CZ2014539A3 - Benzothiazolyl urea derivatives, process of their preparation and their use - Google Patents
Benzothiazolyl urea derivatives, process of their preparation and their use Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2014539A3 CZ2014539A3 CZ2014-539A CZ2014539A CZ2014539A3 CZ 2014539 A3 CZ2014539 A3 CZ 2014539A3 CZ 2014539 A CZ2014539 A CZ 2014539A CZ 2014539 A3 CZ2014539 A3 CZ 2014539A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- thiazol
- urea
- fluorobenzo
- hydroxyphenyl
- chlorobenzo
- Prior art date
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje deriváty benzothiazolylmočoviny, které jsou modulátory aktivity beta-amyloid vázající alkoholdehydrogenasy (ABAD). Dále poskytuje způsob jejich přípravy a jejich léčebné použití.The present invention provides benzothiazolylurea derivatives which are modulators of beta-amyloid alcohol dehydrogenase (ABAD) activity. It further provides a method for their preparation and their therapeutic use.
Description
1 ?!';&?</' AJf/ '
Deriváty benzothiazolylmočoviny, způsob jejich přípravy a jejich použití &V 'Tg/f1? — £ Oblast techniky
Vynález se týká nových modulátorů aktivity beta-amyloid vázající alkoholdehydrogenasy (ABAD) na bázi derivátů benzothiazolylmočoviny, způsobu jejich přípravy a jejich léčebného použití.
Dosavadní stav techniky
Alzheimerova nemoc (AD) je nej častější formou senilní demence a její léčba představuje vysoké finanční i sociální náklady. Současná léčba jev nej lepším případě paliativní, léčí symptomy, nikoli příčiny nemoci. Tudíž jsou další rozvoj nemoci a pacientova smrt nevyhnutelné. Nesmírně důležitý je proto vývoj efektivnějších terapeutických prostředků proti této nemoci.
Amyloid beta peptid (Αβ) je obecně uznávaným faktorem zapříčiňujícím rozvoj AD. Bylo zjištěno, že tento peptid interaguje s mitochondriálním enzymem nazvaným beta-amyloid vázající alkohodehydrogenasa (amyloid binding alcohol dehydrogenase - ABAD) (Yan, S. D., Fu, J., Soto, C., Chen, X., Zhu, H., Al-Mohanna, F., Collison, K., Zhu, A., Stem, E., Saido, T., Tohyama, M., Ogawa, S., Roher, A., and Stem, D. (1997) Nátuře 389, 689-695). ABAD je 27 kDa multifunkční enzym mitochondriálního matrixu, který katalyzuje redukci aldehydů a ketonů a oxidaci alkoholů (He, X. Y., Yang, Y. Z., Schulz, H., and Yang, S. Y. (2000) Biochem. J. 345 Pt 1, 139-143; Powell, A. J., Read, J. A., Banfield, M. J., Gunn-Moore, F., Yan, S. D., Lustbader, J., Stem, A. R., Stem, D. M., and Brady, R. L. (2000) J. Mol. Biol. 303, 311-327). V experimentech in vitro bylo zjištěno, že interakce mezi ABAD a Αβ je cytotoxická a způsobuje mitochondriální disfunkci, produkci reaktivních radikálů a následně buněčnou smrt (Lustbader, J. W., Cirilli, M., Lin, C., Xu, H. W., Takuma, K., Wang, N., Caspersen, C., Chen, X., Pollak, S., Chaney, M., Trinchese, F., Liu, S., Gunn-Moore, F., Lue, L.-F., Walker, D. G., Kuppusamy, P., Zewier, Z. L., Arancio, O., Stem, D., Yan, S. S., and Wu, H. (2004) Science 304, 448-452), Zajímavé je, že pro tuto cytotoxicitu je třeba, aby byl ABAD enzym katalyticky aktivní (Yan, S. D., Shi, Y., Zhu, A., Fu, J., Zhu, H., Zhu, Y., Gibson, L., Stem, E., Collison, K., Al-Mohanna, F., Ogawa, S., Roher, A., Clarke, S. G., and Stem, D. M. (1999) J. Biol. Chem. 274, 2145-2156). -2 - *·' ! Přímá inhibice nebo aktivace ABAD tudíž může vést k nové strategii léčby Alzheimerovy choroby. V roce 2006 popsal Xie et al. frentizol jako sloučeninu schopnou inhibovat ABAD-Αβ interakci (Xie, Y., Deng, S., Chen, Z., Yan, S., Landry, D. W. (2006) Bioorg. Med. Chem. Lett. 16,4657-4660).
-N \ XYVnh
0'^^'S ^NH 0 ΪΛ frentizol \_/
Frentizol je slabý inhibitor s hodnotou IC50 přibližně 200 μΜ. Xie et al. rovněž popsal analogy frentizolu, z nichž dva vykazovaly 30 x vyšší aktivitu v inhibici ABAD-Αβ interakce ve srovnání s frentizolem (IC50 menší než 10 μΜ):
Dosud nebyly nalezeny modulátory aktivity enzymu ABAD na bázi obdobného strukturního typu, které mohou mít uplatnění v léčbě Alzheimerovy choroby.
Podstata vynálezu Předmětem tohoto vynálezu jsou nově připravené modulátory aktivity ABAD na bázi benzothiazolových derivátů. Předmětem tohoto vynálezu jsou deriváty benzothiazolylmočoviny obecného vzorce I„ X - 3 '
NH
O /
-NH R K
R (I) a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, kde X, R1, R2 a R3 jsou vybrány z následujících kombinací X R1 R" RJ název sloučeniny Cl H H OH V-(2-hydroxyfenyl)-V-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea F OH Cl H N-( 3 -chlor-4-hydroxy feny 1)-V-(6-fluorbenzo [d] thiazol-2- -yljurea Cl OH Cl H i¥-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-V-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2- . yljurea F -OPh H H iV-(4-phenoxyfenyl)-V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea Cl -C(0)0Et H H Ethyl-4- [3 -(6-chlorbenzo [d]thiazol-2-yl)ureido] benzoát F -C(0)Me H H V-(4-acetylfenyl)-jV-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea pro použití pro použití při léčení Alzheimerovy choroby a/nebo demence. Předmětem tohoto vynálezu jsou rovněž deriváty benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z TV-(2-hydroxyfenyl)-/V-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, JV-(3-chlor-4- - hydroxyfenyl)-iV-(6-fluorbenzo [d]thiazol-2-yl)urey, N-(3 -chlor-4-hydroxyfenyl)-W-(6- - chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, jV-(4-phenoxyfenyl)-jV-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a A-(4-acetylfenyl)-jV-(6--fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
Ve výhodném provedení jsou předmětem vynálezu deriváty benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z V-(2-hydroxyfenyl)-V-(6-chIorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, N-• (3-chlor-4'hydroxyfenyl)-/V-(6~fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, V-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-7V-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, iV-(4-phenoxyfenyl)-iV-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2- -* 4 — « * * * « í t yl)urey, ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a A/-(4-acetylfenyl)-7V-(6- - fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, pro použití pro modulaci aktivity beta-amyloid vázající alkoholdehydrogenasy vážící amyloid-beta (ABAD). Modulací se rozumí změna aktivity tohoto enzymu, tj. aktivace nebo inhibice. Ve sloučeninách podle vynálezu je alespoň jeden ze substituentů R1, R2, R3 hydroxy skupina, fenoxy skupina nebo substituent s karbonylovou skupinou. Látky s hydroxy skupinou jeví zejména inhibiční aktivitu vůči ABAD enzymu. Látky s fenoxy skupinou nebo substituentem s karbonylovou skupinou jeví zejména aktivační aktivitu vůči enzymu ABAD. Předmětem vynálezu jsou rovněž deriváty benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z AL(2-hydroxyfenyl)-/V-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, V-(3-chlor-4- hydroxyfenyl)-V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, iY-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-iV-(6- - chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, jV-(4-phenoxyfenyl)-7V’-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a V-(4-acetylfenyl)-V-(6- fluorbenzo[d]thiazol-2-y ljurey, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami, pro použití jako léčivo. Předmětem vynálezu je dále použití derivátů benzothiazolylmočoviny, vybrané ze skupiny sestávající z Ar-(2-hydroxyfenyl)-iV-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, jV-(3-chlor-4- - hydroxyfenyl)-V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, V-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-V-(6--chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, A-(4-phenoxyfenyl)-7V-(6-íluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a iV-(4-acetylfenyl)-yV-(6- "fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, a jejich farmaceuticky přijatelných solí s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adičních solí s kyselinami, pro výrobu léčiva pro léčení Alzheimerovy nemoci a/nebo demence. Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický přípravek obsahující alespoň jeden derivát benzothiazolylmočoviny, vybraný ze skupiny sestávající z vV-(2-hydroxyfenyl)-vV-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, iV-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-./V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2- - yljurey, Ar-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-A'-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, N-(4- phenoxyfenyl)-/V-(6-fluorbenzo[d]thiazoI-2-yl)urey, ethyl-4-[3-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)ureido]benzoátu a iV-(4-acetylfenyl)-/V’-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urey, a alespoň jeden
- 5 i i « 14* « * i # I* * * * farmaceuticky přijatelný nosič. Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidlajako cukry, škroby, dále karboxymethylový škrob, zesíťovaný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, rozpouštědla, pojivá, atd.
Stručný popis obrázků
Obr. 1: Závislost ABAD aktivity na koncentraci sloučenin K690 a K691.
Obr. 2: Hanes-Woolfovo zobrazení kinetiky ABAD (μΜ min"1 mg'1) v závislosti na koncentraci acetoacetyl-Co za přítomnosti (1,25 μΜ a 5 μΜ) a absence inhibitoru K690 (A) a K691 (B).
Obr. 3: Hanes-Woolfovo zobrazení kinetiky ABAD (μΜ min"1 mg'1) v závislosti na koncentraci NADH za přítomnosti (1,25 μΜ a 5 μΜ) a absence inhibitoru K690 (A) a K691 (B).
Obr. 4: Relativní aktivity ABAD enzymu v přítomnosti derivátů benzothiazolylmočoviny při koncentraci 25 μΜ. Příklady provedení vynálezu
Vynález je popsán v následujících příkladech, které nijak neomezují jeho rozsah. Výchozí suroviny pro sloučeninu obecného vzorce I jsou dostupné z komerčních zdrojů. Příklad 1: Příprava ABAD inhibitorů 2-amino-6-fluorbenzo[d]thiazol (1 g, 5,95 mmol) byl rozpuštěn ve směsi bezvodého dichlormethanu (DCM; 60 ml) a bezvodého dimethylformamidu (DMF, 10 ml). Byl přidán Ι,Γ-karbonyldiimidazol (CDI; 1,16 g, 7,13 mmol) a reakční směs byla dobře míchána za refluxu po dobu 16 hodin v atmosféře dusíku. Výsledná sraženina byla zfiltrována, promyta — 6 DCM (30 ml) a usušena. Vznikl V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-y 1)-1 H-imidazol-1 -karboxamid jako bílá pevná látka (výtěžek 95 %). V dalším kroku byl V-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)-l H-imidazol-1-karboxamid (0,3 g, 1,14 mmol) rozpuštěn ve směsi bezvodého DMF (10 ml) a triethylaminu (Et3N; 0,35 ml). K. reakční směsi byl přidán 4-hydroxyanilin (0,14 g, 1,26 mmol) a reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 16 hodin v atmosféře dusíku. Reakční směs byla naředěna vodou (40 ml) nebo 10 % HC1 (40 ml; sloučeniny s karboxylovou skupinou), pevný produkt byl zfiltrován, promyt vodou (30 ml), MeOH (5 ml) a usušen. Byla získána béžová pevná látka (iV-(4-hydroxyfenyl)-iV-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea) ve výtěžku 95 %.
Analogickým postupem byly připraveny následující deriváty, jejichž charakterizace je uvedena: Ař-(2-hydroxyfenyl)-Ař,-(6-chIorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea (K689) B. t. 216-218 °C. Výtěžek 42 %. ’H NMR (500 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 11,30 (br s, 1H), 10,12 (br s, 1H), 8,84 (br s, 1H), 8,04 (d, J= 1,8 Hz, 1H, H-7), 7,99 (d,J= 6,5 Hz, 1H), 7,64 (d, J= 8,6 Hz, 1H, H-4), 7,40 (dd, J= 8,6,2,1 Hz, 1H, H-5), 6,93 - 6,88 (m, 2H), 6,85 - 6,77 (m, 1H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 160,77, 152,24,148,09, 146,47,133,35, 126,67, 126,54, 125,97, 123,13, 121,01,120,77, 119,28,119,06,114,91. ESI-MS: m/z 320 [M+H+] (vypočteno pro C14H10CIN3O2S: 319,02). EA: vypočteno C 52,59; H, 3,15; N 13,14; S 10,03. Nalezeno: C 52,72; H 3,27; N 13,09; S 10,07. AL(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-./V-(6-fluorbenzo[d]thiazoI-2-yl)urea (K690) Ó.t. 298-299,5 °C. Výtěžek 74 %. 'H NMR (500 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 9,94 (br s, 1H), 8,98 (br s, 1H), 7,82 (dd, J= 8,6, 2,6 Hz, 1H, H-7), 7,69 - 7,61 (m, 1H, H-4), 7,59 (d, J= 2,5 Hz, 1H, H-2'), 7,22 (td, J= 9,1, 2,7 Hz, 1H, H-5), 7,18 (dd,J= 8,7, 2,5 Hz, 1H, H-6'), 6,94 (d, J= 8,7 Hz, 1H, H-5'). I3C NMR (126 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 159,42, 158,29 (d, ./ = 239,1 Hz), 151,83, 149,05, 145,57, 132,52, 130,60, 120,92, 120,57, 119,59, 119,36, 116,67, 113,80 (d, J= 24,4 Hz), 108,11 (d, J= 27,0 Hz). ESI-MS: m/z 338 [M+H+] (vypočteno pro C, 4H9C1FN302S: 337,01). EA: vypoč. C 49,78; H 2,69; N 12,44; S 9,49. Nalezeno: C 47,39; H 2,89; N 12,12; S 9,15. - 7 iV-(3-chl()r-4-hydroxyfenyl)-/V'-(6-chlorbenzo|d|thiazoI-2-yl)urea (K691)
Bit. 283,5-285 °C. Výtěžek 30 %. 'H NMR (300 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 9,95 (br s, 1H), 9.01 (br s, 1H), 8,04 (d, J= 2,1 Hz, 1H, H-7), 7,70 - 7,56 (m, 2H, H-4,2'), 7,40 (dd, 8,6,
2.2 Hz, 1H, H-5), 7,19 (dd, J= 8,8, 2,5 Hz, 1H, H-6'), 6,94 (d, 8,7 Hz, 1H, H-5'). 13C NMR (75 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 160,40, 151,93, 149,07, 132,94, 130,55, 126,88, 126,20, 121,24, 120,93, 119,60, 119,34, 116,66. ESI-MS: m/z 354 [M+H+] (vypoč. pro C14H9CI2N3O2S: 352,98). EA: vypoč. C 47,47; H 2,56; N 11,86; S 9,05. Nalezeno: C 47,12; H 2,96; N 11,49; S 9,33. iV-(4-phenoxyfeny lyiY -(6-fluorbenzo [d] thiazol-2-yl)urea (K700) át. 305 - 307 °C. Výtěžek 83 %. ’H NMR (500 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 9,15 (br s, 1H), 7,82 (dd, J= 8,6, 2,2 Hz, 1H, H-7), 7,69 - 7,62 (m, 1H, H-4), 7,53 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 7,37 (t, J= 7,8 Hz, 2H), 7,23 (td, J= 9,1, 2,5 Hz, 1H, H-5), 7,10 (t, J= 7,4 Hz, 1H), 7,02 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 6,98 (d, J= 8,0 Hz, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 158,29 (d, J = 238,4 Hz), 151,74, 134,16, 132,54, 129,96, 122,99, 120,79, 120,67, 119,67, 117,87, 113,80 (d, J = 24,3 Hz), 108,09 (d, J = 27,1 Hz). ESI-MS: m/z 380 [M+H+] (vypoč. pro C20H14FN3O2S: 379,08). EA: vypoč. C 63,31; H 3,72; N 11,08; S 8,45. Nalezeno: C 62,89; H 3,40; N 10,70; S 8,05.
Ethy 1-4- [3-(6-fluorbenzo [d] thiazol-2-y l)u reido 1 benzoát (K704) r B.t. 333-335 °C. Výtěžek 32 %. lH NMR (500 MHz, DMSO-í/6): δ (ppm) 9.53 (br s, 1H), 7,99 - 7,79 (m, 3H, H-7,2',6'), 7,72 - 7.56 (m, 3H, H-4,3',5'), 7,29 - 7,20 (m, 1H, H-5), 4,33 --4.25 (m, 2H, -0-C//2-CH3), 1,31 (t, J = 6.5 Hz, 3H, -O-CH2-CH3). 13C NMR (126 MHz, DMSO-40: δ (ppm) 165,30, 158:.36 (d, J = 237.5 Hz), 142,93, 130.39, 123,85, 118,02, 117.49, 113,94 (d, J = 23,6 Hz), 108,21 (d, J = 26,9 Hz), 60,44, 14.24. ESI-MS: m/z 360 [M+H+] (vypoč. pro Ci7H,4FN303S: 359.07). EA: vypoč. C 56,82; H 3.93; N 11.69; S 8,92. Nalezeno: C 56.37; H 3,77; N 11,92; S 9.24.
Ethyl-4- [3-(6-chlorbenzo [d] thiazol-2-y l)ureido] benzoát (K705)
B.t. 326 - 328 °C. Výtěžek 45 %. *H NMR (500 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 9,19 (br s, 1H), 8,08 (s, 1H, H-7), 7,97 - 7,86 (m, 2H, H-2',6'), 7,72 - 7,55 (m, 3H, H-4,3',5'), 7,48 - 7,39 (m, 1H, H-5), 4,34 - 4,25 (m, 2H, -0-C77rCH3), 1,32 (t, J= 6,9 Hz, 3H, -O-CH2-CH3). I3C NMR -8 - (126 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 165,27, 160,41, 151,78, 142,91, 132,73, 130,37, 127,04, 126,31,123,86,121,33,118,03, 117,45, 60,45,14,24. ESI-MS: m/z 376 [M+H+] (vypoč. pro C17H14CIN3O3S: 375,04). EA: vypoč. C 54,33; H 3,75; N 11,18; S 8,53. Nalezeno: C 54,01; H 3,89; N 11,50; S 8,82. /V-(4-acetylfeny l)-iV-(6-fliiorbenzo [d]thiazol-2-yl)urea (K706) Ď.t. 308 - 310 °C. Výtěžek 48 %. ‘H NMR (500 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 9,53 (br s, 1H), 8,00 - 7,80 (m, 3H, H-7,3',5'), 7,71 - 7,55 (m, 3H, H-4,2',6'), 7,25 (t, J= 7,8 Hz, 1H, H-5), 2,53 (s, 3H, -CO-CH3). 13C NMR (126 MHz, DMSO-/): δ (ppm) 196,41, 158,37 (d, J = 235,7 Hz), 151,85, 143,91, 143,02, 132,24, 131,36, 129,67, 120,45, 117,89, 117,38, 113,96 (d, J = 23,8 Hz), 108,26 (d, J = 27,9 Hz), 26,45. ESI-MS: m/z 330 [M+H+] (vypoč. pro Ci6H12FN302S: 329,06). EA: vypoč. C 58,35; H 3,67; N 12,76; S 9,74. Nalezeno: C 57,97; H 3,46; N 13,18; S 10,19.
Příklad 2: Čištění ABAD
Buňky E. coli BL21-CodonPlus, obsahující Histev-ABAD protein, byly suspendovány po dobu 30 min, 4 °C, ve štěpícím pufru (20 mM NaH2P04, 30 mM imidazol, 500 mM NaCl, 10% (v/v) glycerol, pH 7,5) s přídavkem kompletně EDTA-zbaveného inhibitoru proteasy (Roche), lysozymu (1 mg/mL), DNasy (20 pg/mL) a Tritonu X-100 (0,1 % (v/v)). Buňky byly štěpeny průchodem přes buněčný disruptor při 30 kPSI (Constant Systems Ltd) a lyzát byl vyčištěn centrifugací (Sorvall Evolution RC, rotor S5-34 55-34 úhel, 20500 rpm, 30 min, 4 °C). Vyčištěný lyzát byl přefiltrován (0,44 pm membrána; Whatman) a poté aplikován na Ni---NTA (GE Healthcare) sloupec, předem promytý štěpícím pufrem, a protein byl eluován 300 mM imidazolovým pufrem (20 mM NaH2P04, 300 mM imidazol, 500 mM NaCl, 10 % (v/v) glycerol, pH 7,5). K proteinu byla přidána proteasa Tobacco etch viru (TEV) v hmotnostním poměru 10:1, aby odštěpila histidinovou značku a protein byl poté dialyzován do 20 mM Tris--HC1, 30 mM imidazolu, 500 mM NaCl, 10 % (v/v) glycerolu, pH 7,5 obsahujícím EDTA (1 mM) a DTT (1 mM) ke zvýšení rozpustnosti. Štěpení a dialýza enzymu probíhala při teplotě 4 °C po dobu 16 h. Kompletní štěpení bylo nejprve zkontrolováno SDS- PAGE a potom kompletně štěpený protein prošel druhým Ni-sloupcem a eluát obsahující ABAD protein byl zkoncentrován na ~7 mL pomocí Vivaspin kolony (10 kDa MWCO, GE Healthcare). Nakonec byl produkt přečištěn a zbaven imidazolu pomocí gelové filtrace (Hi-Load 16/60 - 9 ~
Superdex 75 prep grade column, GE Healthcare, flow rate 1,5 mL/min). Protein byl eluován pufrem pro gelovou filtraci (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, pH 7,5) a zkoncentrován (Vivaspin column (10 kDa MWCO, GE Healthcare)) na 10 mg/ml. Byly odebrány vzorky o objemu 10 pL, 25 pL and 50 pL, zmrazený v kapalném dusíku a uskladněny při teplotě -80 °C. Příklad 3: Kinetika podle Michaelis-Mentenové
Byly připraveny 10 mM zásobní roztok NADH a 4,8 mM roztok acetoacetyl-CoA v HEPES pufru (10 mM, pH 7,4). Dále byl připraven pufr pro testování, složený z 10 mM HEPES pufru a 0,5 % želatiny (w/v), zahřátý na teplotu 37 °C a pH upraveno na hodnotu 7,4 pomocí NaOH.
Master mix roztoky byly připraveny v pufru pro testování obsahujícím 1 mM NADH a acetoacetyl-CoA v koncentracích 0 pM, 25 pM, 50 pM, 100 pM, 200 pM a 400 pM. Každý roztok byl rozdělen do tří jamek na 96-ti jamkové destičce (150 pL na jamku). ABAD (výsledná koncentrace 0,5 pg/mL) byl přidán do každé jamky a byla měřena absorbance při 340 nm.
Vybrané sloučeniny podle vynálezu (K690 a K691) byly přidány kreakční směsi v koncentracích 1,25 pM a 5 pM (1 % DMSO (v/v)) a testovány. Výsledky jsou shrnuty do grafu na 0br. 2 a 3. Příklad 4: Testování sloučenin
Byly připraveny 10 mM zásobní roztoky v DMSO všech nových sloučenin připravených
A v Příkladu 1. Roztoky NADH a acetoacetyl-CoA byly připraveny v HEPES pufru (10 mM, pH 7,4) a jejich koncentrace byly 10 mM, resp. 4,8 mM. Byl připraven pufr pro esej obsahující 10 mM HEPES a 0,5 % želatiny (w/v), zahřát na teplotu 37 °C a jeho pH upraveno na hodnotu 7,4 pomocí NaOH.
Master mix roztok každé sloučeniny připravené v Příkladu 1 byl připraven v pufru pro testování; 100 μΜ sloučeniny, 250 μΜ NADH a 120 μΜ acetoacetyl-CoA. Výsledná koncentrace DMSO byla udržována na 1 % kvůli rozpustnosti sloučenin. Byl připraven kontrolní vzorek obsahující stejnou koncentraci DMSO. - 10
Každý roztok byl rozdělen do tří jamek na 96$ jamkové destičce (150 pL na jamku). ABAD (výsledná koncentrace 0,5 pg/mL) byl přidán do každé jamky a byla měřena absorbance při 340 nm.
Další měření byla provedena pro koncentraci sloučeniny 25 μΜ (1 % DMSO (v/v)). Výsledné relativní aktivity ABAD enzymu jsou uvedeny v Tabulce 1 a Obr. 4.
Tabulka 1: Relativní aktivity ABAD enzymu v přítomnosti derivátů benzothiazolylmočoviny při koncentracích 25 μΜ a 100 μΜ. Číslo sloučeniny X R1 R2 R3 100 μΜ SEM 25 μΜ SEM kontrola - - - - 1,00 0,03 1,00 0,03 K689 Cl H H OH 0,41 0,01 0,78 0,03 K690 F OH Cl H 0,31 0,01 0,39 0,00 K691 Cl OH Cl H 0,34 0,01 0,38 0,01 K700 F OPh H H 1,04 0,03 1,06 0,02 K704 F COOEt H H 1,05 0,03 1,07 0,02 K705 Cl COOEt H H 1,05 0,03 1,06 0,02 K706 F COMe H H 1,09 0,01 1,28 0,08 Příklad 5: Hodnoty IC50 a měření aktivity ABAD enzymu za přítomnosti inhibitoru
InhibiČní vlastnosti vybraných sloučenin podle vynálezu byly testovány pro sérii koncentrací \ (10 mM zásobní roztoky byly sériově zředěny 11 Tkrát) a byly vypočteny hodnoty IC50.
Byl připraven pufr pro esej obsahující 10 mM HEPES a 0,5 % želatiny (w/v), zahřát na teplotu 37 °C a jeho pH upraveno na hodnotu 7,4 pomocí NaOH.
Pro každou sloučeninu byl připraven Master mix v pufru pro testování, obsahující 250 μΜ NADH, 120 μΜ acetoacetyl-CoA a vybranou sloučeninu v příslušné koncentraci (1% DMSO v/v). Rovněž byl připraven kontrolní roztok obsahující ekvivalentní objem DMSO.
Každý roztok byl rozdělen do tří jamek na 96$ jamkové destičce (150 pL na jamku). ABAD (výsledná koncentrace 0,5 pg/mL) byl přidán do každé jamky a byla měřena absorbance při 340 nm.
Další měření byla provedena pro koncentraci sloučeniny 25 μΜ (1 % DMSO (v/v)). -11 V přítomnosti sloučenin K690 (A-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-iV-(6-fluorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea) a K691 (A-(3-chlor-4-hydroxyfenyl)-./V-(6-chlorbenzo[d]thiazol-2-yl)urea) byla pozorována inhibice ABAD enzymu a byly vypočteny hodnoty IC50 pomocí GraphPad Prism. IC50 hodnoty nalezené pro K690 a K691 byly 2,00 μΜ ± 1,08 μΜ a 1,78 μΜ ±1,12 μΜ. Nalezené hodnoty ABAD specifické aktivity v přítomnosti vzrůstající koncentrace látky K690, respektive K691, jsou znázorněny na Obr. 1.
1?! ';&Amp;?≪/' AJf / '
Benzothiazolylurea Derivatives, Process for their Preparation and Their Use & V 'Tg / f1? - £ Technology
The present invention relates to novel modulators of beta-amyloid alcohol dehydrogenase binding activity (ABAD) based on benzothiazolyl urea derivatives, a process for their preparation and their therapeutic use.
Background Art
Alzheimer's disease (AD) is the most common form of senile dementia and its treatment costs high financial and social costs. The current treatment seems to be the most palliative, treats the symptoms, not the causes of the disease. Thus, the further development of the disease and the patient's death are inevitable. Therefore, the development of more effective therapeutic agents for this disease is extremely important.
Amyloid beta peptide (Αβ) is a widely recognized factor causing AD development. It was found that this peptide interacts with the mitochondrial enzyme called amyloid binding alcohol dehydrogenase (ABAD) (Yan, SD, Fu, J., Soto, C., Chen, X., Zhu, H., Al Mohanna, F., Collison, K., Zhu, A., Stem, E., Saido, T., Tohyama, M., Ogawa, S., Roher, A., and Stem, D. (1997) Nature 389, 689-695). ABAD is a 27 kDa multifunctional mitochondrial matrix enzyme that catalyzes the reduction of aldehydes and ketones and oxidation of alcohols (He, XY, Yang, YZ, Schulz, H., and Yang, SY (2000) Biochem. J. 345 Pt 1, 139-143 Powell, AJ, Read, JA, Banfield, MJ, Gunn-Moore, F., Yan, SD, Lustbader, J., Stem, AR, Stem, DM, and Brady, RL (2000) J. Mol. 303, 311-327). In vitro experiments have shown that the interaction between ABAD and Αβ is cytotoxic and causes mitochondrial dysfunction, reactive radical production and consequently cell death (Lustbader, JW, Cirilli, M., Lin, C., Xu, HW, Takuma, K. , Wang, N., Caspersen, C., Chen, X., Pollak, S., Chaney, M., Trinchese, F., Liu, S., Gunn-Moore, F., Lue, L.-F. , Walker, DG, Kuppusamy, P., Zewier, ZL, Arancio, O., Stem, D., Yan, SS, and Wu, H. (2004) Science 304, 448-452). cytotoxicity, the ABAD enzyme needs to be catalytically active (Yan, SD, Shi, Y., Zhu, A., Fu, J., Zhu, H., Zhu, Y., Gibson, L., Stem, E., Collison, K., Al-Mohanna, F., Ogawa, S., Roher, A., Clarke, SG, and Stem, DM (1999) J. Biol. Chem., 274, 2145-2156). -2 - * · '! Therefore, direct inhibition or activation of ABAD may lead to a new strategy for the treatment of Alzheimer's disease. In 2006, Xie et al. frentizole as a compound capable of inhibiting ABAD-ββ interaction (Xie, Y., Deng, S., Chen, Z., Yan, S., Landry, DW (2006) Bioorg. Med. Chem. Lett. 16,4657-4660) .
-NYVnh
0 '^^' S ^ NH 0 ΪΛ frentizol \ _ /
Frentizole is a weak inhibitor with an IC50 of approximately 200 μΜ. Xie et al. also described frentizole analogues, two of which exhibited 30-fold higher activity in inhibiting ABAD-Αβ interaction compared to frentizole (IC 50 less than 10 μΜ):
Until now, modulators of ABAD-like activity of a similar structural type have been found to be useful in the treatment of Alzheimer's disease.
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides novel ready-to-use modulators of ABAD activity based on benzothiazole derivatives. The present invention relates to benzothiazolylurea derivatives of the formula I " X-3 "
NH
O /
-NH RK
R (I) and pharmaceutically acceptable alkali metal salts, ammonia or amines thereof, or acid addition salts thereof, wherein X, R 1, R 2 and R 3 are selected from the following combinations of R 1 R " RJ name of compound C1 HH OH N - (2-hydroxyphenyl) - N - (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea F OH Cl H N- (3-chloro-4-hydroxyphenyl) -V- (6-Fluoro-benzo [d] thiazol-2-yl) -urea Cl OH Cl H i - (3-Chloro-4-hydroxy-phenyl) - N - (6-chloro-benzo [d] thiazol-2-yl-urea F -OPh HH iV) - (4-phenoxyphenyl) - N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea C 1 -C (O) OEt HH Ethyl-4- [3- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) ureido] benzoate F -C (O) Me HH N - (4-acetylphenyl) - N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea for use in the treatment of Alzheimer's disease and / or dementia. also benzothiazolylurea derivatives selected from the group consisting of N - (2-hydroxyphenyl) - N - (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N - (3-chloro-4-hydroxyphenyl); N - (6-Fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N- (3-chloro-4-hydroxyphenyl) - N - (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea; (4-phenoxyphenyl) -N- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, ethyl 4- [3- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) ureido] benzoate and A- ( 4-acetylphenyl) -N- (6-fluorobenzo [d thiazol-2-yl) ureas, and pharmaceutically acceptable salts thereof with alkali metals, ammonia or amines, or acid addition salts thereof.
In a preferred embodiment, the invention provides benzothiazolylurea derivatives selected from the group consisting of N- (2-hydroxyphenyl) -N- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N- (3-chloro-4'hydroxyphenyl) N - (6-Fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N - (3-chloro-4-hydroxyphenyl) - N - (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, iV - (4-phenoxyphenyl) - N - (6-fluorobenzo [d] thiazole-2- [4- (4-dimethoxy) urea] ethyl 4- [3- (6-chlorobenzo [d] thiazole -2-yl) ureido] benzoate and N- (4-acetylphenyl) - N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, and pharmaceutically acceptable salts thereof with alkali metals, ammonia or amines, or their acid addition salts for use in modulating amyloid-beta binding amyloid-beta-amyloid-binding activity (ABAD). By modulation is meant a change in the activity of this enzyme, ie, activation or inhibition. In the compounds of the invention, at least one of R 1, R 2, R 3 is a hydroxy group, a phenoxy group, or a carbonyl substituent. In particular, the hydroxy group exhibits ABAD enzyme inhibitory activity. Substances with a phenoxy group or a substituent with a carbonyl group, in particular, exhibit ABAD activation activity. The present invention also provides benzothiazolylurea derivatives selected from the group consisting of AL (2-hydroxyphenyl) -N- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N- (3-chloro-4-hydroxyphenyl) -V - (6-Fluoro-benzo [d] thiazol-2-yl) -urea, i- (3-chloro-4-hydroxy-phenyl) - N - (6-chloro-benzo [d] thiazol-2-yl) -urea; -phenoxyphenyl) -N '- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, ethyl 4- [3- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) ureido] benzoate and V- (4 -acetylphenyl) -N- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) ureas, and pharmaceutically acceptable alkali metal salts, ammonia or amines, or acid addition salts thereof, for use as a medicament. benzothiazolylurea derivatives selected from the group consisting of N- (2-hydroxyphenyl) -N- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N- (3-chloro-4- hydroxyphenyl) -V- (6 -fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N- (3-chloro-4-hydroxyphenyl) -N- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N- (4-phenoxyphenyl) N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, ethyl-4- [3- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) ureido] benzoate and N - (4-acetylphenyl) - N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, and their pharmaceutically acceptable salts with alkali metals, ammonia or amines, or acid addition salts thereof, for the manufacture of a medicament for the treatment of Alzheimer's disease and / or dementia. The invention also provides a pharmaceutical composition comprising at least one benzothiazolylurea derivative selected from the group consisting of N - (2-hydroxyphenyl) - N - (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N - (3-chloro-4) -hydroxyphenyl) - N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N- (3-chloro-4-hydroxyphenyl) -N- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, N- (4-phenoxyphenyl) -N- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea, ethyl 4- [3- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) ureido] N - (4-acetylphenyl) - N '- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea benzoate, and at least one
- a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers are in particular fillers such as sugars, starches, carboxymethyl starch, cross-linked polyvinylpyrrolidine, alginic acid and its salts, solvents, binders, etc.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
FIG. 1: Dependence of ABAD activity on K690 and K691 concentrations.
FIG. 2: Hanes-Woolf ABAD kinetics (μΜ min " 1 mg'1) versus acetoacetyl-Co concentration in the presence (1.25 μΜ and 5 μΜ) and absence of K690 (A) and K691 (B) inhibitor.
FIG. 3: Hanes-Woolf ABAD kinetics (μΜ min " 1 mg'1) versus NADH concentration in the presence (1.25 μΜ and 5 μΜ) and absence of K690 (A) and K691 (B) inhibitor.
FIG. 4: Relative activity of ABAD enzyme in the presence of benzothiazolylurea derivatives at a concentration of 25 μΜ. EXAMPLES OF THE INVENTION
The invention is described in the following non-limiting Examples. The starting materials for the compound of formula (I) are commercially available. Example 1: Preparation of ABAD Inhibitors 2-Amino-6-fluorobenzo [d] thiazole (1 g, 5.95 mmol) was dissolved in a mixture of anhydrous dichloromethane (DCM; 60 mL) and anhydrous dimethylformamide (DMF, 10 mL). Ι, β-carbonyldiimidazole (CDI; 1.16 g, 7.13 mmol) was added and the reaction mixture was stirred well under reflux for 16 hours under a nitrogen atmosphere. The resulting precipitate was filtered, washed with 66 DCM (30 mL) and dried. The N- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) -1H-imidazole-1-carboxamide was obtained as a white solid (95% yield). Next, N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) -1 H -imidazole-1-carboxamide (0.3 g, 1.14 mmol) was dissolved in a mixture of anhydrous DMF (10 mL) and triethylamine (Et 3 N; 0.35 mL). To the reaction mixture was added 4-hydroxyaniline (0.14 g, 1.26 mmol), and the reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours under a nitrogen atmosphere. The reaction mixture was diluted with water (40 mL) or 10% HCl (40 mL; carboxylic acid compound), the solid product was filtered, washed with water (30 mL), MeOH (5 mL), and dried. A beige solid of N- (4-hydroxyphenyl) -N- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea was obtained in 95% yield.
Following the same procedure, the following derivatives were prepared, the characterization of which was given: N - (2-hydroxyphenyl) - N, - (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea (K689) B. mp 216-218 ° C. Yield 42%. 1 H NMR (500 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 11.30 (br s, 1H), 10.12 (br s, 1H), 8.84 (br s, 1H), 8.04 ( d, J = 1.8 Hz, 1H, H-7), 7.99 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.6 Hz, 1H, H-4); 7.40 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H, H-5), 6.93-6.88 (m, 2H), 6.85-6.77 (m, 1H ). 13 C NMR (126 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 160.77, 152.24, 148.09, 146.47, 133.35, 126.67, 126.54, 125.97, 123.13, 121.01, 120 , 77, 119.28, 119.06, 114.91. ESI-MS: m / z 320 [M + H +] (calcd for C 14 H 10 ClN 3 O 2 S: 319.02). EA: C, 52.59; H, 3.15; N, 13.14; S 10.03. Found: C, 52.72; H 3.27; N, 13.09; S 10.07. N - (3-chloro-4-hydroxyphenyl) - N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea (K 690)? 298-299.5 ° C. Yield 74%. 1 H NMR (500 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 9.94 (br s, 1H), 8.98 (br s, 1H), 7.82 (dd, J = 8.6, 2, m). 6 Hz, 1H, H-7), 7.69-7.61 (m, 1H, H-4), 7.59 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H-2 '), 7, 22 (td, J = 9.1, 2.7 Hz, 1H, H-5), 7.18 (dd, J = 8.7, 2.5 Hz, 1H, H-6 '), 6.94 (d, J = 8.7 Hz, 1H, H-5 '). 13 C NMR (126 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 159.42, 158.29 (d, J = 239.1 Hz), 151.83, 149.05, 145.57, 132.52, 130.60, 120.92, 120.57, 119.59, 119.36, 116.67, 113.80 (d, J = 24.4 Hz), 108.11 (d, J = 27.0 Hz) ). ESI-MS: m / z 338 [M + H +] (calcd for C 14 H 9 ClFN 3 O 2 S: 337.01). EA: calculated C, 49.78; H, 2.69; N, 12.44; S 9.49. Found: C, 47.39; H, 2.89; N, 12.12; S 9.15. - N - (3-chloro-4-hydroxyphenyl) - N '- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea (K691)
Bit. 283.5-285 ° C. Yield 30%. 1 H NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 9.95 (br s, 1H), 9.01 (br s, 1H), 8.04 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H) -7), 7.70-7.56 (m, 2H, H-4.2 '), 7.40 (dd, 8.6,
2.2 Hz, 1H, H-5), 7.19 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H, H-6 '), 6.94 (d, 8.7 Hz, 1H, H- 5 '). 13 C NMR (75 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 160.40, 151.93, 149.07, 132.94, 130.55, 126.88, 126.20, 121.24, 120.93 , 119.60, 119.34, 116.66. ESI-MS: m / z 354 [M + H +] (calcd for C 14 H 9 Cl 2 N 3 O 2 S: 352.98). EA: calculated C, 47.47; H 2.56; N, 11.86; S 9.05. Found: C, 47.12; H, 2.96; N, 11.49; S 9.33. N- (4-phenoxyphenyl) - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea (K700), 305-307 ° C, 83% yield. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-): δ (ppm) 9.15 (br s, 1H), 7.82 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H, H-7), 7.69-7.62 (m, 1H, H -4), 7.53 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.23 (td, J = 9.1, 2, 5 Hz, 1H, H-5), 7.10 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.0 Hz, 2H) 13 C NMR (126 MHz, DMSO-d 6): δ (ppm) 158.29 (d, J = 238.4 Hz), 151.74, 134.16, 132.54, 129 , 96, 122.99, 120.79, 120.67, 119.67, 117.87, 113.80 (d, J = 24.3 Hz), 108.09 (d, J = 27.1 Hz) ESI-MS: m / z 380 [M + H +] (calcd for C 20 H 14 FN 3 O 2 S: 379.08) EA: calcd C 63.31, H 3.72, N 11.08, S 8.45. H, 3.40, N, 10.70, S, 8.05.
Ethyl 1-4- [3- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) reido 1 benzoate (K704) r Bt 333-335 ° C. Yield 32%. 1 H NMR (500 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 9.53 (br s, 1H), 7.99-7.79 (m, 3H, H-7.2 ', 6'), 7, 72-7.56 (m, 3H, H-4,3 ', 5 '), 7.29-7.20 (m, 1H, H-5), 4.33-4.25 (m, 2H, -O- C12-CH3), 1.31 (t, J = 6.5 Hz, 3H, -O-CH2-CH3). 13 C NMR (126 MHz, DMSO-d 6: δ (ppm) 165.30, 158: 36 (d, J = 237.5 Hz), 142.93, 130.39, 123.85, 118.02, 117.49, 113.94 (d, J = 23.6 Hz), 108.21 (d, J = 26.9 Hz), 60.44, 14.24, ESI-MS: m / z 360 [M + H +] (calcd for C 17 H 15 H 3 O 2 S). EA: C, 56.82, H, 3.93, N, 11.69, S, 8.92, Found: C, 56.37, H, 3.77, N, 11.92, S, 9.24.
Ethyl 4- [3- (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) ureido] benzoate (K705)
Bt 326 - 328 ° C. Yield 45%. 1 H NMR (500 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 9.19 (br s, 1H), 8.08 (s, 1H, H-7), 7.97-7.86 (m, 2H) , H-2 ', 6'), 7.72-7.55 (m, 3H, H-4,3 ', 5'), 7.48-7.39 (m, 1H, H-5), 4.34-4.25 (m, 2H, -O-C77rCH3), 1.32 (t, J = 6.9 Hz, 3H, -O-CH2-CH3). 13 C NMR -8- (126 MHz, DMSO-): δ (ppm) 165.27, 160.41, 151.78, 142.91, 132.73, 130.37, 127.04, 126.31, 123, 86,121,33,118,03, 117,45, 60,45,14,24. ESI-MS: m / z 376 [M + H +] (calcd for C 17 H 14 ClN 3 O 3 S: 375.04). EA: calculated C, 54.33; H, 3.75; N 11.18; S 8.53. Found: C, 54.01; H, 3.89; N, 11.50; S 8.82. N - (4-acetylphenyl) - N - (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea (K706) η m.p. 308-310 ° C. Yield 48%. 1 H NMR (500 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 9.53 (br s, 1H), 8.00-7.80 (m, 3H, H-7,3 ', 5'), 7 , 71-7.55 (m, 3H, H-4.2 ', 6 '), 7.25 (t, J = 7.8 Hz, 1H, H-5), 2.53 (s, 3H, -CO-CH 3). 13 C NMR (126 MHz, DMSO- d 6): δ (ppm) 196.41, 158.37 (d, J = 235.7 Hz), 151.85, 143.91, 143.02, 132.24, 131 , 36, 129.67, 120.45, 117.89, 117.38, 113.96 (d, J = 23.8 Hz), 108.26 (d, J = 27.9 Hz), 26.45 . ESI-MS: m / z 330 [M + H +] (calcd for C 16 H 12 FN 3 O 2 S: 329.06). EA: calculated C, 58.35; H, 3.67; N, 12.76; S 9.74. Found: C, 57.97; H, 3.46; N, 13.18; S 10,19.
Example 2: ABAD Cleaning
E. coli BL21-CodonPlus cells containing Histev-ABAD protein were suspended for 30 min, 4 ° C, in digestion buffer (20 mM NaH 2 PO 4, 30 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10% (v / v) glycerol, pH 7.5) with the addition of completely EDTA-depleted protease inhibitor (Roche), lysozyme (1 mg / mL), DNase (20 pg / mL) and Triton X-100 (0.1% (v / v)). Cells were digested by passing through a cell disruptor at 30 kPSI (Constant Systems Ltd) and the lysate was purified by centrifugation (Sorvall Evolution RC, rotor S5-34 55-34 angle, 20500 rpm, 30 min, 4 ° C). The purified lysate was filtered (0.44 µm membrane; Whatman) and then applied to Ni-NTA (GE Healthcare) column, prewashed with digestion buffer, and the protein eluted with 300 mM imidazole buffer (20 mM NaH 2 PO 4, 300 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10% (v / v) glycerol, pH 7.5). A Tobacco etch virus (TEV) protease of 10: 1 was added to the protein to cleave the histidine tag and the protein was then dialyzed into 20 mM Tris-HCl, 30 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10% (v / v) glycerol, pH 7.5 containing EDTA (1 mM) and DTT (1 mM) to increase solubility. Enzyme digestion and dialysis was performed at 4 ° C for 16 h. The complete digestion was first checked by SDS-PAGE and then the fully digested protein passed through the second Ni-column and the ABAD protein-containing eluate was concentrated to ~7 mL with a Vivaspin column (10 kDa). MWCO, GE Healthcare). Finally, the product was purified and deprived of imidazole by gel filtration (Hi-Load 16/60-9 ~)
Superdex 75 prep grade column, GE Healthcare, flow rate 1.5 mL / min). The protein was eluted with gel filtration buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.5) and concentrated (10 kDa MWCO, GE Healthcare) to 10 mg / ml. Samples of 10 µL, 25 µL and 50 µL were taken, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. Example 3: Michaelis-Menten Kinetics
A 10 mM NADH stock solution and a 4.8 mM solution of acetoacetyl-CoA in HEPES buffer (10 mM, pH 7.4) were prepared. Next, a assay buffer was prepared, consisting of 10 mM HEPES buffer and 0.5% gelatin (w / v), heated to 37 ° C, and adjusted to pH 7.4 with NaOH.
Master mix solutions were prepared in assay buffer containing 1 mM NADH and acetoacetyl-CoA at concentrations of 0 pM, 25 pM, 50 pM, 100 pM, 200 pM, and 400 pM. Each solution was divided into three wells in a 96-well plate (150 µL per well). ABAD (final concentration 0.5 pg / mL) was added to each well and absorbance at 340 nm was measured.
Selected compounds of the invention (K690 and K691) were added to the reaction mixture at concentrations of 1.25 µM and 5 µM (1% DMSO (v / v)) and tested. The results are summarized in graph at 0br. 2 and 3. Example 4: Testing compounds
10 mM DMSO stock solutions of all new compounds prepared were prepared
A in Example 1. NADH and acetoacetyl-CoA solutions were prepared in HEPES buffer (10 mM, pH 7.4) and their concentrations were 10 mM and 10 mM, respectively. 4.8 mM. An assay buffer was prepared containing 10 mM HEPES and 0.5% gelatin (w / v), heated to 37 ° C and adjusted to pH 7.4 with NaOH.
The master mix solution of each compound prepared in Example 1 was prepared in assay buffer; 100 μΜ of compound, 250 μΜ NADH and 120 μΜ acetoacetyl-CoA. The resulting DMSO concentration was maintained at 1% due to the solubility of the compounds. A control sample containing the same DMSO concentration was prepared. - 10
Each solution was divided into three wells on a 96 $ well plate (150 µL per well). ABAD (final concentration 0.5 pg / mL) was added to each well and absorbance at 340 nm was measured.
Further measurements were made for a compound concentration of 25 μΜ (1% DMSO (v / v)). The resulting relative ABAD enzyme activities are shown in Table 1 and FIG. 4.
Table 1: Relative activities of ABAD enzyme in the presence of benzothiazolylurea derivatives at concentrations of 25 μΜ and 100 μΜ. Compound Number X R1 R2 R3 100 μΜ SEM 25 μΜ SEM Control - - - - 1.00 0.03 1.00 0.03 K689 Cl HH OH 0.41 0.01 0.78 0.03 K690 F OH Cl H 0.31 0.01 0.39 0.00 K691 Cl OH Cl H 0.34 0.01 0.38 0.01 K700 F OPh HH 1.04 0.03 1.06 0.02 K704 F COOEt HH 1 , 05 0.03 1.07 0.02 K705 Cl COOEt HH 1.05 0.03 1.06 0.02 K706 F COMe HH 1.09 0.01 1.28 0.08 Example 5: IC50 values and measurements ABAD enzyme activity in the presence of inhibitor
The inhibitory properties of selected compounds of the invention were tested for a series of concentrations (10 mM stock solutions were serially diluted 11-fold) and IC 50 values were calculated.
An assay buffer was prepared containing 10 mM HEPES and 0.5% gelatin (w / v), heated to 37 ° C and adjusted to pH 7.4 with NaOH.
For each compound, a master mix was prepared in assay buffer, containing 250 μΜ NADH, 120 μΜ acetoacetyl-CoA and the selected compound at the appropriate concentration (1% DMSO v / v). A control solution containing an equivalent volume of DMSO was also prepared.
Each solution was divided into three wells on a 96 $ well plate (150 µL per well). ABAD (final concentration 0.5 pg / mL) was added to each well and absorbance at 340 nm was measured.
Further measurements were made for a compound concentration of 25 μΜ (1% DMSO (v / v)). -11 In the presence of K690 (N- (3-chloro-4-hydroxyphenyl) -N- (6-fluorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea) and K691 (N- (3-chloro-4-hydroxyphenyl)) - N - (6-chlorobenzo [d] thiazol-2-yl) urea) inhibition of ABAD enzyme was observed and IC 50 values were calculated with GraphPad Prism. IC50 values found for K690 and K691 were 2.00 μΜ ± 1.08 μΜ and 1.78 μΜ ± 1.12 μΜ. The values of ABAD specific activity found in the presence of increasing concentrations of K690 and K691, respectively, are shown in FIG. 1.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-539A CZ305633B6 (en) | 2014-08-13 | 2014-08-13 | Benzothiazolyl urea derivatives, process of their preparation and their use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-539A CZ305633B6 (en) | 2014-08-13 | 2014-08-13 | Benzothiazolyl urea derivatives, process of their preparation and their use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2014539A3 true CZ2014539A3 (en) | 2016-01-13 |
| CZ305633B6 CZ305633B6 (en) | 2016-01-13 |
Family
ID=55080334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2014-539A CZ305633B6 (en) | 2014-08-13 | 2014-08-13 | Benzothiazolyl urea derivatives, process of their preparation and their use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ305633B6 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ2018152A3 (en) * | 2018-03-27 | 2019-05-09 | Univerzita Hradec Králové | Arylbenzothiazolylurea derivatives, preparing and using them |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004501863A (en) * | 2000-01-19 | 2004-01-22 | アルテオン インコーポレーテッド | Thiazole, imidazole and oxazole compounds and treatment of protein aging related diseases |
| WO2002053161A1 (en) * | 2000-12-29 | 2002-07-11 | Alteon, Inc. | Method for treating fibrotic diseases or other indications |
| JP2008509982A (en) * | 2004-08-16 | 2008-04-03 | プロシディオン・リミテッド | Aryl urea derivatives |
| KR101064258B1 (en) * | 2008-12-29 | 2011-09-14 | 한국과학기술연구원 | Benzoarylureido compounds, and composition for prevention or treatment of neurodegenerative disease containing the same |
-
2014
- 2014-08-13 CZ CZ2014-539A patent/CZ305633B6/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ305633B6 (en) | 2016-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yadav et al. | Structure activity relationship (SAR) study of benzimidazole scaffold for different biological activities: A mini-review | |
| Mohamed et al. | 2, 4-Disubstituted quinazolines as amyloid-β aggregation inhibitors with dual cholinesterase inhibition and antioxidant properties: Development and structure-activity relationship (SAR) studies | |
| US8921405B2 (en) | Compounds | |
| US9040565B2 (en) | 1H-benzimidazole-5-carboxamides as anti-inflammatory agents | |
| AU2006218405A1 (en) | Acridine and quinoline derivatives as sirtuin modulators | |
| CA2747158A1 (en) | Phthalazinone and related analogs as sirtuin modulators | |
| ZA200608712B (en) | Substantially pure 2-{[2-(2-methylamino-pyrimidin-4-yl)-1II-indole-5-carbonyl]-amino}-3-(phenylpyridin-2-yl-amino)-propionic acid as an IkB kinase inhibitor | |
| KR20080110931A (en) | 5-phenyl-thiazol-2-yl-urea derivatives and use as pi3 kinase inhibitors | |
| JP2009541387A (en) | Thiazolyl urea derivatives as phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors | |
| CA2480451A1 (en) | New 2-substituted -1,3-thiazole compounds | |
| Senthilkumar et al. | Synthesis of new thiazolidine-2,-4-dione-azole derivatives and evaluation of their α-amylase and α-glucosidase inhibitory activity | |
| CZ2014539A3 (en) | Benzothiazolyl urea derivatives, process of their preparation and their use | |
| US11858905B1 (en) | Cathepsin L inhibitors | |
| CZ307796B6 (en) | Arylbenzothiazolylurea derivatives, preparing and using them | |
| Manoharan et al. | Synthesis, characterization and evaluation of antidiabetic activity of novel indoline derivatives | |
| CZ2022319A3 (en) | Derivatives of 2-arylbenzothiazole, methods of their preparation and their use | |
| EP1910314B1 (en) | Benzimidazole derivatives for treatment of inflammatory diseases | |
| CN110790724B (en) | Selective carbonic anhydrase inhibitor and synthesis method and application thereof | |
| US20140371469A1 (en) | Photoreactive benzamide probes for histone deacetylase 2 | |
| CN108358925B (en) | 7, 8-substituted-3-methylxanthine compound and preparation method and application thereof | |
| EP4422753A1 (en) | Imidazolone derivatives as inhibitors of protein kinases in particular dyrk1a, clk1 and/or clk4 | |
| Dhineshkumar Manoharan et al. | Synthesis, characterization and evaluation of antidiabetic activity of novel indoline derivatives. | |
| WO2024033293A1 (en) | Difluoro- and trifluoro-acetyl hydrazides as selective hdac6 inhibitors | |
| FR2933980A1 (en) | New triazolo(4,3-a)pyridine derivatives are mesenchymal-epithelial transition protein kinase inhibitors useful in a pharmaceutical composition for preparing a medicament to treat/prevent e.g. fibrotic disorders, allergies and asthma | |
| KR20190043013A (en) | Novel indazole derivatives, and use thereof |