CZ2018190A3

CZ2018190A3 - A method of preparation of stromal vascular fraction of adipose tissue cells

Info

Publication number: CZ2018190A3
Application number: CZ2018-190A
Authority: CZ
Inventors: Tomáš Kaško; Serhiy Forostyak
Original assignee: Národní Centrum Tkání A Buněk A.S.
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2019-04-10
Also published as: CZ307750B6

Abstract

Předkládané řešení poskytuje způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně z adipózní tkáně, při němž se adipózní tkáň podrobí ultrazvukové kavitaci a následné centrifugaci, kde se adipózní tkáň před a/nebo po ultrazvukové kavitaci promyje roztokem monosacharidu nebo disacharidu. Promývání sacharidy namísto obvyklého promývání roztokem chloridu sodného či nepromytí materiálu vede ke zvýšení viability buněk. Dále se promytím sacharidy spolehlivě odstraní zbytky a komponenty krve, což vede ke snížení rizika nežádoucích účinků přípravků obsahujících SVF buňky u pacientů.The present invention provides a method of preparing adipose tissue cell stromal vascular fraction of adipose tissue by subjecting adipose tissue to ultrasonic cavitation and subsequent centrifugation, wherein the adipose tissue is washed with a monosaccharide or disaccharide solution before and / or after ultrasound cavitation. Washing carbohydrates instead of the usual washing with sodium chloride solution or washing the material leads to increased cell viability. Furthermore, washing of carbohydrates reliably removes residuals and blood components, resulting in reduced risk of adverse effects of SVF cell preparations in patients.

Description

Oblast technikyTechnical field

Předkládaný vynález poskytuje zlepšený způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně.The present invention provides an improved method for preparing the stromal vascular fraction of adipose tissue cells.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Adipózní tkáň je pojivová tkáň sestávající převážně z adipocytů. Kromě adipocytů obsahuje buňky stromální vaskulární frakce obsahující regenerativně cenné buňky, a také imunitní buňky včetně makrofágů adipózní tkáně. Úkolem adipózní tkáně je skladovat energii ve formě lipidů, poskytnout tepelnou izolaci organismu, a chránit některé orgány proti mechanickému poškození.Adipose tissue is connective tissue consisting predominantly of adipocytes. In addition to adipocytes, the cells contain stromal vascular fractions containing regeneratively valuable cells, as well as immune cells, including adipose tissue macrophages. The role of adipose tissue is to store energy in the form of lipids, provide thermal insulation for the body, and protect some organs from mechanical damage.

Stromální vaskulární frakce (SVF) buněk se izoluje z adipózní tkáně, například odebrané v rámci liposukcí. SVF je zdrojem preadipocytů, mesenchymálních kmenových buněk a endotheliálních progentorových buněk. Tyto buňky mají velký terapeutický a regenerační potenciál. Je tedy zapotřebí vyvíjet metody izolace těchto buněk, které vedou k produktům splňujícím striktní požadavky na medicínské přípravky pro podání pacientům.The stromal vascular fraction (SVF) of the cells is isolated from adipose tissue, for example, collected by liposuction. SVF is a source of preadipocytes, mesenchymal stem cells and endothelial progentor cells. These cells have great therapeutic and regenerative potential. Thus, there is a need to develop methods for isolating these cells which lead to products meeting the strict requirements of medical preparations for administration to patients.

Izolace stromální vaskulární frakce zahrnuje krok rozrušení tkáně, který se může provádět enzymaticky nebo mechanicky. Enzymatické metody jsou účinné, ale zahrnují rizika poškození některých typů buněk, kontaminace buněk enzymy není vhodná pro terapeutické aplikace, zejména není vhodná pro transplantaci, a regulatomí orgány považují takto získané buňky za biotechnologicky upravené, takže vyžadují specifické regulatomí procesy pro schválení takto získaných přípravků.Isolation of the stromal vascular fraction comprises a tissue disruption step that may be performed enzymatically or mechanically. Enzymatic methods are effective but involve the risk of damage to certain types of cells, enzyme contamination of cells is not suitable for therapeutic applications, particularly not suitable for transplantation, and regulatory authorities consider the cells thus obtained to be biotechnologically modified, thus requiring specific regulatory processes for the approval of such products.

Mechanické metody spočívající v třepání a centrifugaci vedou k nízkému výtěžku SVF buněk. Později byly zveřejněny patentové přihlášky US 2012/0164113, WO 2014/000031 a WO 2014/015229, které popisují izolaci SVF z adipózní tkáně mechanickou cestou pomocí ultrasonické kavitace. Ultrasonická příprava SVF buněk dovoluje dosáhnout poměrně vysokých výtěžků. Regulatomí orgány považují takto získané přípravky za „minimálně manipulované“. Dokument WO 2014/138383 v odst. 0173 zmiňuje, že ponechání hematopoietických faktorů a dalších krevních komponent prodlužuje viabilitu buněk, a výslovně uvádí, že ultrasonické metody přípravy tyto komponenty v přípravku ponechávají.Mechanical methods of shaking and centrifugation result in low yield of SVF cells. Later, patent applications US 2012/0164113, WO 2014/000031 and WO 2014/015229 disclose the isolation of SVF from adipose tissue by mechanical means by ultrasonic cavitation. The ultrasonic preparation of SVF cells makes it possible to achieve relatively high yields. Regulatory authorities consider the products thus obtained to be 'minimally handled'. WO 2014/138383 in paragraph 0173 mentions that retention of hematopoietic factors and other blood components prolongs cell viability, and explicitly states that ultrasonic methods of preparation leave these components in the formulation.

Předkládaný vynález přináší zlepšení postupů využívajících ultrasonické kavitace, přičemž si klade za úkol zvýšení viability buněk a snížení rizika nežádoucích účinků přípravků obsahujících SVF buňky u pacientů (nežádoucí účinky s vyšší incidencí jsou zejména edém a erytém).SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides improvements in ultrasonic cavitation procedures by increasing the viability of cells and reducing the risk of adverse effects of SVF cell formulations in patients (adverse events with a higher incidence are especially edema and erythema).

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy stromální vaskulární frakce buněk adipózní tkáně z adipózní tkáně, při němž se adipózní tkáň podrobí ultrazvukové kavitaci a následné centrifugaci, a jehož podstata spočívá v tom, že se adipózní tkáň před a/nebo po ultrazvukové kavitaci promyje roztokem monosacharidu nebo disacharidu pro odstranění krevních komponent.It is an object of the present invention to provide a stromal vascular fraction of adipose tissue cells from adipose tissue, in which the adipose tissue is subjected to ultrasonic cavitation and subsequent centrifugation, comprising adipose tissue washing prior to and / or after ultrasonic cavitation with a monosaccharide solution; disaccharide to remove blood components.

Monosacharidem je s výhodou glukóza. Disacharidem je s výhodou neredukující disacharid, výhodněji sacharóza.The monosaccharide is preferably glucose. The disaccharide is preferably a non-reducing disaccharide, more preferably sucrose.

Ultrazvuková kavitace se s výhodou provádí pomocí sonikátoru. Sonikátory jsou komerčněThe ultrasonic cavitation is preferably performed using a sonicator. Sonicators are commercial

- 1 CZ 2018 - 190 A3 dostupné přístroje, obvykle vybavené sondou emitující ultrazvukové signály.A3 instruments available, usually equipped with a probe emitting ultrasonic signals.

Ve výhodném provedení se ultrazvuková kavitace provádí při energii 20 až 70 W, s výhodou 40 až 60 W, výhodněji asi 50 W; hodnotě cyklu 30 až 70 %, s výhodou 40 až 60 % nebo asi 50 %; a době sonikace alespoň 60 sekund, s výhodou alespoň 90 sekund, nej výhodněji 90 až 150 sekund.In a preferred embodiment, the ultrasonic cavitation is performed at an energy of 20 to 70 W, preferably 40 to 60 W, more preferably about 50 W; a cycle value of 30 to 70%, preferably 40 to 60% or about 50%; and a sonication time of at least 60 seconds, preferably at least 90 seconds, most preferably 90 to 150 seconds.

Ultrazvuková kavitace se s výhodou provádí tak, že se sonda ultrazvukového sonikátoru vloží do adipózní tkáně tak, aby byla ponořená ve spodní polovině adipózní tkáně, provede se sonikace po polovinu stanoveného času, a následně se sonda ultrazvukového sonikátoru vloží do adipózní tkáně tak, aby byla ponořená v horní polovině adipózní tkáně, a provede se sonikace po druhou polovinu stanoveného času. Adipózní tkáň je při sonikaci obvykle umístěna ve zkumavce.The ultrasonic cavitation is preferably performed by inserting the ultrasonic sonicator probe into the adipose tissue so that it is immersed in the lower half of the adipose tissue, sonication for half a specified time, and then inserting the ultrasonic sonicator probe into the adipose tissue submerged in the upper half of the adipose tissue, and sonicated for the second half of the set time. Adipose tissue is usually placed in a tube during sonication.

Promytí roztokem monosacharidu nebo disacharidu se s výhodou provádí před ultrazvukovou kavitací, a výhodněji před kavitací i po ní. Může se použít standardní roztok glukózy nebo sacharózy o koncentraci 5 hmotn. %. Může se například použít roztok glukózy nebo sacharózy o koncentraci 2 až 10 hmotn. %.The washing with the monosaccharide or disaccharide solution is preferably carried out before ultrasonic cavitation, and more preferably before and after cavitation. A standard glucose or sucrose solution of 5 wt. %. For example, a glucose or sucrose solution having a concentration of 2 to 10 wt. %.

Centrifůgaci lze provádět například při 900 až 1500 rpm, s výhodou při 1200 až 1000 rpm.Centrifugation can be carried out, for example, at 900 to 1500 rpm, preferably at 1200 to 1000 rpm.

Následně po centrifůgaci lze produkt dále zpracovávat, například rozdispergováním peletu buněk v izotonickém roztoku, jako je 0,9% (hmotn.) roztok NaCl.Following centrifugation, the product may be further processed, for example, by dispersing the cell pellet in an isotonic solution, such as a 0.9% NaCl solution.

Další možný způsob zpracování produktu zahrnuje následně po centrifůgaci odebrání a uschování tukové tkáně z produktu po centrifůgaci, rozdispergování peletu buněk v izotonickém roztoku, jako je 0,9% (hmotn.) roztok NaCl, centrifůgaci této suspenze, odstranění supematantu, a následné resuspendaci peletu buněk v tukové tkáni odebrané z produktu po centrifůgaci. Tuto tukovou tkáň lze po jejím odebrání a před resuspendaci pelet zpracovat sonikaci a/nebo filtrací přes síto o velikosti ok 400 až 700 mikrometrů.Another possible method of processing the product comprises, after centrifugation, removing and retaining adipose tissue from the product after centrifugation, dispersing the cell pellet in an isotonic solution, such as 0.9% NaCl solution, centrifuging the suspension, removing the supernatant, and then resuspending the pellet. cells in adipose tissue collected from the product after centrifugation. The adipose tissue may be sonicated and / or filtered through a 400 to 700 micron mesh screen after removal and prior to resuspension of the pellets.

Ve výhodném provedení obsahuje postup kroky:In a preferred embodiment, the process comprises the steps of:

a. promytí adipózní tkáně roztokem monosacharidu nebo disacharidu, s výhodou roztokem glukózy nebo sacharózy, výhodněji 5% (hmotn.) roztokem glukózy nebo sacharózy,washing the adipose tissue with a monosaccharide or disaccharide solution, preferably a glucose or sucrose solution, more preferably a 5% (w / w) glucose or sucrose solution,

b. ultrazvuková kavitace se sondou ponořenou ve spodní polovině adipózní tkáně, s výhodou při 50 W a 50% cyklu po dobu alespoň 50 sekund,b. ultrasonic cavitation with a probe submerged in the lower half of adipose tissue, preferably at 50 W and 50% cycle for at least 50 seconds,

c. ultrazvuková kavitace se sondou ponořenou v horní polovině adipózní tkáně, s výhodou při 50 W a 50% cyklu po dobu alespoň 50 sekund,c. ultrasonic cavitation with a probe submerged in the upper half of the adipose tissue, preferably at 50 W and 50% cycle for at least 50 seconds,

d. centrifůgace produktu kroku c., s výhodou při 1100 až 1300 rpm, s výhodou po dobu 5 minut,d. centrifuging the product of step c., preferably at 1100 to 1300 rpm, preferably for 5 minutes,

e. odstranění tukové vrstvy a přidání roztoku monosacharidu nebo disacharidu, s výhodou roztoku glukózy nebo sacharózy, výhodněji 5% (hmotn.) roztoku glukózy nebo sacharózy,e. removing the fat layer and adding a solution of a monosaccharide or disaccharide, preferably a glucose or sucrose solution, more preferably a 5% (w / w) glucose or sucrose solution,

f. centrifůgace, s výhodou při 900 až 1100 rpm, s výhodou po dobu 5 minut;f. centrifugation, preferably at 900 to 1100 rpm, preferably for 5 minutes;

g. dispergace peletu v 0,9% roztoku NaCl;g. dispersing the pellet in 0.9% NaCl solution;

h. volitelně centrifůgace suspenze získané v kroku g., odstranění supematantu, a následná resuspendace peletu buněk v tukové tkáni.h. optionally centrifuging the suspension obtained in step g., removing the supernatant, and then resuspending the cell pellet in the adipose tissue.

S výhodou lze před započetím zpracování odebrané adipózní tkáně provést mikrobiální kontrolu pro vyloučení rizika mikrobiální kontaminace tkáně.Advantageously, a microbial control may be performed prior to commencing processing of the collected adipose tissue to avoid the risk of microbial contamination of the tissue.

-2CZ 2018 - 190 A3-2GB 2018 - 190 A3

V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že v postupech využívajících ultrasonické kavitace vede promývání sacharidy namísto obvyklého promývání roztokem chloridu sodného či nepromytí materiálu ke zvýšení viability buněk. Dále se promytím sacharidy spolehlivě odstraní zbytky a komponenty krve, což vede ke snížení rizika nežádoucích účinků přípravků obsahujících SVF buňky u pacientů, jako jsou edémy, erytémy, či nežádoucí alergické a imunitní reakce na komponenty krve.In the present invention, it has been found that in processes utilizing ultrasonic cavitation, washing with carbohydrates instead of conventional washing with sodium chloride solution or non-washing of the material results in increased cell viability. Furthermore, carbohydrate washing reliably removes debris and blood components, leading to a reduction in the risk of adverse effects of SVF cell preparations in patients such as edema, erythema, or unwanted allergic and immune reactions to blood components.

Příklady uskutečnění vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

Adipózní tkáň odebraná při liposukci byla nejprve podrobena mikrobiální kultivační kontrole. Pokud není prokázána přítomnost mikrobiální kontaminace, může být adipózní tkáň podrobena dalšímu zpracování. Adipózní tkáň byla proplachována 5 % (hmotn.) glukózy až do vizuálního potvrzení odstranění zbytků krve z adipózní tkáně. Následně byla pročištěná adipózní tkáň alikvotována do sterilních 50ml zkumavek tak, aby byl v každé zkumavce objem 20 ml.The adipose tissue collected during liposuction was first subjected to microbial culture control. If there is no evidence of microbial contamination, the adipose tissue may be subjected to further processing. The adipose tissue was flushed with 5% (w / w) glucose until visual confirmation of removal of blood residue from the adipose tissue. Subsequently, the purified adipose tissue was aliquoted into sterile 50 ml tubes to give a volume of 20 ml in each tube.

Do každé zkumavky byla postupně ponořena sonda ultrazvukového sonikátoru, tak aby špička sondy byla ponořená ve spodní polovině adipózní tkáně. Na ultrazvukovém sonikátoru byla nastavena energie na hodnotu 50 W a cyklus na hodnotu 50 %, a časový limit na hodnotu 60 sekund a přístroj byl spuštěn.An ultrasonic sonicator probe was gradually immersed in each tube so that the tip of the probe was immersed in the lower half of the adipose tissue. On the ultrasonic sonicator, the energy was set at 50 W and the cycle at 50%, and the timeout was set at 60 seconds and the instrument was started.

Po uplynutí časového limitu sonikace byla sonda ultrazvukového sonikátoru přesunuta tak, aby špička sondy byla ponořená v horní polovině adipózní tkáně. Na ultrazvukovém sonikátoru byla nastavena energie na hodnotu 50 W a cyklus na hodnotu 50 %, a časový limit na hodnotu 60 sekund a přístroj byl spuštěn.After the sonication timeout, the ultrasonic sonicator probe was moved so that the probe tip was submerged in the upper half of the adipose tissue. On the ultrasonic sonicator, the energy was set at 50 W and the cycle at 50%, and the timeout was set at 60 seconds and the instrument was started.

Po dokončení ultrazvukové sonikace (kavitace) se provedla centrifůgace vzorků na přístroji Hettich Rotina 380R pro izolaci SVF při 1200 rpm/5 min při pokojové teplotě, (rpm = ot/min)Upon completion of ultrasonic sonication (cavitation), centrifugation of samples was performed on a Hettich Rotina 380R for SVF isolation at 1200 rpm / 5 min at room temperature, (rpm = rpm).

Po centrifůgaci byla opatrně odstraněna lipidová vrstva. Ke zbytku adipózní tkáně bylo přidáno 10 ml 5% roztoku glukózy a centrifůgace byla opakována při 1000 rpm/5 min při pokojové teplotě.After centrifugation, the lipid layer was carefully removed. 10 ml of 5% glucose solution was added to the rest of the adipose tissue and centrifugation was repeated at 1000 rpm / 5 min at room temperature.

Po centrifůgaci byl opatrně odstraněn supernatant, zbylá tuková tkáň přesunuta do 50 ml zkumavky a proveden pooling všech buněčných peletů v 5,1 ml 0,9% roztoku NaCl.After centrifugation, the supernatant was carefully removed, the remaining adipose tissue was transferred to a 50 ml tube and pooled of all cell pellets in 5.1 ml of 0.9% NaCl solution.

Příklad 2Example 2

Byl proveden postup jako v Příkladu 1, ale suspenze buněčných peletů v roztoku NaCl získaná v posledním kroku Příkladu 1 byla následně centrifugo vána při 900 rpm/5 min při pokojové teplotě a byl odstraněn supernatant za vzniku peletu buněk.The procedure was as in Example 1, but the cell pellet suspension in NaCl solution obtained in the last step of Example 1 was subsequently centrifuged at 900 rpm / 5 min at room temperature and the supernatant was removed to form a cell pellet.

Mezitím byla tuková tkáň odebraná v posledním kroku Příkladu 1 sonikována tak, že se do ní ponořila špička sondy ultrazvukového sonikátoru (cca doprostřed), na ultrazvukovém sonikátoru byla nastavena energie na hodnotu 40 W a cyklus na hodnotu 40 %, a časový limit na hodnotu 60 sekund a přístroj byl spuštěn. Následně bylo na zkumavku nasazeno 500 pm buněčné síto a trychtýř pro filtraci tukové tkáně.Meanwhile, the adipose tissue collected in the last step of Example 1 was sonicated by dipping the tip of the ultrasonic sonicator probe (approximately in the middle), setting the energy at 40 W and the cycle at 40%, and the time limit at 60 seconds and the device was started. Subsequently, a 500 µm cell sieve and a funnel for adipose tissue filtration were mounted on the tube.

Z přefiltrované tukové tkáně byl odebrán objem podle požadované velikosti přípravku, a v něm byl resuspendován pelet buněk.A volume was removed from the filtered adipose tissue according to the desired size of the preparation, and the cell pellet was resuspended.

-3 CZ 2018 - 190 A3-3 EN 2018 - 190 A3

Příklad 3Example 3

Pro demonstraci účinku promývání sacharidy byly provedeny srovnávací příklady a porovnání viability buněk. Experimenty se lišily v činidlech použitých k promývání materiálu, jinak se jednalo o stejný postup jako v Příkladu 1 (v Příkladu 1 byl pro promývání použit 5% roztok glukózy).Comparative examples and cell viability comparisons were performed to demonstrate the carbohydrate wash effect. The experiments differed in the reagents used to wash the material, otherwise it was the same procedure as in Example 1 (in Example 1 a 5% glucose solution was used for washing).

Každý experiment byl zopakován ΙΟχ. V první skupině experimentů byl k promývání použit 0,9% roztok NaCl. V druhé skupině experimentů byl k promývání použit 5% roztok glukózy. Ve třetí skupině experimentů byl k promývání použit 5% roztok sacharózy. Roztoky jsou vodné roztoky, údaje v % jsou v hmotnostních %.Each experiment was repeated ΙΟχ. In the first group of experiments, a 0.9% NaCl solution was used for washing. In the second group of experiments, a 5% glucose solution was used for washing. In the third group of experiments 5% sucrose solution was used for washing. Solutions are aqueous solutions,% by weight.

Následující tabulka uvádí výsledky stanovení viability buněk pro jednotlivé skupiny experimentů lišící se promývacím činidlem (viabilita je uvedena jako % živých buněk vzhledem k celkovému množství přítomných buněk):The following table shows the results of the cell viability determination for each group of experiments with different washing agent (viability is given as% living cells relative to the total number of cells present):

Promývání Washing 1. 1. 2. 2. 3. 3. 4. 4. 5. 5. 6. 6. 7. 7. 8. 8. 9. 9. 10. 10. Průměr Diameter Rozptyl Dispersion SD SD NaCl NaCl 68% 68% 74% 74% 73% 73% 73% 73% 73% 73% 69% 69% 70% 70% 68% 68% 71% 71% 73% 73% 71,2% 71.2% 4,76 4.76 2,18 2.18 Glukóza Glucose 94% 94% 93 % 93% 97% 97% 97% 97% 95% 95% 98 % 98% 95% 95% 94% 94% 95% 95% 96% 96% 95,4 % 95.4% 2,24 2.24 1,5 1.5 Sacharóza Sucrose 93% 93% 97% 97% 96% 96% 96% 96% 93% 93% 99% 99% 97% 97% 95% 95% 94% 94% 97% 97% 95,7 % 95.7% 3,41 3.41 1,85 1.85

Pro stanovení viability buněk byla použita následující metoda:The following method was used to determine cell viability:

° Trypanová modř je smíchána s buněčnou suspenzí před nanesením do Bůrkerovy komůrky v poměru 1:1 ° Počítání buněk s příměsí trypanové modři - buňky, které jsou modré, jsou mrtvé (došlo k narušení membrány a absorpci barviva dovnitř buňky); buňky s neporušenou membránou neabsorbují barvivo dovnitř - nebarví se a jsou počítány jako živé ° Počítají se pouze ty buňky, které se nacházejí uvnitř čtverce a buňky, které se z vnitřní nebo vnější strany dotýkají dvou stanovených stran (např. horní a levá) ° Počítány jsou buňky ve čtyřech rohových čtvercích ° Pro vyhodnocení byla použita následující tabulkaTrypan blue is mixed with the cell suspension prior to loading into the Bkerker chamber at a ratio of 1: 1. Counting cells with trypan blue - cells that are blue are dead (membrane disruption and dye uptake into the cell); cells with intact membranes do not absorb dye in - they do not stain and are counted as living ° Only cells that are inside the square and cells that touch the inside or outside of the two specified sides (eg upper and left) are counted ° Counted cells are in four corner squares ° The following table was used for evaluation

Naměřené hodnoty - počítám buněk a barvení Trypanovou modří (ředění 1 : 1) Measured values - cell count and Trypan blue staining (1: 1 dilution) Počet živých buněk ve čtverci Number of living cells per square 1. 1. 2. 2. 3. 3. 4. 4. Celkem buněk (živé čtv1+2+3+4) Total cells (live 1 + 2 + 3 + 4) 0 buněk/čtverec (čtv 1+2+3+4/4) 0 cells / square (Thu 1 + 2 + 3 + 4/4) Ředění 1:1= x2 Dilution 1: 1 = x2 Suspenze (ml) 1 ml= xl 2 ml= x2 Suspension (ml) 1 ml = x 1 2 ml = x 2 (X10000 =) (X10000 =) Počet mrtvých buněk ve čtverci Number of dead cells per square 1. 1. 2. 2. 3. 3. 4. 4. Celkem mrtvých (mrtvé čtv 1+2+3+4) Total dead (dead Thu 1 + 2 + 3 + 4) živé/živé + mrtvé (živé čtvl+2+3+4)/ (živé čtvl+2+3+4)+ (mrtvé čtvl+2+3+4) alive / dead + dead (live + 2 + 3 + 4) / (live + 2 + 3 + 4) + (dead + 2 + 3 + 4) Viabilita (%) živé/(živé + mrtvé) xlOO Viability (%) live / (live + dead) x100 bb bb

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS

Claims

A method of preparing a stromal vascular fraction of adipose tissue cells from adipose tissue, wherein the adipose tissue is subjected to ultrasonic cavitation and subsequent centrifugation, characterized in that:

The adipose tissue is washed with a monosaccharide or disaccharide solution before and / or after ultrasonic cavitation.

Method according to claim 1, characterized in that the adipose tissue is washed with a monosaccharide or disaccharide solution before ultrasound cavitation, preferably before and after cavitation.

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the ultrasonic cavitation is performed at an energy of 20 to 70 W, preferably 40 to 60 W, more preferably about 50 W; a cycle value of 30 to 70%, preferably 40 to 60% or about 50%; and a sonication time of at least 60 seconds, preferably at least 90 seconds, most preferably 90 to 150 seconds.

Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the ultrasonic cavitation is performed by inserting the ultrasonic sonicator probe into the adipose tissue so that it is immersed in the lower half of the adipose tissue, performing sonication for half the set time and subsequently the ultrasonic sonicator probe is inserted into the adipose tissue so that it is immersed in the upper half of the adipose tissue and sonication is performed for the second half of the set time.

The method of any preceding claim, wherein the monosaccharide or disaccharide solution is a glucose or sucrose solution.

Process according to any one of the preceding claims, characterized in that the monosaccharide or disaccharide solution has a concentration of 2 to 10% by weight. %, preferably a concentration of 5 wt.

Process according to any one of the preceding claims, characterized in that the product is further processed by dispersion in an isotonic solution, such as 0.9% by weight. NaCl solution.

The method of claim 7, wherein the product is subsequently processed by centrifuging the product suspension in 0.9% NaCl solution, removing the supernatant, and then resuspending the cell pellet in the adipose tissue; wherein the adipose tissue is preferably adipose tissue taken from the product prior to dispersion in 0.9% NaCl solution and processed by sonication and / or filtration through a sieve having a mesh size of 400 to 700 microns.

The method of claim 1, comprising the steps of:

washing the adipose tissue with a solution of monosaccharide or disaccharide, preferably 5 wt. glucose or sucrose solution,

b. ultrasonic cavitation with a probe submerged in the lower half of adipose tissue, preferably at 50 W and 50% cycle for at least 50 seconds,

c. ultrasonic cavitation with a probe submerged in the upper half of the adipose tissue, preferably at 50 W and 50% cycle for at least 50 seconds,

d. centrifuging the product of step c., preferably at 1100 to 1300 rpm, preferably for 5 minutes,

e. removing the fat layer and adding a solution of monosaccharide or disaccharide, preferably 5 wt. glucose or sucrose solution,

f. centrifugation, preferably at 900 to 1100 rpm, preferably for 5 minutes;

g. dispersing the pellet in 0.9% NaCl solution;

h. optionally centrifuging the suspension obtained in step g., removing the supernatant, and then resuspending the cell pellet in the adipose tissue.

-5 CZ 2018-190 A3

Method according to any one of the preceding claims, characterized in that a microbial control is carried out before the processing of the collected adipose tissue to avoid microbial contamination of the tissue.