CZ2017483A3 - Method for determining the presence of an analyte in a liquid sample, an analyte detection electrode in a liquid sample, a method of its preparation, a kit for determining the presence of an analyte and its use - Google Patents
Method for determining the presence of an analyte in a liquid sample, an analyte detection electrode in a liquid sample, a method of its preparation, a kit for determining the presence of an analyte and its use Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2017483A3 CZ2017483A3 CZ2017-483A CZ2017483A CZ2017483A3 CZ 2017483 A3 CZ2017483 A3 CZ 2017483A3 CZ 2017483 A CZ2017483 A CZ 2017483A CZ 2017483 A3 CZ2017483 A3 CZ 2017483A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- analyte
- electrode
- liquid sample
- immobilized
- determining
- Prior art date
Links
- 239000012491 analyte Substances 0.000 title claims abstract description 94
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 40
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 24
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 16
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 12
- 241000589972 Borrelia sp. Species 0.000 claims description 11
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 claims description 11
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 9
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 7
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 6
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 6
- VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N Allylamine Chemical compound NCC=C VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 claims description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 4
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 claims description 4
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 claims description 3
- AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(6+);hexacyanide Chemical group [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+6].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- ILZSSCVGGYJLOG-UHFFFAOYSA-N cobaltocene Chemical compound [Co+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 ILZSSCVGGYJLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 15
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid group Chemical group C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000001301 anti-borrelial effect Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000002847 impedance measurement Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 3
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 description 2
- -1 preferably pH 4- 9 Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000009713 electroplating Methods 0.000 description 1
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- VVNRQZDDMYBBJY-UHFFFAOYSA-M sodium 1-[(1-sulfonaphthalen-2-yl)diazenyl]naphthalen-2-olate Chemical compound [Na+].C1=CC=CC2=C(S([O-])(=O)=O)C(N=NC3=C4C=CC=CC4=CC=C3O)=CC=C21 VVNRQZDDMYBBJY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/403—Cells and electrode assemblies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/549—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic with antigen or antibody entrapped within the carrier
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
Abstract
Předkládané řešení se týká způsobu stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku, který obsahuje kroky: (i) povrch pracovní elektrody obsahující imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem se inkubuje se vzorkem, přičemž v případě, že vzorek obsahuje stanovovaný analyt, se tento naváže na imobilizované částice na povrchu elektrody za vzniku imobilizovaného komplexu analyt-imobilizovaná částice na povrchu elektrody; (ii) pracovní elektroda s imobilizovaným komplexem analyt-imobilizovaná částice se uvede do kontaktu s roztokem redoxní látky, která má opačný náboj než stanovovaný analyt; (iii) změří se elektrochemický parametr pro stanovení impedance na rozhraní povrchu pracovní elektrody a roztoku redoxní látky ve vztahu k doplňkové elektrodě přítomné v kapalném vzorku; (iv) z naměřené hodnoty elektrochemického parametru se vyhodnotí změna impedance, přičemž platí, že přítomnost analytu ve vzorku vede k poklesu hodnoty impedance na rozhraní povrchu elektrody a roztoku redoxní látky. Ze změny impedance se kvalitativně a/nebo semikvantitativně a/nebo kvantitativně stanoví i přítomnost analytu v kapalném vzorku. Předkládané řešení se dále týká elektrody pro detekci analytu v kapalném vzorku, způsobu její přípravy, sady pro stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku a jejich použití.The present invention relates to a method for determining the presence of an analyte in a liquid sample comprising the steps of: (i) incubating the working electrode surface containing the immobilized particles for affinity interaction with the analyte, and binding the sample to the immobilized if the analyte is to be assayed particles on the electrode surface to form an immobilized analyte-immobilized particle complex on the electrode surface; (ii) contacting the working electrode with the immobilized analyte-immobilized particle complex with a solution of a redox substance having an opposite charge than the analyte to be determined; (iii) measuring the electrochemical parameter to determine the impedance at the interface of the working electrode surface and the redox solution relative to the supplemental electrode present in the liquid sample; (iv) an impedance change is evaluated from the measured value of the electrochemical parameter, the presence of the analyte in the sample results in a decrease in the impedance value at the electrode surface and redox solution. The presence of an analyte in a liquid sample is also determined qualitatively and / or semi-quantitatively and / or quantitatively from the impedance change. The present invention further relates to an electrode for detecting an analyte in a liquid sample, a method for its preparation, a kit for determining the presence of an analyte in a liquid sample, and their use.
Description
Oblast technikyTechnical field
Předkládaný vynález se týká způsobu stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku, sady pro stanovení přítomnosti analytu a jejich použití zejména pro stanovení bakteriálních antigenů či odpovídajících protilátek v tělních tekutinách testovaných jedinců s podezřením na onemocnění, např. stanovení protilátek proti bakteriím kmene Borelia sp. v krevním séru.The present invention relates to a method for determining the presence of an analyte in a liquid sample, a kit for determining the presence of an analyte, and their use, in particular for determining bacterial antigens or corresponding antibodies in the body fluids of test subjects suspected of disease. in blood serum.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Většina současných komerčních imunosenzorů vychází z imunochemických testů na bázi laterálního toku (lateral flow imunoassay, LFIA) s vizuální či optickou detekcí. Elektrochemické metody detekce pro imunosenzory nejsou rozšířené.Most current commercial immunosensors are based on lateral flow immunoassays (LFIA) with visual or optical detection. Electrochemical detection methods for immunosensors are not widespread.
Dříve byly afinitní elektrochemické imunosenzory založeny na značení jednoho z interagujících partnerů dvojice antigen-protilátka. Jakožto značky mohly být použity enzymy či jiné redoxní látky, např. ferocen (Okochi, Ohta, Tanaka, Matsunaga, Biotechnol Bioeng 90 (2005) 14). Dnešní přístupy nejčastěji využívají sledování změny elektrochemické impedance senzoru v závislosti na proběhlé afinitní interakci rekogniční složky s analytem.Previously, affinity electrochemical immunosensors were based on the labeling of one of the interacting partners of the antigen-antibody pair. Enzymes or other redox substances such as ferrocene could be used as labels (Okochi, Ohta, Tanaka, Matsunaga, Biotechnol Bioeng 90 (2005) 14). Today's approaches most often use the monitoring of the change of sensor electrochemical impedance in dependence on the affinity interaction of the recognitive component with the analyte.
Afinitní interakce sledované pomocí elektrochemické impedance využívají vznik komplexu mezi různými molekulami. Mohou to být interakce např. mezi aptamery a adenosinem (Zayats, Huang, Gill, Ma, Willner, J Am Chem Soc 128 (2006) 13666) nebo protilátkami a antigeny (Susmel, Guilbault, O’Sullivan, Bosens Bioelectron 18 (2003) 881). Susmel a spol. měřili pokles difuzního koeficientu redoxní próby při zachycení bakterií (potravinových patogenů) na povrch elektrody.Affinity interactions monitored by electrochemical impedance exploit complex formation between different molecules. These may be, for example, interactions between aptamers and adenosine (Zayats, Huang, Gill, Ma, Willner, J Am Chem Soc 128 (2006) 13666) or antibodies and antigens (Susmel, Guilbault, O'Sullivan, Bosens Bioelectron 18 (2003) 881). Susmel et al. measured the decrease in the diffusion coefficient of the redox probe when bacteria (food pathogens) were captured on the electrode surface.
Na povrchu biosenzorů založených na imunoafinitních interakcích dochází k nárůstu hmoty, proto je nejčastější variantou detekce měření nárůstu impedance (míra odporu prostupu nabitých látek skrz tuto vrstvu biomolekul). Měření nárůstu impedance bylo použito také při detekci bakterií kmene Salmonella sp. (Kim, Moon, Hahm, Morgan, Bhunia, Om, Food Sci Biotechnol 18 (2009) 89) či Escherichia coli (Yang, Li, Erf, Anal Chem 76 (2004) 1107, Maalouf, FournierWírth, Coste, Chebib, Sailkali, Vittori, Errachid, Cloarec, Claude Martelet, Jaffrezic-Renault, Anal Chem 79 (2007) 4879). Stanovení Escherichia coli bylo založeno na vysrážení nevodivé vrstvy, přičemž množství precipitátu stínícího elektroaktivní povrch bylo přímo úměrné množství navázané bakterie (Ruan, Zang, Li, Anal Chem 74 (2002) 4814). Signál - nárůst impedance - byl tak zesílen.There is a mass increase on the surface of biosensors based on immunoaffinity interactions, which is why the most common variant of detection is the measurement of impedance increase (measure of the resistance of charged substances through this layer of biomolecules). Impedance measurement was also used to detect Salmonella sp. (Kim, Moon, Hahm, Morgan, Bhunia, Om, Food Science Biotechnol 18 (2009) 89) or Escherichia coli (Yang, Li, Erf, Anal Chem 76 (2004) 1107, Maalouf, FournierWerth, Coste, Chebib, Sailkali, Vittori, Errachid, Cloarec, Claude Martelet, Jaffrezic-Renault, Anal Chem 79 (2007) 4879). The Escherichia coli assay was based on precipitation of a non-conductive layer, the amount of precipitate shielding the electroactive surface being proportional to the amount of bound bacteria (Ruan, Zang, Li, Anal Chem 74 (2002) 4814). The signal - impedance increase - was thus amplified.
Nanomateriály pro afinitní diagnostiku jsou velmi rozšířené (Wang, Analyst 130 (2005) 421), ale používají se především jako značky pro zesílení signálu (Wan, Su, Zhu, Liu, Fan, Biosens Bioelectron 47 (2013) 1; Mwilu, Aluoch, Miller, Wong, Sadik, Fatah, Arcilesi, Anal Chem 81 (2009) 7561).Nanomaterials for affinity diagnostics are widespread (Wang, Analyst 130 (2005) 421), but are mainly used as signal amplification labels (Wan, Su, Zhu, Liu, Fan, Biosens Bioelectron 47 (2013) 1; Mwilu, Aluoch, Miller, Wong, Sadik, Fatah, Arciles, Anal Chem 81 (2009) 7561).
Principem impedančního stanovení imunoreakcí ze stavu techniky je blokace či „zaizolování“ povrchu elektrody při detekční reakci mezi specificky modifikovanou elektrodou a analytem. Prostup redoxní značky skrz modifikační vrstvu na povrchu detekční elektrody je snížen vytvořeným afinitním párem (např. protilátka-antigen, receptor-ligand či jinou kombinací komplementárních biomolekul), čímž dojde k tzv. difúzní limitaci velikosti faradaického proudu generovaného elekrtochemickou reakcí redoxní značky na elektrodě (sníží se prostup redoxní značky proteinovou/modifikační vrstvou na elektrodě). V některých případech se tento princip zesiluje pomocí různých prostředků. Mohou to být membrány např. vytvořené pomocíThe principle of prior art impedance immunoreaction assays is to block or "isolate" the electrode surface during a detection reaction between a specifically modified electrode and an analyte. The passage of the redox tag through the modification layer on the surface of the detection electrode is reduced by the generated affinity pair (eg, antibody-antigen, receptor-ligand or other combination of complementary biomolecules), thereby imparting so-called diffusion limitations on faradic current generated by the redox tag electrode the redox tag penetration through the protein / modification layer on the electrode is reduced). In some cases, this principle is strengthened by various means. They may be membranes, e.g.
- 1 CZ 2017 - 483 A3 aluminiové matrice (Koh, Agarwal, Cheow, Toh, Electrochim Acta 53 (2007) 803), kdy detekční princip využíval blokaci póru, jehož stěny byly modifikovány jedním z partnerů imunoreakce.- 1 CZ 2017 - 483 A3 aluminum matrices (Koh, Agarwal, Cheow, Toh, Electrochim Acta 53 (2007) 803), where the detection principle used a pore block whose walls were modified by one of the immunoreaction partners.
Pro elektrochemická měření byly použity litograficky připravené elektrody s následnou galvanizací především pro běžný způsob měření v nastavení: Au pracovní, resp. pomocná elektroda a Ag referentní elektroda (La Belle, Shah, Reed, Nandakumar, Alford, Wilson, Nickerson, Joshi, Electroanalysis 21 (2009) 2267; La Belle, Gerlach, Svárovsky, Joshi, Anal. Chem. 79 (2007) 6959; Bhavsar, Fairchild, Alonas, Bishop, La Belle, Sweeney, Alford, Joshi, Biosensor. Bioelectron. 25 (2009) 506). Elektrochemické měření pak bylo prováděno obvyklým způsobem, kdy se na pracovní elektrodě nastavuje potenciál proti hodnotě potenciálu referentní elektrody. Nejčastěji použité měřicí elektrochemické metody jsou impedanční a voltametrická měření.For electrochemical measurements were used lithographically prepared electrodes with subsequent galvanization primarily for the common method of measurement in the setting: Au working, respectively. auxiliary electrode and Ag reference electrode (La Belle, Shah, Reed, Nandakumar, Alford, Wilson, Nickerson, Josh, Electroanalysis 21 (2009) 2267; La Belle, Gerlach, Svarovsky, Josh, Anal. Chem. 79 (2007) 6959; Bhavsar, Fairchild, Alonas, Bishop, La Belle, Sweeney, Alford, Joshi, Biosensor, Bioelectron, 25 (2009) 506). The electrochemical measurement was then carried out in the usual way by setting the potential on the working electrode against that of the reference electrode. The most commonly used electrochemical measurement methods are impedance and voltammetric measurements.
Nemoc lymská borelióza je způsobena infekcí bakterií kmene Borrelia sp. V Evropě je převažující infekce druhy B. afzelii a B. garinii a v Severní Americe je to B. burgdorferi. Tato bakteriální infekce je v současné době nejčastěji diagnostikována pomocí metody ELISA, kdy čas pro diagnózu je několik hodin. Přesnějšími metodami jsou Western blot či PCR, kde minimální čas pro diagnózu je 14-ti hodinová analýza. V tomto časovém úseku však není zohledněno odebrání vzorku, transport, zpracování vzorku, dále komunikace a interpretace výsledků. Jelikož se stanovení provádí pouze ve specializovaných laboratořích, udává se doba jedné analýzy minimálně 3 dny. I přes existující diagnostický systém pro odhalení infekce bakteriemi kmene Borelia sp. chybí možnost rychlého a levného stanovení v domácích podmínkách nebo u praktického lékaře, ke kterému by nebylo zapotřebí analyzovat vzorek ve speciálně vybavené laboratoři.Lyme disease is caused by infection with Borrelia sp. In Europe, B. afzelii and B. garinii are the predominant infection, and in B. America, B. burgdorferi. This bacterial infection is currently most commonly diagnosed by ELISA, where the time for diagnosis is several hours. More accurate methods are Western blot or PCR, where the minimum time for diagnosis is a 14-hour analysis. However, sampling, transport, sample processing, communication and interpretation of results are not taken into account in this period. As the determination is performed only in specialized laboratories, the time of one analysis is at least 3 days. Despite the existing diagnostic system for detecting infection by Borelia sp. there is no possibility of rapid and cheap determination at home or by a general practitioner who would not need to analyze the sample in a specially equipped laboratory.
Zdlouhavost, komplikovanost a finanční náročnost stanovení analytu, zejména protilátek proti lymské borelióze, dle stavu techniky řeší předkládaný vynález, který umožňuje udělat si předběžný screening u lékaře nebo doma (při podezření na infekci, např. v prvotní fázi imunitní odpovědi organismu po přisátí infikovaného klíštěte či poštípání hmyzem), který doposud na trhu chybí.The lengthy, complicated and costly nature of an analyte assay, in particular anti-Lyme borreliosis antibodies, of the prior art is solved by the present invention, which allows pre-screening in a physician or at home (suspected of infection, eg in the initial immune response of an organism after sucking an infected tick). or insect bites) that is still missing from the market.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Předmětem předkládaného vynálezu je způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku, který obsahuje následující kroky:It is an object of the present invention to provide a method for determining the presence of an analyte in a liquid sample, comprising the following steps:
(i) stanoví se hodnota elektrochemického parametru systému, tvořeného povrchem pracovní elektrody, obsahující imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem, ponořené v roztoku redoxní látky, která má opačný náboj než stanovovaný analyt, přičemž rozpouštědlem redoxní látky je s výhodou voda, vodný roztok pufru, s výhodou o pH 4 až 9, nebo fyziologický roztok, a přičemž s výhodou je koncentrace redoxní látky v roztoku v rozmezí od 1 μΜ do 1 M, s výhodou od 1 mM do 20 mM; případně se povrch pracovní elektrody omyje, s výhodou destilovanou vodou nebo fyziologickým roztokem, a následně se zbaví přebytečné kapaliny;(i) determining the value of the electrochemical parameter of a working electrode surface comprising immobilized particles for affinity interaction with an analyte immersed in a solution of a redox having an opposite charge to the analyte being determined, wherein the solvent of the redox is preferably water, an aqueous buffer solution , preferably at a pH of 4 to 9, or saline, and wherein preferably the concentration of the redox in the solution is in the range of 1 µΜ to 1 M, preferably from 1 mM to 20 mM; optionally, the surface of the working electrode is washed, preferably with distilled water or saline, and subsequently freed of excess liquid;
(ii) povrch pracovní elektrody obsahující imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem se inkubuje s kapalným vzorkem, přičemž v případě, že vzorek obsahuje stanovovaný analyt, se tento analyt naváže na imobilizované částice, s výhodou antigen nebo protilátku, na povrchu elektrody za vzniku afinitního komplexu analyt-imobilizovaná částice na povrchu elektrody; doba inkubace je s výhodou v rozmezí od 5 do 120 minut při teplotě od 10 do 40 °C a pH 4 až 9, případně se povrch pracovní elektrody s imobilizovaným afinitním komplexem analytimobilizovaná částice omyje, s výhodou destilovanou vodou nebo fyziologickým roztokem a následně se se zbaví přebytečné kapaliny;(ii) the working electrode surface containing the immobilized particles for affinity interaction with the analyte is incubated with the liquid sample, and if the sample contains the analyte to be determined, the analyte binds to the immobilized particles, preferably antigen or antibody, on the electrode surface to form an affinity an analyte-immobilized particle complex on the electrode surface; the incubation time is preferably in the range of 5 to 120 minutes at a temperature of 10 to 40 ° C and a pH of 4 to 9, optionally the surface of the working electrode with the immobilized affinity complex is washed, preferably with distilled water or saline, removes excess liquid;
(iii) pracovní elektroda s imobilizovaným afinitním komplexem analyt-imobilizovaná částice se(iii) a working electrode with the immobilized analyte-immobilized particle affinity complex is
-2CZ 2017 - 483 A3 uvede do kontaktu se stejně koncentrovaným roztokem téže redoxní látky jako v kroku (i), která má opačný náboj než stanovovaný analyt, přičemž rozpouštědlem redoxní látky je s výhodou voda, vodný roztok pufru, s výhodou o pH 4-9, nebo fyziologický roztok, přičemž koncentrace redoxní látky v roztoku je v rozmezí od 1 μΜ do 1 M, s výhodou od 1 mM do 20 mM;A3 - 483 A3 is contacted with an equally concentrated solution of the same redox as in step (i) having the opposite charge to the analyte being determined, wherein the solvent of the redox is preferably water, an aqueous buffer solution, preferably pH 4- 9, or saline, wherein the concentration of the redox in the solution is in the range of 1 μΜ to 1 M, preferably 1 mM to 20 mM;
(iv) stanoví se hodnota elektrochemického parametru, vybraného ze stejnosměrného proudu, stejnosměrného napětí, odporu, střídavého proudu, střídavého napětí, impedance, na rozhraní povrchu pracovní elektrody a roztoku redoxní látky ve vztahu k doplňkové elektrodě přítomné v kapalném vzorku, přičemž redoxní látka má opačný náboj než stanovovaný analyt, s výhodou je měřeným elektrochemickým parametrem elektrický proud nebo napětí, ze kterých se následně stanoví impedance systému;(iv) determining a value of an electrochemical parameter selected from direct current, direct voltage, resistance, alternating current, alternating voltage, impedance, at the interface of the working electrode surface and the redox substance solution relative to the supplemental electrode present in the liquid sample; an opposite charge to the analyte being determined, preferably the measured electrochemical parameter is an electric current or voltage from which the system impedance is subsequently determined;
z hodnoty stanoveného elektrochemického parametru v kroku iv) se určí změna elektrochemického parametru vůči elektrochemickému parametru roztoku redoxní látky stanovenému v kroku i), přičemž platí, že přítomnost analytu ve vzorku vede ke změně elektrochemického parametru na rozhraní povrchu elektrody a roztoku redoxní látky, a přičemž je-li elektrochemickým parametrem odpor nebo impedance nebo napětí, dojde k jeho poklesu, a je-li elektrochemickým parametrem proud, dojde k jeho nárůstu. Ze změny elektrochemického parametru, s výhodou impedance, se kvalitativně a/nebo semikvantitativně a/nebo kvantitativně stanoví přítomnost analytu v kapalném vzorku.determining from the value of the determined electrochemical parameter in step iv) the change in the electrochemical parameter relative to the electrochemical parameter of the redox solution determined in step i), wherein the presence of the analyte in the sample leads to a change in the electrochemical parameter at the interface of the electrode surface and the redox solution; if the electrochemical parameter is a resistance or impedance or voltage, it will drop, and if the electrochemical parameter is current, it will increase. From the change in the electrochemical parameter, preferably impedance, the presence of the analyte in the liquid sample is qualitatively and / or semi-quantitatively and / or quantitatively determined.
Uvedeným způsobem lze stanovit analyt v rozmezí koncentrací v kapalném vzorku od jednotek ng/ml do jednotek mg/ml.In this way, the analyte can be determined over a range of concentrations in the liquid sample from ng / ml to mg / ml.
Pro stanovení elektrochemického parametru lze použít metody potenciometrie, voltametrie, amperometrie nebo biamperometrie, s výhodou biamperometrie, a jim příslušné elektrodové uspořádání. Odborník znalý oboru by byl bez vynaložení vynálezecké činnosti schopen určit vhodné elektrodové uspořádání, typy a počet elektrod.Potentiometry, voltammetry, amperometry or biamperometry, preferably biamperometry, and their respective electrode arrangement can be used to determine the electrochemical parameter. A person skilled in the art would be able to determine the appropriate electrode arrangement, types and number of electrodes without resorting to the invention.
S výhodou se kapalný vzorek nakápne přímo na pracovní elektrodu, v případě biamperometrie na elektrodový systém, a měření probíhá v nakápnutém vzorku. Tentýž vzorek se nakápne rovněž na doplňkovou / referentní elektrodu, aby byly elektrody vodivě spojeny měřeným vzorkem. Snižuje se tím instrumentální náročnost tohoto způsobu stanovení i chyba měření, která by mohla vzniknout např. při převádění vzorku do měřicí nádoby, oplachu elektrody apod. Kapalným vzorkem se rozumí např. vzorek krevního séra nebo krve subjektu.Preferably, the liquid sample is dropped directly onto the working electrode, in the case of biamperometry to the electrode system, and the measurement takes place in the dropped sample. The same sample is also dropped onto the complementary / reference electrode to conduct the electrodes electrically connected to the sample being measured. This reduces the instrumental complexity of this method of measurement as well as the measurement error that could arise, for example, when transferring a sample to a measuring vessel, electrode rinsing, etc. A liquid sample is, for example, a blood serum or subject blood sample.
Optimální (nejcitlivější) detekční technikou je stanovení změny impedance pracovní elektrody či v případě biamperometrie elektrodového systému v roztoku redoxní značky před a po inkubaci s kapalným vzorkem. Nej výhodnější je měření impedance při nižších hodnotách frekvence (nej častěji v rozmezí do 1000 Hz), kdy se uplatňuje jak vliv analytu na střídavou tak i na stejnosměrnou složku budícího signálu, resp. stanovované impedance. Měření probíhá tak, že se mezi dvě elektrody v roztoku vloží střídavé napětí a měří se prošlý proud - velikost a jeho fázové posunutí proti vloženému napětí, z čehož se následně dopočítá hodnota impedance. Měří se výstupní signál, resp. impedance, čímž se rozumí vliv reakce imobilizované částice s analytem na budící signál. Střídavá složka budícího signálu je ovlivněna obousměrným pohybem iontů směrem k elektrodě a od elektrody; stejnosměrná složka je ovlivněna jednosměrným tokem iontů k elektrodě nebo od elektrody. Jako detekční elektrochemickou metodu lze použít rovněž jiné než impedanční techniky, jako např. různé voltametrické či amperometrické metody sledující průchodnost iontů modifikační vrstvou nebo změny napětí generované ne/přítomností nabitých protilátek.The optimal (most sensitive) detection technique is to determine the impedance change of the working electrode or, in the case of biamperometry of the electrode system, in a redox solution before and after incubation with a liquid sample. It is most advantageous to measure the impedance at lower frequency values (most often in the range up to 1000 Hz), where both the analyte's influence on the AC and DC components of the excitation signal, respectively, is applied. determined impedance. The measurement is done by inserting an alternating voltage between two electrodes in the solution and measuring the passed current - magnitude and its phase offset against the inserted voltage, from which the impedance value is then calculated. The output signal is measured. impedance, meaning the effect of the reaction of the immobilized particle with the analyte on the excitation signal. The alternating component of the excitation signal is affected by the bi-directional movement of ions towards and away from the electrode; the DC component is affected by the unidirectional ion flux to or from the electrode. Other non-impedance techniques, such as various voltammetric or amperometric methods for monitoring the patency of ions through the modification layer or voltage variations generated by the presence / absence of charged antibodies, may also be used as an electrochemical detection method.
Další možností měření je také způsob, kdy se vzorek nanese na elektrodový systém, kde je přítomna imobilizovaná částice (komplementární partner imunoreakce) a současně i redoxní látka v pevné formě. Tento elektrodový systém (při použití biamperometrie) nebo pracovní elektroda (při použití ostatních výše uvedených metod stanovení) se připraví tak, že se pracovní elektroda,Another method of measurement is also the method where the sample is deposited on an electrode system where an immobilized particle (complementary immunoreaction partner) and a solid redox substance are present. This electrode system (using biamperometry) or the working electrode (using the other aforementioned determination methods) is prepared by working the working electrode,
-3 CZ 2017 - 483 A3 případně elektrodový systém, obsahující imobilizované částice pro afinitní reakci s analytem, uvede do kontaktu s roztokem redoxní látky a stanoví se elektrochemický parametr (krok i)). Následně se pracovní elektroda / elektrodový systém ponechá na vzduchu zaschnout, čímž dojde k adsorpci redoxní látky na povrch pracovní elektrody / elektrodového systému. Přídavkem kapalného vzorku s analytem dojde současně k interakci analytu s modifikovaným povrchem (krok ii)) a k rozpuštění redoxní látky (krok iii)), v jejímž roztoku poté proběhne měření elektrochemické veličiny. Jelikož dojde ke změně elektrochemického parametru povrchu pracovní elektrody / elektrodového systému navázáním analytu, dojde současně i ke změně signálu redoxní látky, z čehož lze v následujících krocích iv) a v) stanovit přítomnost a případně rovněž koncentraci analytu ve vzorku. Celá procedura stanovení je tak uskutečněna bez potřeby oplachu elektrody a výsledek je znám v minimálním čase po odběru vzorku. Aby byla dodržena podmínka stejné koncentrace redoxní látky v kroku (i) a kroku (iii), musí být objem vzorku, který se nakápne na elektrodový systém v kroku (ii), stejný jako objem roztoku redoxní látky v kroku (i), který byl po změření elektrochemického parametru ponechán zaschnout na elektrodovém systému. Například pokud bylo v kroku (i) nakápnuto na elektrodu / elektrodový systém 5 μΐ roztoku redoxní látky známé koncentrace, byla změřena elektrochemicá veličina a kapka se následně vysušila (čímž došlo k adsorpci redoxní látky na povrch elektrody), musí se pro vlastní měření nakápnout na elektrodu rovněž 5 pl kapalného vzorku. Tím vznikne stejná koncentrace redoxní látky v kapalném vzorku, potenciálně obsahujícím stanovovaný analyt.A3, optionally an electrode system comprising immobilized particles for affinity reaction with the analyte is contacted with a redox solution and an electrochemical parameter is determined (step i)). Subsequently, the working electrode / electrode system is allowed to air dry, thereby adsorbing the redox material to the surface of the working electrode / electrode system. Addition of the liquid sample to the analyte simultaneously interacts with the analyte with the modified surface (step ii)) and dissolves the redox substance (step iii)), in which solution the electrochemical quantity is measured. As the electrochemical parameter of the working electrode / electrode system surface is altered by the binding of the analyte, the redox signal is also altered, from which the presence and possibly also the concentration of the analyte in the sample can be determined in subsequent steps iv) and v). Thus, the entire assay procedure is performed without the need to rinse the electrode and the result is known in a minimum time after sampling. In order to maintain the condition of the same redox concentration in step (i) and step (iii), the volume of the sample that is dropped onto the electrode system in step (ii) must be the same as the volume of the redox solution in step (i) that was After measuring the electrochemical parameter, allow it to dry on the electrode system. For example, if in step (i) a 5 μΐ solution of a redox solution of known concentration was applied to an electrode / electrode system, the electrochemical was measured and the drop was subsequently dried (thereby adsorbing the redox substance to the electrode surface). electrode also 5 µl of liquid sample. This produces the same concentration of redox in the liquid sample potentially containing the analyte to be determined.
Ve výhodném provedení je imobilizovanou částicí pro afinitní interakci s analytem na povrchu pracovní elektrody protilátka nebo antigen, s výhodou je imobilizovanou částicí celobuněčný antigen bakterie kmene Borrelia sp.In a preferred embodiment, the immobilized particle for affinity interaction with the analyte on the working electrode surface is an antibody or antigen, preferably the immobilized particle is a whole cell antigen of a Borrelia sp.
Ve výhodném provedení je analytem protilátka nebo antigen, přičemž, pokud je imobilizovanou částicí protilátka, je analytem antigen a více versa, s výhodou je analytem protilátka proti bakteriím kmene Borrelia sp.In a preferred embodiment, the analyte is an antibody or an antigen, and when the immobilized particle is an antibody, the analyte is an antigen and more versa, preferably the analyte is an antibody against Borrelia sp.
V jednom provedení je redoxní látkou záporně nabitý hexakyanoželeznatan draselný a hexakyanoželezitan draselný. Je možné použít i jiné typy redoxaktivních látek přednostně nesoucí kladný či záporný náboj. Mezi látky s kladným nábojem patří např. hexaaminruthenium(II/III) chlorid, kobaltocen, ferocen či aminoferocen, látky se záporným nábojem např. Γ'/Τ či ferocenkarboxylová kyselina.In one embodiment, the redox is a negatively charged potassium hexacyanoferrate and potassium ferrocyanide. It is also possible to use other types of redoxactive substances preferably carrying a positive or negative charge. Positive charges include, for example, hexaaminruthenium (II / III) chloride, cobaltocene, ferrocene, or aminopherocene, and negatively charged substances such as Γ '/ Τ or ferrocarboxylic acid.
V jednom provedení měření elektrochemického parametru pro stanovení impedance na rozhraní povrchu pracovní elektrody a roztoku redoxní látky ve vztahu k doplňkové elektrodě přítomné v kapalném vzorku v kroku (iv) je měření elektrického proudu a/nebo elektrického napětí pomocí amperometrie, biamperometrie, potenciometrie a/nebo voltametrie, nej výhodnější je použití biamperometrie.In one embodiment, measuring the electrochemical parameter to determine the impedance at the interface of the working electrode surface and the redox solution relative to the complementary electrode present in the liquid sample in step (iv) is measuring electrical current and / or electrical voltage by amperometry, biamperometry, potentiometry and / or voltammetry, the most preferred is the use of biamperometry.
S výhodou měření elektrického proudu a/nebo elektrického napětí proběhne při hodnotách frekvence střídavého proudu/napětí v rozmezí od jednotek Hz do stovek kHz. Výhodné je omezit měření na jednu či dvě frekvence, čímž se výrazně zjednoduší, zrychlí a zlevní celé stanovení, což je vhodné zejména pro nízkonákladové detekce.Preferably, the measurement of electric current and / or electric voltage is performed at AC / voltage frequency values ranging from Hz to hundreds of kHz. It is advantageous to limit the measurement to one or two frequencies, which greatly simplifies, speeds up and cheaper the whole assay, which is particularly suitable for low-cost detection.
Ve výhodném provedení proběhne měření elektrochemického parametru v kroku (iv) biamperometrickou metodou za použití dvou stejných pracovních elektrod s imobilizovanými částicemi pro afinitní interakci s analytem. V případě použití biamperometrie jsou pracovní elektrody modifikovány stejně (stejný povrch o stejné velikosti je i stejně modifikovaný potenciál mezi těmito elektrodami je tudíž nulový), tudíž mají stejné elektrochemické vlastnosti a měření může probíhat při vloženém nulovém potenciálu, což zjednodušuje analýzu. Dalším faktorem zvýhodňujícím použité měřící uspořádání je fakt, že bez použití biamperometrie, kdy je impedanční měření (vložení střídavého budícího signálu o amplitudě 5 až 10 mV) prováděno při nulovém offsetu stejnosměrné složky napětí, by nebylo možné měřit malé rozdíly ve změně rozložení náboje na rozhraní elektroda/roztok. Při měření v klasickém uspořádání s pracovní aIn a preferred embodiment, the electrochemical parameter is measured in step (iv) by a biamperometric method using two identical working electrodes with immobilized particles for affinity interaction with the analyte. In the case of biamperometry, the working electrodes are modified in the same way (the same surface of the same size is the same modified potential between these electrodes is therefore zero), thus having the same electrochemical properties and measurement can be performed at zero potential input, simplifying analysis. Another factor favoring the measurement arrangement used is that without the use of biamperometry, where impedance measurement (insertion of 5 to 10 mV AC excitation signal) is performed at zero offset of the DC voltage component, it would not be possible to measure small differences in charge distribution change at the interface electrode / solution. When measuring in a classical arrangement with working and
-4CZ 2017 - 483 A3 referentní elektrodou je vložen buď potenciál vhodný pro měření redoxního mediátoru, čímž se systém vychýlí z rovnováhy vzhledem k potenciálovému rozdílu systému dvou elektrod vložených do roztoku (elektroda/roztok-roztok/elektroda), nebo v druhém případě, kdy systém není vychýlen vzhledem k rozdílu potenciálu elektroda/roztok-roztok/elektroda, je systém vychýlen vzhledem k redoxnímu potenciálu redoxního páru mediátoru. Tyto rozdíly v aplikovaném potenciálu offsetu při měření biamparometrií nenastávají.The reference electrode inserts either the potential suitable for measuring the redox mediator, thereby deflecting the system due to the potential difference of the system of the two electrodes embedded in the solution (electrode / solution-solution / electrode), or in the second case the system is not biased due to the potential difference of the electrode / solution-solution / electrode, the system is biased due to the redox potential of the redox mediator pair. These differences in applied offset potential do not occur when measuring biamparometry.
Pracovní elektrodou pro detekci analytu v kapalném vzorku je s výhodou elektroda vybraná ze skupiny zahrnující kovovou a uhlíkovou elektrodu, s výhodou je elektroda vybraná ze skupiny obsahující měděnou, stříbrnou, platinovou, zlatou, nerezovou a kompozitní uhlíkovou elektrodu, a na povrchu obsahuje imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem, s výhodou jsou imobilizovanými částicemi antigen nebo protilátka. S výhodou lze pracovní elektrodu připravit sítotiskem nebo fotolitograficky dle obecně známých postupů (patent 291411 a La Belle, Gerlach, Svárovsky, Joshi, Analytical Chemistry 79 (2007) 6959). Imobilizované částice pro interakci s analytem jsou navázané, s výhodou kovalentně, na polymerní vrstvě nesoucí aktivovatelné funkční skupiny. Tato polymerní vrstva je adherovaná na povrchu pracovní elektrody. Polymerní vrstvou může být například poly-L-lysin, poly-allylamin, poly-ethylenimin, chitosan, poly-akrylová kyselina a jiné.The working electrode for detecting the analyte in the liquid sample is preferably an electrode selected from the group consisting of a metal and carbon electrode, preferably an electrode selected from the group consisting of copper, silver, platinum, gold, stainless and composite carbon electrodes, and affinity interaction with the analyte, preferably the immobilized particles are an antigen or an antibody. Advantageously, the working electrode can be prepared by screen printing or photolithography according to generally known methods (patent 291411 and La Belle, Gerlach, Svárovský, Joshi, Analytical Chemistry 79 (2007) 6959). The immobilized particles for interaction with the analyte are bound, preferably covalently, to a polymer layer carrying activatable functional groups. This polymer layer is adhered to the surface of the working electrode. The polymer layer may be, for example, poly-L-lysine, poly-allylamine, polyethyleneimine, chitosan, polyacrylic acid and others.
Ve výhodném provedení je pracovní elektrodou pro detekci analytu v kapalném vzorku kovová nebo uhlíková elektroda, která na svém povrchu obsahuje adsorbovaný poly-L-lysin a/nebo polyallylamin a/nebo poly-ethylenimin, ke kterému jsou kovalentně navázány částice pro afinitní interakci s analytem, s výhodou antigen nebo protilátka. Nejvýhodněji je pracovní elektroda zlatá nebo platinová, potažená vrstvou poly-L-lysinu o tloušťce 20 až 50 nm (Colville, Tompkins, Rutenberg, Jericho, Langmuir 2010 26 (4), 2639) s kovalentně navázaným celobuněčným antigenem bakterie kmene Borrelia sp.In a preferred embodiment, the working electrode for detecting an analyte in a liquid sample is a metal or carbon electrode that contains adsorbed poly-L-lysine and / or polyallylamine and / or polyethyleneimine to which the particles are covalently bound for affinity interaction with the analyte , preferably an antigen or antibody. Most preferably, the working electrode is gold or platinum coated with a 20-50 nm layer of poly-L-lysine (Colville, Tompkins, Rutenberg, Jericho, Langmuir 2010 26 (4), 2639) with a covalently bound whole cell antigen of Borrelia sp.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob přípravy pracovní elektrody pro detekci analytu v kapalném vzorku způsobem podle předkládaného vynálezu, který obsahuje následující kroky:The present invention further provides a method of preparing a working electrode for detecting an analyte in a liquid sample by the method of the present invention, comprising the steps of:
(i) kovová nebo uhlíková elektroda se inkubuje s kladně nabitým polymemím nosičem nesoucím volné/konjugovatelné aminoskupiny (tj. polymerní nosič se vyznačuje takovým zastoupení aminoskupin ve své struktuře, že má celkový náboj kladný při fyziologickém pH, což znamená, že hodnota pl takovéhoto nosiče je nad hodnotou pH 7,4), zejména s poly-L-lysinem a/nebo polyallylaminem a/nebo poly-ethyleniminem, s výhodou o molekulové hmotnosti od 30 do 70 kDa, po dobu alespoň 30 minut; následně se opláchne vodou či pufrem, případně se přebytek oplachovacího roztoku odfoukne v proudu stlačeného vzduchu.(i) the metal or carbon electrode is incubated with a positively charged polymeric carrier carrying free / conjugatable amino groups (i.e., the polymeric carrier is characterized by such amino group representation in its structure that it has a total charge positive at physiological pH, meaning that the pI value of such carrier it is above pH 7.4), in particular with poly-L-lysine and / or polyallylamine and / or polyethyleneimine, preferably having a molecular weight of from 30 to 70 kDa, for at least 30 minutes; then rinse with water or buffer, or excess excess rinse solution is blown off in a stream of compressed air.
(ii) výsledná elektroda potažená vrstvou kladně nabitého polymemího nosiče obsahujícího volné aminoskupiny, s výhodou potažená vrstvou poly-L-lysinu a/nebo poly-allylaminu a/nebo polyethyleniminu, se inkubuje s roztokem nízkomolekulární látky o molekulové hmotnosti do 1000 kDa, nesoucí alespoň dvě karboxylové skupiny, z nichž alespoň jedna je aktivovaná pro konjugaci s aminoskupinami polymemího nosiče, s výhodou je touto nízkomolekulární látkou kyselina citrónová s EDC/NHS aktivovanou alespoň jednou COOH skupinou, po dobu alespoň 15 minut za vzniku karboxylem modifikovaného povrchu ve formě mono vrstvy, karboxylové skupiny pro vazbu k poly-L-lysinu a/nebo poly-allylaminu a/nebo poly-ethyleniminu se aktivují pomocí karbodiimidu, s výhodou EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid), za vzniku kovalentní vazby mezi karboxylovou skupinou nízkomolekulární látky nesoucí alespoň dvě karboxylové skupiny a aminovou skupinou poly-L-lysinu a/nebo poly-allylaminu a/nebo poly-ethyleniminu.(ii) the resulting electrode coated with a layer of positively charged polymeric carrier containing free amino groups, preferably coated with a layer of poly-L-lysine and / or poly-allylamine and / or polyethyleneimine, is incubated with a solution of low molecular weight molecular weight up to 1000 kDa two carboxyl groups, at least one of which is activated to conjugate to the amino groups of the polymeric carrier, preferably the low molecular weight substance is citric acid with EDC / NHS activated by at least one COOH group for at least 15 minutes to form the carboxyl modified surface as a mono layer; carboxyl groups for binding to poly-L-lysine and / or poly-allylamine and / or polyethyleneimine are activated with carbodiimide, preferably EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), to form a covalent bond between a carboxyl group of a low molecular weight substance carrying at least two carboxyl groups and an amino group of poly-L-lys and / or poly-allylamine and / or polyethyleneimine.
(iii) pro vazbu k částicím pro afinitní interakci se zbývající volné karboxylové skupiny na povrchu elektrody aktivují pomocí karbodiimidu, s výhodou EDC (l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl) karbodiimid), a N-hydroxysukcinimidu po dobu alespoň 20 minut za(iii) for binding to the particles for affinity interaction, the remaining free carboxyl groups on the electrode surface are activated with carbodiimide, preferably EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), and N-hydroxysuccinimide for at least 20 minutes in
-5 CZ 2017 - 483 A3 vzniku aktivních esterů na povrchu polymemí (s výhodou poly-L-lysinové) vrstvy;A3 of formation of active esters on the surface of the polymer (preferably poly-L-lysine) layer;
(iv) částice pro afinitní interakci s analytem reagují s N-hydroxysukcinimidem aktivovanými karboxylovými skupinami na povrchu polymemího nosiče během alespoň 30 minut inkubace za vzniku kovalentní vazby mezi polymemím nosičem, kterým je potažen povrch elektrody, a částicí pro afinitní reakci s analytem.(iv) the analyte affinity interaction particles react with N-hydroxysuccinimide activated carboxyl groups on the surface of the polymeric support during at least 30 minutes of incubation to form a covalent bond between the polymeric support coated with the electrode surface and the analyte affinity reaction particle.
V nej výhodnějším provedení způsobu přípravy pracovní elektrody je kladně nabitým polymemím nosičem poly-L-lysin, nízkomolekulámí látkou nesoucí alespoň dvě karboxylové skupiny je kyselina citrónová a částicí pro afinitní reakci s analytem je celobuněčný antigen bakterie kmene Borrelia sp.In a most preferred embodiment of the method for preparing the working electrode, the positively charged polymeric carrier is poly-L-lysine, the low molecular weight carrying at least two carboxyl groups is citric acid, and the analyte affinity particle is a whole cell antigen of Borrelia sp.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž sada pro stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku způsobem podle předkládaného vynálezu, která obsahuje alespoň jednu pracovní elektrodu pro detekci analytu v kapalném vzorku, vybranou ze skupiny zahrnující kovovou a uhlíkovou elektrodu, s výhodou je elektroda vybraná ze skupiny obsahující měděnou, stříbrnou, platinovou, zlatou, nerezovou a pastovou uhlíkovou elektrodu, obsahující na povrchu imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem, s výhodou jsou imobilizovánými částicemi antigen nebo protilátka, pro připojení k měřicímu přístroji pro kvantifikaci elektrochemického parametru vybraného z impedance, proudu a/nebo napětí; a alespoň jednu doplňkovou elektrodu pro připojení k měřicímu přístroji pro kvantifikaci elektrochemického parametru vybraného z impedance, proudu a/nebo napětí; přičemž sada dále obsahuje měřicí přístroj pro kvantifikaci elektrochemického parametru vybraného z impedance, proudu a/nebo napětí; redoxní látku, která má v roztoku opačný náboj než stanovovaný analyt, popřípadě její roztok ve vodě, pufru nebo fyziologickém roztoku; přičemž popřípadě sada dále obsahuje analyzátor pro připojení k měřicímu přístroji a/nebo řídicí jednotku (např. počítač nebo mobilní telefon) pro připojení k měřicímu přístroji nebo k analyzátoru; a/nebo displej, který může být integrální součástí měřicího přístroje nebo analyzátoru nebo řídicí jednotky; a/nebo světlo emitující diodu, která může být integrální součástí měřicího přístroje nebo analyzátoru nebo řídicí jednotky. Měřicím přístrojem je přístroj schopný změřit a kvantifikovat elektrochemický parametr, s výhodou je měřicím přístrojem potenciostat, amperometr, voltmetr. Světlo emitující dioda může být nastavená tak, aby svítila při přednastavené konkrétní prahové hodnotě elektrochemického parametru, s výhodou impedance.The present invention also provides a kit for determining the presence of an analyte in a liquid sample according to the method of the present invention comprising at least one working electrode for detecting an analyte in a liquid sample selected from the group consisting of metal and carbon electrodes, preferably an electrode selected from copper. a silver, platinum, gold, stainless and paste carbon electrode comprising surface-immobilized particles for affinity interaction with an analyte, preferably the immobilized particles are antigen or antibody, for connection to a meter for quantifying an electrochemical parameter selected from impedance, current and / or voltage ; and at least one additional electrode for connection to a meter for quantifying an electrochemical parameter selected from impedance, current and / or voltage; wherein the kit further comprises a measuring device for quantifying an electrochemical parameter selected from impedance, current and / or voltage; a redox substance having an opposite charge in solution to the analyte to be determined, or a solution thereof in water, buffer or saline; optionally, the kit further comprising an analyzer for connection to the measuring instrument and / or a control unit (eg, computer or mobile phone) for connection to the measuring instrument or analyzer; and / or a display which may be an integral part of the measuring instrument or the analyzer or control unit; and / or a light emitting diode, which may be an integral part of the measuring instrument or analyzer or control unit. The measuring instrument is an instrument capable of measuring and quantifying the electrochemical parameter, preferably the measuring instrument is a potentiostat, an amperometer, a voltmeter. The light emitting diode may be set to illuminate at a predetermined specific threshold value of the electrochemical parameter, preferably impedance.
Elektrodu podle předkládaného vynálezu lze vyrobit s vynaložením jen nízkých nákladů použitím metody sítotisku (výroba sítotiskových elektrod) nebo fotolitografických metod (metoda tvorby desek plošných spojů). Litograficky generované tvary (nejčastěji měděné) pak mohou být modifikovány, např. galvanickým pokovením, kdy jako materiály vylučované na litograficky generované měděné struktury jsou použity nej častěji ušlechtilé kovy jako zlato, platina, stříbro, paladium či jejich kombinace (směs či různé pokrytí různých elektrod). Použity mohou být i elektrody vyrobené jiným způsobem (např. pastové uhlíkové). Díky nízkým nákladům je možné celou elektrodu použít pouze pro jediné měření, odpadá tak problém s infekčností vzorku.The electrode of the present invention can be manufactured at low cost by using the screen printing method (manufacturing screen printing electrodes) or the photolithographic methods (printed circuit board forming method). The lithographically generated shapes (most often copper) can then be modified, for example by electroplating, where noble metals such as gold, platinum, silver, palladium or combinations thereof (a mixture or different coverage of different electrodes) are used as materials deposited on lithographically generated copper structures. ). Electrodes made by other means (eg, paste carbon) may also be used. Due to the low cost, the entire electrode can be used for only one measurement, eliminating the problem of sample infectivity.
Výstupní signál může být zobrazený na obrazovce připojeného počítače, integrovaného displeje nebo formou signalizace svitu světlo emitující diody při nastaveném určité hraniční hodnotě signálu. Při nastavení hraniční hodnoty signálu mezi pozitivní a negativní hodnotou analytu ve vzorku lze signalizaci zjednodušit na pouhý svit LED - např. negativní signál - svítí zelená barva, pozitivní signál - svítí červená barva.The output signal can be displayed on a connected computer screen, an integrated display, or a light emitting diode signal at a certain signal threshold. When setting the signal limit between the positive and negative values of the analyte in the sample, the signaling can be simplified to a simple LED - for example, the negative signal - green, the positive signal - red.
Řídicí jednotkou může být například mobilní telefon, který slouží jako napájecí zdroj a/nebo jako měřicí přístroj pro měření a zobrazování signálu impedance, popřípadě prostřednictvím vestavěného modulu fotoaparátu kvantitativně odečíst intenzitu svitu indikační světelné diody.The control unit can be, for example, a mobile phone, which serves as a power supply and / or as a measuring device for measuring and displaying the impedance signal, or, by means of a built-in camera module, quantitatively read the light intensity of the indicator light.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití sady pro stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku a/nebo způsobu stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku podleThe present invention further provides the use of a kit for determining the presence of an analyte in a liquid sample and / or a method for determining the presence of an analyte in a liquid sample according to the invention.
-6CZ 2017 - 483 A3 předkládaného vynálezu pro kvalitativní a/nebo kvantitativní a/nebo semikvantitativní detekci přítomnosti protilátky a/nebo antigenu a/nebo bakterií v kapalném vzorku.The present invention for the qualitative and / or quantitative and / or semi-quantitative detection of the presence of antibody and / or antigen and / or bacteria in a liquid sample.
Ve výhodném provedení je použití pro detekci přítomnosti protilátek proti bakteriím kmene Borrelia sp. v kapalném vzorku.In a preferred embodiment, the use is for detecting the presence of antibodies against Borrelia sp. in a liquid sample.
Předkládaný vynález umožňuje rychlé stanovení analytu v kapalném vzorku prostřednictvím afinitní interakce mezi specificky modifikovaným povrchem elektrody a detekovanou látkou, analytem. Principem je detekce imunoafinitní interakce, kdy vazba například protilátky na antigenem modifikovaný povrch způsobí pokles impedance v prostředí negativně nabité redoxní látky, přičemž míra poklesu impedance odpovídá množství navázaného analytu (např. protilátky) na povrch elektrody, resp. koncentraci protilátky ve vzorku. Podmínkou pro správnou funkci je kombinace opačně nabité redoxní značky a analytu vázajícího se na detekční povrch, např. záporně nabitá redoxní značky a pozitivně nabitý analyt (protein) za daného pH (např. za fyziologického pH 7,4 nebo nižšího pH).The present invention allows rapid determination of an analyte in a liquid sample through an affinity interaction between a specifically modified electrode surface and a detected analyte substance. The principle is the detection of an immunoaffinity interaction, where the binding of, for example, an antibody to an antigen-modified surface causes a decrease in impedance in the environment of a negatively charged redox, the rate of decrease in impedance corresponding to the amount of analyte bound (e.g. concentration of antibody in the sample. A condition for proper functioning is a combination of an oppositely charged redox tag and an analyte binding to the detection surface, e.g., a negatively charged redox tag and a positively charged analyte (protein) at a given pH (e.g., physiological pH 7.4 or lower pH).
Tento princip stanovení je odlišný od stavu techniky, kde při detekci imunoafinitních interakcí dochází k nárůstu impedance při navázání proteinu na povrch - vrstva proteinu způsobí snížení propustnosti modifikační vrstvy elektrody prostupujícím látkám, což má za následek zvýšení odporu přenosu hmoty a tím i nárůst odporu/impedance.This assay principle differs from the state of the art, where the detection of immunoaffinity interactions increases the impedance of protein binding to the surface - the protein layer reduces the permeability of the electrode modification layer to the permeating substances, resulting in increased mass transfer resistance and thus increased resistance / impedance .
Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku podle předkládaného vynálezu je proveden metodou přímého stanovení (není použit měřící přístup kompetice apod.) a měření je provedeno bez použití značky (ve smyslu značky jakožto signální molekuly konjugované s jedním partnerem z detekční afinitní interakce).The method for determining the presence of an analyte in a liquid sample according to the present invention is performed by a direct assay method (no competition approach is used, etc.) and the measurement is performed without the use of a label.
Stručný popis výkresůBrief description of the drawings
Obr. 1: Blokové schéma impedančního analyzátoru sestávající z počítače 1, USB převodníku 2, mikrokontroléru 3, zesilovače 4, senzoru 5, I/U převodníku 6 a uživatelského rozhraní 7. Vztahová značka 8 označuje vlastní impedanční analyzátor.Giant. 1: Block diagram of an impedance analyzer consisting of a computer 1, a USB converter 2, a microcontroller 3, an amplifier 4, a sensor 5, an I / U converter 6 and a user interface 7. Reference numeral 8 denotes the impedance analyzer itself.
Obr. 2: Stanovení analytu, anti-HSA protilátek (HSA, lidský sérová albumin), v prostředí 1 mg/ml balastního proteinu BSA (hovězí sérový albumin) ověřenou metodou. Znázornění hodnot reálné složky impedance měřené při frekvenci 2 Hz, amplituda 10 mV v prostředí 5 mM ferri/ferrokyanidu.Giant. 2: Determination of an analyte, anti-HSA antibodies (HSA, human serum albumin), in an environment of 1 mg / ml ballast protein BSA (bovine serum albumin) by a validated method. Representation of real component impedance measured at 2 Hz, 10 mV amplitude in 5 mM ferri / ferrocyanide.
Obr. 3: Příklad změny reálné složky elektrochemické impedance pro negativní a pozitivní vzorek přítomnosti anti-Borelie protilátek v krevním séru. Zobrazena je reálná složka impedance pro celé proměřované frekvenční spektrum 6 stejných litograficky připravených elektrod - elektrody se stejnými výchozími vlastnostmi. Tři byly inkubovány s pozitivním a tři byly inkubovány s negativním vzorkem krevního séra.Giant. 3: Example of a change in the real component of electrochemical impedance for a negative and positive sample of the presence of anti-Borrelia antibodies in blood serum. The real component of impedance for the whole measured frequency spectrum of 6 identical lithographically prepared electrodes - electrodes with the same initial properties is shown. Three were incubated with the positive and three were incubated with the negative blood serum sample.
Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Příklad 1: Konstrukce elektrody, zapojení měřicího přístroje a stanovení koncentrace modelového analytu protilátky anti-HSA ve vzorkuExample 1: Construction of an electrode, connection of a measuring instrument and determination of the concentration of a model anti-HSA antibody analyte in a sample
Měření impedance je možné uskutečnit jakýmkoli měřícím přístrojem vhodným pro měření impedance. S výhodou lze použít miniaturizovaný impedanční analyzátor (blokové schéma na Obr. 1).The impedance measurement can be performed with any impedance measuring device. Preferably, a miniaturized impedance analyzer can be used (block diagram in Fig. 1).
Modifikace elektrod byla provedena kombinací poly-L-lysinu s následnou vazbou antigenuElectrode modification was performed by combining poly-L-lysine with subsequent antigen binding
-7 CZ 2017 - 483 A3 (lidský sérový albumin, HSA) skrze citrát aktivovaný EDC (karbodiimid). Takto modifikovaný povrch byl následně inkubován se vzorkem analytu (anti-HSA protilátky). Nakonec byla elektroda ponořena do roztoku redoxní látky (ferri/ferrokyanid) a byla změřena její elektrochemická impedance v tomto roztoku. Ze změn impedance byla stanovena koncentrace analytu (anti-HSA) ve vzorku. S klesající impedancí roste koncentrace protilátky ve vzorku (Obr. 2).-7 CZ 2017 - 483 A3 (human serum albumin, HSA) via citrate activated EDC (carbodiimide). The modified surface was then incubated with an analyte (anti-HSA antibody) sample. Finally, the electrode was immersed in a solution of redox (ferri / ferrocyanide) and its electrochemical impedance was measured in this solution. The analyte concentration (anti-HSA) in the sample was determined from the impedance changes. As the impedance decreases, the antibody concentration in the sample increases (Fig. 2).
Detailní popis metodiky:Detailed description of the methodology:
- Elektrody byly pokryty vrstvou poly-L-lysinu po 30 min inkubaci v roztoku 50 pg/ml poly-Llysin, 50 mM PBS pH 7,4 (30-70 kDa).The electrodes were covered with a layer of poly-L-lysine after 30 min incubation in a solution of 50 µg / ml poly-Llysine, 50 mM PBS pH 7.4 (30-70 kDa).
- Aktivace povrchu pomocí 50 mM kyseliny citrónové s 150 mM EDC/NHS v prostředí 500 mM MES pufru pH 5,6 po dobu 30 min. Aktivované molekuly s karboxylovými skupinami umožní následnou vazbu molekul proteinu.Surface activation with 50 mM citric acid with 150 mM EDC / NHS in 500 mM MES buffer pH 5.6 for 30 min. Activated molecules with carboxyl groups allow subsequent binding of the protein molecules.
- Bezprostředně po předchozím kroku inkubace 60 min s 1 mg/ml HSA/100 mM MES pH 5,6, třepáno 150 rpm. Tímto dojde k navázání proteinu na povrch elektrod. 30-45 min inkubace s protilátkou anti-HSA v prostředí 1 mg/ml BSA, 50 mM PBS pH 7,4, třepáno 150 rpm, 4 plImmediately after the previous incubation step of 60 min with 1 mg / ml HSA / 100 mM MES pH 5.6, shaken 150 rpm. This will bind the protein to the electrode surface. 30-45 min incubation with anti-HSA antibody in 1 mg / ml BSA medium, 50 mM PBS pH 7.4, shaken 150 rpm, 4 µl
- Každý krok je následován oplachem destilovanou vodou a osušení v proudu stlačeného vzduchu.- Each step is followed by rinsing with distilled water and drying in a stream of compressed air.
- Měření impedance elektrod v prostředí 2,5 mM ferrikyanidu a 2,5 mM ferrokyanidu v 50 mM PBS pufru, pH 7,4.- Electrode impedance measurement in 2.5 mM ferricyanide and 2.5 mM ferrocyanide in 50 mM PBS buffer, pH 7.4.
Na Obr. 2 je znázorněno stanovení třech koncentrací anti-HSA (0, 50, 200 pg/ml) v roztoku proteinu BSA (hovězí sérový albumin) o koncentraci 1 mg/ml, který představuje velké množství balastních specificky neinteragujících proteinů přítomných v reálných vzorcích, tzn. signál pozadí vzorku. Každá hodnota koncentrace byla stanovena ve čtyřech opakováních - každá hodnota představuje jeden separátní elektrodový systém modifikovaný a měřený dle popisu metodiky.In FIG. 2 shows the determination of three concentrations of anti-HSA (0, 50, 200 pg / ml) in a 1 mg / ml solution of BSA (bovine serum albumin), which represents a large amount of ballast specific non-interacting proteins present in real samples; signal background pattern. Each concentration value was determined in four replicates - each value representing one separate electrode system modified and measured according to the methodology description.
Příklad 2: Stanovení koncentracepritilátky anti-Borrelie ve vzorkuExample 2: Determination of anti-Borrelia antibody concentration in a sample
Stejným způsobem jako v Příkladu 1 bylo stanoveno množství (přítomnost) anti-Borelie protilátek ve vzorku krevního séra. V tomto případě se postupovalo stejně jako v Příkladu 1, jen místo proteinu HSA se navázal celobuněčný antigen Borrelie (koncentrace 0,1 mg/ml v 100 mM MES pufru o pH 5,6). Po modifikaci antigenem je elektroda inkubována se zředěným vzorkem séra, které potencionálně obsahuje anti-Borrelia protilátky. Ze změn impedance měřených v roztoku ferri/ferrokyanidu lze stanovit přítomnost těchto protilátek v séru (Obr. 3). Dva vzorky lidských sér (jeden pozitivní, druhý negativní z pohledu přítomnosti anti-Borelie protilátek) byly měřeny šesti různými elektrodovými systémy připravenými dle popisu. Křivky v Obr. 3 jsou záznamy měření impedance jednotlivých elektrod při různých frekvencích (rozpětí od 2 Hz do 100 000 Hz). Data jsou ve formě Nyquistova grafu. Pozitivní vzorek obsahuje 3,04 IP protilátek, což je množství protilátek vyjádřených v indexu pozitivity stanovené metodou ELIS A (index pozitivity je poměr optické denzity vzorku k optické denzitě hraniční kontroly). Negativní sérum neobsahuje žádné protilátky anti-Borelie.In the same manner as in Example 1, the amount (presence) of anti-Borrelia antibodies in the blood serum sample was determined. In this case, as in Example 1, only the whole cell Borrelie antigen (0.1 mg / ml in 100 mM MES buffer pH 5.6) was bound instead of the HSA protein. After antigen modification, the electrode is incubated with a diluted serum sample that potentially contains anti-Borrelia antibodies. The presence of these antibodies in the serum can be determined from changes in impedance measured in ferri / ferrocyanide solution (Fig. 3). Two human serum samples (one positive, the other negative for the presence of anti-Borrelia antibodies) were measured with six different electrode systems prepared as described. The curves in FIG. 3 are records of impedance measurements of individual electrodes at different frequencies (range from 2 Hz to 100,000 Hz). The data is in the form of a Nyquist graph. The positive sample contains 3.04 IP antibodies, which is the amount of antibodies expressed in the ELIS A positivity index (positivity index is the ratio of the optical density of the sample to the optical density of the border control). Negative serum contains no anti-Borrelia antibodies.
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Vynález je zejména vhodný k rychlému a levnému stanovení bakteriálních antigenů či odpovídajících protilátek v tělních tekutinách testovaných jedinců s podezřením na onemocnění,The invention is particularly suitable for the rapid and inexpensive determination of bacterial antigens or corresponding antibodies in the body fluids of test subjects suspected of having a disease,
CZ 2017 - 483 A3 např. stanovení protilátek proti bakteriím kmene Borelia sp. v krevním séru. Vynález lze použít pro jakákoli serologická stanovení - stanovují se protilátky vytvářené proti patogenu, toxinu či jiné cizorodé látce.CZ 2017 - 483 A3 eg determination of antibodies against bacteria of Borelia sp. in blood serum. The invention can be used for any serological assay - antibodies raised against a pathogen, toxin or other foreign substance are determined.
PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS
Claims (14)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-483A CZ307792B6 (en) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | Method of determining the presence of an analyte in a liquid sample and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-483A CZ307792B6 (en) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | Method of determining the presence of an analyte in a liquid sample and its use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017483A3 true CZ2017483A3 (en) | 2019-03-06 |
| CZ307792B6 CZ307792B6 (en) | 2019-05-09 |
Family
ID=66344458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-483A CZ307792B6 (en) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | Method of determining the presence of an analyte in a liquid sample and its use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307792B6 (en) |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8328520D0 (en) * | 1983-10-25 | 1983-11-23 | Serono Diagnostics Ltd | Methods of assay |
| IL108726A (en) * | 1994-02-22 | 1999-12-31 | Yissum Res Dev Co | Electrobiochemical method and system for the determination of an analyte which is a member of a recognition pair in a liquid medium and electrodes therefor |
| JP3395673B2 (en) * | 1998-11-18 | 2003-04-14 | 株式会社豊田中央研究所 | Specific binding pair measurement method using micro oxygen electrode |
| US8679772B2 (en) * | 2008-06-06 | 2014-03-25 | Agency For Science, Technology And Research | Immunoassay |
| RO129261B1 (en) * | 2011-07-04 | 2017-01-30 | Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Tehnologii Izotopice Şi Moleculare | Process for making a vitreous coal electrode modified with a nanostructured assembly based on gold and l-cysteine nanoparticles |
| KR102216258B1 (en) * | 2014-09-02 | 2021-02-18 | 광주과학기술원 | Sensor of detecting norovirus and sensing method using the sensor |
| EP3362785A4 (en) * | 2015-10-14 | 2019-06-12 | University Health Network (UHN) | Electrochemical assay for a protein analyte |
-
2017
- 2017-08-23 CZ CZ2017-483A patent/CZ307792B6/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ307792B6 (en) | 2019-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boonkaew et al. | Electrochemical paper-based analytical device for multiplexed, point-of-care detection of cardiovascular disease biomarkers | |
| CN105556307B (en) | The bioassay of electrochemistry lateral flow and biosensor | |
| Boonyasit et al. | A multiplexed three-dimensional paper-based electrochemical impedance device for simultaneous label-free affinity sensing of total and glycated haemoglobin: The potential of using a specific single-frequency value for analysis | |
| Dulay et al. | Electrochemical detection of celiac disease-related anti-tissue transglutaminase antibodies using thiol based surface chemistry | |
| Rahmati et al. | An electrochemical immunosensor using SARS-CoV-2 spike protein-nickel hydroxide nanoparticles bio-conjugate modified SPCE for ultrasensitive detection of SARS‐CoV‐2 antibodies | |
| Akkapinyo et al. | Development of a multiplex immunochromatographic strip test and ultrasensitive electrochemical immunosensor for hepatitis B virus screening | |
| WO2007116811A1 (en) | Method for determination of substance | |
| US20210063334A1 (en) | Apparatus and methods for detection of diabetes-associated molecules using electrochemical impedance spectroscopy | |
| Truong et al. | Development of label-free impedimetric Hcg-immunosensor using screen-printed electrode | |
| US20180011054A1 (en) | Metal ion detection method, test substance detection method | |
| CN108982605A (en) | A kind of endotoxin aptamer sensor and its endotoxic method of detection based on copper-rich ionic material label | |
| Huang et al. | Electrochemical immunosensor detection for lactoferrin in milk powder | |
| US20050176067A1 (en) | Biosensor for determining an allergen with operating procedures | |
| US20210332405A1 (en) | Methods for immunoassays using electrochemical measurement | |
| Yaiwong et al. | A new portable toluidine blue/aptamer complex-on-polyethyleneimine-coated gold nanoparticles-based sensor for label-free electrochemical detection of alpha-fetoprotein | |
| Oliveira et al. | Development of impedimetric and optical calcium biosensor by using modified gold electrode with porcine S100A12 protein | |
| AU2013314262B2 (en) | Potentiometric sensor | |
| Boonkaew et al. | Point-of-care testing for C-reactive protein in a sequential microfluidic device | |
| Ni et al. | A one-step potentiometric immunoassay for plasma cardiac troponin I using an antibody-functionalized bis-MPA–COOH dendrimer as a competitor with improved sensitivity | |
| KR20140110795A (en) | Biosensor strips using redox cycling | |
| Norfun et al. | Electrochemical detection of human interleukin-15 using a graphene oxide-modified screen-printed carbon electrode | |
| JP2021533337A (en) | Improved electrodes for electrochemical devices | |
| WO2023105389A1 (en) | Electrode for detecting analytes, relative biosensor and production method | |
| CZ2017483A3 (en) | Method for determining the presence of an analyte in a liquid sample, an analyte detection electrode in a liquid sample, a method of its preparation, a kit for determining the presence of an analyte and its use | |
| Adhikari et al. | Electrochemical study of dimensional specific carbon nanomaterials modified glassy carbon electrode for highly sensitive label-free detection of immunoglobulin A |