jsou napojené na řídicí a vyhodnocovací jednotku 20.

Separační kapilára 4 má svůj výstup 26 mimo průtokové potrubí 28, dále prochází prostřednictvím vstupu 23 bezkontaktním vodivostním detektorem 5 a poté je svým výstupem 26 vyvedena do koncové nádoby 6, ve které je umístěna vysokonapěťová elektroda 7. Do koncové nádoby 6 je vyveden vakuový ventil 8 propojený s rezervoárem 9 podtlaku a zdrojem 10 podtlaku. Bezkontaktní vodivostní detektor 5, vysokonapěťová elektroda 7, zdroj 10 podtlaku a vakuový ventil 8 jsou také napojeny na řídicí a vyhodnocovací jednotku 20.

Výstupní větev 24 průtokového potrubí 28 je propojena s měřičem 18 doby mezi dvěma kapkami průtoku základního elektrolytu, který je dále opatřen výstupem 19 základního elektrolytu.

Bylo zjišťováno, zda navržený zdroj 10 podtlaku, konkrétně vakuová mikropumpa v kombinaci se 100 ml reservoárem 9 podtlaku je schopen zajistit potřebný podtlak v koncové nádobě 6 pro dávkování kapalného vzorku do separační kapiláry 4 a zároveň i pro promývání separační kapiláry 4 po ukončení separace. Výsledky testování jsou znázorněny na obr. 4, kde je znázorněna doba dávkování, resp. doba aktivace vakuového ventilu 8, což je graf závislosti negativního tlaku v koncové nádobě 6 v mbar na čase v minutách. Je zřejmé, že při prakticky použitelných dobách dávkování, 0,5 až 1,5 s, je průběh podtlakového pulsu přijatelný.

Zařízení bylo testováno dávkováním a separací modelové směsi kationtů draslíku K⁺, sodíku Na⁺ a aminokyseliny argininu Arg⁺ o ekvimolámí koncentraci 100 μΜ. Základní elektrolyt, BGE, byl vodný roztok 20 mM MES + 5 mM LiOH (pH 5,9). Parametry experimentu: křemenná separační kapilára 4, vnitřní průměr 25 pm, délka celková/k detektoru 5 15/10 cm; separační napětí/proud, 10 kV/2 až 3 pA;

vzorek byl kontinuálně dávkován lineární pumpou rychlostí 5 pL min¹; průtok řídicího BGE 160 mL min¹;

Schéma sekvenovaného dávkovacího procesu je znázorněno na obr. 3, kdy v čase 1 je zastaven tok základního elektrolytu na dobu a. V čase 2 je generován dávkovači podtlakový puls v koncové nádobě 6 na dobu bav čase 3, po krátké době c, potřebné k odplavení zóny vzorku od

-4 CZ 2019 - 262 A3 vstupního ústí 30 separační kapiláry 4, je zahájena separace přivedením napětí na vysokonapěťovou elektrodu 7;

doba zastavení BGE (čas a), 15 s;

doba dávkování vzorku do kapiláry (čas b), 0,5 s;

odklad zapnutí VN po nadávkování (čas c), 5 s.

Testovány byly dvě varianty vnitřního průměru střední větve 21 průtokového potrubí 28:

a) varianta A - průměr střední větve 21 je 1,5 mm;

b) varianta B - do střední větve 21 vložena skleněná trubička (vnější průměr 1,5 mm, délka 4 mm), průměr zmenšen na 1 mm.

Ilustrační elektroferogramy testovací směsi kationtů získané oběma variantami jsou znázorněny na obr. 5. Ekvimolámí koncentrace 100 μΜ K⁺, Na⁺ a Arg⁺, BGE, 20 mM MES + 5 mM Li OH. A - vnitřní průměr střední větve 21 1,5 mm, délka 1 mezery m od výstupního ústí 29 dávkovači kapiláry 25 do vstupního ústí 30 separační kapiláry 4 je 700 pm. B - vnitřní průměr střední větve 21 1 mm, délka 1 mezery m od výstupního ústí 29 dávkovači kapiláry 25 do vstupního ústí 30 separační kapiláry 4 je 390 pm.

V tabulce na obr. 6 jsou uvedeny plochy píků testovaných kationtů zjištěné vyhodnocením elektroferogramů desetkrát nadávkovaného vzorku. Z údajů v tabulce vyplývá, že zmenšení průměru střední větve 21 průtokového potrubí 28 se příznivě projevuje na přesnosti dávkování.

Průmyslová využitelnost

Zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků lze využít zejména pro on-line monitorování složení tělních tekutin při medicínských a farmakologických studiích, ale také při potravinářských, environmentálních a průmyslových aplikacích.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zařízení pro sekvenční elektroforetickou analýzu klinických, potravinářských, environmentálních a průmyslových kapalných vzorků, zahrnující separační kapiláru (4), bezkontaktní vodivostní detektor (5), vysokonapěťovou elektrodu (7), zemnicí elektrodu (17), řídicí a vyhodnocovací jednotku (20) pro sběr a vyhodnocení dat a plnicí zařízení (27) pro transport základního elektrolytu do separační kapiláry (4), vyznačující se tím, že dále zahrnuje dávkovač (3) pro sekvenční dávkování vzorků do separační kapiláry (4), který má průtokové potrubí (28) pro průtok základního elektrolytu tvořené vstupní větví (22) napojenou na výstup plnicího zařízení (27), výstupní větví (24) pro odtok základního elektrolytu, a střední větví (21), ve které je proti sobě uspořádána dávkovači kapilára (25) pro dávkování vzorku a separační kapilára (4) tak, že výstupní ústí (29) dávkovači kapiláry (25) je otevřené ve směru proti průtoku základního elektrolytu, vstupní ústí (30) separační kapiláry (4) je otevřené ve směru průtoku základního elektrolytu a mezi ústími (29, 30) kapilár (25, 4) je mezera (m) o šířce 1 = od 300 do 800 pm, přičemž vstup (31) dávkovači kapiláry (25) je vyústěn mimo průtokové potrubí (28) a je upraven pro vstup vzorku, a výstup (26) separační kapiláry (4) je vyústěn mimo průtokové potrubí (28), separační kapilára (4) dále prochází bezkontaktním vodivostním detektorem (5) a je svým výstupem (26) vyvedena do koncové nádoby (6) opatřené vysokonapěťovou elektrodou (7) a připojené na zdroj (10) podtlaku, přičemž ve výstupní větvi (24) je uspořádána zemnicí

   -5 CZ 2019 - 262 A3 elektroda (17) a zároveň je výstupní větev (24) propojena s měřičem (18) doby mezi dvěma kapkami průtoku základního elektrolytu.
2. 2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že měřič (18) doby mezi dvěma kapkami základního elektrolytu je opatřen optickým senzorem pro určení průtokové rychlosti základního elektrolytu průtokovým potrubím a dále je opatřen výstupem (19) základního elektrolytu.
3. 3. Zařízení podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že plnicí zařízení (27) je opatřeno přívodem základního elektrolytu z reservoáru (11) základního elektrolytu přes čisticí filtr (12), piezoelektrickou mikropumpu (13), ventil (14) základního elektrolytu, pomocný ventil (15) a zpětný ventil (16).
4. 4. Zařízení podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že zdroj (10) podtlaku je napojen na reservoár (9) podtlaku a vakuový ventil (8) napojený do koncové nádoby (6).
5. 5. Zařízení podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že na vstup (31) dávkovači kapiláry (25) je napojena mikrodialyzační souprava sestávající z mikrodialyzační sondy (2) a zásobníku (1) nosné kapaliny.
6. 6. Zařízení podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že řídicí a vyhodnocovací jednotka (20) je napojena na zásobník (1) nosné kapaliny, piezoelektrickou mikropumpu (13), ventil (14) základního elektrolytu, pomocný ventil (15), bezkontaktní vodivostní detektor (5), vysokonapěťovou elektrodu (7), vakuový ventil (8) a zdroj (10) podtlaku, a obsahuje software pro sběr a vyhodnocení dat a pro ovládání pohyblivých prvků zařízení.
7. 7. Zařízení podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že je přenosné.