CZ201481A3

CZ201481A3 - Způsob zpracování odpadních vod z výroby sýrů

Info

Publication number: CZ201481A3
Application number: CZ2014-81A
Authority: CZ
Inventors: Bohuslav Rittich; Alena Španová; Jan Drbohlav; Šárka Havlíková; Eva Kvasničková
Original assignee: Vysoké Učení Technické V Brně; Výzkumný ústav mlékárenský, s. r. o.
Priority date: 2014-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2015-08-12
Also published as: CZ305450B6

Abstract

Předkládané řešení poskytuje nové kmeny bakterií Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498, či fragmenty jejich buněk (geny, enzymy nebo jejich části). Dále vynález popisuje použití těchto kmenů, a to zejména k produkci vodíku.

Description

Nové kmeny bakterií a způsob produkce vodíku

Oblast techniky

Předkládané řešení se týká nových kmenů bakterií Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 a způsobu výroby vodíku využívajícího těchto bakterií.

Dosavadní stav techniky

Současný trend v energetické politice prosazuje vyrovnaný energetický mix jednotlivých druhů zdrojů. Kromě primárních zdrojů energie (klasické a jaderné elektrárny) je pozornost věnována alternativním zdrojům energie, což je jedním z klíčových bodů energetické politiky Evropské unie.

Vodík není klasické palivo, ale energetický vektor neboli nosič energie (nelze jej těžit, ale musí se vyrábět). V současné době je vodík vyráběn z fosilních paliv a biomasy, elektrolýzou vody a fermentaci biomasy. Pro produkci vodíku lze použít biofotolýzu vody cyanobakteriemi. Tento postup je závislý na době osvitu slunečním světlem (je tedy periodický a v noci vyžaduje dodávání energie). Dále jsou pro produkci vodíku používány anaerobní bakterie, mezi kterými mají důležitou roli bakterie rodu Clostridium. N mnoha studiích (Chen W. M., Tseng Z. J., Lee K. S., Chang, J. S. Fermentative hydrogen production with Clostridium butyricum CGS5 isolated from anaerobic sewage sludge. Int. J. Hydrogen Energ. 30 (2005) 1063-1070; Wang J , Wan W. Factors influencing fermentative hydrogen production: A review. Int. J. Hydrogen Energ. 34 (2009) 799-811; Ferchichi M., Crabbe E., Gwang-Hoon Gil G.H., Hintz W., Almadidy A. Influence of initial pH on hydrogen production from cheese whey. J. Biotechnol. 120 (2005) 402-409) bylo potvrzeno, že některé druhy tohoto rodu produkují vodík ve vyšších množstvích než ostatní bakterie a také jsou schopny fermentovat širokou škálu organických materiálů. Mezi významné producenty vodíku patří druhy Clostridum butyricum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium thermolacticum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium thermocellum a Clostridium paraputrificum. Tyto bakterie využívají většinou dva způsoby tvorby vodíku: octové a máselné kvašení. Teoreticky jsou z jednoho molu glukosy produkovány až 4 moly vodíku při octovém kvašení a 2 moly vodíku při máselném kvašení. Produkce vodíku je katalyzována enzymem hydrogenasou. Bakterie rodu Clostridium obvykle využívají obou typů fermentace a množství vzniklého vodíku z glukosy je určeno poměrem výsledných produktů butyrát/acetát.

Anaerobní bakterie rodu Clostridium izolované z vadných sýrů produkují vodík kontinuálně ve fermentačním procesu (oproti cyanobakteriím bez přístupu světla). Bakterie rodu Clostridium jsou schopné utilizovat nejen sacharolytické substráty, ale i potravinářské odpady, odpadní vody a kaly a lignocelulózové materiály. Mezi substráty používané pro produkci vodíku patří i syrovátka. Syrovátka je odpadní produkt, který vzniká v mlékárenském průmyslu jako vedlejší produkt při výrobě sýrů, kaseinu a tvarohů. Jednou z možností zpracování syrovátky z mlékáren je biologická produkce vodíku. Při reakci s kyslíkem je vodík za uvolnění energie spalován pouze na vodu. Tato reakce neprodukuje žádné emise, jako je tomu například v případě spalování uhlíku.

Při vsádkové kultivaci za anaerobních podmínek některé druhy rodu Clostridium během fáze exponenciálního růstu (acidogenní fáze) vedle vodíku a oxidu uhličitého tvoří acetát a butyrát. Když růst buněk dosáhne stacionární fáze, jejich metabolismus se může změnit z produkce vodíku a kyselin na produkci organických rozpouštědel. Tvorba kyselin způsobuje pokles pH kultivačního média, což vede k zahájení sporulace, a buňky v tomto stadiu mění svůj metabolismus (aceton-butanolové kvašení, solventogenní fáze). Kritickou hodnotou pH pro růst buněk je pH 4,0 (Lipovský J., Patáková P., Rychtera M., Čížková H., Melzoch M. Perspektivy produkce butanolu ze škrobnatých a celulosových materiálů, Chem. listy 103 (2009) 479-483).

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu jsou nové bakteriální kmeny Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 produkující vodík. Tyto kmeny jsou uloženy v České sbírce mikroorganismů (CCM Brno).

Vynález zahrnuje i fragmenty buněk těchto nových bakteriálních kmenů, včetně sekvencí nukleových kyselin (tj. genů nebo jejich částí) kódujících enzymy zodpovědné za produkci vodíku, a enzymů zodpovědných za produkci vodíku a jejich částí.

Identita těchto dvou bakteriálních kmenů byla potvrzena mikroskopicky pomocí typické morfologie buněk, kultivačních a molekulárně biologických metod (včetně rodově a druhově specifických PCR).

V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že při použití médií obsahujících glukosu nebo laktosu nebo jejich směs nebo jiné substráty obsahující výše uvedené komponenty dochází ve fermentoru činností uvedených bakteriálních kmenů k vysoké produkci vodíku. Hodnoty produkce vodíku byly naměřeny v rozmezí 35,8 až 47,5 % (% vyjadřuje objemový podíl vodíku ve volně odcházejících plynech) v čase 18 až 60 hodin od počátku inokulace.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob výroby vodíku, a popřípadě i kyseliny octové a/nebo máselné a/nebo jejich solí, ze substrátu obsahujícího glukosu a/nebo laktosu, jehož podstata spočívá v tom, že se na substrát působí alespoň jedním bakteriálním kmenem vybraným z Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498.

Substráty obsahující glukosu a/nebo laktosu zahrnují média obsahující glukosu a/nebo laktosu, syrovátku, odpadní vody z výroby sýrů a další odpadní produkty z mlékárenského průmyslu.

S výhodou se výroba vodíku provádí při pH v rozmezí 4 až 7,5, s výhodou 5 až 7, nejvýhodněji pro Clostridium butyricum CCM 8499 je pH 5 až 7 a pro Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 je pH 6 až 7.

S výhodou se výroba vodíku provádí při teplotě v rozmezí 30 až 40 °C, výhodněji 35 až 39 °C.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž použití alespoň jednoho kmene vybraného z Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 k produkci vodíku ze substrátu obsahujícího glukosu a/nebo laktosu.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití alespoň jednoho kmene vybraného z Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 k fermentaci (zpracování) odpadních vod z výroby sýrů, které obsahují glukosu a/nebo laktosu, syrovátku a další odpadní produkty z mlékárenského průmyslu. Produktem fermentace jsou odpadní voda s nižším obsahem organického podílu; dále vodík a mastné kyseliny, které mohou být rovněž využity.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití alespoň jednoho kmene vybraného z Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 k produkci kyseliny octové nebo kyseliny máselné nebo jejich směsi nebo jejich solí, ze substrátu obsahujícího glukosu a/nebo laktosu.

Ve výhodném provedení se k produkci vodíku použije kombinace obou kmenů Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498.

Kmeny bakterií, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být dodávány a používány ve formě volné, imobilizované, lyoftlizované, ve formě fragmentů buněk (např. DNA, enzymů).

Objasnění výkresů

Obr. 1. Produkce vodíku kmenem Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 v médiu s laktosou (RCML) při pH 5,6 a pH 6,9 (37 °C), příklad 1.

Obr. 2. Produkce vodíku kmenem Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 při použití syrovátky z pokusných výrob sýrů eidamského typu (37 °C), příklad 2.

Obr. 3. Produkce vodíku kmenem Clostridium butyricum CCM 8499 v médiu s laktosou (RCML) při 37 °C, příklad 3.

Obr. 4. Produkce vodíku kmenem Clostridium butyricum CCM 8499 při použití obnovené syrovátky jako média (37 °C), příklad 4.

Obr. 5. Produkce vodíku směsí kmenů Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 (1:1) při použití obnovené syrovátky jako fermentačního média (37 °C), příklad 5.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Bakteriální kmeny Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 produkující vodík byly vybrány ze souboru kmenů bakterií rodu Clostridium, které byly průběžně izolovány při sledování kvality sýrů při jejich výrobě. Kmen Clostridium butyricum CCM 8499 byl izolován ze sýru eidamského typu. Pro jeho izolaci byl použit RCM agar (Oxoid CM0151, UK) s přídavkem 10 ml roztoku neutrální červeni na 1000 ml (0,5% v 60% ethanolu); kultivace probíhala anaerobně při 37 °C po dobu 5 dní. Kultivace izolátu byla provedena anaerobně v tekutém RCMB médiu při 37 °C po dobu 3 dní. Kmen Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 byl izolován z měkkého zrajícího sýru (Romadur). Pro jeho izolaci byl použit RCM agar (Oxoid CM0151, UK) s přídavkem 10 ml roztoku neutrální červeni na 1000 ml (0,5% v 60% ethanolu); kultivace probíhala anaerobně při 37 °C po dobu 5 dní. Kultivace izolátu byla provedena anaerobně v tekutém RCMB médiu při 37 °C po dobu 3 dní. Při použití média RCML s laktosou (složení je uvedeno v Tabulce 1) byla sledována produkce vodíku a růst buněk. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2. Vybrány byly kmeny s vysokou produkcí vodíku a nejvyšším nárůstem buněk.

Fermentace probíhala v laboratorním fermentoru, který sestával z dvouplášťové skleněné nádoby o obsahu 2 litry a analyzátorů plynů pro CO2 a FU Kultivace probíhala za anaerobních podmínek při 37 °C. Očkovací dávka byla 5 % (obj). pH bylo udržováno na konstantní hodnotě pomocí alkalické pumpy - její dávkování bylo řízeno podle signálu pH elektrody. Během fermentace byl udržován konstantní objem fermentačního média.

Tabulka 1: Složení médií RCM a RCML

Složka	Hmotnost (g)
RCM^a	RCML^b
kvasničný extrakt	3,0	3,0
Lab-Lemco prášek	10,0	10,0
bakteriologický pepton	10,0	5,0
škrob	1,0	1,0
chlorid sodný	5,0	5,0

octan sodný	3,0	3,0
glukosa	5,0	0
laktosa	0	5,0

^a standardní médium (kontrola) (Oxoid CM01), ^b pokusné médium

Tabulka 2 Výběr kmenů v závislosti na produkci vodíku (%) a růstu (cfu/ml)

Kmen S29	Druh C. tyrobutyricum	H₂ (%) 0,0	CFU/ml 2.10E+03
CCM 8498	C. tyrobutyricum	47,5	2.60E+06
CCM 8499	C. butyricum	35,8	1.40E+05
L3	C. tyrobutyricum	30,9	nestanoveno
1030	C. butyricum	27,4	1.10E+04
12-15-1A	C .tyrobutyricum	45,8	2.00E+02
V51-RCM-3C	C. tyrobutyricum	1,3	1.26E+05
SMR 184	C. tyrobutyricum	0,0	2.28E+03
SP 112	C. tyrobutyricum	54,5	>l,00E+03

Příklad produkce vodíku kmenem Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 při použití média obsahujícího laktosu (RCML, viz Tabulka 1) při teplotě 37 °C je uveden na Obr. 1. Při použití média obsahujícího laktosu docházelo v laboratorním fermentoru k produkci vodíku při hodnotě pH 6,9; podíl vodíku ve volně odcházejících plynech činil 47,5 % při pH 6,9.

Příklad 2

Příklad produkce vodíku kmenem Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 při použití syrovátky z pokusných výrob sýrů eidamského typu při teplotě 37 °C je uveden na Obr. 2. Při použití uvedeného média docházelo v laboratorním fermentoru k produkci vodíku při hodnotě pH

6,9 jako v případě použití média s laktosou (RCML).

Při kultivaci za laboratorní teploty (20 °C) kmen neprodukoval významnější množství vodíku.

Příklad 3

Příklad produkce vodíku kmenem Clostridium butyricum CCM 8499 při použití média obsahujícího laktosu (RCML, viz Příloha 1) je při teplotě 37 °C uveden na Obr. 3. Při použití média obsahujícího laktosu docházelo v laboratorním fermentoru k produkci vodíku při hodnotách pH 5,6 a 6,9. U fermentace při použití pH 5,6 došlo k výraznému časovému posunu produkce vodíku.

Příklad 4

Příklad produkce vodíku kmenem Clostridium butyricum CCM 8499 při použití obnovené syrovátky jako média (byla použita sušená syrovátka; hmotnost použité syrovátky byla přepočtena na stejný obsah laktosy jako u média RCML) při teplotě 37 °C je uveden na Obr.

4. Produkce vodíku byla vyšší při pH 5,6 než při pH 6,9. Podíl vodíku ve volně odcházejících plynech činil až 28 % při pH 5,6; zatímco při pH 6,9 nepřesáhl hodnotu 15 %. Při kultivaci za laboratorní teploty (20 °C) kmen neprodukoval významnější množství vodíku.

Příklad 5

Vzhledem k tomu že sladká syrovátka má pH v rozmezí hodnot 6,5 až 6,9, přítomnost kmene Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 umožňuje produkovat vodík i při vyšších hodnotách pH. Tvorba kyselin způsobuje pokles pH kultivačního média, což umožňuje využití kmene Clostridium butyricum CCM 8499. Při fermentaci je kmen Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 po 42 hodinách nedetekovatelný a při produkci vodíku se uplatňuje kmen Clostridium butyricum CCM 8499.

Při fermentaci syrovátky směsí klostridií při teplotě 37 °C byl podíl kmene C. butyricum CCM 8499 u obou směsí pro produkci vodíku rozhodující. Při poměru kmenů (1:1) metodou denaturační gradientově gelové elektroforézy (DGGE) nebyla prokázána přítomnost kmene C. tyrobutyricum CCM 8498 po více než 18 hodinách fermentace.

Příklad 6

Produkce kyselin

Při vsádkové kultivaci při použití glukosy, laktosy, nebo jejich směsi jako substrátu, testované druhy rodu Clostridium za anaerobních podmínek během fáze exponenciálního růstu vedle vodíku a oxidu uhličitého tvořily acetát a butyrát. Produkce těkavých mastných kyselin testovanými bakteriálními kmeny v RCM médiu (s glukosou) je uvedena v Tabulce 3.

Tabulka 3 Produkce těkavých mastných kyselin testovanými bakteriálními kmeny - plynová chromatografie (RCM médium)

Druh	Kmen	Kyselina/(koncentrace (mg/L)
		octová	propionová	i-máselná	n-máselná	n-valerová
C .tyrobutyricum	CCM 8498	828	0	0	2123	0
C. butyricum	CCM 8499	1557	0	0	0	0

Průmyslová využitelnost

V České republice se zpracovává ročně asi 2,5 miliardy litrů mléka a z výroby sýrů je produkováno asi 900 milionů litrů syrovátky jako vedlejšího produktu. Lze odhadovat, že dvě třetiny produkované syrovátky jsou s nulovým ziskem prodávány ke krmným účelům nebo nežádoucím způsobem unikají do životního prostředí. V Evropě se většina syrovátky velkokapacitně zpracovává ve specializovaných podnicích, kam se syrovátka sváží v zahuštěném stavu i z velkých vzdáleností. Tento způsob zpracování syrovátky je energeticky velmi náročný a stále obtížněji udržitelný v důsledku rostoucích cen pohonných hmot. Navrhovaný způsob zpracování syrovátky z mlékáren umožňuje biologickou produkci vodíku. Vodík lze využít jako nízkotlaký lokální zdroj energie. Při fermentaci vznikají těkavé mastné kyseliny (kyselina octová a máselná), které lze po vhodném zpracování dále využít jako biologicky nezávadná konzervační činidla v potravinářství, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Bakteriální kmeny Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 produkující vodík, a fragmenty buněk těchto bakteriálních kmenů, zejména vybrané ze sekvencí nukleových kyselin, které kódují enzymy zodpovědné za produkci vodíku, a jejich částí, a enzymů zodpovědných za produkci vodíku a jejich částí.
2. Způsob produkce vodíku, a popřípadě i kyseliny octové a/nebo máselné a/nebo jejich solí, ze substrátu obsahujícího glukosu a/nebo laktosu, vyznačený tím, že se na substrát působí alespoň jedním bakteriálním kmenem vybraným z Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se na substrát působí alespoň jedním bakteriálním kmenem při pH v rozmezí 4 až 7,5, s výhodou 5 až 7.
4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačený tím, že se na substrát působí alespoň jedním bakteriálním kmenem při teplotě v rozmezí 30 až 40 °C, výhodněji 35 až 39 °C.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 2 až 4, vyznačený tím, že substrát obsahující glukosu a/nebo laktosu je vybrán ze skupiny zahrnující média obsahující glukosu a/nebo laktosu, syrovátku, odpadní vody z výroby sýrů a odpadní produkty z mlékárenského průmyslu.
6. Použití alespoň jednoho kmene vybraného z Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 a/nebo fragmentů buněk těchto kmenů k produkci vodíku ze substrátu obsahujícího glukosu a/nebo laktosu.
7. Použití alespoň jednoho kmene vybraného z Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 a/nebo fragmentů buněk těchto kmenů k fermentaci odpadních vod vznikajících při výrobě sýrů, které obsahují glukosu a/nebo laktosu.
8. Použití alespoň jednoho kmene vybraného z Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 a/nebo fragmentů buněk těchto kmenů k produkci kyseliny octové a/nebo kyseliny máselné a/ nebo jejich solí, ze substrátu obsahujícího glukosu a/nebo laktosu.
9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8, vyznačené tím, že se použije směs obou kmenů Clostridium butyricum CCM 8499 a Clostridium tyrobutyricum CCM 8498 a/nebo fragmentů buněk těchto kmenů.