CZ2014757A3

CZ2014757A3 - Polymeric substrates for direct covalent binding of biomolecules

Info

Publication number: CZ2014757A3
Application number: CZ2014-757A
Authority: CZ
Inventors: Hynek Biederman; Marcela Bilek; Ondřej Kylián
Original assignee: Univerzita Karlova v Praze Matematicko- fyzikální fakulta
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2016-05-18

Abstract

Předmětem řešení jsou polymerní substráty umožňující přímé kovalentní navázání biomolekul při zachování jejich biofunkčních vlastností. Polymerní substráty jsou připravovány postupem založeným na aktivaci jejich povrchů pomocí atmosférického plazmatu ve vzduchu následované navázáním požadovaných biomolekul. Kovalentní navázání biomolekul bylo ověřeno na příkladu polytetrafluoroethylenu (PTFE), na který byl kovalentně navázán bovin serum albumin. Zachování biofunkčních vlastností navázaných biomolekul bylo ověřeno na příkladu tropoleastinu navázáno na tenkou polytetrafluoroethylenovou folii, přičemž bioaktivita tropolestinu byla ověřena studiem růstu endoteliálních buněk na povrchu s navazaným tropoelastinem. Bylo prokázáno, že v tomto případu dochází k výrazně rychlejšímu růstu endoteliálních buněk na povrchu PTFE s kovalentně navazaným tropoelastinem než v případu PTFE folie bez povrchové aktivace a bez navázaného tropoelastinu.The subject of the solution are polymer substrates allowing direct covalent binding of biomolecules while maintaining their biofunctional properties. Polymer substrates are prepared by a process based on the activation of their surfaces by atmospheric plasma in the air followed by binding of the desired biomolecules. The covalent attachment of biomolecules was verified by the example of polytetrafluoroethylene (PTFE), to which bovine serum albumin was covalently bound. The preservation of biofunctional properties of bound biomolecules was verified on the example of tropoleastin bound to a thin polytetrafluoroethylene film, while the bioactivity of tropolestine was verified by the study of endothelial cell growth on the surface with tropoelastin. It has been shown that in this case the growth of endothelial cells is significantly faster on the surface of PTFE with covalently bound tropoelastin than in the case of PTFE film without surface activation and without bound tropoelastin.

Description

>νννΛΠ r Z,> νννΛΠ r Z,

POPIS VYNÁLEZU ,α-i /* & -3- - / y /*.· • ·»· • · % · 'DESCRIPTION OF THE INVENTION α-i / * & -3- - / y /*.· • · · · · · · · ·

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká metody pro kovalentní navázání biomolekul na polymemí substráty při zachování jejich biofunkcionality.The invention relates to a method for covalently attaching biomolecules to polymeric substrates while maintaining their biofunctionality.

Dosavadní stav technikyBackground Art

Kovalentní navázání různých typů biomolekul (proteiny, enzymy, léčiva) na různé typy substrátů je důležitý krok pro biolékařské aplikace, jako jsou například výroba biosenzorů, proteinových mikročipů, či zvýšení biokompatibility různých druhů implantátů. Pro tyto aplikace je nutné zajistit nejen pevnou vazbu mezi biomolekulou a substrátem, ale i zaručit zachování biofunkčních vlastností navázané biomolekuly.The covalent attachment of different types of biomolecules (proteins, enzymes, drugs) to various types of substrates is an important step for biomedical applications such as the production of biosensors, protein microchips, or enhancement of the biocompatibility of different types of implants. For these applications, it is necessary to ensure not only a solid bond between the biomolecule and the substrate, but also to ensure the maintenance of the biofunctional properties of the bound biomolecule.

Pro kovalentní vázání biomolekul na substráty bylo vyvinuto mnoho různých postupů založených na využití poznatků organické chemie. V těchto metodách se například využívají dlouhé polymemí řetězce, jejichž konce jsou vhodně funkcionalizovány tak, aby jeden z jejich konců vytvořil kovalentní vazbu s funkčními skupinami na povrchu substrátu a druhý konec umožnil kovalentní navázání požadované biomolekuly (např. [1-8]). Nicméně použití tohoto postupu s sebou nese jistá omezení týkající se jeho náročnosti, výtěžnosti, nemožnosti využití na širší škálu substrátů, náchylnosti na možné bočné reakce a v neposlední řadě nutnosti použití potencionálně nebezpečných rozpouštědel a chemikálií. Některé z těchto limitujících faktorů se podařilo odstranit s využitím takzvaných plazmových polymerů. Tento typ materiálu je připravován metodami plazmové polymerace, které probíhají typicky za sníženého tlaku. Vhodnou volbou depozičních podmínek je možné připravit tenké vrstvy obsahující požadované funkční skupiny pro kovalentní imobilizaci biomolekul, přičemž je tímto postupem možné povlakovat v podstatě libovolný typ substrátu [9-11]. V nedávné době bylo prokázáno, že s pomocí plazmatu generovaném za sníženého tlaku je možné u polymemích materiálů vytvořit v tenké povrchové vrstvě vysoké množství vysoce reaktivních radikálů, které mají schopnost kovalentní vazby s biomolekulami [12-14]. Zásadní nevýhodou výše popsaných metod využívající plazma pro funkcionalizaci povrchů, či pro tvorbu reaktivních radikálů je potřeba sníženého tlaku, což s sebou nese zvýšené náklady spojené s nutností nákladných vakuových aparatur i relativně malou výtěžnost. 4 lMany different methods have been developed for the covalent binding of biomolecules to substrates based on the use of organic chemistry knowledge. In these methods, for example, long polymer chains are used whose ends are suitably functionalized so that one of their ends forms a covalent bond with functional groups on the substrate surface and the other end allows covalent attachment of the desired biomolecule (eg [1-8]). However, the use of this procedure entails some limitations on its complexity, yield, inability to be used on a wider range of substrates, susceptibility to possible side reactions and, last but not least, the need for potentially hazardous solvents and chemicals. Some of these limiting factors have been eliminated using so-called plasma polymers. This type of material is prepared by plasma polymerization methods that typically take place under reduced pressure. By appropriately selecting the deposition conditions, it is possible to prepare thin layers containing the desired functional groups for covalent immobilization of the biomolecules, by which essentially any type of substrate can be coated [9-11]. Recently, it has been shown that with the aid of plasma generated under reduced pressure, a high amount of highly reactive radicals having the ability to covalently bond with biomolecules can be formed in a thin surface layer [12-14]. A major disadvantage of the above-described methods using plasma for surface functionalization or reactive radical formation is the need for reduced pressure, which entails increased costs associated with the need for expensive vacuum apparatuses and relatively low yields. 4 l

Podstata vynálezu Výše uvedené nedostatky v podstatě odstraňuje níže popsaný postup, který rovněž splňuje následující vytyčený cíl. Cílem předkládaného vynálezu je vyvinutí takového postupu, který by ve srovnání se známými metodami vykazoval stejnou nebo vyšší účinnost pro kovalentní vazbu biomolekul na polymemí materiály při zachování jejich bioaktivity, a současně se vyznačoval výrazně nižšími náklady, nižší časovou náročností a nevyžadoval by použití rozpouštědel a dalších chemických látek.SUMMARY OF THE INVENTION The above-mentioned drawbacks are substantially eliminated by the procedure described below, which also fulfills the following objective. It is an object of the present invention to provide such a process which, in comparison with known methods, exhibits the same or higher efficacy for covalently bonding biomolecules to polymeric materials while maintaining their bioactivity, while at the same time having significantly lower costs, less time consuming and does not require the use of solvents and others. chemicals.

Podstata vynálezu spočívá ve využití plazmatu generovaném za atmosférického tlaku pro modifikaci polymemích materiálů (Obr.l). Tento typ plazmatu generuje energetické elektrony, ionty a fotony i chemicky aktivní radikály, které při svých interakcích spolymemími materiály vytvářejí vysoce reaktivní radikály v povrchové vrstvě polymeru, přičemž takto vzniklé radikály umožňují následnou imobilizaci biomolekul. Jako pracovní plyn je využíván vzduch, což snižuje náklady této metody. Plazmovou aktivaci polymerů je dále možné provádět jak ve statickém režimu, tak v režimu, kdy se jedna z elektrod posouvá nad opracovávaným polymerem (viz. Obr.2). Tento postup je vhodný zejména pro opracovávání polymemích fólií.The invention is based on the use of plasma generated at atmospheric pressure for the modification of polymeric materials (FIG. 1). This type of plasma generates energy electrons, ions and photons, as well as chemically active radicals, which in their interactions with co-materials form highly reactive radicals in the polymer surface layer, allowing the resulting radicals to subsequently immobilize biomolecules. Air is used as working gas, which reduces the cost of this method. Further, the plasma activation of the polymers can be carried out both in static mode and in a mode where one of the electrodes moves over the polymer being processed (see Fig. 2). This process is particularly suitable for the processing of polymer films.

Použití tohoto postupu se očekává zejména v oblasti aktivace polymemích substrátů pro diagnostické přístroje, jako jsou například bílkovinné mikročipy, bioaktivní polymemí náplastí používané pro chirurgické zákroky a pro regeneraci tkání, bioaktivní povrchy pro kultivaci buněčných kultur, pro zařízení založené na biologické aktivitě imobilizovaných biomolekul atd. Příklady provedení vynálezuIn particular, the use of this procedure is expected in the field of activation of polymeric substrates for diagnostic devices such as protein microarrays, bioactive polymer patches used for surgical procedures and tissue regeneration, bioactive cell culture surfaces, devices based on the biological activity of immobilized biomolecules, and the like. EXAMPLES OF THE INVENTION

Popis aktivace polymemích materiálů pro následné kovalentní navázání biomolekul pomocí výboje generovaného za atmosférického tlaku je následující. Obr. 3 zobrazuje dielektrický bariérový výboj, to jest výboj hořící mezi kovovou elektrodou I napájenou pomocí nízkofrekvenčního vysokonapěťového zdroje a uzemněnou elektrodou 2, která je pokryta tenkou dielektrickou vrstvou 3. Napájená elektroda je pohyblivá ve směru rovnoběžném se zemněnou elektrodou, což umožňuje homogenně opracovávat větší plochy substrátů. Energetické částice, záření a radikály, které vznikají v takovémto výboji 4 následně interagují s polymemí folií 5, která je umístěna na zemněné elektrodě. Výsledkem působení plazmatu je tvorba reaktivních radikálů v povrchové vrstvě polymeru. Aktivace polymemí fólie se provádí ve vzduchu. Kovalentní navázání biomolekul následně probíhá vložením opracovaných folií do roztoku, který obsahuje danou biomolekulu, popřípadě pro použití roztoků bílkovin nanášených ve formě nátěrů či ve formě kapek. Příklad provedení 1: Kovalentní vazba bovin sérum albuminuThe description of activation of polymeric materials for subsequent covalent binding of biomolecules by means of a discharge generated at atmospheric pressure is as follows. FIG. 3 shows a dielectric barrier discharge, i.e. a discharge burning between a metal electrode I fed by a low frequency high voltage source and a grounded electrode 2 which is covered by a thin dielectric layer 3. The electrode is powered in a direction parallel to the grounded electrode, allowing larger surfaces of substrates to be homogeneously treated . The energy particles, radiation and radicals that arise in such a discharge 4 then interact with the polymeric film 5, which is located on the earthed electrode. Plasma action results in the formation of reactive radicals in the polymer surface layer. The polymer film is activated in the air. Subsequently, the covalent attachment of the biomolecules is effected by inserting the treated films into a solution containing the biomolecule, or by using solutions of the proteins applied in the form of paints or drops. Example 1: Covalent binding of bovine serum albumin

Použití postupu pro kovalentní imobilizaci biomolekul bylo demonstrováno na příkladu navázání bovin sérum albuminu (BSA) na folii polytetrafluoroethylenu (PTFE). Plazmové opracování proběhlo za atmosférického tlaku a výboj byl buzen střídavým napětím o frekvenci 22kHz a pík-pík napětím llkV. PTFE folie byla umístěna na zemněnou elektrodu pokrytou dielektrickou vrstvou. Napájená elektroda se pohybovala ve vzdálenosti 1,5 mm nad PTFE folií rychlostí 40mm/s, přičemž každé místo povrchu bylo vystaveno působení plazmatu po dobu lOs. PTFE folie byla následně vložena do roztoku BSA v PBS (fosfátový pufř) 50 pg/ml. Po různě dlouhé inkubační době, byla folie z roztoku vyjmuta a dvakrát opláchnuta po dobu 10 minut čerstvým PBS. Pro určení, zda je BSA na povrch plazmatem aktivované PTFE folie navázán kovalentně byly folie v dalším kroku omyty 3% vodným roztokem SDS (sodiumdodecylsulfát) po dobu jedné hodiny při teplotě 80C. Při tomto postupu dochází k odstranění všech bílkovin, které nejsou na povrch pevně vázány kovalentní vazbou. Vzorky byly poté dvakrát omyty v PBS po dobu 10 minut. Pro ověření přítomnosti BSA na povrchu po SDS omytí byla použita rentgenová fotoelektronová spektroskopie (XPS). Bylo zjištěno, že atomární koncentrace dusíku, tedy prvku, který není přítomen v PTFE folii ani po jejím opracování plazmatem, ale který je naopak přítomen v BSA, je u vzorků kolem 3%, což ukazuje, že podstatná část BSA byla na PTFE folii opracované plazmatem kovalentně navázána. Přítomnost BSA na PTFE folii opracované plazmatem je možné demonstrovat i na XPS spektrech Cis píku. Jak je vidět na obr. 4, kde jsou uvedeny XPS spektra Cis píku pro PTFE folii opracovanou plazmatem (obr. 4a), Cis spektrum BSA (obr. 4c) a Cis spektrum PTFE folie po jejím opracování plazmatem, inkubaci v roztoku BSA/PBS a jejím následném omytí v roztoku SDS (obr. 4b), na posledně zmiňovaném spektru jsou jasně přítomny píky odpovídající chemickým vazbám C-C/C-H, C-O/C-N a C=0, které jsou charakteristické pro BSA a nejsou přítomny v PTFE. Příklad provedení 2: Kovalentní vazba tropoelastinuThe use of a process for covalent immobilization of biomolecules was demonstrated on the example of binding of bovine serum albumin (BSA) to a film of polytetrafluoroethylene (PTFE). Plasma treatment was carried out at atmospheric pressure and the discharge was excited by an AC voltage of 22 kHz and a peak-peak voltage of 11 kV. The PTFE film was placed on a dielectric-coated earth electrode. The powered electrode moved at a distance of 1.5 mm above the PTFE film at a rate of 40mm / s, each surface area being exposed to plasma for 10s. The PTFE film was then placed in a BSA solution in PBS (phosphate buffer) of 50 µg / ml. After an incubation period of varying length, the film was removed from the solution and rinsed twice with fresh PBS for 10 minutes. To determine whether BSA was bound covalently to the plasma-activated PTFE film surface, the films were washed in a next step with 3% aqueous SDS (sodium dodecylsulfate) for one hour at 80 ° C. This procedure removes all proteins that are not bound to the surface by a covalent bond. The samples were then washed twice in PBS for 10 minutes. X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) was used to verify the presence of BSA on the surface after SDS washing. It was found that the atomic concentration of nitrogen, an element which is not present in the PTFE film even after plasma treatment, but which is in turn present in BSA, is about 3% in the samples, indicating that a substantial portion of the BSA was treated with PTFE film plasma covalently bound. The presence of BSA on the plasma-treated PTFE film can also be demonstrated on the XPS spectra of the Cis peak. As shown in Fig. 4, the XPS spectra of Cis peak for plasma-treated PTFE film (Fig. 4a), Cis spectrum of BSA (Fig. 4c) and Cis spectrum of PTFE film after plasma treatment, incubation in BSA / PBS solution are shown. and subsequently washing it in an SDS solution (FIG. 4b), the peaks corresponding to the chemical bonds CC / CH, CO / CN and C = 0 which are characteristic of BSA and not present in PTFE are clearly present in the latter spectrum. Example 2: Covalent binding of tropoelastin

Pro určení, zda si biomolekuly kovatelně navázané na povrch polymeru po jeho opracování atmosférickým plazmatem zachovávají svou biologickou aktivitu, byly provedeny testy sPTFE folií a tropoelastinem. Plazmové opracování proběhlo jako v příkladu provedení 1. Následně byly plazmatem aktivované folie vloženy na 4 dny do 50 pg/ml roztoku tropoelastinu v destilované vodě. Posléze byly folie dvakrát omyty v PBS po dobu 10 minut. V dalším kroku byly připravené vzorky vloženy do 24 jamkových polystyrénových destiček a osazeny endoteliálními buňkami (linie CPAE ATCC CCL-209, Rockville, MA). Buňky byly kultivovány při teplotě 37°C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5% CO2 po dobu 1,3 a 7 dnů. Po inkubaci byly vzorky omyty v PBS, zafixovány 70% etanolem a obarveny fluorescentaími barvivý (Hoechst #33258 a Texas Red C2-maleimide). Takto připravené vzorky byly následně vyfotografovány pomocí mikroskopu IX 51 vybaveného digitální kamerou DP 70 (Olympus).To determine whether the biomolecules forged to the polymer surface retained their biological activity after atmospheric plasma treatment, sPTFE foil and tropoelastin assays were performed. Plasma treatment was carried out as in Example 1. Subsequently, plasma-activated films were placed in 50 µg / ml tropoelastin solution in distilled water for 4 days. Subsequently, the films were washed twice in PBS for 10 minutes. In the next step, the prepared samples were loaded into 24 well polystyrene plates and seeded with endothelial cells (CPAE line ATCC CCL-209, Rockville, MA). Cells were cultured at 37 ° C in a humidified 5% CO 2 atmosphere for 1.3 and 7 days. After incubation, the samples were washed in PBS, fixed with 70% ethanol and stained with fluorescent dye (Hoechst # 33258 and Texas Red C2-maleimide). The specimens thus prepared were then photographed using an IX 51 microscope equipped with a DP 70 digital camera (Olympus).

Jak je vidět na obrázku obr.5, po jednom dni po nasazení buněk je množství buněk pozorovaných na PTFE opracované plazmatem a pokryté tropelastinem výrazně vyšší 19,200 Λ ± 1,300 buněk/cm ), než u srovnávacích vzorků opracovaného PTFE bez navázaného tropoelastinu (13,300 ± 800 buněk/cm2) a PTFE bez jakékoliv modifikace (6,900 ± 900 buněk/cm ). Obdobné výsledky, tj. vyšší počet buněk na PTFE pokryté tropoelastinem po aktivaci atmosférickým plazmatem než u folií bez žádné úpravy a bez vrstvy tropoelastinu. Tyto výsledky ukazují, že bílkovina extracelulámí matrice - tropoelastin, si zachovává své adhesivní charakter vůči buňkám i po imobilizaci na povrch PTFE folie opracované DBD plazmatem. 7As shown in Figure 5, after one day after cell deposition, the amount of cells observed on plasma-treated PTFE and covered with tropelastin is significantly higher 19,200 Λ ± 1,300 cells / cm) than the comparison of treated PTFE-free tropoelastin (13,300 ± 800). cells / cm 2) and PTFE without any modification (6.900 ± 900 cells / cm). Similar results, ie, higher number of tropoelastin-coated PTFE-coated cells after atmospheric plasma activation than non-treated and tropoelastin-free films. These results show that the protein extracellular matrix - tropoelastin, retains its adhesive character to cells even after immobilization on the surface of a PTFE film treated with DBD plasma. 7

Literatura [1] Z. Yang, J. Wang, R. Luo, M. F. Maitz, F. Jing, H. Sun, and N. Huang, "The covalent immobilization of heparin to pulsed-plasma polymeric allylamine films on 316L stainless Steel and the resulting effects on hemocompatibility," Biomaterials, vol. 31, pp. 2072-2083, 2010.Literature [1] Z. Yang, J. Wang, R. Luo, MF Maitz, F. Jing, H. Sun, and N. Huang, " The covalent immobilization of heparin to pulsed-plasma polymeric allylamine films on 316L stainless Steel and the resulting effects on hemocompatibility, " Biomaterials, vol. 31, p. 2072-2083, 2010.

[2] L. S. Wong, F. Khan, and J. Micklefield, "Selective covalent protein immobilization: strategies and applications," Chemical reviews, vol. 109, pp. 4025-4053,2009.[2] L. S. Wong, F. Khan, and J. Micklefield, " Selective covalent protein immobilization: strategies and applications " Chemical reviews, vol. 109, p. 4025-4053,2009.

[3] Η. H. Weetall, "Preparation of immobilized proteins covaiently coupled through silane coupling agents to inorganic supports," Applied biochemistry and biotechnology, vol. 41, pp. 157-188,1993.[3] Η. H. Weetall, " Preparation of immobilized proteins covaiently coupled through silane coupling agents to inorganic supports " Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 157-188,1993.

[4] F. Rusmini, Z. Zhong, and J. Feijen, "Protein immobilization strategies for protein biochips," Biomacromolecules, vol. 8, pp. 1775-1789,2007.[4] F. Rusmini, Z. Zhong, and J. Feijen, " Protein Immobilization Strategies for Protein Biochips " Biomacromolecules, vol. 1775-1789,2007.

[5] S. Puertas, M. de Gracia Villa, E. Mendoza, C. Jimenez-Jorquera, J. M. de la Fuente, C. Femandez-Sanchez, and V. Grazu, "Improving immunosensor performance through oriented immobilization of antibodies on carbon nanotube composite surfaces," Biosensors and Bioelectronics, 2012.[5] S. Puertas, M. de Gracia Villa, E. Mendoza, C. Jimenez-Jorquera, JM de la Fuente, C. Femandez-Sanchez, and V. Graz, " Improving Immunosensor Performance through Oriented Immobilization of Antibodies on carbon nanotube composite surfaces, " Biosensors and Bioelectronics, 2012.

[6] H. Jennissen, T. Zumbrink, M. Chatzinikolaidou, and J. Steppuhn, "Biocoating of implants with mediator molecules: surface enhancement of metals by treatment with chromosulfuric acid," Materialwissenschaft und Werkstqfftechnik, vol. 30, pp. 838-845,1999.[6] H. Jennissen, T. Zumbrink, M. Chatzinikolaidou, and J. Steppuhn, " Biocoating of implants with mediator molecules: surface enhancement of metals by treatment with chromosulfuric acid " Materialwissenschaft und Werkstqfftechnik, vol. 838-845,1999.

[7] Y. Gao and I. Kyratzis, "Covalent immobilization of proteins on carbon nanotubes using the cross-linker l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide - a critical assessment," Bioconjugate Chemistry, vol. 19, pp. 1945-1950,2008.[7] Y. Gao and I. Kyratzis, " Covalent immobilization of proteins on carbon nanotubes using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide - and critical assessment, " Bioconjugate Chemistry, vol. 1945-1950,2008.

[8] B. R. Coad, M. Jasieniak, S. S. Griesser, and H. J. Griesser, "Controlled covalent surface immobilization of proteins and peptides using plasma methods," Surface and Coatings Technology, 2013.[8] B. R. Coad, M. Jasieniak, S. S. Griesser, and H. J. Griesser, " Controlled covalent surface immobilization of proteins and peptides using plasma methods " Surface and Coatings Technology, 2013.

[9] R. Ganapathy, S. Manolache, M. Sarmadi, and F. Denes, "Immobilization of papain on cold-plasma functionalized polyethylene and glass surfaces," Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, vol. 12, pp. 1027-1049,2001.[9] R. Ganapathy, S. Manolache, M. Sarmadi, and F. Denes, " Immobilization of papain on cold-plasma functionalized polyethylene and glass surfaces, " Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, vol. 1027-1049,2001.

[10] R. Forch, A. N. Chifen, A. Bousquet, H. L. Khor, M. Jungblut, L.-Q. Chu, Z. Zhang, I. Osey-Mensah, E.-K. Sinner, and W. Knoll, "Recent and Expected Roles of Plasma-Polymerized Films for Biomedical Applications," Chemical Vapor Deposition, vol. 13, pp. 280-294,2007.[10] R. Forch, A. N. Chifen, A. Bousquet, H. L. Khor, M. Jungblut, L.-Q. Chu, Z. Zhang, I. Osey-Mensah, E.-K. Sinner, and W. Knoll, " Recent and Expected Roles of Plasma-Polymerized Films for Biomedical Applications " Chemical Vapor Deposition, vol. 280-294,2007.

[11] K. S. Siow, L. Britcher, S. Kumar, and H. J. Griesser, "Plasma Methods for the Generation of Chemically Reactive Surfaces for Biomolecule Immobilization and Cell Colonization" Plasma Processes and Polymers, vol. 3, pp. 392-418,2006.[11] K. S. Siow, L. Britcher, S. Kumar, and H. J. Griesser, " Plasma Methods for Generation of Chemically Reactive Surfaces for Biomolecule Immobilization and Cell Colonization " Plasma Processes and Polymers, vol. 392-418,2006.

[12] Μ. Μ. M. Bilek, D. R. McKenize,“Plasma modified surfaces for covalent immobilization of fimctional biomolecules in the absence of Chemical linkers: towards better biosensors and a new generation of medical implants,“ Biophysical Reviews, vol. 2, pp. 55-65,2010.[12] Μ. . M. Bilek, D.R. McKenize, " Plasma modified surfaces for covalent immobilization of fimctional biomolecules in the absence of chemical linkers: towards better biosensors and new generation of medical implants, " Biophysical Reviews, vol. 55-65,2010.

[13] Μ. Μ. M. Bilek, D. V. Bax, A. Kondyurin, Y. Yin, N. J. Nosworthy, K. Fisher, A.[13] Μ. . M. Bilek, D. V. Bax, A. Kondyurin, Y. Yin, N. J. Nosworthy, K. Fisher, A.

Waterhouse, A. S. Weiss, C. G. dos Remedios, D. R. McKenzie, „Free radical íunctionalization of surfaces to prevent adverse responses to biomedical devices,“ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 108, pp. 14405-14410,2011.Waterhouse, A. S. Weiss, C. G. dos Remedios, D. R. McKenzie, " Free radical functionalization of surfaces to prevent adverse responses to biomedical devices, " Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 14405-14410,2011.

[14] Μ. Μ. M. Bilek, “Biofunctionalization of surfaces by energetic ion implantation: Review of progress on applications in implantable biomedical devices and antibody microarrays,” Applied Surface Science, 2014, http://dx.doi.org/! 0.1016/j .apsusc.2014.03.097[14] Μ. . M. Bilek, “Biofunctionalization of Surfaces by Energy Ion Implantation: Review of Application on Implantable Biomedical Devices and Antibodies,” Applied Surface Science, 2014, http://dx.doi.org/! 0.1016 / j .ususc.2014.03.097

Claims

PATENT REQUIREMENTS (1) Activated polymeric substrate with increased surface energy for covalent binding of biomolecules

(2) Activated surface-enhanced polymer substrate according to claim 1 in the form of a homopolymer, co-polymer, or a material comprising multiple polymers.

(3) Activated surface-enhanced polymeric substrate according to claim 1, in the form of a coating, film or woven and nonwoven fabric.

(4) Activated polymeric substrate with increased surface energy according to claim 1, wherein the activated substrate is used for biosensors, diagnostic purposes, implants or is part of a medical device

* (5) A polymeric substrate according to claims (1,2,3,4) with attached functional biomolecule.

(6) The polymeric substrate of claim 5, wherein the activated substrate is used for biosensors, diagnostic purposes, implants, or is part of a medical device.

(7) A polymeric substrate according to claims (5, 6), wherein the functional biomolecule consists of amino acids, peptides or proteins.

A method for preparing activated polymeric substrates according to claims 1-7, characterized in that the polymeric substrate is modified in a DBD discharge at atmospheric pressure in air.