CZ2016843A3 - Kopolymery hyaluronanu s polyhydroxyalkanoáty, způsob jejich přípravy, vlákna a výrobky, které je obsahují - Google Patents

Abstract

Řešení se týká kopolymeru hyaluronamu a polyhydroxyalkanoátů a způsobu jeho přípravy, s výhodou zahrnujícího jako první krok aktivaci PHA a jako druhý krok modifikaci hyaluronanu roubováním PHA na něj. Výhodná aktivační činidla zahrnují CDI nebo HSTU. Dále se rovněž týká vláken obsahujících kopolymer a způsobu jejich výroby, stejně jako produktů obsahujících uvedená vlákna.

Description

Tento vynález se týká kopolymerů obsahujících esterové deriváty hyaluronanu sodného nebo jeho soli a polyhydroxyalkanoátů a způsobu jejich syntézy a jejich použití při přípravě nanovláken nebo scaffoldů z nich vyrobených.

Dosavadní stav techniky

Polyhydroxyalkonáty (PHAs) jsou přírodní biopolymery (polyestery) syntetizované řadou bakterií jako materiál k uchovávání energie a uhlíku. PHA polymery mohou tvořit až 90 % suché hmotnosti buňky bakterie a nacházejí se ve formě oddělených granulí uvnitř bakteriálních buněk. K syntéze PHA obvykle dochází při fermentaci za podmínek omezených živin a za nadbytku uhlíku. Obecný vzorec PHA je uveden na obrázku ΙΑ. V závislosti na počtu uhlíků v jejich opakujících se jednotkách mohou být PHA rozděleny na PHA s krátkým řetězcem (SCL-PHAs) a PHA se středně dlouhým řetězcem, (MCL-PHAs, obrázek 1B). Jinými slovy, jsou tvořeny krátkými bočními skupinami, kterými jsou C3-5hydroxykyseliny, zatímco relativně dlouhé boční skupiny jsou Có-ishydroxykyseliny. Mechanické a tepelné vlastnosti PHA závisí hlavně na počtu uhlíků v monomemí jednotce a na její molekulové hmotnosti. Polyhydroxybutyrát (PHB) a polyhyroxybutyrát-hydroxyvalerát (PHBV) jsou komerčně používány jako biodegradabilní náhrada syntetických spotřebních pryskyřic a jsou rozsáhle studovány pro použití v biomedicínských aplikacích. Příklady těchto biomedicínských aplikací zahrnují řízené uvolňování (Michalak, Marek et al. 2013), formulaci tablet, chirurgické nitě, krytí ran, lubrikační prášky, krevní cévy, tkáňové scaffoldy, chirurgické implantáty ke spojení trubicovitých částí těla, fixační pláty pro zlomeniny kostí a další ortopedické použití, jak je uvedeno v evropské patentové přihlášce č. 754 467 Al. Avšak ukázalo se, že PHBs a PHBVs způsobují při implantaci in vivo akutní zánětlivé reakce (Valappil, Misra et al. 2006).

PHA polymery jsou obvykle tvořeny 3-hydroxykyselinami a v některých případech 4-, 5- a 6hydroxykyselinami. Esterové vazby odvozené od těchto hydroxykyselin jsou obecně méně náchylné k hydrolýze než esterové vazby odvozené od 2-hydroxykyselin, což polymeru dodává vysokou stabilitu vůči hydrolýze (Martin, Skraly et al. 2004).

HDD

Vzorec I. A) obecný molekulový vzorec PHA polymerů. B) Vzorec, ve kterém jsou ilustrovány různé možné alkylové boční skupiny, kde SCL-PHA znamená „PHA s krátkým řetězcem“ a MCL-PHA znamená „PHA se středně dlouhým řetězcem“, oba termíny mají běžný známý význam, r je celé číslo od 1 do 100. PHA obsahují ve struktuře typicky x = 1-8 a s = 100 až 1 000 různých segmentů. Krátké boční PHA jsou definovány při m = 1 (nebo 3HB).

Pro efektivní zapracování musí být tyto polymery solubilizovány. PHA jsou nejčastěji solubilizovány v chlorovaných organických rozpouštědlech, v závislosti na chemické struktuře. Maximální rozpustnost PHB (80%) byla pozorována v chloroformu. Naopak v methanolu (95%) bylo pozorováno srážení (Mahapatra, Suresh Kumar et al. 2007). Superkritický CO2 je použit pro solubilizaci a proces asistované extruze (Khosravi-Darani, Vasheghani-Farahani et al. 2003). Nástroje vyrobené z PHA, s řízenými rychlostmi degradace, jsou popsány v US patentu č. US 20080095823 Al (a rodině patentů). I když patent popisuje důležitost chemické modifikace úplné nebo částečné, příklady chemické modifikace nebyly popsány. Avšak autoři zdůrazňovali potřebu přídavku externích činidel k dodání porozity do nástrojů k urychlení doby • · · · • · ···· · · • · ··· ♦ · · · ··· · · · · · ··· · · · · · ·· fr · · ···· ·· r· · ·· · ····· degradace, což znamená, že polymer je tvořen pouze vysokomolekulámími polymery, jak bylo dříve známo odborníkům z oboru.

Zpracování polyhydroxyalkanoátů

PHA mohou být zapracovány do scaffoldů pro tkáňové inženýrství za použití širokého rozmezí technik zpracování polymerů. Výhodné způsoby zpracování scaffoldů pro tkáňové inženýrství s PHA zahrnují metody solvent casting, melting, zpracování vláken/zvlákňování/tkaní, extruzi, nástřik a tlakové lisování, laminaci a metody leaching/solvent casting. Tyto způsoby jsou odborníkům z oboru známy. Avšak u těchto způsobů je potřeba solubilizace PHA polymerů v toxických chorovaných rozpouštědlech.

Elektrostatické zvlákňování PHBV do nanovláken bylo již objeveno pro krytí ran a bylo zde použito očkování pomocí ko-kultur kožních a vlasových folikulámích epitelových buněk (Asran, Razghandi et al, 2010). PHA mohou být zpracovány na prostředky vhodné k hojení ran. Například netkané vláknité materiály k tomuto účelu mohou být připraveny nejprve výrobou polymemích vláken, protlačením polymerů přes perforovaný výstup, za použití postupů známých odborníkům v oboru. Vlákna mohou pak být zpracována do porézní membrány (látky) jejich rozprostřením na pevnou podložku a vystavením kompresnímu formování, jak je popsáno v US 20120021471 Al. Avšak prostředek pro hojení ran by měl být znovu modifikován, aby se dosáhlo požadované porozity, tj. za použití laseru nebo metody leaching/solvent casting. Avšak techniky louhování (leaching) mají několik nevýhod, jako je špatné odstraňování činidla poté, co bylo dosaženo porosity. Druhou technikou jsou takzvané laserové nebo imprintové techniky, které jsou obtížně proveditelné v průmyslovém měřítku.

V podobné oblasti techniky byla připravena vlákna a filmy z poly(3-hydroxybutyát-ko-3hydroxyvalerátu) neboli PHBV pomocí elektrostatického zvlákňování nebo metodou solvent casting, kde polymer (PHBV) byl rozpuštěn ve směsi dichlormethanu a dimethylformamidu (DMF) v poměru 9:1 za vzniku roztoku 15% (w/v) (Kuppan, Vasanthan et al. 2011). Bohužel DMF je velmi toxické rozpouštědlo, které se obtížně odstraňuje, když je kompozice cílena pro medicínské použití. Dále Meng et al. popsali tvorbu nanovláknových scaffoldů elektrostatickým zvlákňováním za použití kombinace poly(3-hydroxybutyrát-ko-3hydroxyvalerátu) (PHBV) a kolagenu typu I v l,l,l,3,3,3-hexafluor-2-isopropanolu (HIFP) (Meng, Kim et al. 2007). Bohužel použití HIFP je nevýhodou procesu, protože je známo, že r · toto rozpouštědlo je korozivní a klasifikováno jako nebezpečné rozpouštědlo třídy 4 (OSHA Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200).

Na druhou stranu jsou PHA chemicky modifikovány ke změně jejich fyzikálních a/nebo chemických vlastností, nejčastěji k uzpůsobení jejich biodegradability nebo odstraňování retikuloendotelovým systémem, protože vlastní hydrofobicita PHA brání jejich širšímu použití v medicínských aplikacích. PHA mají rovněž nedostatek funkčních skupin (Li a Loh 2015). Kvůli těmto a dalším nevýhodám bylo navrženo použití P4HB (poly-4-hydroxybutyrátu), protože tento polymer je rovněž biokompatibilní, resorbovatelný, zpracovatelný, pevný a tvárný ajeho rychlost degradace in vivo]e vyšší než u polymerů P3HA (poly-3-hydroxybutyrát), avšak rychlost jejich resorpce je pomalejší, než u řady materiálů používaných jako resorbovatelné nitě (US 6828357 Bl).

Jak je odborníkům z oboru dobře známo, PHA polymery jsou nerozpustné ve vodě. Dále je potřeba, aby PHA měly nastavitelnou hydrofobicitu, chemické funkční skupiny a vhodnou hydrolytickou stabilitu, aby se jejich terapeutické použití mohlo rozšířit do více oblastí (Li a Loh 2015), a aby z nich mohly být vytvářeny nosiče pro vakcíny nebo diagnostická zařízení (Parlane, Gupta et al, 2016). Rozpustnost PHA ve vodě lze získat chemickou modifikací, např. karboxylací, epoxidací, chlorací nebo hydroxylací (Kai a Loh 2014) nebo roubováním se syntetickými polymery, např. kopolymerací s poly[(R)-3-hydroxybutyrátem] a poly(Nisopropylakrylamidem) neboli (PNIPAA). Bohužel syntetické polymery jako PNIPAA nejsou biodegradabilní nebo absorbovány v těle, což je činí nepoužitelnými pro medicínské aplikace. Roubování polyhydroxybutyrátu (P3HB) na polysacharidy jako celulózu (Wei, McDonald et al. 2015), chitosan (Arslan, Hazer et al. 2007) nebo lignin (Luo, Cao et al. 2016) již bylo popsáno. Avšak exogenní povaha těchto biopolymerů je stále nevýhodou těchto typů biopolymerů při medicínských aplikacích. Je známo, že hlavní překážkou převedení nanomateriálů do biomedicínských aplikací je bezpečnost, zejména při invazivním podávání. Klinické aplikace rovněž vyžadují pečlivé vyhodnocení systémové toxicity složek, stejně jako jejich potenciální imunogenicitu (Mitragotri, Anderson et al. 2015).

Hyaluronan (HA), známý rovněž jako kyselina hyaluronová (Obrázek II) je přirozeně se vyskytující polysacharid tvořený kyselinou D-glukuronovou a N-acetyl-D-glukosaminem (GlcNAc). HA má určité výhody oproti jiným biopolymerům, jako je jeho biokompatibilita a biodegradabilita kvůli jeho všudypřítomnosti v lidském těle. Přirozeně se vyskytující polymery • · · · « · ···· ·· ···· • · · · · · « · · · · ♦ • · « · · · · • · · · · · · * · · · · · · mohou dodat výhodu jakékoli kompozici pomocí své biokompatibility, jsou-li použity pro výrobu biomateriálů.

Bohužel nativní HA musí být chemicky modifikován pro biomedicínské aplikace kvůli jeho rychlé degradaci a krátké době skladovatelnosti. Odborníci v oboru kombinovali alifatické polyestery jako kyselinu polymléčnou (Pravata et al., 2007), poly(laktid-ko-glykolid) (PLGA) (Huang et al., 2014), poly(kaprolakton) (PCL) (Yadav, Mishra, Jain, Mishra, Mishra & Agrawal, 2008). Avšak žádný z aktuálně dostupných kopolymerů není uspokojivý. Ve skutečnosti použití syntetických polymer trpí několika nevýhodami, zejména co se týče biokompatibility a biodegradability, nebo dochází k nežádoucí akumulaci v játrech, ale rovněž nemají aktivní skupiny na povrchu umožňující rozpoznávání receptory, tudíž mají relativně nízkou biologickou aktivitu ve smyslu podpory regenerace tkání v porovnání s ECM polymery odvozenými z přírodních polymerů (Do, Khorsand, Geary & Sálem, 2015). Proto v této přihlášce popisujeme syntézu nových hřebenovitých materiálů tvořených polysacharidovým skeletem (hyaluronan) a poly-[(R)-3-hydroxyalkanoáty], které jsou naroubovány jako boční

Tyto materiály na bázi polysacharid-polyesterů s řízenými strukturami tvoří nové biokompatibilní chemické formy, které překonávají dosavadní omezení kopolymerů pro medicínské aplikace. Možné očekávané problémy k řešení pro odborníky z oboru jsou i) známá degradace HA při chemické modifikaci a ii) volba adekvátních reakčních podmínek k homogenizaci konjugační reakce mezi dvěma polymery, které se vyznačují zcela odlišnými fyzikálně chemickými vlastnostmi (například rozpustnost HA ve vodě a PHA polymerů v chlorovaných rozpouštědlech, která jsou s vodou nemísitelná). Pro roubování poly-[(R)-3hydroxyalkanoátů] na HA bylo specificky nalezeno vhodné vazebné činidlo, protože odborníci z oboru vědí, že poly-[(R)-3-hydroxyalkanoáty] (polyestery) se vyznačují různými délkami řetězce, a tudíž zvýšenou hydrofobicitou. Stojí za to zmínit, že odborníci z oboru popsali strategie zahrnující katalytickou polymeraci monomerů (laktid nebo kaprolakton) s otevíráním kruhů za přítomnosti polysacharidů. Hlavní nevýhodou tohoto přístupu je obtížnost získání řízených struktur, protože tento druh polymerace nelze snadno řídit. Na počátku mohou všechny hydroxylové skupiny v polysacharidovém skeletu iniciovat polymeraci (zejména ty primární, které jsou nej reaktivnější). V jiném aspektu byly použity PEG a kopolymery PEG k produkci kopolymerů PHA-g-PEG pomocí reakcí volných radikálů, etherifikační reakcí, UV ozařováním a reakcí thiolenů (Le Fer, Babinot et al. 2012). Avšak chemické reakce zahrnují sadu kroků, které ztěžují vhodnost použití v průmyslovém měřítku.

Problémem, který odborníci z oboru očekávali, je obtížnost zpracování HA a polyesterů (přírodních nebo syntetických, konkrétněji PHA polymerů) ve formě fyzikálních směsí kvůli špatné fyzikální interakci a/nebo rozpustnosti. Očekáváným řešením je rozpuštění obou složek v korozivním rozpouštědle jako l,l,l,3,3,3-hexafluoro-2-isopropanolu.

PODSTATA VYNÁLEZU

Výše zmíněné problémy řeší tento vynález, který nabízí řešení zpracovatelnosti polyhydroxyalkanoátů a HA. Vynález se zabývá produkcí roubovaných kopolymerů obsahujících oba přírodní polymery. Materiály na základě dvou přírodních polymerů hyaluronanu a polyhydroxy-3-alkanoátů tvoří nové biokompatibilní chemické jednotky, které překonávají současná omezení zpracování materiálů ve formě scaffoldů, tenkých filmů, textilií atd. Navíc chemické spojení HA a PHA polymerů roubováním vede ktomu, že výsledný konjugát je rozpustný ve vodě.

Předmět tohoto vynálezu se rovněž týká kopolymerů nebo esterového derivátu kyseliny hyaluronové nebo její soli s obecným vzorcem IV

(IV),

OH

kde R⁴ je H⁺ nebo jakákoli farmaceuticky přijatelná sůl, s výhodou vybraná ze skupiny obsahující jakýkoli z iontů alkalického kovu nebo iontů kovů alkalických zemin, výhodněji Na⁺, K⁺, Mg²⁺ nebo Li⁺, a n je celé číslo v rozmezí 1 až 5 000 dimerů;

a PHA-CO- představuje polymer s následujícím vzorcem III:

kde

R je nezávisle H nebo -COCH3 a kde R¹, R² a R³ jsou alkyl, aryl, nasycený nebo nenasycený, obsahující od 1 do 18 atomů uhlíku.

A s je celé číslo mezi 1 a 100, s výhodou mezi 1 a 15 a v nevýhodnějším provedení mezi 1 a 3. Tudíž vzorec III může zahrnovat jednotky odvozené z 3-hydroxykyselin (x = 1), 4hydroxykyselin (x = 2) a 5-hydroxykyselin (x = 3), kde x je definováno s ohledem na vzorec ΙΑ. PHA je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující P3HB, PHO, PHD, PHDD nebo jejich kombinaci.

Tyto jednotky mohou být stejné v homopolymeru nebo různé, jako například v kopolymeru nebo terpolymeru.

A dimer obsahuje alespoň jeden substituent ve formě esteru, kde stupeň substituce HA pomocí PHA, nebo tak zvaný stupeň roubování, je v rozmezí od 0,1 do 15 %, s výhodou 4 až 10 %.

HA nebo jeho sůl je modifikovaná převážně na alespoň jedné pozici z OH skupin kyseliny Dglukuronové nebo N-acetylglukosaminové jednotky HA, s výhodou na pozici C6 Nacetylglukosaminu v HA, ale náhodně se substituce může objevit na pozicích C2, C3 kyseliny glukuronové nebo C4 N-acetylglukosaminu.

Odborníky z oboru může odrazovat kombinace polymerů PHA a HA zejména proto, že přírodní PHA nemají funkční skupiny, které by mohly být fiinkcionalizovány, konkrétněji polymer nenese žádnou terminální funkční skupinu. Molekulová hmotnost PHA polymerů byla stanovena v rozmezí 300 až 10⁷ a výhodněji mezi 10 000 a 10 000 000 Daltonů (US patent č. US 6245537 Bl). PHA s výhodou obsahují jednu nebo více jednotek, výhodněji mezi 10 a • · · ·

100 000 a nejvýhodněji mezi 100 a 30 000 jednotkami s následujícím vzorcem: — ROCR’R²(CR³R⁴)_SCOOH—. Avšak vysoká molekulová hmotnost komerčně dostupných PHA polymerů způsobuje, že jsou špatně reaktivní, tudíž odborníci z oboru mohou očekávat nízkou reaktivitu. Hydrolýza PHA (označovaná rovněž jako depolymerizace) se provádí 1 až 40 hodin, s výhodou 8-30 hodin, výhodněji 8 - 10 h; při teplotách v rozmezí 100 °C až 150 °C, výhodněji při 110 °C. V této přihlášce byla jako příklad provedena depolymerace polyhydroxybutyrátu za přítomnosti např. kyseliny octové, vedoucí k nízkomolekulámím oligomerům, které se vyznačují průměrem 2 000 až 70 000 g/mol (viz tabulku 1). Kyselá degradace popsaná v této přihlášce může být provedena pomocí organické kyseliny, jak bylo popsáno dříve v oblasti techniky (Stigers a Tew 2003), za dosažení syntézy telechelického polymeru. Jinými slovy, oligomery budou charakterizovány terminálními koncovými karboxylovými skupinami (viz schéma 1 a obrázek 1 pro charakterizaci ’H NMR).

Δ

R

ΌΗ

R= -OH or -OCOCHj

Vysokomolekulární P3HB

Oligo P3HB

Schéma 1. Příklad depolymerizace poly-3-hydroxybutyrátu

Polymer PHA použitý v této přihlášce může mít strukturu homopolymeru (P3HB nebo P3HO) nebo kopolymeru (P3HO-3HD) nebo terpolymeru (P3HO-3HD-3HDD). PHA kopolymery nejsou přirozené, ale odborníci z oboru je mohou vyrábět pomocí metabolického inženýrství. Množství PHA polymerů (-COPHA) v esterovém derivátu kyseliny hyaluronové (vzorec IV) nebo jeho soli podle vynálezu je od 0,1 do 15 % na 100 dimerů kyseliny hyaluronové nebo její soli, s výhodou 4 až 10 %, výhodněji 5 %. Takové množství PHA odpovídá stupni roubování (grafting degree, GD), jaký byl stanoven integrací signálů na 'HNMR (viz obrázek 3 jako příklad).

• · ··«· · · ···· · ···· • · · · · ·· ·

Dále, roubovaný kopolymer tvořený hylauronanem a oligomerem odvozenými z polyhydroxyalkanoátů, rovněž označovaný v této přihlášce jako HA-PHA nebo HA-graftPHA, může být zpracován ve formě nanovláken za vzniku nanovláknové sítě nebo scaffoldu. Podle tohoto vynálezu výroba nanovláknové sítě nebo rohože může zahrnovat elektrostatické zvlákňování jakýchkoli roubovaných kopolymerů (HA-PHA) uvedených v této přihlášce a jakéhokoli biologicky kompatibilního polymeru relativně snadno zvláknitelného, ale rovněž biologicky kompatibilního polymeru, s výhodou polyethylenoxidu (PEO) nebo polymeru ze seznamu: karboxymethylcelulóza (CMC), želatina, chitosan, polykaprolakton (PCL), kyselina polymléčná (PLA), polyamid (PA), polyurethan (PUR), poly-(laktid-ko-glykolová) kyselina, polyvinylalkohol (PVA), kyselina hyaluronová (HA) a/nebo jejich deriváty a jejich směsi.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je způsob syntézy kopolymerů podle tohoto vynálezu obsahujících esterové deriváty kyseliny hyaluronové nebo jejich sůl s obecným vzorcem IV definovaným výše, zahrnující reakci aktivovaného derivátu PHA s kyselinou hyaluronovou nebo její solí, kde PHA může být aktivován například aktivačními reakcemi popsanými níže:

O O

PHA-COOH + ^{11 (h})’ ^Ti ^C PHA^N^ + CO₂ + N^NH

DMSO, TEA

V

Schéma 2A. Aktivace PHA polymeru pomocí CDI (karbonyldiimidazolu) nebo

PHA-COOH

Í! (h), T/C

DMSO, TEA

Schéma 2B. Aktivace PHA polymeru pomocí HSTU (O-(N-sukcimidyl)-N,N,N’,N’ bis(tetramethylen)-uronium hexafluorfosfátu) • · * · kde PHA-COOH odpovídá vzorci VI níže, ve kterém A-D jsou příklady různých substituentů R',R²aR³:

COOH

A) P3HB R‘= - CH₃, R’=R²=R³ C) P(3HO-3HD) R*= - (CH2)4CH3, R²= - (CH2)₆CH₃, R³= R¹ or R²

Β) P3HO R>=-(CH₂)₄CH₃, R¹⁼R²=R³D) P(3HO-3HD-3HDD) R'= - (CH2)4CH3 R²= - (CH2)₆CH₃ R³= - (CH₂)₈CH₃ (VI)

Ve výhodném provedení zahrnuje kovalentní coupling (vázání) HA a PHA polymerů dva kroky uvedené ve schématu 2A a 2B, a 3, v uvedeném pořadí. Prvním krokem je aktivace karboxylové koncové skupiny v PHA polymerech. Polyhydroxyalkanoáty PHA-COOH mají molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 500 do 20 000, s výhodou 1 500 až 15 000. Tato aktivace je provedena, ale ne omezeně, reakcí s CDI (1,1,-karbonyldiimidazol). Místo CD1 může být použit rovněž aktivátor HSTU (nazývaný rovněž SbTMU nebo O-(N-sukcimidyl)-N,N,N’,N’bis(tetramethylen)-uronium hexafluorfosfát) pro aktivaci nejvíce hydrofobních PHA. Dále reakce vyžaduje přítomnost organické báze v organickém polárním rozpouštědle, jako je DMSO (schéma 2A a B). Druhá část syntézy zahrnuje reakci aktivovaných PHA polymerů (označovaných rovněž jako imidazolid-PHA) a hyaluronanu nebo jeho soli, která byla před tím rozpuštěna ve vodě, DMSO (schéma 3), a/nebo jejich směsi.

Couplingová neboli vazebná reakce PHA na hyaluronan může být provedena za použití sodné soli hyaluronanu nebo farmaceutické soli nebo rovněž s použitím kyseliny hyaluronové.

K aktivaci telechelického polymeru dochází v přítomnosti organické báze nebo alifatického aminu, s výhodou terciárního aminu, který má lineární nebo rozvětvenou, nasycenou nebo nenasycenou, substituovanou nebo neusbstituovanou C3-C30 alkyl skupinu, s výhodou terciárního aminu, výhodněji triethylaminu (TEA), diisopropylethylaminu (DIPEA); v polárním rozpouštědle, které je mísitelné s vodou, jako DMSO, THF nebo formamid, konkrétněji DMSO; kdy vzniká aktivovaný derivát PHA s obecným vzorcem V.

Aktivovaný derivát PHA obecného vzorce V reaguje s kyselinou hyaluronovou nebo její solí za přítomnosti DMAP a organické báze, např. alifatického aminu, s výhodou terciárního aminu, který má lineární nebo rozvětvenou, nasycenou nebo nenasycenou, substituovanou nebo neusbstituovanou C3-C30 alkyl skupinu, s výhodou terciárního aminu, výhodněji triethylaminu nebo diisopropylethylaminu; ve vodě nebo v polárním rozpouštědle s mísitelném vodou nebo ve vodě smíchané s polárním rozpouštědlem mísitelným s vodou, kde s výhodou tvorba V byla provedena v poměru 1 ku 99 % (voda : organické rozpouštědlo), výhodněji je poměr vody a organického rozpouštědla (1:1 v/v) (viz rovněž Schéma 3, reakce meziproduktu V s HA), za vzniku ester derivátu HA-PHA kyseliny hyaluronové nebo její soli obecného vzorce IV, podle schématu 3:

PHA-CO kde

t₂ (h), T₂ °C organická báze, rozpouštědlo

CHgCo'

Schéma 3. Reakce meziproduktu (V) s HA

V případě nejdelšího PHO-HD-HDD byl jako nejlepší rozpouštědlo vyhodnocen DMSO. Avšak ve větším měřítku je lepší pracovat s PHB, protože reakce je snazší díky nižší teplotě a krátkým reakčním dobám.

Krok aktivace může být prováděn 4 až 48 hodin při jakékoli teplotě mezi 25 °C a 60 °C. Dále bylo zjištěno, že použití kombinace CDI/TEA zrychluje reakci. Tudíž je výhodné provádět aktivační reakci při teplotě 22 °C až 37 °C, výhodněji po dobu 4 hodin při 25 °C pro PHB. Pokud je teplota aktivační reakce PHB zprostředkované pomocí CDI vyšší než 25 °C, může reakce generovat vedlejší produkty, zatímco pokud je reakce provedena za laboratorní teploty, zpomalí se, ale stále probíhá. Avšak aktivace PHO, PHO-HD a PHO-HD-HDD vyžadovaly delší aktivační dobu kvůli vyššímu sterickému chránění polymeru.

«· ···· ·4 · · · · · · · · · • «·· · · · * • · · « · · · * · · · · · » · · ·· ···· · · • Λ · · · · · · · · *

Dále, molární množství aktivačního činidla, např. CDI a PHA je rovněž velmi určující pro úspěch reakce. CDI by se měl přidat kPHA v molámím nadbytku 1,5-5 molámích ekvivalentů, s výhodou v rozmezí 1,6 až 2,1, ještě výhodněji za použití 2 ekvivalentů CDI vůči PHA.

Aktivace PHA polymerů pomocí CDI popsaná ve schématu 2A se provádí po 4 hodinách, výhodněji bylo více než 98,5 % PHB aktivováno na imidazolid. Dále reaktivní meziprodukt struktury V může být připravován 5 až 24 hodin za přítomnosti terciárního aminu, s výhodou TEA, v závislosti na hydrofobicitě PHA polymeru, dle očekávání odborníků z oboru. Zvýšení doby aktivace zvyšuje rovněž stupeň roubování, zejména v případě PHO-HD-HDD.

Dále reakce zobrazená ve schématu 3 se provádí za přítomnosti 4-dimethylaminopyridinu (DMAP), který je odstraněn z reakčního produktu po postupných promýváních.

Výchozí kyselina hyaluronová nebo její sůl, použitá v kroku modifikace podle způsobu podle vynálezu má molekulovou hmotnost (hmotnostně střední relativní molekulová hmotnost) od 5xl0³ do lxlO⁵ g/ mol, s výhodou od l,5xl0⁴. Avšak způsob podle vynálezu není omezen na tyto rozsahy HA nebo její soli. Hmotnostně střední relativní molekulová hmotnost Mw a početně střední relativní molekulová hmotnost Mn polymerů byly stanoveny pomocí SECMALLS, stejně jako polydisperzita derivátů (tabulka 2).

Reakce meziproduktu V a HA (viz schéma 3, krok modifikace) je prováděna 12 až 48 hodin, s výhodou 10 - 24 hodin; při teplotách v rozmezí 22 °C až 37 °C, výhodněji 12 h při 25 °C, kdy se neočekává degradace polysacharidu.

Molární množství aktivovaného derivátu PHA (V) podle vynálezu, které je smícháno s HA nebo její solí, odpovídá 0,01 až 2,0 ekvivalentům, s výhodou 0,75 až 1,5 ekvivalentům, výhodněji 1 ekvivalentu na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli, za produkce esterového derivátu HA nebo její soli podle vynálezu kovalentně spojené s PHA. Esterové deriváty kyseliny hyaluronové nebo její soli podle vynálezu nijak významně nemění viskozitu a fyzikálně chemické charakteristiky HA a vyznačují se nízkou polydisperzitou. Dále se ukázal mírný nárůst molekulové hmotnosti derivátů po chemické modifikaci, díky samoagregaci derivátů. To znamená, že se očekává rovněž použití derivátů pro tvorbu polymemích micel, jak je popsáno v patentové přihlášce (W02014082609, Smejkalová et al a (Loh, Zhang et al. 2009). Deriváty byly plně charakterizovány pomocí ’H a HSQC-NMR, IR spektroskopií a vybraná spektra jsou zobrazena v této přihlášce jako ukázka, že polymery jsou kovalentně vázány (zejména DOSY na obrázku 5 pro HA-g-PHB a obrázku 6 pro HA-g-PHO-HD-HDD) a nejsou ·· ··#· ·· ···· · ···· ·· · · · · · · * • · · · · · · · • · · · · · ·· · · ··· · · · · · · • · · · · ·» · · · · ve formě polymerních směsí, kdy odborníci z oboru mohou očekávat pouze fyzikální interakci, ale ne chemickou (esterovou) vazbu.

Kroky aktivace a modifikace (viz schéma 2 výše) jsou provedeny, jak je popsáno výše, ve směsi vody a rozpouštědla mísitelného s vodou. Rozpouštědlo, které může být stejné nebo jiné v kroku aktivace a kroku modifikace, je vybráno ze skupiny tvořené isopropanolem, dimethylsulfoxidem, dimethylformamidem, tetrahydrofuranem, ale výhodné je použití dimethylsulfoxidu. Množství vody ve směsi vody a s vodou mísitelného polárního rozpouštědla je od 10 % v/v do 99 % v/v, výhodněji 50 % v/v.

Dále se vynález rovněž týká nanovláken obsahujících kopolymer hyaluronanu a PHA. Nanovlákna podle tohoto vynálezu lze připravit například elektrostatickým zvlákňováním v zařízení pro přípravu nanovláken (například 4SPIN®) nebo jiným způsobem elektrostatického zvlákňování známého v oblasti techniky, například uniaxiální elektrostatické zvlákňování, koaxiální elektrostatické zvlákňování nebo multiaxiální elektrostatické zvlákňování. Charakterizace vláknového síta byla provedena pomocí skenovací elektronové mikroskopie (SEM), jak je popsáno ve známé oblasti techniky a uvedeno na obrázcích 7 - 10. Tudíž překvapivě jsme schopni elektrostaticky zvláknit PHAs, když jsou napojeny na HA, dokonce bez přídavku DMF, pouze ve vodě, tj. bez toxických rozpouštědel, jako je 1,1,1,3,3,3hexafluoro-2-isopropanol (HIFP), který je vysoce toxický.

Nanovlákna podle tohoto vynálezu, jak jsou popsána výše, jsou s výhodou charakterizována průměrným průměrem mezi 200 a 700 nm. Tudíž po chemické modifikaci průměrná velikost vláken vzrostla nejméně dvakrát (viz obrázek 9) v porovnání s obrázky 6, 7, 8 a 10. Zvýšený průměr velikosti kopolymerů znatelně zvýšil mechanické vlastnosti (obrázky 11 a 12). Nanovlákna vyrobená na bázi HA-g-PHB a na bázi nativní HA byla připravena na slídě ke vzájemnému porovnání vláken, aby mohl být vyhodnocen účinek roubování PHA polymeru na kyselinu hyaluronovou. Vzorky byly připraveny pro analýzu na zařízení AFM Bruker Dimension Icon v módu PF-QNM. K měření mechanických vlastností získaných nanovláknových podložek byla použita metoda nanoindentace používající ATM mikroskop (ATM, atomic force microscopy, mikroskopie atomárních sil). Nanoindentace je užitečná technika ke studiu vlastností materiálů v měřítku menším než řády mikronů. AFM se používá jako nanoindentátor a umožňuje získat přesné hodnoty tvrdosti tenkých filmů nebo rohoží, na základě vysoké citlivosti rádiu hrotu a nosníku. Byly měřeny mechanické vlastnosti vláken za použití síly hrotu, který byl jemně zatlačen do materiálu a v každém bodě měřen. Síla byla

získána analýzou poklesu síly vs. vzdálenosti v části, kde byl hrot zatlačen do materiálu za získání tuhosti materiálu. Pozorujeme lineární závislost; tudíž je vhodný Hookův zákon ke znázornění tuhosti / mechanické odolností uvedeného materiálu. Mechanické vlastnosti nanovláknových podložek z nativní HA byly použity k porovnání v nezávislém experimentu za použití podobných experimentálních parametrů (obrázek 13). Připravená vlákna mohou být uspořádaná nebo náhodně rozmístěná, ale odborník z oboru může preferovat uspořádaná, kvůli lepšímu přilnutí buněk a očekávané lepší regeneraci, tj. regeneraci periferního nervu.

Chemická modifikace HA zvýšila mechanické vlastnosti jednotlivých nanovláken a očekává se zvýšení hydrofobicity HA. Odborník z oboru očekává, že mechanické vlastnosti kompozic vyrobených z těchto nanovláken budou zahrnovat zvýšenou pevnost, a ty mohou být ve formě vrstvy, filmu, podložky, krytí ran nebo tkáňového scaffoldu a lze je použít v kosmetice, medicíně nebo regenerativní medicíně, například u prostředků pro ošetření ran na náplastech pro vnější nebo vnitřní použití. Nanovlákna připravená v tomto vynálezu mohou zahrnovat sloučeniny dle vzorce IV (HA-graft-PHA nebo HA-PHA), které byly definovány výše a které byly rovněž testovány jako biokompatibilní (viz obrázky 14, 15 a 16).

Dále, možné očekávané problémy k řešení jsou známá degradace HA při chemické modifikaci a výběr vhodných reakčních podmínek k homogenizaci konjugační reakce mezi dvěma polymery, které se vyznačují zcela odlišnými fyzikálně chemickými vlastnostmi, tj. rozpustností. Dále bylo nalezeno vhodné vazebné (couplingové) činidlo, které by mohlo být použito v širokém rozmezí substrátů (tj. PHA) vyznačujících se různou délkou řetězců a hydrofobicitou. Metoda musí být robustní, jinými slovy aktivátor by měl být schopen kovalentně vázat PHA polymery vyznačující se různými hydrofobicitami. PHA se vyznačují následným nárůstem sterického bránění kvůli inkorporaci hydroxykyselin, použitých při jejich produkci, do jejich chemické struktury (od C3 do Cl8), a měla by být umožněna aktivace terminálních karboxylových kyselin v PHA. Odborníci z oboru by očekávali, že kovalentní napojení bude fungovat pouhou aktivací karboxylové skupiny v PHA polymerech, avšak syntéza konjugátů byla testována použitím kombinované metodiky, jak je popsána v naší předchozí práci (Huerta-Angeles et al., 2016), a i když bylo testováno vice reakčních podmínek zahrnujících různá rozpouštědla, báze a reakční doby, reakce nebylo dosaženo. Bylo rovněž testováno použití peptidového couplingového reagentu N,N,N',N'-tetramethyl-O-(Nsukcinimidyl)uronium hexafluorfosfátu (HSTU) (El-Faham & Albericio, 2011), které vedlo k nízké účinnosti reakce. Druhou nevýhodou je to, že aktivační reakce s CDI může vest k nízké

konverzi. Tyto výsledky jsou v dobré shodě s předchozími studiemi (Pravata et al., 2007). Odborníci z oboru očekávají, že CDI obvykle konvertuje karboxylové kyseliny na odpovídající acylimidazoly při reakci provedené v různých rozpouštědlech jako THF, DMF nebo DMSO, tj. tato reakce je zvláště vhodná pro roubování polyesterů na polysacharidy (Gref, Rodrigues et al. 2002). Avšak je popsáno, že tato reakce funguje pod inertními plyny, zejména pod argonem, pod refluxem THF, což není přímo použitelné pro aktivaci PHA polymer, protože vzniklý meziprodukt se překvapivě rozkládá při vysoké teplotě a také přírodní PHA jsou rozpustné pouze v chlorovaných rozpouštědlech, ne v THF . Jinými slovy, aktivace polymeru PHA musí bát provedena při laboratorní teplotě za přítomnosti akceptoru protonu, tj., báze jako TEA, která zvyšuje reakční rychlost.

Tato přihláška popisující kovalentní napojení HA a PHAs umožňuje zpracování chemického konjugátu (HA-graft-PHA) zcela rozpustného ve vodě, což je dobrou výhodou pro průmyslové měřítko.

Dále zpracování PHB samotného je problematické, protože vlastnosti se mění, zejména kvůli krystalinitě, když byl tento biopolymer zpracován pomocí tepelně tlakového tvarování nebo elektrostatickým zvlákňováním. Výhoda našeho řešení je, že krystalinita se po naroubování PHA na hyaluronan ztrácí.

Definice:

Jak je použit zde,

Termín „hyaluronan“ zahrnuje různé formy, jakých mohou molekuly nabývat, např. kyselá forma, kyselinu hyaluronovou, a soli, jako hyaluronan sodný, které se tvoří při fyziologickém pH.

PHA polymery nebo polyestery mohou obsahovat jednu nebo více jednotek, například mezi 10 a 100 000 a s výhodou mezi 100 a 30 000 jednotkami podle vzorce VI:

R= -OH nebo -OCOCH₃ ·· · · 9 · 99 ···· ·9999

999 9 9 99

9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

9 99 999999

V této přihlášce je hmotnostně střední relativní molekulová hmotnost PHA polymerů po hydrolýze s výhodou mezi 500 g/mol až 30 000 g/mol, výhodněji mezi 1 500 a 20 000, ještě výhodněji mezi 1 500 až 15 000 g/mol a nejvýhodněji 2 500 g/mol. PHA s výhodou obsahují 1 až 18 uhlíkových jednotek: R-CHR¹/R²/R³(CH2)mCOO(CHR^,)(CH2)mCOO(CHR²)(CH2)mCOO(CR³)(CH²)mCOOH-;

kde m je celé číslo, například mezi la 13, s výhodou mezi la 4; a kde R¹, R², R³ jsou nezávisle vybrány z vodíku, methylu, přímých C₂-is, rozvětvených nebo cyklických alkylskupin.

kde R=-OH nebo -OCOCH3

Telechický polymer nebo oligomer je polymer schopný vstupovat do další polymerace nebo jiných reakcí pomocí svých reaktivních koncových skupin.

Kompozit nebo nanokompozit je definován jako scaffold tvořený směsí materiálů a/nebo polymerů. Mohou být tvořeny uspořádanými nanovláknovými vícesložkovými scaffoldy vyrobenými pomocí elektrostatického zvlákňování nebo podobné techniky popsané v oblasti techniky. V tomto případě kovalentní vazba HA a PHA produkuje nový konjugát označovaný dále jako HA-g-PHA, který může nebo nemusí být kombinován s jiným polymerem, s výhodou s biodegradabilním polymerem jako PEG.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1. ’H NMR spektra výchozího P(3HB) (A) a P(3HB) hydrolyzovaného po dobu 30 hodin (B).

Obrázek 2. Infračervené spektrum HA-graft-P3HB (A), Oligo P3HB (B) a nativní HA použité pro modifikaci.

Obrázek 3. *H NMR spektra HA-g-P(3HB)

Obrázek 4. Upravené spektrum z heteronukleámí jednokvantové koherence (HSQC) odpovídající HA-graft-PHB, DS = 10,3 % a Mw =13 700 g/mol) zaznamenané v D2O.

Obrázek 5. DOSY NMR spektra HA roubované s -P(3HB) v D₂O (Mw=13 700g/ mol, DS = 10,3 %, c=10 mg/ml).

Obrázek 6. DOSY NMR spektra HA roubované s P(3HO-co-3HD-co-3HDD) v D2O (Mw=39 200 g/ mol, DS = 6%, c=10 mg/ml).

Obrázek 7. SEM snímky vláken elektrostaticky zvlákněných ze vzorků připravených podle podmínek uvedených v příkladu 12, tvořených z HA-graft-PHB; 15 000 g/mol DS: 4,9% a PEO: 400 000 g/mol.

Obrázek 8. SEM snímky vláken elektrostaticky zvlákněných ze vzorků připravených podle podmínek uvedených v příkladu 13 tvořených z HA-graft-PHB; 15 000 g/mol DS: 4,9% a PEO: 400,000 g/mol.

Obrázek 9. SEM snímky vláken elektrostaticky zvlákněných ze vzorků popsaných v příkladu tvořených ze tří složek, kde jednaje HA-graft-PHB; 15 000 g/mol DS: 4,9%

Obrázek 10. SEM snímky vláken elektrostaticky zvlákněných ze vzorků popsaných v příkladu tvořených ze tří složek, kde jednaje HA-graft-PHB; 15 000 g/mol DS: 4,9%

Obrázek 11. Nativní HA o 82 000 g/mol použitá ke srovnání v příkladech 12 - 16.

Obrázek 12. Mechanické vlastnosti orientovaných nanovláken tvořených z HA-g-PHB a porovnaných s nativní HA. LG - podélný směr, TD - příčný směr.

Obrázek 13. Stanovení tuhosti vláken pomocí AFM Bruker dimension Icon v módu PF-QNM. Obrázek 14. Buněčná viabilita hyaluronanu sodného roubovaného s poly-3-hydroxybutyrátem Obrázek 15. Buněčná viabilita hyaluronanu sodného roubovaného s poly-3hydroxyoktanoátem

Obrázek 16. Buněčná viabilita hyaluronanu sodného roubovaného s (3-hydroxyoktanoát-ko-3hydroxydekanoátem) nebo (3-hydroxyoktanoát-ko-3-hydroxydekanoát-ko-3-hydroxydodekanoátem).

Obrázek 17. Graf 1. Porovnání distribuce velikosti (nativní HA versus HA-graft-PHB). Stanovení bylo založeno na měření průměru nanovláken a následné statistické analýze. Graf představuje průměr vlákna v nm (osa x) vs. počet vláken (frekvence; osa y).

Příklady

Příklad 1. Získání polyhydroxyalkanoátů a jejich hydrolytická depolymarace P(3HB)

Podle tohoto vynálezu PHA polymery, např. P(3HB) a příbuzné polymery, mohou být extrahovány např. z biomasy Bacillus cereus SPV po fermentaci (Basnett, Ching et al. 2013), ale není to omezeno na tento postup, protože jejich produkce fermentaci je popsána odborníky z oboru (např. Evropská patentová přihláška EP 1739182 Al). Částečná depolymerace P(3HB), která byla použita pro přípravu oligomemích derivátů P(3HB) byla provedena pomocí hydrolýzy v roztocích kyseliny octové. Například 3,0 g suchého P(3HB) bylo suspendováno ve směsi 166 ml ledové kyseliny octové a 34 ml destilované vody. Hydrolýza byla prováděna při 100 - 105 °C pod refluxem po dobu až 30 hodin. Charakterizace oligomemích produktů byla studována podle kinetiky hydrolýzy. Pro tento experiment byly 5ml alikvoty periodicky odebírány a sráženy pomocí studeného methanolu. Polymer byl izolován po několikanásobném promytí destilovanou vodou až do pH = 7,0. Polymer byl vysušen vymrazením a charakterizován (viz tabulka 1).

Tabulka 1. Charakterizace počátečního a částečně depolymerovaného P(3HB)

Vstup	Doba hydrolýzy, v hodinách	Mn, Da	Mw, Da	PDI	Tg, °c	Tm*, °C	ΔΗ, J/g
A	0	158 400	273 500	1,73	2,5	174,5	83,9
B	3	15 290	27 700	1,81	-0,3	163,8	77,2
C	8	5 714	9 790	1,71	-2,8	155,1	79,9
D	20	2 270	3 470	1,53	-8,2	135,8	72,4
E	30	1 527	2 224	1,46	-n,i	95,6	81,3

* - konec píku rozpouštění a Mn = číselně střední relativní molekulová hmotnost; Mw = hmotnostně střední relativní molekulová hmotnost; PDI = index polydispersity (Mw/Mn).

Příklad 2. Syntéza konjugátu hyaluronanu sodného a PHB

Kyselina hyaluronová o průměrné molekulové hmotnosti 6 000 g/ mol (0,10 g, 0,3 mmol) byla rozpuštěna ve 2 ml destilované vody. K tomuto roztoku se pomalu naléval DMSO (2 ml). Když byl roztok homogenní, přidalo se 0,044 ml DIPEA (3 mmol) a poté dimethylaminopyridin (DMAP) (0,002 g, 0,013 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 0,022 g polyhydroxybutyrátu (byl použit Oligo PHB vyznačující se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 27 700 g/mol) ve 2 ml DMSO a poté l,l'-karbonyldiimidazol (0,37 mmol) a DIPEA (0,044 ml, 3,75 mmol), reakce se nechala běžet 4 hodiny při 60 °C. K roztoku obsahujícímu HA se přidal aktivovaný PHB a vše se nechalo reagovat 12 h při 60 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného roztoku chloridu

·· • •	*999 • 9 • ·	·· • •		» *·· r • * 9 • Ί
» •	• •
•	• ·	•	*	• ·	• ·
• ·	•	• ·		··	« · · «

sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), pak roztoky isopropylalkohol: voda (85% v/v, 4x10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylalkoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR). ’H NMR (D2O):

DS: 0.76%

Příklad 3. Syntéza konjugátu hyaluronanu sodného a PHB (HA-graft-PHB)

Kyselina hyaluronová s průměrnou molekulovou hmotností 15 000 g/mol (5 g 12,5 mmol) byla rozpuštěna ve 100 ml destilované vody. Když byl roztok homogenní, přidalo se 1,74 ml TEA (3 mmol) a poté dimethylaminopyridin (DMAP) (0,08 g, 0,625 mmol). V oddělené baňce bylo ve 100 ml DMSO rozpuštěno 1,08 g polyhydroxybutyátu (byl použit Oligo PHB vyznačující se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 2 224 g/mol) a následoval 1,1'karbonyldiimidazol (2,02 g, 3,75 mmol) a 1,74 ml TEA. Aktivační reakce se nechala běžet 4 hodiny při 25 °C. Aktivovaný PHB byl přidán k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat po dobu 12 h při 25 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), poté roztoky isopropylalkohol : voda (85% v/v, 4 x 10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylalkoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

DS: 3,76 %

Příklad 4. Syntéza konjugátu hyaluronanu sodného a PHB (HA-graft-PHB)

Kyselina hyaluronová o průměrné molekulové hmotnosti 15 000 g/mol (5 g, 12,5 mmol) byla rozpuštěna ve 100 ml destilované vody. Když byl roztok homogenní, přidalo se 1,74 ml TEA (3 mmol) a poté dimethylaminopyridin (DMAP) (0,08 g, 0,625 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 1,08 g polyhydroxybutyrátu (byl použit Oligo PHB vyznačující se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 2 224 g/mol) ve 100 ml DMSO a následoval Ι,Γ-karbonyldiimidazol (2,02 g, 3,75 mmol) a 1,74 ml TEA. Aktivační reakce se nechala běžet 24 hodin při 25 °C. Aktivovaný PHB byl přidán k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat po dobu 12 h při 25 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml ·· ··** ·· ··/· • · · · · · · ·· • · · ··« ·i • * · « » J · · ·· • e · · ♦ · · ·· ·· · ·« ·· ··· * přesyceného roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), poté roztoky isopropylalkohol : voda (85% v/v, 4x10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylalkoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C po 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

DS: 5,2 %

Příklad 5. Syntéza derivátu HA-graft-PHB

Kyselina hyaluronová o průměrné molekulové hmotnosti 15 000 g/mol (1 g, 2,5 mmol) byla rozpuštěna ve 20 ml destilované vody. Když byl roztok homogenní, přidalo se 0,35 ml TEA (2,5 mmol) a poté dimethylaminopyridin (DMAP) (0,015 g, 0,125 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 0,43 g polyhydroxybutyrátu (nebo 5 mmol) Oligo PHB, vyznačujícího se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 2 224 g/mol, ve 20 ml DMSO a následoval l,l'-karbonyldiimidazol (0,811 g, 5 mmol) a 0,35 ml TEA. Aktivační reakce se nechala běžet 24 hodin při 25 °C. Aktivovaný PHB byl přidán k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat po dobu 24 h při 25 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), poté roztoky isopropylalkohol : voda (85% v/v, 4x10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylalkoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

DS: 10,3 %

Příklad 6. Syntéza derivátu HA-graft-PHB

Kyselina hyaluronová o průměrné molekulové hmotnosti 76 000 g/mol (1 g, 2,5 mmol) byla rozpuštěna ve 20 ml destilované vody. Když byl roztok homogenní, přidalo se 0,35 ml TEA (3 mmol) a poté dimethylaminopyridin (DMAP) (0,015 g, 0,125 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 0,431 g polyhydroxybutyrátu (byl použit Oligo PHB vyznačující se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 2 224 g/mol) ve 20 ml DMSO a následoval 1,Tkarbonyldiimidazol (0,811 g, 5 mmol) a 0,35 ml TEA. Aktivační reakce probíhá 24 hodin při 25 °C. Aktivovaný PHB byl přidán k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat po dobu 24 h při 25 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného • · ·· · · ·· · ···· • · · · · • · · · ·· • · · · · ·* • · · · ·*

4« ♦ ···· · roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), poté roztoky isopropylalkohol : voda (85% v/v, 4 x 10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylaikoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C po 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

DS: 13,2 %

Příklad 7. Syntéza derivátu HA-graft-PHB

A. Příprava kyselé formy hyaluronanu

V krátkosti, 5 g kyseliny hyaluronové bylo rozpuštěno v 500 ml destilované vody. Ke směsi se přidala kationtově výměnná pryskyřice DOWEX 50WX8 (typ H). Po asi 2 hodinách, když došlo k iontové výměně, byla pryskyřice odstraněna odstředěním při 5 000 ot/min po dobu 5 minut a výsledný roztok byl vymrazen při -80 °C a lyofilizován. Molekulová hmotnost a polydisperzita polymeru po kationtové výměně byly stanoveny pomocí SEC-MALLS (viz tabulka 2). Získaná kyselá forma HA byla dále použita k přípravě esterových derivátů HA.

B. Modifikace HA

Kyselá forma hyaluronanu (0,1 g, 0,3 mmol s Mw = 22 000 g/mol) byla rozpuštěna ve 4 ml DMSO. Když byl roztok homogenní, přidalo se 0,037 ml TEA (0,3 mmol), následoval dimethylaminopyridin (DMAP) (0,002 g, 0,013 mmol). V oddělené baňce bylo 1,05 g polyhydroxyoktanoátu (oligomemí PHB, vyznačující se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 25 000 g/mol) rozpuštěno ve 2 ml DMSO, následoval by 1,1'karbonyldiimidazol (0,047 g, 0,3 mmol) a 0,037 ml TEA (0,3 mmol). Aktivační reakce probíhala 2 hodiny při 60 °C. Aktivovaný PHO byl přidán k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat dalších 12 h při 25 °C. Reakční produkt byl izolován po purifikaci dialýzou proti roztoku 0,5% NaHCOj (3 x 5 1) a poté extenzivní dialýzou proti vodě (3x5 1).

DS = 3,3 %

Příklad 8. Syntéza derivátu HA-graft-PHO-HD-HDD

a) Syntéza TBA formy HA: V krátkosti, 5 g kyseliny hyaluronové bylo rozpuštěno v 500 ml destilované vody. Ke směsi se přidala kationtově výměnná pryskyřice DOWEX 50WX8 (typ H) a neutralizovalo se vodným roztokem tetrabutylammonium hydroxidu (TBA hydroxid), aby došlo k solubilizaci v bezvodém dimethylsulfoxidu (DMSO). Po asi 2 hodinách, kdy došlo • · · · ·· ··«· ·· • · · · • · * · • · « · · ··· ···· ·· ·· · ·» · · ···· k výměně iontů, byla pryskyřice odstraněna odstředěním při 5 000 ot/min po dobu 5 minut a výsledný roztok byl vymrazen při -80 °C a lyofilizován. Molekulová hmotnost a polydisperzita polymeru po kationtové výměně byly stanoveny pomocí SEC-MALLS. Získaná kyselá forma HA byla dále použita k přípravě esterových derivátů HA.

b) reakce kyselé formy HA s PHO-HD-HDD aktivovaným HSTU. Forma TBA kyseliny hyaluronové s průměrnou molekulovou hmotností 13 000 g/mol (0,15 g, 0,2 mmol) byla rozpuštěna v 8 ml DMSO. Když byl roztok homogenní, přidalo se 0,034 ml TEA (0,2 mmol) a následoval dimethylaminopyridin (DMAP) (0,0015 g, 0,0012 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 0,124 g polymeru PHA označovaného jako P3HO-3HD-3HDD (0,2 mmol, Mw 2 800 g/mol) ve 4 ml DMSO, následoval N,N,N,N-tetramethyl-O-(N-sukcinimidyl) uroniumhexafluorofosát, označovaný rovněž jako HSTU (0,087 g, 0,2 mmol) a smíchalo se s 0,034 ml TEA (0,2 mmol). Aktivační reakce s HSTU se nechala probíhat 8 hodin při 60 °C. K roztoku obsahujícímu HA se přidal aktivovaný P3HO-3HD-3HDD a vše se nechalo reagovat 48 hodin při 60 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (2 x 30 ml), poté roztoky isopropylalkohol: voda (85% v/v, 4 x 10 ml), jednou 100% isopropanolem a následovalo třikrát 10 ml isopropylalkohol: voda (85 % v/v) a vysušení dvakrát 10 ml IPA. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C po 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

DS: 1,3 %

Příklad 9. Syntéza derivátu HA-g-PHO-HD-HDD za použití kyselé formy hyaluronanu

101 mg kyselé formy HA (0,3 mmol) bylo rozpuštěno v 5 ml DMSO. Po rozpuštění polymeru se k reakčnímu roztoku přidalo 0,037 ml triethylaminu (0,3 mmol), následovalo 2,9 mg DMAP. V oddělené baňce byl odpovídající PHA (0,3 mmol) solubilizován ve 3 ml DMSO. Směs se míchala při laboratorní teplotě jednu hodinu. Poté se přidal CDI (43,8 mg, 0,30 mol). Aktivace byla prováděna při laboratorní teplotě nebo 60 °C 48 hodin. Poté byl roztok smíchán s roztokem obsahujícím HA a reakce se prováděla 48 h při 60 °C. Nakonec byla reakce naředěna 0,5 ml destilované vody a purifikována.

DS: 2,5 % • ·

Příklad 10. Syntéza derivátu HA-g-PHO-HD-HDD

Kyselina hyaluronová o průměrné molekulové hmotnosti 15 000 g/mol (0,1 g, 0,3 mmol) byla rozpuštěna ve 2 ml destilované vody. Když byl roztok homogenní, přidalo se 0,035 ml TEA (0,3 mmol), následoval dimethylaminopyridin (DMAP) (0,002 g, 0,013 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 0,128 g polyhydroxyoktanoát- ko-polyhydroxydekanoát-kopolyhydroxydodekanoátu (byl použit P3HO-3HD-3HDD vyznačující se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 3 500 g/mol) ve 2 ml DMSO, následoval 1,1'karbonyldiimidazol (0,041 g, 0,3 mmol) a 0,035 ml TEA. Aktivační reakce byla prováděna 4 hodiny při 60 °C. Aktivovaný P3HO-3HD-3HDD se přidal k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat 48 h při 60 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), poté roztoky isopropylalkohol : voda (85% v/v, 4 x 10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylalkoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C po 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

DS: 2,97 %

Příklad 11. Syntéza derivátu HA-g-PHO-HD

Kyselina hyaluronová o průměrné molekulové hmotnosti 15 000 g/mol (0,1 g, 0,3 mmol) byla rozpuštěna ve 2 ml destilované vody. Když byl roztok homogenní, přidalo se 0,035 ml TEA (0,3 mmol), následoval dimethylaminopyridin (DMAP) (0,002 g, 0,013 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 0,078 g polyhydroxyoktanoát- ko-polyhydroxydekanoát (nazývaný rovněž P(3HO-3HD vyznačující se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 7 500 g/mol) ve 2 ml DMSO, následoval Ι,Γ-karbonyldiimidazol (0,041 g, 0,3 mmol) a 0,035 ml TEA. Aktivační reakce byla prováděna 4 hodiny při 60 °C. Aktivovaný PHO se přidal k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat 12 h při 25 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), poté roztoky isopropylalkohol : voda (85% v/v, 4 x 10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylalkoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C po 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

• · · · · · ·* • «· ·· ··· ·

DS: 3,29 %

Příklad 12. Syntéza derivátu HA-g-PHO

Sodná sůl kyseliny hyaluronové o průměrné molekulové hmotnosti 15 000 g/mol (0,1 g, 0,3 mmol) byla rozpuštěna ve 2 ml destilované vody. Když byl roztok homogenní, přidalo se se 0,035 ml TEA (0,3 mmol), následoval dimethylaminopyridin (DMAP) (0,002 g, 0,013 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 1,05 g polyhydroxyoktanoátu (oligomemí P3HO), vyznačujícího se hmotnostně střední relativní molekulovou hmotností (Mw) 5 000 g/mol, ve 2 ml DMSO, následoval Ι,Γ-karbonyldiimidazol (0,041 g, 0,3 mmol) a 0,035 ml TEA. Aktivační reakce byla prováděna 4 hodiny při 60 °C. Aktivovaný PHO se přidal k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat 12 h při 25 °C. Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), poté roztoky isopropylalkohol : voda (85% v/v, 4x10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylalkoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C po 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

DS: 1,5 %

Příklad 13. Syntéza derivátu HA-g-PHO

Kyselá forma hyaluronanu (2,28 g, 6 mmol) byla rozpuštěna ve 110 ml DMSO. Když byl roztok homogenní, přidalo se se 0,841 ml TEA (6 mmol), následoval dimethylaminopyridin (DMAP) (0,0037 g, 0,302 mmol). V oddělené baňce bylo rozpuštěno 1,05 g polyhydroxyoktanoátu (oligomemí P3HO, charakterizovaný hmotnostně průměrnou relativní molekulovou hmotností (Mw) 5 000 g/mol, v 72 ml DMSO, následoval 1, Γ-karbonyIdiimidazol (0,978 g, 6 mmol) a 0,841 ml TEA (6 mmol). Aktivační reakce probíhá 4 hodiny při 60 °C. Aktivovaný PHO se přidal k roztoku obsahujícímu HA a vše se nechalo reagovat dalších 48 h při 60 °C. C Reakční produkt byl izolován srážením s přídavkem 40 ml přesyceného roztoku chloridu sodného ve vodě. Poté byl produkt promyt nejprve isopropylalkoholem (100 ml), poté roztoky isopropylalkohol : voda (85% v/v, 4x10 ml) a nakonec třikrát 10 ml isopropylalkoholu. Bílá sraženina byla dekantována a sušena v sušárně při 40 °C po 24 h. Struktura produktu a stupeň substituce byly stanoveny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a potvrzeny infračervenou spektroskopií (FT-IR).

DS: 6,3 %

Příklad 14. Charakterizace vybraných materiálů

Materiály připravené podle dříve uvedených příkladů byly charakterizovány pomocí SECMALLS a data jsou shrnuta v tabulce 2. Průměrná molekulová hmotnost HA-g-PHA vzrostla v porovnání s výchozí HA, což znamená, že polymer může vykazovat supramolekulámí agregaci nazývanou rovněž samoshlukování.

Tabulka 2. Hodnoty SEC-MALLS pro HA-graft-PHA

Vstup	polymer	DS(%)	MnXlO3 g/mol	Mw xlO3 g/mol	Mz xlO3 g/mol	P Mw/Mn
A	HA	0	5,5	12,5	21,2	1,53
B	HA-H+	0	5,3	11,9	34,5	2,24
C	HA-TBA	0	5,4	14,9	35,2	1,25
D	HA-gra//-HB5.2	5,2	10,4	13,4	22,9	1,27
E	HA-gra/r-HBi.e	8,4	68,4	27,5	44,82	1,62
F	HA-gra/j-HOi.i	1,1	10,4	14,9	29,9	1,26
G	HA-gra//-HO-HDo.4	0,7	12,7	15,9	36,5	1,27
H	HA-gra/Z- HO-HD-HDD2.5	4,8	21,6	17,4	2684	1,68

Mw = hmotnostně střední relativní molekulová hmotnost; Mn = číselně střední relativní molekulová hmotnost; PDI = index polydispersity (Mw/Mn).

Příklad 15. Zpracování materiálu syntetizovaného v příkladu 4 elektrostatickým zvlákňováním

Výroba objemných nanovláknových materiálů z nativní HA a modifikovaného HA-g-PHB. Jak je známo odborníkům z oboru, příprava objemných nanovláknových materiálů spočívá zejména ve správné volbě parametrů zvlákňovaného roztoku a podmínkách formování.

Elektrostatické zvlákňování může být prováděno například za použití parametrů uvedených v dosud popsaném stavu techniky, např. v patentové přihlášce WO2015074631 (Al) CONTIPRO a.s. Chemicky modifikovaný HA-graft-PHB připravený v příkladu 4 byl zvlákňován ze zvlákňovacího roztoku spolu s nosným polymerem PEO (polyethylenoxid, 400 000 g/mol). Zvlákňovací roztok byl připraven smícháním HA-gra/CPHB a PEO v poměru např. 8/2 pro obsah HA, následovalo jejich rozpuštění ve vodě na odpovídající koncentraci. Koncentrace roztoku znamená obsah polymerní směsi HA-graft-PHB/PEO ve vodném roztoku.

Podmínky elektrostatického zvlákňování
Parametr	Hodnota
Teplota [°C]	25
Vlhkost [% relativní vlhkosti]	18
Vzdálenost od elektrody [cm]	20
Napětí [kV]	50
Výtok	Statický
Rychlost sběrače (ot/min)	2 500
Zařízení	4SPIN
Rozpouštědlo	Voda
Průměr vlákna	Průměr: 243 nm (minimum 137 nm, maximum 419 nm)
Polymerní směs	(HA-graft-PHB; 15 000 g/mol DS: 4,9 % PEO: 400 000 g/mol)

Mikrografy SEM jsou zobrazeny na obrázku 7. Měření průměru za použití elektronové skenovací mikroskopie. Měření průměru jednotlivých vláken byla provedena pomocí SEM. Jednotlivá vlákna byla nalezena porovnáním snímků získaných z invertovaného optického mikroskopu se zvětšením 40x stýmž vláknem nalezeným na SEM. Jakmile bylo vlákno nalezeno, byl pořízen snímek při zvětšení 10 OOOx pomocí SEM a průměry byly měřeny pomocí SEM software. Z každého snímku vlákna se bral průměr 50 měření průměrů a všechny průměry se poté zprůměrovaly a stanovila se velikost každého jednotlivého vlákna.

Příklad 16. Zpracování materiálu syntetizovaného v příkladu 4 pomocí elektrostatického zvlákňování

Výroba objemných materiálů z nativního a modifikovaného HA-g-PHA.

Jak je odborníkům z oboru známo, příprava objemných nanovláknových materiálů spočívá zejména ve správné volbě parametrů zvlákňovaného roztoku a podmínek tvarování. Elektrostatické zvlákňování může být provedeno například pomocí parametrů uvedených v drive popsané oblasti techniky, tj. v patentové přihlášce WO2015074631 (Al) CONTIPRO a.s.

Chemicky modifikovaný HA-gra/ž-PHB připravený jako v příkladu 4 byl zvlákňován ze zvlákňovacího roztoku spolu s nosným polymerem PEO (polyethylenoxid, 400 000 g/mol). Zvlákňovací roztok byl připraven smícháním HA-graft-PHB a PEO v poměru např. 8/2 pro obsah HA, následovalo jejich rozpuštění ve vodě na odpovídající koncentraci. Koncentrace roztoku znamená obsah polymemí směsi HA-g-PHA/PEO ve vodném roztoku. Mikrografy SEM jsou zobrazeny na obrázku 8.

Podmínky elektrostatického zvlákňování
Parametr	Hodnota
Teplota [°C]	24
Vlhkost [% relativní vlhkosti]	14-18
Vzdálenost od elektrody [cm]	20
Napětí [kV]	30
Výtok	statický
Rychlost sběrače (ot/min)	3000
Zařízení	4SPIN
Rozpouštědlo	voda
Průměr vlákna	Průměr: 324 nm
Polymemí směs 3 složky	(HA-graft-PHB; 15 OOOg/mol PEO: 400 000 g/mol)

• · · ·

Elektrostatické zvlákňování nativní HA bylo rovněž prováděno za podobných podmínek k porovnání rozdílů mezi polymerem před a po chemické modifikaci (obrázek 11). Distribuce velikosti vláken je uvedena na obr. 17.

Podmínky pro zvlákňování nativní HA
Parametr	Hodnota
Teplota [°C]	26
Vlhkost [% relativní vlhkosti]	20
Vzdálenost od elektrody [cm]	16
Napětí [kV]	55
Výtok	statický
Rychlost sběrače (ot/min)	3000
Zařízení	4SPIN
Rozpouštědlo	voda
Průměr vlákna	Průměr: 116 nm
Polymerní směs 3 složky	(HA 85 OOOg/mol smíchaná s PEO: 400 000 g/mol)

Příklad 17. Zpracování materiálu syntetizovaného v příkladu 4 elektrostatickým zvlákňováním

Chemicky modifikovaný HA-gra/TPHB připravený jako v příkladu 4 byl zvlákňován ze zvlákňovacího roztoku spolu s nosným polymerem PEO (polyethylenoxid, 400 000 g/mol). Zvlákňovací roztok byl připraven smícháním HA-graft-PHB a PEO v poměru např. 8/2 pro obsah HA 80 % v sušině, následovalo jejich rozpuštění ve vodě na odpovídající koncentraci. Koncentrace roztoku znamená obsah polymerní směsi HA-graft-PHB/PEO ve vodném roztoku.

Podmínky elektrostatického zvlákňování
Parametr	Hodnota
Teplota [°C]	24
Vlhkost [% relativní vlhkosti]	21
Vzdálenost od elektrody [cm]	20

Napětí [kV]	50
Dávkování [μΐ/min]	70
Výtok	statický
Rychlost sběrače (ot/min)	2000
Zařízení	4SPIN
Rozpouštědlo	voda
Průměr vlákna	Průměr: 258 nm
Polymemí směs 3 složky	(HA-gra/i-PHB 15 000 g/mol 5% DS + PEO, 400 000 g/mol)

Příklad 18. Zpracování materiálu syntetizovaného v příkladu 4 elektrostatickým zvlákňováním s polymerem obsahujícím polymer vhodný k zesíťování

Produkce objemných nanovláknových materiálů z nativního a modifikovaného HA-g-PHA.

Jak je odborníkům z oboru známo, příprava objemných nanovláknových materiálů spočívá hlavně ve správné volbě parametrů zvlákňovaného roztoku a podmínkách formování. Elektrostatické zvlákňování může být provedeno například pomocí parametrů uvedených v dříve popsané oblasti techniky, tj. v patentové přihlášce WO2015074631 (Al) CONTIPRO a.s.

Chemicky modifikovaný HA-g-PHA připravený jako v příkladu 4 byl zvlákňován ze zvlákňovacího roztoku spolu s nosným polymerem PEO (polyethylenoxid, 400 000 g/mol). Zvlákňovací roztok byl připraven smícháním HA-graft-PHB /HA-Fu a PEO v poměru např. 4/4/2 pro obsah HA 80 % v sušině, následovalo jejich rozpuštění ve vodě na odpovídající koncentraci. Koncentrace roztoku znamená obsah polymemí směsi HA-graft-PHB + HA-Fu + PEO ve vodném roztoku. Polymer HA-Fu může být připraven podle patentové přihlášky WO2015074632 (Al), jak bylo nedávno uvedeno v Journal Carbohydrate Polymers 137:255, únor 2016 (DOI: 10.1016/j.carbpol.2015.10.077). Mikrografy SEM jsou zobrazeny na obrázku

9. Měření průměru jednotlivých vláken byla provedena pomocí SEM. Jednotlivá vlákna byla nalezena porovnáním snímků získaných z invertovaného optického mikroskopu se zvětšením 40x s týmž vláknem nalezeným na SEM. Jakmile bylo vlákno nalezeno, byl pořízen snímek při • « • · · ·

zvětšení 30 000x pomocí SEM a průměry byly měřeny pomocí SEM software. Z každého snímku vlákna se bral průměr 15 měření průměrů a všechna měření průměrů se poté zprůměrovala ke stanovení velikosti každého jednotlivého vlákna.

Podmínky elektrostatického zvlákňování
Parametr	Hodnota
Teplota [°C]	24
Vlhkost [% relativní vlhkosti]	14-18
Vzdálenost od elektrody [cm]	20
Napětí [kV]	30
Výtok	statický
Rychlost sběrače (ot/min)	2 500
Zařízení	4SP1N
Rozpouštědlo	voda
Průměr vlákna	150 nm
Polymemí směs 3 složky	(HA-graft-PHB; 15 000 g/mol DS= 4,9 %, HA-Furan s DS=5 % a Mw= 85 000 g/mol + PEO: 400 000 g/mol)

Příklad 19. Zpracování materiálu syntetizovaného v příkladu 4 elektrostatickým zvlákňováním smíchaného s polymerem obsahujícím polymer vhodný k zesíťování Chemicky modifikovaný HA-g-PHB připravený jako v příkladu 4 byl zvlákněn ze zvlákňovacího roztoku spolu s nosným polymerem PEO (polyethylenoxid, 400 000 g/mol). Zvlákňovací roztok byl připraven smícháním HA-g-PHB/HA-methakrylát /PEO v poměru 4/4/2, následovalo jejich rozpuštění ve vodě na koncentraci 6 nebo 11 % w/v. Koncentrace roztoku znamená obsah polymemí směsi HA-g-PHA + HA-methakrylát /PEO ve vodném roztoku. Polymer HA-methakrylát může být připraven podle našeho dříve popsaného stavu techniky (Huerta-Angeles, Brandejsova et al. 2016) zahrnujícího reakci směsi anhydridů. SEM mikrografy jsou zobrazeny na obrázku 10.

v · · · · · ·· · · ·«· · · · · ·· ·· · · · · · · · · ·

Podmínky elektrostatického zvlákňování
Parametr	Hodnota
Teplota [°C]	27
Vlhkost [% relativní vlhkosti]	24
Vzdálenost od elektrody [cm]	20
Napětí [kV]	55
Dávkování [μΐ/min]	120
Výtok	statický
Substrát	spanbond
Rychlost sběrače (ot/min)	2000
Zařízení	4SPIN
Rozpouštědlo	voda
Průměr vlákna	150 nm
Polymerní směs 3 složky	(HA-graft-PHB 15 000 g/mol 40 (% w/w) + HA-methakrylát 40 (% w/w) s Mw= 115 000 g/mol a DS = 9 % + PEO (400 000 g/mol ve 20 (% w/w))

Jak odborníci z oboru očekávali, pokud kompozice obsahuje polymer se skupinami, které mohou být polymerovány světlem a jsou schopny reagovat s vnějším činidlem, může být produkována nerozpustná nanovláknová podložka.

Příklad 20. Zpracování materiálu syntetizovaného v příkladu 4 elektrostatickým zvlákňováním smíchaného se dvěma polymery

Chemicky modifikovaný HA-g-PHB připravený jako v příkladu 4 byl zvlákněn ze zvlákňovacího roztoku spolu s nosným polymerem PEO (polyethylenoxid, 400 000 g/mol) smíchaným s polyvinylalkoholem (PVA). Zvlákňovací roztok byl připraven smícháním HA-gPHB/PVA/PEO v poměru 80/15/5 a následovalo jejich rozpuštění ve vodě na koncentraci 10 % w/v. Koncentrace roztoku znamená obsah všech polymerů směsi rozpuštěných ve vodě za vzniku roztoku.

• · · · • · · ♦·· ·· ·· • « · · · · · ·· ·· · ·· ·· ····

Příklad 21. Test cytotoxicity derivátů HA-graft-PHA

K vyhodnocení potenciálu HA-g-PHA pro biomedicínské aplikace byla u kopolymerů testována cytotoxicita podle ČSN EN ISO 10993-5 (leden 2010). Výsledky jsou znázorněny graficky na obrázcích 14 - 16. Byly kultivovány 3T3 NIH myší fibroblasty a udržovaly se v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) doplněném roztoky 10% fetálním bovinním sérem (FBS), glutaminem (0,29 mg.ml·¹), penicilinem (10 000 jednotek.ml·¹) a streptomycinem (10 mg.ml·¹) a pěstovanými pod atmosférou 7,5 % CO₂ při 37 °C. Jeden den před experimentálním ošetřením bylo 3 000 buněk naočkováno do 96jamkových destiček. Buňky byly ošetřeny HA-g-PHA rozpuštěným v kultivačním médiu v koncentracích 100, 500 nebo 1 000 pg.ml·¹ trojmo. Viabilita buněk byla stanovena pomocí testu MTT po 24, 48 a 72 hodinách ošetření (Vištejnová, Dvořáková et al. 2009).

Literatura

Arslan, Η., B. Hazer and S. C. Yoon (2007). Grafting of póly (3-hydroxyalkanoate) and linoleic acid onto chitosan. Journal of applied polymer science 103(1): 81-89.

Asran, A., K. Razghandi, N. Aggarwal, G. H. Michler and T. Groth (2010). Nanofibers from blends of polyvinyl alcohol and polyhydroxy butyrate as potential scaffold materiál for tissue engineering of skin. Biomacromolecules 11(12): 3413-3421.

Basnett, P., K. Y. Ching, M. Stolz, J. C. Knowles, A. R. Boccaccini, C. Smith, I. C. Locke, T. Keshavarz and 1. Roy (2013). Novel Poly(3-hydroxyoctanoate)/Poly(3-hydroxybutyrate) blends for medical applications. Reactive and Functional Polymers 73(10): 1340-1348.

Gref, R., J. Rodrigues and P. Couvreur (2002). Polysaccharides Grafited with Polyesters: Novel Amphiphilic Copolymers for Biomedical Applications. Macromolecules 35(27): 9861-9867. Huerta-Angeles, G., M. Brandejsova, K. Knotkova, M. Hermannova, M. Moravcova, D. Smejkalova and V. Velebný (2016). Synthesis of photo-crosslinkable hyaluronan with tailored degree of substitution suitable for production of water resistant nanofibers. Carbohydr Polym 137:255-263.

Kai, D. and X. J. Loh (2014). Polyhydroxyalkanoates: Chemical Modifications Toward Biomedical Applications. ACS Sustainable Chemistry & Engineering 2(2): 106-119.

Khosravi-Darani, K., E. Vasheghani-Farahani, Y. Yamini and N. Bahramifar (2003). Solubility of Poly(í²-hydroxybutyrate) in Supercritical Carbon Dioxide. Journal of Chemical & Engineering Data 48(4): 860-863.

• · · ·

Kuppan, P., K. S. Vasanthan, D. Sundaramurthi, U. M. Krishnan and S. Sethuraman (2011). Development of Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) Fibers for Skin Tissue Engineering: Effects of Topography, Mechanical, and Chemical Stimuli. Biomacromolecules 12(9): 3156-3165.

Le Fer, G., J. Babinot, D.-L. Versace, V. Langlois and E. Renard (2012). An Efficient ThiolEne Chemistry for the Preparation of Amphiphilic PHA-Based Graft Copolymers. Macromolecular Rapid Communications 33(23): 2041-2045.

Li, Z. and X. J. Loh (2015). Water soluble polyhydroxyalkanoates: future materials for therapeutic applications. Chemical Society Reviews 44(10): 2865-2879.

Loh, X. J., Z.-X. Zhang, Y.-L. Wu, T. S. Lee and J. Li (2009). Synthesis of Novel Biodegradable Thermoresponsive Triblock Copolymers Based on Poly[(R)-3-hydroxybutyrate] and Poly(N-isopropylacrylamide) and Their Formation of Thermoresponsive Micelles. Macromolecules 42(1): 194-202.

Luo, S., J. Cao and A. G. McDonald (2016). Interfacial Improvements in a Green Biopolymer Alloy of Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and Lignin via in Šitu Reactive Extrusion. ACS Sustainable Chemistry & Engineering 4(6): 3465-3476.

Mahapatra, K., M. Suresh Kumar and T. Chakrabarti (2007). Production and recovery process of polyhydroxybutyrate (PHB) from waste activated sludge. Joumal of Environmental Science and Engineering 49(3): 164-169.

Martin, D. P., F. Skraly and S. F. Williams (2004). Polyhydroxyalkanoate compositions having controlled degradation rates, Google Patents.

Meng, W., S. Y. Kim, J. Yuan, J. C. Kim, O. H. Kwon, N. Kawazoe, G. Chen, Y. Ito and I. K. Kang (2007). Electrospun PHBV/collagen composite nanofibrous scaffolds for tissue engineering. J Biomater Sci Polym Ed 18(1): 81-94.

Michalak, M., A. A. Marek, J. Zawadiak, M. Kawalec and P. Kurcok (2013). Synthesis of PHB-based carrier for drug delivery systems with pH-controlled release. European Polymer Joumal 49(12):4149-4156.

Mitragotri, S., D. G. Anderson, X. Chen, Ε. K. Chow, D. Ho, A. V. Kabanov, J. M. Karp, K. Kataoka, C. A. Mirkin, S. H. Petrosko, J. Shi, Μ. M. Stevens, S. Sun, S. Teoh, S. S. Venkatraman, Y. Xia, S. Wang, Z. Gu and C. Xu (2015). Accelerating the Translation of Nanomaterials in Biomedicine. ACS Nano 9(7): 6644-6654.

·· ·»»« ·· ···· · ···· • · · · · ··· · ··· · · ·· · ··· · · · · ·* · • · · · · · ··· ·· · ·· 9 9 9999

Parlane, N. A., S. K. Gupta, P. Rubio-Reyes, S. Chen, M. Gonzalez-Miro, D. N. Wedlock and

B. H. A. Rehm (2016). Self-Assembled Protein-Coated Polyhydroxyalkanoate Beads:

Properties and Biomedical Applications. ACS Biomaterials Science & Engineering.

Stigers, D. J. and G. N. Tew (2003). Poly(3-hydroxyalkanoate)s Functionalized with

Carboxylic Acid Groups in the Side Chain. Biomacromolecules 4(2): 193-195.

Valappil, S. P., S. K. Misra, A. R. Boccaccini and I. Roy (2006). Biomedical applications of polyhydroxyalkanoates, an overview of animal testing and in vivo responses. Expert Review of Medical Devices 3(6): 853-868.

Vištejnová, L., J. Dvořáková, M. Hasová, T. Muthný, V. Velebný, K. Souček and L. Kubala (2009). The comparison of impedance-based method of cell proliferation monitoring with commonly ušed metabolic-based techniques. Neuro Endocrinol Lett 30 Suppl 1: 121-127.

Wei, L., A. G. McDonald and N. M. Stark (2015). Grafting of Bacterial Polyhydroxybutyrate (PHB) onto Cellulose via In Šitu Reactive Extrusion with Dicumyl Peroxide.

Biomacromolecules 16(3): 1040-1049.

Claims (17)

1. Kopolymer kyseliny hyaluronové a/nebo její soli a jednoho nebo více polyhydroxyalkanoátů, podle obecného vzorce IV:

kde n je celé číslo v rozmezí 1 až 5 000 dimerů,

R⁴ je H⁺ nebo jakákoli farmaceuticky přijatelná sůl, s výhodou vybraná ze skupiny obsahující jakýkoli z iontů alkalických kovů nebo iontů kovů alkalických zemin, výhodněji Na⁺, K⁺, Mg²⁺ nebo Li⁺, a R⁵ je H nebo PHA-CO-, kde PHA-CO- představuje polymer s následujícím vzorcem III:

kde

R je nezávisle H nebo -COCH3 a kde R¹, R² a R³ jsou alkyl, aryl skupiny, nasycené nebo nenasycené, obsahující od 1 do 18 atomů uhlíku.

s je celé číslo mezi 1 a 100, a kde PHA-CO- jsou stejné nebo různé v rámci celého kopolymeru a kde stupeň substituce kyseliny hyaluronové a/nebo její soli skupinou PHA-CO-je v rozmezí 0,1 až 15 %.

2. Kopolymer podle nároku 1, vyznačující se tím, že stupeň substituce je v rozmezí od 4 do

10 %.

3. Kopolymer podle kteréhokoli z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že PHA je vybrán ze skupiny zahrnující P3HB, PHO, PHD, PHDD nebo jejich kombinaci.

4. Způsob produkce kopolymeru definovaného v nároku 1, vyznačující se tím, že PHA derivát podle vzorce V se nechá reagovat s kyselinou hyaluronovou nebo její solí podle schématu 3

Schéma 3 kde

R⁶ nebo za přítomnosti DMAP a organické báze v polárním rozpouštědle mísitelném s vodou nebo ve vodě nebo ve směsi vody a s vodou mísitelného polárního rozpouštědla při teplotě v rozmezí 22 °C až 37 °C po dobu 12 až 48 hodin.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že organická báze je vybrána ze skupiny zahrnující alifatický amin, který má lineární nebo rozvětvenou, nasycenou nebo nenasycenou C3-C30 alkyl skupinu, a rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující isopropanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a tetrahydrofuran.

6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 4 a 5, vyznačující se tím, že organická báze je vybrána ze skupiny zahrnující Ν,Ν-diisopropylethylamin a triethylamin a rozpouštědlem je dimethylsulfoxid.

7. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že derivát PHA podle vzorce V je vytvořen aktivací polyhydroxyalkanoátu PHA-COOH o molekulové hmotnosti Mw v rozmezí od 1 500 do 20 000 pomocí aktivačního činidla, podle schématu 2A, za podmínky, že R⁶ je

N^NH \=/

PHA-COOH ti (h), T, °C _pHAA org. rozpouštědlo,

V co₂ +

Schéma 2A nebo podle schématu 2B za podmínky, že R⁶ je

PHA-COOH ti (h), η °C --------------------> org. rozpouštědlo, org. báze

Schéma 2B za tvorby reaktivního derivátu PHA podle vzorce V v přítomnosti organické báze a organického polárního rozpouštědla nebo směsi vody a s vodou mísitelného polárního rozpouštědla, při jakékoli teplotě mezi 25 °C a 60 °C, po dobu 4 až 48 hodiny, kde molámí množství aktivačního činidla je 1,5-5 molámích ekvivalentů vzhledem k PHA.

8. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že molekulová hmotnost polyhydroxyalkanoátu PHA-COOH je v rozmezí 1 500 až 15 000 g/mol.

9. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že molámí množství reaktivního derivátu PHA (V), který se nechá reagovat s HA nebo její solí, je 0,01 až 2,0 ekvivalentů vzhledem k dimeru »φ * · ♦♦ ··*· » · · * *· • · * · ·· • « · · * ** • · · ·· · · ·· · ♦ « ·· kyseliny hyaluronové, a rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující isopropanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a tetrahydrofuran.

10. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že reakce je prováděna při 25 °C a molámí množství reaktivního derivátu PHA (V), který se nechá reagovat s HA nebo její solí, je 0,75 až

1,5 ekvivalentů vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové.

11. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že aktivačním činidlem je karbonyldiimidazol (CD1), organická báze je triethylamin (TEA) a rozpouštědlo je dimethylsulfoxid (DMSO).

12. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že aktivačním činidlem je O-(N-sukcimidyl)N,N,N’,N’-bis(tetramethylen)-uronium hexafluorofosfát (HSTU), organická báze je triethylamin (TEA), rozpouštědlo je dimethylsulfoxid (DMSO) a kyselina hyaluronová je ve své kyselé formě.

13. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že aktivace probíhá při teplotě 22 °C až 37 °C a molámí množství aktivačního činidla je 1,6 až 2,1 molárních ekvivalentů vzhledem k PHA.

14. Vlákna zahrnující kopolymer definovaný v kterémkoli z nároků 1 až 3 a jiný biologicky kompatibilní polymer vybraný ze skupiny zahrnující polyethylenoxid (PEO), karboxymethylcelulózu (CMC), želatinu, chitosan, polykaprolakton (PCL), kyselinu polymléčnou (PLA), polyamid (PA), polyurethan (PUR), poly-(laktid-ko-glykolovou) kyselinu, polyvinylalkohol (PVA), kyselinu hyaluronovou (HA) a/nebo jejich deriváty.

15. Způsob výroby vláken definovaných v nároku 14, vyznačující se tím, že kopolymer definovaný v kterémkoli z nároků 1 až 3 se smíchá s jiným biologicky kompatibilním polymerem vybraným ze skupiny zahrnující polyethylenoxid (PEO), karboxymethylcelulózu (CMC), želatinu, chitosan, polykaprolakton (PCL), kyselinu polymléčnou (PLA), polyamid (PA), polyurethan (PUR), poly-(laktid-ko-glykolovou) kyselinu, polyvinylalkohol (PVA), kyselinu hyaluronovou (HA) a/nebo jejich deriváty, a rozpustí se ve vodě, načež se elektrostaticky zvlákňuje.

99 ·· ·· it 9999 * ··♦ 9 9 • · 9 • 9 9 9 9 9 • · 9 9 • 9 9 9 • · 9 9 9 • r 9 9 9 • · ·· · • 9 99 • · ·· 9 9 999 ·

16. Produkt obsahující vlákna definovaná v nároku 14 pro použití v kosmetice, medicíně nebo regenerativní medicíně pro vnější nebo vnitřní použití.

17. Produkt podle nároku 16, vyznačující se tím, že je ve formě vrstvy, filmu, podložky, krytí ran nebo tkáňového scaffoldu.