CZ2017696A3 - Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke QoI fungicidům - Google Patents
Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke QoI fungicidům Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2017696A3 CZ2017696A3 CZ2017-696A CZ2017696A CZ2017696A3 CZ 2017696 A3 CZ2017696 A3 CZ 2017696A3 CZ 2017696 A CZ2017696 A CZ 2017696A CZ 2017696 A3 CZ2017696 A3 CZ 2017696A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- primers
- sequence
- mutated
- cytb gene
- Prior art date
Links
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 101150001086 COB gene Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 101150053771 MT-CYB gene Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 101150006264 ctb-1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 101150088166 mt:Cyt-b gene Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 26
- 229930182692 Strobilurin Natural products 0.000 claims abstract description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000007859 qualitative PCR Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000228452 Venturia inaequalis Species 0.000 claims description 36
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 239000002420 orchard Substances 0.000 abstract description 4
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 abstract description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 5
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 5
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 5
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 5
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 description 1
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke Qol fungicidům, která je charakterizovaná tím, že obsahuje primery pro současnou kvalitativní nebo kvantitativní PCR detekci lokusu mitochondriálního genu cytb u původce strupovitosti jabloně, kdy tento lokus obsahuje buď přirozeně se vyskytující aminokyselinu glycin v poloze 143 (WT), nebo mutaci G143A zajišťující rezistenci vůči strobilurinovým fungicidům, a uvedené primery mají následující sekvence: Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1), Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2), Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3), přičemž pro PCR detekci WT sekvence mitochondriálního genu cytb uobsahuje sada primery, jejichž sekvence jsou: Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1), Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3), a pro PCR detekci mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb uobsahuje sada primery, jejichž sekvence jsou: Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2), Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3). Sada primerů tak zrychluje, zpřesňuje a zlevňuje monitoring výskytu mutovaného kmene houbys vysokou senzitivitou a umožňuje tak operativnější management ochrany sadů s pozitivním ekonomickým dopadem.
Description
Oblast techniky
Řešení se týká sady primerů pro PCR detekci mutace G143A v mitochondriálním genu cytb u Venturia inaequalis, která způsobuje rezistenci ke Qol fungicidům.
Dosavadní stav techniky
Strupovitost jabloně je hospodářsky nej významnější choroba jabloní, která je způsobena houbovým patogenem Venturia inaequalis [(Cooke) G. Winter 1875], Tato houba napadá listy i plody, na kterých vytváří tmavé strupovité skvrny. V těchto místech dochází k nekrózám, opadu listů a praskání plodů, čímž je umožněn vstup pro druhotné infekce a napadené ovoce je tržně nerealizovatelné. U neošetřovaných sadů může klesnout výnosnost o 40 až 80 % nebo i více.
Základní způsob ochrany je používání fungicidů. Jedním typem často používaných fungicidů jsou fungicidy z chemické skupiny strobilurinů, které inhibují respirační řetězec, a jsou známy jako Quinone-outside ínhibitors (Qoí). Strobiluriny cíleně inhibují klíčový protein respiračního řetězce, cytochrom b (cytb). Používání těchto fungicidů však často vede ke vzniku rezistence k těmto přípravkům, a to zejména vyselektováním jednobodové mutace v genu cytb vedoucí k záměně glycinu za alanin v pozici Í43 (GÍ43A).
Z hlediska managementu ošetřování jabloňových sadů je proto žádoucí včas zachytit přítomnost rezistentních kmenů Venturia inaequalis, a to z mnoha důvodů: 1) zabránit neúčelnému použití strobilurinových fúngicidních přípravků tam, kde se již vytvořila rezistence patogena k nim; 2) a tím předejít ekonomickým ztrátám z použití nesprávného přípravku; 3) předejít zbytečné environmentální zátěži; 4) zahájit používání fungicidů z jiné skupiny s odlišným mechanismem působení pro zajištění efektivní ochrany jabloní proti chorobě a pro zachování kvalitní produkce. Pro účinnou ochranu ovocného sadu je dále výhodné znát poměr mutovaného, rezistentního kmenu Venturia inaequalis, k citlivému.
V současnosti se pro detekci mutace G143A používají postupy založené na metodě PCR. Fontaine (Fontaine, S., 2009) popisuje kvalitativní metodu detekce s použitím alelicky specifických primerů s udávanou citlivostí 1 %. Sedlák (Sedlák, P., 2013) popisuje detekci mutované varianty analýzou PCR produktů pomocí metody SSCP (ssDNA Conformation Polymorphism) s využitím polyakrylamidové gelové elektroforézy. Výbor FRAC (Fungicide Resistance Action Committee) uvádí dvě schválené metody pro detekci mutace G143A v genu cytb - využití RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), respektive pyrosekvenování pro analýzu PCR produktů.
Nevýhodou všech postupů je časová náročnost, nemožnost přesné kvantifikace zastoupení mutované rezistentní formy G143A a nízká citlivost.
Podstata vynálezu
Uvedené nedostatky odstraňuje sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke Qol fúngicidům, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery pro současnou kvalitativní nebo kvantitativní PCR detekci lokusu mitochondriálního genu cytb u původce strupovitosti jabloně Venturia inaequalis, kdy tento lokus obsahuje buď přirozeně se vyskytující aminokyselinu glycin v poloze 143 (WT), nebo mutaci G143A zajišťující rezistenci vůči strobilurinovým fúngicidům, a uvedené primery mají následující sekvence:
- 1 CZ 2017 - 696 A3
Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1)
Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2) Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3), přičemž pro PCR detekci WT sekvence mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis obsahuje sada primery, jejichž sekvence jsou:
Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1)
Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3), a pro PCR detekci mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis obsahuje sada primery, jejichž sekvence jsou:
Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2)
Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Výše uvedené sady primerů jsou vhodné pro kvalitativní nebo kvantitativní detekci WT sekvence (varianty) nebo mutované sekvence (varianty) G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis metodou PCR. Kombinací výsledků kvantitativní analýzy obou variant lze získat přesné zastoupení mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb ve sledované populaci, a to s vysokou citlivostí nejméně 0,1 % vzhledem k WT variantě.
Metodou PCR se rozumí klasické uspořádaní PCR reakce s detekcí amplikonů pomocí gelové elektroforézy nebo digitální PCR nebo real-time PCR využívající k detekci interkalační barviva a další varianty metody PCR známé odborníkovi v oboru. Ve výhodném provedení vynálezu je PCR produkt detekován v reálném čase pomocí real-time PCR s využitím interkalačního barviva, kdy v oddělených zkumavkách probíhá analýza daného vzorku s primery pro WT sekvenci, respektive mutovanou sekvenci G143A.
Detekce WT sekvence nebo mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis může být dle provedení vynálezu provedena z jakékoliv části organizmu, s výhodou se jedná o konidie, askospory, nebo jinou část houbového organizmu.
Prvním krokem detekce WT sekvence nebo mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis je izolace celkové DNA z houbového organizmu metodami známými v oboru. Izolovaná DNA je následně analyzována na přítomnost WT a/nebo mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis metodou PCR sadami primerů podle vynálezu.
Příklady provedení vynálezu jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a žádným způsobem neomezují rozsah této přihlášky, která je vymezena připojenými nároky a podrobně popsána v popisu vynálezu. Odborník v oboru bude schopen učinit různé modifikace použitého způsobu PCR a uvedených primerů tak, aby nedošlo ke snížení specificity a senzitivity PCR detekce; i tyto modifikace budou spadat do rozsahu této přihlášky. Modifikací primerů se rozumí zejména zkrácení nebo prodloužení na 3‘ a/nebo 5‘ konci nebo záměna nukleotidů nebo kombinace těchto modifikací, které zachovávají alespoň 80% identitu k uvedeným sekvencím.
-2CZ 2017 - 696 A3
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Stanovení senzitivity metody detekce WT varianty a mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis
Pro stanovení senzitivity metody byly použity syntetické standardy typu Ultramer®, které jsou identické se sekvencemi WT a mutované G143A varianty. Byly připraveny směsi těchto standardů tak, aby obsahovaly standardy v různých poměrech dle Tabulky 1:
| Zastoupení standardů ve směsi | |
| Varianta WT | Varianta MUT |
| 100% | 0% |
| 99,9% | 0,1% |
| 99% | 1% |
| 90% | 10% |
| 50% | 50% |
| 10% | 90% |
| 1% | 99% |
| 0,1% | 99,9% |
| 0% | 100% |
Připravené kombinace standardů byly použity jako templát pro real-time PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ směs standardů; lx PCR Blue reakční pufr (TopBio); 2,5 mM MgCL; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (interkalační barvivo, Biotium). Každá kombinace standardů byla otestována vtriplikátu na přítomnost sekvence WT a mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb pomocí real-time PCR.
Pro real-time PCR detekci WT sekvence mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis byly použity tyto primery:
Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1)
Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Pro real-time PCR detekci mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis byly použity tyto primery:
Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2) Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/2 s, 72 °C/10 s (50x), s odečtem fluorescence v HRM kanálu.
Po ukončení reakce bylo provedeno kvantitativní vyhodnocení obou variant pomoci Rotor-Gene Q softwaru. Ve všech kombinacích standardů byla nalezena shoda mezi očekávaným a identifikovaným poměrem obou variant. Senzitivita metody pro detekci mutované sekvence
-3 CZ 2017 - 696 A3
G143A mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis ve směsi je < 0,1% vzhledem k WT variantě.
Příklad 2: Kvalitativní detekce WT a mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis metodou PCR v klasickém uspořádání
Pro detekci přítomnosti WT a rezistentní mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb byla ze směsi konidií Venturia inaequalis izolována celková DNA pomocí soupravy Exgene Plant SV mini (GeneAll). Připravená DNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCE; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. Každý vzorek byl v oddělených zkumavkách otestován na přítomnost sekvence WT a mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb pomocí PCR.
Pro PCR detekci WT sekvence mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis byly použity tyto primery:
Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1) Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Pro PCR detekci mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis byly použity tyto primery:
Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2) Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru C1000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/2 s, 72 °C/10 s (50x).
Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu. U vzorků, které byly pozitivní pouze na přítomnost WT sekvence a neobsahovaly žádnou mutovanou variantu G143A mitochondriálního genu cytb, byl identifikován proužek o velikosti 105 bp pouze u PCR reakce detekující WT variantu. U vzorků, které obsahovaly pouze mutovanou variantu G143A mitochondriálního genu cytb a neobsahovaly žádnou WT variantu, byl identifikován proužek o velikosti 105 bp pouze u PCR reakce detekující mutovanou variantu G143A mitochondriálního genu cytb. Vzorky, které byly směsné a obsahovaly jak WT variantu, tak mutovanou variantu G143A mitochondriálního genu cytb, vykazovaly proužky o velikosti 105 bp v obou PCR reakcích s různou intenzitou podle poměrů obou variant ve vzorku.
Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů. Ve všech případech byl potvrzen nález WT sekvence nebo mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb ve shodě se závěry z gelové elektroforézy.
Příklad 3: Kvalitativní a kvantitativní detekce WT a mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis metodou real-time PCR
Pro detekci přítomnosti WT a rezistentní mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb byla ze směsi konidií Venturia inaequalis izolována celková DNA pomocí soupravy Exgene Plant SV mini (GeneAll). Připravené DNA byly použity jako templát pro real-time PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ směs standardů; lx PCR Blue reakční pufr (TopBio); 2,5 mM MgCE; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (interkalační barvivo, Biotium). Každý vzorek byl v oddělených zkumavkách otestován na přítomnost sekvence WT a mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb pomocí real-time PCR.
-4CZ 2017 - 696 A3
Pro real-time PCR detekci WT sekvence mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis byly použity tyto primery:
Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1)
Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Pro real-time PCR detekci mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis byly použity tyto primery:
Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2) Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/2 s, 72 °C/10 s (50x), s odečtem fluorescence v HRM kanálu.
Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů. Ve všech případech byl potvrzen nález WT sekvence nebo mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb ve shodě se závěry z real-time PCR.
Ve výhodném provedení vynálezu byla přítomnost WT nebo mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy pro WT sekvenci a čtyři standardy pro mutovanou sekvenci G143A mitochondriálního genu cytb o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. U pozitivních vzorků byla použita kalibrační křivka pro stanovení absolutní koncentrace WT sekvence nebo mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis.
Příklad 4: Stanovení zastoupení mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb v populaci Venturia inaequalis metodou real-time PCR
Pro stanovení zastoupení rezistentní mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb v populaci byla ze směsi konidií Venturia inaequalis izolována celková DNA pomocí soupravy Exgene Plant SV mini (GeneAll). Připravené DNA byly použity jako templát pro real-time PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ směs standardů; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCF; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (interkalační barvivo, Biotium). Každý vzorek byl v oddělených zkumavkách otestován v triplikátu na přítomnost sekvence WT a mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb pomocí real-time PCR. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy pro WT sekvenci a čtyři standardy pro mutovanou sekvenci G143A mitochondriálního genu cytb o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky.
Pro real-time PCR detekci WT sekvence mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis byly použity tyto primery:
Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1)
Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Pro real-time PCR detekci mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb Venturia inaequalis byly použity tyto primery:
Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2)
-5 CZ 2017 - 696 A3
Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/2 s, 72 °C/I0 s (50x), s odečtem fluorescence v HRM kanálu.
Po ukončení běhu byly pomoci Rotor-Gene Q softwaru sestrojeny kalibrační křivky pro absolutní kvantifikaci varianty WT a mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb v testované populaci Venturia inaequalis. Z absolutních koncentrací jednotlivých variant bylo po provedené normalizaci vypočteno zastoupení mutované varianty G143A mitochondriálního genu cytb jako procento v testované populaci Venturia inaequalis.
Průmyslová využitelnost
Nová sada primerů pro PCR detekci mutace G143A v mitochondriálním genu cytb u Venturia inaequalis, která způsobuje rezistenci ke Qol fungicidům, odstraňuje oproti dosavadnímu stavu techniky nízkou senzitivitu, umožňuje provést současnou přesnou kvantifikaci i kvalifikaci zastoupení mutované varianty v populaci a zkracuje čas potřebný k analýze. Tato sada primerů tak zrychluje, zpřesňuje a zlevňuje monitoring výskytu mutovaného kmene houby Venturia inaequalis a umožňuje tak operativnější management ochrany zejména sadů jabloní s pozitivním ekonomickým dopadem.
Seznam použité literatury
Fontaine, S., Remuson, F., Fraissinet-Tachet, L. et al. Monitoring of Venturia inaequalis harbouring the Qol resistance G143A mutation in French orchards as revealed by PCR assays. Pěst Manage. Sci. (2009) 65:74-81.Sedlák, P., Vavra, R., Vejl, P. et al. Efficacy loss of strobilurins ušed in protection against apple scab in Czech orchards. Hort. Sci. (Prague) (2013) 40: 45-51.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (3)
1. Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke Qol fungicidům, vyznačující se tím, že obsahuje primery pro současnou kvalitativní nebo kvantitativní PCR detekci lokusu mitochondriálního genu cytb u původce strupovitosti jabloně Venturia inaequalis, kdy tento lokus obsahuje buď přirozeně se vyskytující aminokyselinu glycin v poloze 143 (WT), nebo mutaci G143A zajišťující rezistenci vůči strobilurinovým fungicidům, a uvedené primery mají následující sekvence:
Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1)
Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO.
2)
Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO.
3), přičemž pro PCR detekci WT sekvence mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis obsahuje sada primery, jejichž sekvence jsou:
Forward primer 1: ATGGTCAAATGAGCCTAGGTGGT (SEQ ID NO. 1)
Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3), a pro PCR detekci mutované sekvence G143A mitochondriálního genu cytb u Venturia inaequalis obsahuje sada primery, jejichž sekvence jsou:
-6CZ 2017 - 696 A3
Forward primer 2: ATGGTCAAATGAGCCTAGTGGCT (SEQ ID NO. 2) Reverse primer 1: AAGCCTCCCCACAGAAATTCG (SEQ ID NO. 3).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017696A CZ309242B6 (cs) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke QoI fungicidům |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017696A CZ309242B6 (cs) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke QoI fungicidům |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017696A3 true CZ2017696A3 (cs) | 2019-07-03 |
| CZ309242B6 CZ309242B6 (cs) | 2022-06-15 |
Family
ID=67060176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017696A CZ309242B6 (cs) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke QoI fungicidům |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309242B6 (cs) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002542803A (ja) * | 1999-04-30 | 2002-12-17 | シンジェンタ リミテッド | 方 法 |
| EP1421207A2 (en) * | 2001-04-02 | 2004-05-26 | Syngenta Limited | Method for the detection of cytochrome b mutations in fungi |
-
2017
- 2017-10-31 CZ CZ2017696A patent/CZ309242B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ309242B6 (cs) | 2022-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cipriani et al. | Grapevine fingerprinting using microsatellite repeats | |
| Semagn et al. | An overview of molecular marker methods for plants | |
| Usman et al. | Comparison of methods for high quantity and quality genomic DNA extraction from raw cow milk | |
| WO2008056325B1 (en) | Process for animal species identification in samples with genetic material based on mitochondrial dna size variation | |
| Ramamoorthi et al. | Genetic characterization of Barbari goats using microsatellite markers | |
| Kokhmetova et al. | Identification of wheat germplasm resistant to leaf, stripe and stem rust using molecular markers | |
| McNeil et al. | Conversion of AFLP markers to high-throughput markers in a complex polyploid, sugarcane | |
| Pasqualone et al. | Identification of durum wheat cultivars and monovarietal semolinas by analysis of DNA microsatellites | |
| Sefc et al. | Genetic analysis of grape berries and raisins using microsatellite markers | |
| Kacar et al. | Genetic relationships of some Citrus genotypes based on the candidate iron chlorosis genes | |
| CZ2017696A3 (cs) | Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke QoI fungicidům | |
| CZ31547U1 (cs) | Sada pro detekci mutace G143A způsobující rezistenci ke Qol fungicidům | |
| Onache et al. | Comparison of some DNA extraction methods from monovarietal must and wines | |
| Bakht et al. | Genetic diversity and phylogenetic relationship among different peach genotypes through rapd markers | |
| Nefzaoui et al. | Molecular diversity in Tunisian durum wheat accessions based on microsatellite markers analysis. | |
| Nagano et al. | Conversion of AFLP markers linked to the Sh allele at the S locus in buckwheat to a simple PCR based marker form | |
| Tripathi | A simplified and cheapest method for the diagnosis of sickle cell using whole blood PCR and RFLP in Nepal | |
| Fajardo et al. | Real-time RT-PCR high-resolution melting curve analysis to detect and differentiate Brazilian variants of grapevine viruses | |
| PL238698B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Cyp51 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| Thilagam et al. | Kanniadu goats of Tamilnadu, India: genetic characterisation through microsatellite markers | |
| Conțescu | A simple and rapid DNA isolation method from dry pea seeds suitable for PCR analyses | |
| Joseph et al. | Development of a SCAR marker associated with male sex determination in Garcinia indica Choisy | |
| Jhansi et al. | DNA finger printing of maize hybrids and development of molecular ID’s using SSR markers | |
| Chizhik et al. | Discerning Strains of Phytophthora infestans, Causative Agent of Potato Late Blight, by SSCP Analysis of Virulence Genes | |
| Marzouk et al. | Genetic Diversity among Seven Goat Breeds assessed by Inter Simple Sequence Repeats (ISSR). |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20231031 |