CZ2014320A3 - Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje chimérický polyepitopový rekombinantní antigen, obsahující dva až deset imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, Pak, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko, a orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borellia garinii Pbi. Dále řešení poskytuje vakcinační konstrukt a vakcínu proti Lymeské borelióze obsahující tento rekombinantní antigen a alespoň jedno adjuvans a/nebo Ferritin II.

Description

Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy

Oblast techniky

Vynález se týká složení a kombinace rekombinantních antigenů a formulace vakcíny k prevenci Lymeské borreliózy a klíšťaty přenášených onemocnění. Vakcína je určena pro humánní a veterinární použití.

Dosavadní stav techniky

Lymeská borrelióza je chronické multisystémové infekční onemocnění, které je nej častějším infekčním onemocněním přenášeným členovci, a to v Evropě i ve Spojených státech. Jde zpravidla o nesmrtící, ale v nezanedbatelném procentu invaliduzující onemocnění se závažnými zdravotními důsledky. Z tohoto pohledu jde o závažný socioekonomický problém. O významu tohoto onemocnění svědčí četnost publikací v časopisech zabývajících se infekční problematikou. V poslední dekádě je borrelióza svým významem zařazována za syndrom získané imunodeficience, jak je popsáno např. v článku Barbour AG, Fish D, Science. 1993 Jun ll;260(5114): 1610-6.

Klinické příznaky lymeské boreliózy jsou popisovány různými autory již z přelomu devatenáctého a dvacátého století (Bartůněk P. historie. In: Bartůněk P, a kol. Lymeská borelióza. Praha: Gradapublishing, 2006: 11), ale až v roce 1982 došlo k popisu původce popisovaných příznaků - spirochéty, později nazvané Borrelia burgdorferi. (Burgdorfer W, Barbour AG, Hayes SF, BenachJL, Grunwaldl E, Davis JP., Science. 1982; 216:1317-1319). Postupně došlo k popisu dalších blízce příbuzných druhů, takže druhová skupina označovaná jako Borrelia burgdorferi sensu lato (s. 1.) v současnosti čítá dvanáct druhů a je možné, že toto číslo stále není konečné.

Z popsaných druhů se jako patogeny na Euroasijském kontinentu uplatňují hlavně tři Borrelia burgdorferi sensu stricto (s. s.), Borrelia garinii a Borrelia afzelii. Na Severoamerickém kontinentu se jako patogen uplatňuje pouze B. burgdorferi sensu stricto. Borelie z druhové skupiny B. burgdorferi jsou bakterie přenášené nej častěji klíšťaty rodu Ixodes, ale přenos je pravděpodobně možný iprostřednictvím hmyzu sajícího krev, i když k tomuto jevu dosud chybí přesvědčivé důkazy. Přirozeným hostitelem v přírodě jsou především drobní hlodavci, ale i ptáci a vysoká zvěř. Tvoří tak přírodní rezervoár infekce.

Člověk je v infekčním řetězci slepým článkem, k dalšímu šíření již nedochází. V současné době je lymeská borelióza nej častěji diagnostikovanou antropozoonózou na území Evropy a Severní Ameriky. Její výskyt má navíc místy stoupající tendenci.

Klinický průběh Lymeské boreliózy má obecně tři stadia. Jejich manifestace však nemusí proběhnout u všech infikovaných jedinců. První stadium je charakterizováno chřipko vitým průběhem, často provázeným kožními příznaky v místě vniknutí infekce. Kožní projevy jsou charakteristické a jsou označovány jako erythema migrans. Pokud infekce není léčena, případně eliminována imunitním systémem hostitele, může progredovat do dalšího stadia s postižením kloubů, nervového systému, kůže, vzácněji srdce, očí apod. Asi 10% pacientů bez ohledu na antibiotickou léčbu vykazuje dlouhodobé klinické příznaky. Jedním z možných vysvětlení je indukce autoimunitních procesů.

Závažné poškození savčího organismu, stejně jako problémy s diagnostikou a terapií Lymeské boreliózy jsou významným podnětem pro vývoj vakcíny. Možnost vývoje vakcíny podporují také poznatky o tom, že protilátková imunitní odpověď je dostatečná k ochraně organismu před touto mikrobiální infekcí.

Z mikrobiologického pohledu jsou mikroorganismy druhového komplexu Borrelia burgdorferi s.l. charakterizovány spirálním tvarem, který je určován především bičíky zakotvenými v periplazmatickém prostoru. Povrch borélií je tvořen lipoproteiny OspA, OspB, OspC, OspD, OspE,OspF, případně dalšími, z nichž některé mohou být terčem protektivní imunitní odpovědi (Kumaru OS, Schulze RJ, Rodnin MV, Ladokhin AS, Ziickert WR., J Bacterial. 2011 Jun;193(11):2814-25; Livey I, O'Rourke M, Traweger A, Savidis-Dacho H, Crowe BA, Barrett PN, Yang X, Dunn JJ, Luft BJ, Clinlnfect Dis. 2011 Feb;52 Suppl 3:s266-70; Chen S, Ziickert WR., J Bacteriol. 2011 Dec;193(23):6724-32; Tilly K, Bestor A, Rosa PA., Mol Microbiol. 2013 Jul;89(2):216-27)

Schopnost vyvolávat protektivní odpověď byla popsána na příklad u „outer surface“ proteinů OspA, OspB, OspC, fibronektin vážícího proteinu BBK32 a proteinů vážící dekorin DbpA a DbpB (Gilmore RD 1996 Infect Immun 64:2234-2239).

Povrchové proteiny (outer surface proteins ) jsou vesměs determinovány genovými sekvencemi umístěnými v plasmidech a jsou značně variabilní v rámci druhu a jejich exprese je jemně regulována v asociaci s podmínkami životního cyklu bakterie.

V trávicím traktu klíštěte jsou na povrchu borelií exprimovány hlavně proteiny OspA a OspB, které zde mají funkci adhezivních molekul. V průběhu sání krve klíštětem se snižuje exprese těchto proteinů a zvyšuje se exprese OspC. Během přechodu do diseminované fáze choroby dochází k poklesu exprese OspC a na povrchu borelie se objevuje protein VlsE vyznačující se vysokou antigenní variabilitou, která je podmíněna genovou rekombinací multidoménovéhoVlsE genu (Obonyo M, Munderloh UG, Fingerle V, Wilske B, KurttiTJ, J ClinMicrobiol. 1999 Jul;37(7):2137-41; Xu Q, McShan K, Liang FT., Microbiology. 2008 Nov;154(Pt 11):3420-9. doi: 0.1099/mic.0.2008/019737-0.)

Protein OspA byl popsán jako první ze skupiny vnějších povrchových lipoproteinů (Barbour et al., 1983 Infect Immun. 41(2):795-804). OspA má molekulární hmotnost 31 kDa. Společně s proteinem OspB je exprimován na povrchu borélii v žaludku klíštěte (Howe et al., 1985 Science. 227(4687):645-6). Hlavní funkcí proteinuOspA je vazba na glykoprotein TROSPA přítomný na buňkách žaludečního epitelu klíštěte. Při sání klíštěte se jeho exprese významně snižuje. Další předpokládanou funkcí OspA je vazba na plasminogen v krvi savčího hostitele. V analogii s jinými mikroorganismy je schopnost vazby antigenu OspA na plasminogen vnímána jako faktor virulence. (Lahteenmaki et al., 2001 FEMS Microbiol Rev. 25(5):53152).

Protein OspC je jedním z nadějných kandidátů pro konstrukci preventivní vakcíny proti Lymeské borelióze. Byl identifikován v roce 1992 jako druhý antigen (po OspA) který indukuje protektivní imunitní odpověď (Preac-Mursic, Wilske et al. 1992 Infection 20(6):342-9).OspC gen je lokalizována na cirkulámím plazmidu o velikosti 27 kb (Marconi,R.T., Samuels,D.S. and Garon,C.F. (1993) J.Bacterial., 175, 926±932). Jde o lipoprotein o molekulové hmotnosti 22±23 kDa skládající se z 210 aminokyselin. Je tvořen převážně alfa helikálními strukturami propojeným smyčkami. Lipidový triacylglycerolový motiv umožňuje jeho ukotvení v buněčné membráně. Protektivita po aplikaci pokusným zvířatům byla potvrzena již počátkem devadesátých let 20. století. Jako problematická se ale záhy ukázala variabilita proteinu (Preac-Mursic V, Wilske B, Patsouris E et al 1992 Infection 20:342-349). Postupně bylo popsáno 38 strukturních variant antigenů OspC. Některé z nich se se zvýšenou frekvencí objevují u boreliových mikroorganismů vyvolávajících systémová onemocnění u člověka. Klony nesoucí tyto antigeny jsou proto označovány jako invazívní klony (Seinost,G.,Dykhuizen, D.E., Dattywyler,R.J, Golde,W.T.,Dunn,JJ, Wang,I.-N., Wormser,G.P., Schriefer.M.E. andLuft,B.J. 1999 Infect. Immun., 67, 3518±3524.)

První veterinární vakcína proti borrelióze byla vyvinuta ve Spojených státech vr. 1990 pro psy. Šlo o celobuněčnou vakcínu založenou na bakterinech uvolněných z mikroorganismů homogenizací kultury. (Levy SA, Lissman BA, Ficke CM., 1993 J Am Vet Med Assoc. Jun l;202(ll):1834-8; Wormser, GP., 1995 Ann Intern Med 123,627 - 629).

Výsledky pokusů o přenos protektivní imunity pomocí séra získaného ze zvířat imunizovaných některým z vnějších povrchových antigenů naznačily možnost přípravy subjednotkové vakcíny. Hlavními kandidátními antigeny pro takovou vakcínu se staly vnější povrchové proteiny OspA, B, C a D. Intenzívně byl studován zejména protein OspA. Protektivní efekt této subjednotkové vakcíny byl potvrzen experimentálně u myší, křečků a králíků (Fikrig E et al., 1990 Science Oct 26; 250(4980):553-6; Fikrig E et al., 1992 Infectlmmun. Mar; 60(3):773-7). Laboratorní testy potvrdily, že aplikace tohoto proteinu ve formě purifikováného, lipidováného rekombinantního proteinu indukuje protektivní imunitu při parenterálním podání a chrání proti infekci boreliemi podanými nejen injekční cestou, ale též prostřednictvím infikovaného klíštěte, jako přirozeného vektoru. Potvrdilo se také, že infekční klíšťata sající na takto imunizovaných zvířatech ztrácejí svou infekciozitu (Keller D et al., 1994 JÁMA. Jun 8;271(22): 1764-8; Fikrig E et al., 1992 ProcNatlAcadSci USA. Jun 15;89(12):5418-21).

První komerční monovalentní vakcína byla proto založena na antigenů OspA. Vakcína byla schválena Food and Drug Administration (FDA) v roce 1998 (Steere AC et al., N Engl J Med. 1998 Jul 23;339(4):209-15). Zvláštností této vakcíny je skutečnost, že interakce mezi hostitelskou protilátkou a patogenem probíhá mimo tělo hostitele - v žaludku klíštěte. Nedostatkem této vakcíny byla monovalentní kompozice. Vakcína byla připravena z proteinu OspA Borrelia burgdorferi sensu stricto. Tato genomospecies je dominantním infekčním původcem Lymeské boreliózy na severoamerickém kontinentu. Může tak být efektivní pro obyvatelstvo USA. Pro evropské podmínky však není optimální. OspA antigen připravený z kmene Borrelia burgdorferi sensu stricto nemůže pokrýt variabilitu OspA antigenů všech tří genomospecies na evropském kontinentu.

Ferritin II je klíčovým proteinem, který zajišťuje homeostázu sajícího klíštěte, které přijímá enormní množství železa ve formě hemoglobinu z hostitelovy krve. Bylo prokázáno, že vakcinování králíků rekombinantním klíštěcím Ferritin II proteinem významně snižuje sání klíšťat na vakcinovaných králících. (Hajdusek et al. 2010 Vaccine 28, 2993-2998)

Přechod od živých vakcín k bezpečnějším avšak méně imunogenním vakcínám, založených na rekombinantních antigenech vyžaduje nová strukturně definovaná adjuvans stimulující protilátkovou i T-buněčnou imunitu. V případě boreliové infekce opsonizační a zejména komplement aktivující protilátky jsou považovány za klíčový mechanismus protekce hostitele. Preparáty schválené pro klinickou aplikaci jsou převážně odvozené od hydroxidu hlinitého, fosforečnanu hlinitého, nebo původního síranu hlinitodraselného. Tato adjuvans indukují převážně Th2 orientovanou imunitní odezvu spojenou s tvorbou neutralizačních protilátek. Jediná alternativa schválená pro klinickou (humánní) aplikaci potencující částečně i buněčnou efektorovou imunitu jsou MF59 (Novartis) a AS03 (GSK), (olejové emulze). Tato adjuvans indukují jen mírnou Thl imunitní odpověď nezbytnou k tvorbě opsonizačních a komplement aktivujících protilátek. Tyto o požadavky v plném rozsahu splňují originální, plně syntetické, nepyrogenní, molekulární adjuvans na bázi glykopeptidů normuramylového typu. Kombinací strukturních změn v sacharidové a peptidové části jejich molekul byla eliminována z klinického hlediska netolerovatelná vysoká pyrogenita spojená obecně s muramylovými glykopeptidy (Ledvina M., Ježek J, Šaman D., Hříbalová V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 1998, 63, 590-598; Ledvina M., Zyka D., Ježek J, Trnka T., Šaman D.: Collect. Czech. Chem. Commun. 1998, 63, 577-589). Vzhledem k amfifilnímu charakteru těchto adjuvans, danému přítomností hydrofobní a polámí/hydrofilní domény v jejich molekule, jsou tyto látku schopny vytvářet stabilní micelámí struktury a lze je efektivně zabudovat do lipidové dvoj vrstvy liposomálních nosičových systémů (Turánek J., Masek J, Raška M., Ledvina M., in: Biomedical Science, Engineering and Technology, Application of Liposomes for Construction of Vaccines, InTech, January, 2012, 653-678.).

Liposomy, vesikly z fosfolipních membrán, představují biokompatibilní a víceúčelové nosiče pro přípravu cílených léčiv a konstrukci rekombinantních vakcín. Liposomy jsou nanočásticové systémy schválené FD A pro aplikaci v humánní medicíně. Jejich použití jako adjuvans bylo popsáno Gragoriadisem a Allisonem (Nature252, 252,1974). Použití metalochelatačních liposomů pro konstrukci rekombinantních vakcín bylo popsáno (Křupka et al. Journal of Controlled Release 160 (2012) 374-381; Mašek et al. 151 (2011) 193-201; Mašek et al. Analytical Biochemistry 408 (2011) 95-104)

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je chimérický polyepitopový rekombinantní antigen obsahující dva až deset imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, PKa, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko, a orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B, I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borrelia garinii Pbi.

Imunodominantním úsekem je zde míněna sekvence zahrnující alespoň jeden epitop.

Tento chimérický polyepitopový antigen je základem vakcíny proti Lymeské borelióze pro humánní i veterinární použití.

Ve výhodném provedení je podstatou vynálezu polyepitopový rekombinantní antigen obsahující dva až deset, s výhodou sedm, imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující OspC orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B, I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borrelia garinii Pbi.

V jiném výhodném provedení je podstatou vynálezu polyepitopový rekombinantní antigen obsahujícího dva až deset, s výhodou osm, imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, PKa, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko.

Imunodominantní úseky jsou sloučeny do fúzního proteinu v pořadí umožňujícím imunologické rozpoznání jednotlivých epitopů (tj. orientované sekvence). Na N-terminálním konci je kfúznímu proteinu s výhodou připojena sekvence šesti histidinů (His tag), umožňující metalochelatační vazbu na liposomální nosič. Takový způsob fixace rekombinantního proteinu k lipozomálnímu nosiči zajišťujě imunologicky výhodnou orientaci fúzního proteinu tak, že imunodominantní C-terminální aminokyselinové sekvence jsou přístupnější pro indukci imunitní odpovědi.

Předmětem vynálezu je dále vakcinační konstrukt, obsahující mikro- nebo nano-partikulámí nosič (tj. nanopartikulární nosič s velikostí částic do 1 mikrometru, mikropartikulámí nosič s velikostí částic do 100 mikrometrů) obsahující metalochelatačně vážící složku, chimérický polyepitopový rekombinantní antigen vázaný prostřednictvím metalochelatačně vážící složky, a s výhodou dále adjuvans a/nebo Ferritin II.

S výhodou je nosičem liposom s inkorporovaným metalochelatačním lipidem (např. DOGSNi-NTA (Avanti Polar Lipids, USA)) jako metalochelatačně vážící složkou pro vazbu antigenů, popřípadě molekulárního adjuvans a/nebo Ferritin II rekombinantního proteinu na povrch liposomu. Nosičem může být i farmaceuticky přijatelný polymer, jako například kopolymery kyseliny mléčné a glykolové, polymery a kopolymery na bázi kyseliny akrylové a methakrylové, akrylátů, methakrylátů, např. hydroxymethylmethakrylátu. Nosičem mohou rovněž být částice na bázi anorganických materiálů, např. hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitodraselný, křemičitanové hydrogely.

Předmětem vynálezu je také vakcína k prevenci Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití, obsahující chimérický polyepitopový rekombinantní antigen podle vynálezu, a alespoň jedno adjuvans. Vakcína může případně obsahovat pomocné látky, jako jsou rozpouštědla, stabilizátory, emulgátory, nosiče, apod.

K prevenci šíření borelií z místa kousnutí klíštětem do celého organismu je nejvhodnější využít vakcínu obsahující rekombinantní polyepitopový antigen obsahující imunodominantní úseky OspC.

Adjuvans může být s výhodou vybráno ze skupiny zahrnující hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitodraselný, molekulární adjuvans na bázi normuramylových glykopeptidů popsaná v WO 2009/115782 (obecné vzorce I a II), adjuvans založená na disperzi částic na bázi polymemích polyakrylátových nosičů (například PetGelA).

Molekulární adjuvans na bázi normuramylových glykopeptidů jsou zejména vybrána ze skupiny zahrnující:

LAbu—D-iGIn-OH

MT01

6-<?-(2-Tetradecylhexadekanoyl)-jV-acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D-isoglutamin,

OH

OH .-Abu—D-iGIn-OH

MT02

2-Deoxy-2-stearoylamino-P-D-glucopyranosyl-(l —>4)-A-acetylnormuramoyl-L-2aminobutanoyl-D-isoglutamin,

Ό

L-Abu—D-iGIn-OH

MT03

6-O-Stearoyl-A-acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D-isoglutamin,

MT04

2-Deoxy-2-(2-tetradecylhexadekanoylamino)-P-D-glucopyranosyl-(l —>4)-Aacetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D-isoglutamin,

A-Acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D- isoglutaminyl-L-lysin(stearoyl),

OH

MT06

A-Acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D- isoglutaminyl-L-lysin(2tetradecylhexadekanoyl),

2-Acetamido-2-deoxy-p-D-glucopyranosyl-(l -*4)-A-acetylnormuramoyl- L-2aminobutanoyl-D- isoglutaminyl-L-lysin(stearoyl),

MT08

2-Acetamido-2-deoxy-p-D-glucopyranosyl-(l -*4)-;V-acetylnormuramoyl- L-2aminobutanoyl-D- isoglutaminyl-L-lysin(2-tetradecylhexadekanoyl).

Vakcína s výhodou obsahuje vakcinační konstrukt podle vynálezu.

Ve výhodném provedení jsou OspC antigeny vybrány ze skupin borelií zahrnující:

NP_047005 - gi| 11497007: OspC skupina A (B31MI) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 1)

1	MKKNTLSAIL	MTLFLFISCN	NSGKDGNTSA	NSADESVKGP	NLTEISKKIT
51	DSNAVLLAVK	EVEALLSSID	EIAAKAIGKK	IHQNNGLDTE	NNHNGSLLAG
101	AYAISTLIKQ	KLDGLKNEGL	KEKIDAAKKC	SETFTNKLKE	KHTDLGKEGV
151	TDADAKEAIL	KTNGTKTKGA	EELGKLFESV	EVLSKAAKEM	LANSVKELTS
201	PVVAESPKKP

EF053525 - gi| 117574163: OspC skupina B (LDP73) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 2)

1	NNSGKDGNTS	ANSADESVKG	PNLTEISKKI	TDSNAVLLAV	KEVEALLSSI
51	DELAKAIGKK	IKNDGSLDNE	ANRNESLLAG	AYTISTLITQ	KLSKLNGSEG
101	LKEKIAAAKK	CSEEFSTKLK	DNHAQLGIQG	VTDENAKKAI	LKANAAGKDK
151	GVEELEKLSG	SLESLSKAAK	EMLANSVKEL	TSPVVAESPK	KP

AF467874 - gi|23507072: OspC skupina I (B331) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 3)

1	MKKNTLSAIL	MTLFLFISCN	NSGKDGNTSA	NSADESVKGP	NLTEISKKIT
51	ESNAVVLAVK	EVETLLTSID	ELAKAIGKKI	KNDVSLDNEA	DHNGSLISGA
101	YLISTLITKK	ISAIKDSGEL	KAEIEKAKKC	SEEFTAKLKG	EHTDLGKEGV
151	TDDNAKKAIL	KTNNDKTKGA	DELEKLFESV	KNLSKAAKEM	LTNSVKELTS
201	PVVAESPKKP

EF053517 - gi| 117574147: OspC skupina K (LDP74) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 4)

1	NNSGKDGNTS	ANSADESVKG	PNLTEISKKI	TESNAVVLAV	KEIETLLASI
51	DELATKAIGK	KIQQNGGLAV	EAGHNGTLLA	GAYTISKLIT	QKLDGLKNSE
101	KLKEKIENAK	KCSEDFTKKL	EGEHAQLGIE	NVTDENAKKA	ILITDAAKDK
151	GAAELEKLFK	AVENLAKAAK	EMLANSVKEL	TSPIVAESPK	KP

YP 063261 - gi|51038597: OspC skupina PBi B. garinii (SEQ ID NO. 5)

1	MKKNTLSAIL	MTLFLFISCN	NSGGDSASTN	PDESAKGPNL	TVISKKITDS
51	NAFLLAVKEV	EALLSSIDEL	SKAIGKKIKN	DGTLDNEANR	NESLIAGAYE
101	ISKLITQKLS	VLNSEELKEK	IKEAKDCSEK	FTTKLKDSHA	ELGIQSVQDD
151	NAKKAILKTH	GTKDKGAKEL	EELFKSLESL	SKAAQAALTN	SVKELTNPVV
201	AETPKKP

YP 709265 - gi| 111074118: OspC skupina PKo B. afzelii (SEQ ID NO. 6)

1	MKKNTLSAIL	MTLFLFISCN	NSGKGGDSAS	TNPADESAKG	PNLTEISKKI
51	TDSNAFVLAV	KEVETLVLSI	DELAKKAIGQ	KIDNNNGLAA	LNNQNGSLLA
101	GAYAISTLIT	EKLSKLKNLE	ELKTEIAKAK	KCSEEFTNKL	KSGHADLGKQ
151	DATDDHAKAA	ILKTHATTDK	GAKEFKDLFE	SVEGLLKAAQ	VALTNSVKEL
201	TSPVVAESPK	KP

Ze zvolených OspC anti genů byly vybrány úseky odpovídající a3-L5-a4-L6-a5 úsekům jednotlivých OspC proteinů viz následující tabulka.a dále C' terminální úsek odvozený z OspC PKo.

Označení v databázi GeneBank

Vybraný sekvenční úsek -

Zařazení OspC antigenu podle skupiny

	pořadí aminokyselin
NP_047005 - gi| 11497007	128-196	B. burgdorferi skupina A (B31MI)
EF053525 -gi|l 17574163	109-178	B. burgdorferi skupina B (LDP73)
AF467874 - gi|23507072	128-196	B. burgdorferi skupina I (B331)
EF053517 - gi|l 17574147	110-178	B. burgdorferi skupina K (LDP74)
YP 063261 - gij51038597	125-193	B. garinii skupina PBi
YP709265- gi|111074118	130-211	B. afzelii skupina Pko

Ve výhodném provedení má chimérický polyepitopový rekombinantní antigen založený na OspC antigenech připojeny Ν' konci tři peptidové úseky: 1) hexa His kotva (His tag) umožňující purifikaci proteinu pomocí Ni-NTA afinitní chromatografie a přípravu metalochelatačních proteoliposomů, 2) štěpné místo pro thrombin umožňující odstranit His tag kotvu z rekombinantního proteinu pro imunodetekční ELISA aplikace stanovující hladiny anti genem navozených specifických protilátek u imunizovaných jedinců, 3) T7 epitop umožňující snadnou detekci rekombinantního proteinu během biotechnologické přípravy a purifíkace pomocí anti T7 protilátky a celkový protein má následující sekvenci (SEQ ID NO. 7):

MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSMKKCSE EFSTKLKDNH

AQLGIQGVTD ENAKKAILKA NAAGKDKGVE ELEKLSGSLE SLSKAAKEML 101 ANSVKKKCSE DFTKKLEGEH AQLGIEQVTD ENAKKAILIT DAAKDKGAAE 151 LEKLFKAVEN LAKAAKEMLA NSVKKKCSET FTNKLKEKHT DLGKEGVTDA 201 DAKEAILKTQ GTKTKGAEEL GKLFESVEVL SKAAKEMLAN SVKKKCSEEF 251 TAKLKGEHTD LGKEGVTDDN AKKAILKTNN DKTKGADELE KLFESVKQLS 301 KAAKEMLTNS VKKDCSEKFT TKLKDSHAEL GIQSVQDDNA KKAILKTHGT 351 KDKGAKELEE LFKSLESLSK AAQAALTNSV KKKCSEEFTN KLKSGHADLG 401 KQDATDDHAK AAILKTHATT DKGAKEFKDL FESVEGLLKA AQVALTNSVK 451 ELTSPVVAES PKKN nebo v jiném výhodném provedení má chimérický polyepitopový rekombinantní antigen založený na OspC následující sekvenci (SEQ ID NO. 16).

MASMTGGQQM GRGSMKKCSE EFSTKLKDNH AQLGIQGVTD ENAKKAILKA

NAAGKDKGVE ELEKLSGSLE SLSKAAKEML ANSVKKKCSE DFTKKLEGEH 101 AQLGIEQVTD ENAKKAILIT DAAKDKGAAE LEKLFKAVEN LAKAAKEMLA 151 NSVKKKCSET FTNKLKEKHT DLGKEGVTDA DAKEAILKTQ GTKTKGAEEL 201 GKLFESVEVL SKAAKEMLAN SVKKKCSEEF TAKLKGEHTD LGKEGVTDDN 251 AKKAILKTNN DKTKGADELE KLFESVKQLS KAAKEMLTNS VKKDCSEKFT 301 TKLKDSHAEL GIQSVQDDNA KKAILKTHGT KDKGAKELEE LFKSLESLSK 351 AAQAALTNSV KKKCSEEFTN KLKSGHADLG KQDATDDHAK AAILKTHATT 401 DKGAKEFKDL FESVEGLLKA AQVALTNSVK ELTSPVVAES PKKN

Ve výhodném provedení jsou OspA antigeny vybrány ze skupiny borelií zahrnující: >X80257.1 - gi|258153: OspA-PBi B. garinii (SEQ ID NO. 8)

1	MKKYLLGIGL	ILALIACKQN	VSSLDEKNSV	SVDLPGEMKV	LVSKEKDKDG
51	KYSLMATVDK	LELKGTSDKS	NGSGTLEGEK	SDKSKAKLTI	SEDLSKTTFE
101	IFKEDGKTLV	SKKVNSKDKS	SIEEKFNAKG	ELSEKTILRA	NGTRLEYTEI
151	KSDGTGKAKE	VLKDFALEGT	LAADKTTLKV	TEGTVVLSKH	IPNSGEITVE
201	LNDSNSTQAT	KKTGKWDSNT	STLTISVNSK	KTKNIVFTKE	DTITVQKYDS
251	AGTNLEGNAV	EIKTLDELKN	ALK

>S48322 - gi|258151: OspA-PKo B. afzelii (SEQ ID NO. 9)

1	MKKYLLGIGL	ILALIACKQN	VSSLDEKNSA	SVDLPGEMKV	LVSKEKDKDG
51	KYSLKATVDK	IELKGTSDKD	NGSGVLEGTK	DDKSKAKLTI	ADDLSKTTFE
101	LFKEDGKTLV	SRKVSSKDKT	STDEMFNEKG	ELSAKTMTRE	NGTKLEYTEM
151	KSDGTGKAKE	VLKNFTLEGK	VANDKVTLEV	KEGTVTLSKE	IAKSGEVTVA
201	LNDTNTTQAT	KKTGAWDSKT	STLTISVNSK	KTTQLVFTKQ	DTITVQKYDS
251	AGTNLEGTAV	EIKTLDELKN	ALK

>X80251 - gi|984067: OspA-PHeiR. burgdorferi (SEQ ID NO. 10)

1	MKKYLLGIGL	ILALIACKQN	VSSLDEKNSV	SVDLPGGMKV	LVSKEKDKDG
51	KYSLMATVEK	LELKGTSDKN	NGSGTLEGEK	TDKSKVKLTI	AEDLSKTTFE
101	IFKEDGKTLV	SKKVTLKDKS	STEEKFNEKG	EISEKTIVRA	NGTRLEYTDI
151	KSDKTGKAKE	VLKDFTLEGT	LAADGKTTLK	VTEGTVTLSK	NISKSGEITV
201	ALDDTDSSGN	KKSGTWDSGT	STLTISKNRT	KTKQLVFTKE	DTITVQNYDS

251 AGTNLEGKAV EITTLKELKN ALK >X80252 - gi|984085:OspA-TN, N34, VS307, G25 B. garinii, PWudll B. burgdorferi (SEQ

ID NO. 11)

1	MKKYLLGIGL	ILALIACKQN	VSSLDEKNSV	SVDLPGGMTV	LVSKEKDKDG
51	KYSLEATVDK	LELKGTSDKN	NGSGTLEGEK	TDKSKVKLTI	ADDLSQTKFE
101	IFKEDGKTLV	SKKVTLKDKS	STEEKFNEKG	ETSEKTIVRA	NGTRLEYTDI
151	KSDGSGKAKE	VLKDFTLEGT	LAADGKTTLK	VTEGTVVLSK	NILKSGEITV
201	ALDDSDTTQA	TKKTGKWDSK	TSTLTISVNS	QKTKNLVFTK	EDTITVQKYD
251	SAGTNLEGKA	VEITTLKELK	DALK

>X80182 - gi|984069: OspA-PKa B. burgdorferi (SEQ ID NO. 12)

MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGEMKV LVSKEKNKDG

KYDLIATVDK LELKGTSDKN NGSGVLEGVK ADKSKVKLTI SDDLGQTTLE

101 VFKEDGKTLV SKKVTSKDKS STEEKFNEKG EVSEKIITRA DGTRLEYTGI

151 KSDGSGKAKE VLKGYVLEGT LTAEKTTLVV KEGTVTLSKN ISKSGEVSVE

201 LNDTDSSAAT KKTAAWNSGT STLTITVNSK KTKDLVFTKE NTITVQQYDS

251 NGTKLEGSAV EITKLDEIKN ALK >X80256 - gi|984079: OspA-PBr B. garinii (SEQ ID NO. 13)

MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGGMKV LVSKEKDKDG

KYSLMATVEK LELKGTSDKS NGSGVLEGEK ADKSKAKLTI SQDLNQTTFE

101 IFKEDGKTLV SRKVNSKDKS STEEKFNDKG KLSEKVVTRA NGTRLEYTEI

151 KNDGSGKAKE VLKGFALEGT LTDGGETKLT VTEGTVTLSK NISKSGEITV

201 ALNDTETTPA DKKTGEWKSD TSTLTISKNS QKPKQLVFTK ENTITVQNYN

251 RAGNALEGSP AEIKDLAELK AALK >X80254 - gi|984081: OspA-T25 B. garinii (SEQ ID NO. 14)

MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGEMKV LVSKEKDKDG

KYSLEATVDK LELKGTSDKN NGSGVLEGVK AAKSKAKLTI ADDLSQTKFE

101 IFKEDGKTLV SKKVTLKDKS STEEKFNDKG KLSEKVVTRA NGTRLEYTEI

151 QNDGSGKAKE VLKSLTLEGT LTADGETKLT VEAGTVTLSK NISESGEITV

201 ELKDTETTPA DKKSGTWDSK TSTLTISKNS QKTKQLVFTK ENTITVQKYN

251 TAGTKLEGSP AEIKDLEALK AALK

Ze zvolených OspA antigenů byly vybrány oblasti odpovídající C terminální soudkovité oblasti tvořené β14 až β21 listy jednotlivých výše uvedených OspA viz následující tabulka a C' terminální a helix OspA proteinu. Chimérický OspA polyepitop neobsahuje sekvence, které byly v dřívějších studiích identifikovány jako potenciálně zkříženě autoreaktivní s lidským LFA-1 proteinem (oblast aminokyselin 165-173).

Označení v databázi GeneBank	Oblast sekvence v aminokyselinách	Zařazení OspA antigenů podle skupiny
X80257.1 -gi|258153	178-258	B. garinii PBi
S48322 - gi|258151	178-258	B. afzelii PKo
X80251 -gi|984067	179-258	B. burgdorferi PHei
X80252 - gi 984085	178-259	B. garinii TN, N34, VS307, G25 B. burgdorferi PWudll
X80182 - gi|984069	179-258	B. burgdorferi PKa
X80256 - gi 984079	179-259	B. garinii PBr
X80254 - gi|984081	179-259	B. garinii T25

Ve výhodném provedení má chimérický rekombinantní fúzní protein založený na OspA antigenech připojeny na Ν' konci tři peptidové úseky: 1) hexa His kotva (His tag) umožňující purifikaci proteinu pomocí Ni-NTA afinitní chromatografie a přípravu metalochelatačních proteoliposomů, 2) štěpné místo pro thrombin umožňující odstranit His tag kotvu z rekombinantního proteinu pro imunodetekční ELISA aplikace stanovující hladiny antigenem navozených specifických protilátek u imunizovaných jedinců, 3) T7 epitop umožňující snadnou detekci rekombinantního proteinu během biotechnologické přípravy a purifikace pomocí anti T7 protilátky následující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO. 15)

MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSLKVTEG TVVLSKHIPN

SGEITVELND SNSTQATKKT GKWDSNTSTL TISVNSKKTK NIVFTKEDTI 101 TVQKYDSAGT NLEGNLEVKE GTVTLSKEIA KSGEVTVALN DTNTTQATKK 151 TGAWDSKTST LTISVNSKKT TQLVFTKQDT ITVQKYDSAG TNLEGTLKVT 201 EGTVTLSKNI SKSGEITVAL DDTDSSGNKK SGTWDSGTST LTISKNRTKT 251 KQLVFTKEDT ITVQNYDSAG TNLEGKTLKV TEGTVVLSKN ILKSGEITVA

301 LDDSDTTQAT KKTGKWDSKT STLTISVNSQ KTKNLVFTKE DTITVQKYDS

351 AGTNLEGKLV VKEGTVTLSK NISKSGEVSV ELNDTDSSAA TKKTAAWNSG

401 TSTLTITVNS KKTKDLVFTK ENTITVQQYD SNGTKLEGSL TVTEGTVTLS

451 KNISKSGEIT VALNDTETTP ADKKTGEWKS DTSTLTISKN SQKPKQLVFT

501 KENTITVQNY NRAGNALEGS LTVEAGTVTL SKNISESGEI TVELKDTETT

551 PADKKSGTWD SKTSTLTISK NSQKTKQLVF TKENTITVQK YNTAGTKLEG

601 SAVEITKLDE IKNALKKDLE ALKAALK nebo v jiném výhodném provedení má chimérický rekombinantní fúzní protein založený na OspA antigenech následující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO. 17)

MASMTGGQQM GRGSLKVTEG TVVLSKHIPN SGEITVELND SNSTQATKKT

GKWDSNTSTL TISVNSKKTK NIVFTKEDTI TVQKYDSAGT NLEGNLEVKE 101 GTVTLSKEIA KSGEVTVALN DTNTTQATKK TGAWDSKTST LTISVNSKKT 151 TQLVFTKQDT ITVQKYDSAG TNLEGTLKVT EGTVTLSKNI SKSGEITVAL 201 DDTDSSGNKK SGTWDSGTST LTISKNRTKT KQLVFTKEDT ITVQNYDSAG 251 TNLEGKTLKV TEGTVVLSKN ILKSGEITVA LDDSDTTQAT KKTGKWDSKT 301 STLTISVNSQ KTKNLVFTKE DTITVQKYDS AGTNLEGKLV VKEGTVTLSK 351 NISKSGEVSV ELNDTDSSAA TKKTAAWNSG TSTLTITVNS KKTKDLVFTK 401 ENTITVQQYD SNGTKLEGSL TVTEGTVTLS KNISKSGEIT VALNDTETTP 451 ADKKTGEWKS DTSTLTISKN SQKPKQLVFT KENTITVQNY NRAGNALEGS 501 LTVEAGTVTL SKNISESGEI TVELKDTETT PADKKSGTWD SKTSTLTISK 551 NSQKTKQLVF TKENTITVQK YNTAGTKLEG SAVEITKLDE IKNALKKDLE 601 ALKAALK

Přehled vyobrazení

Obr. 1 Trojrozměrný prediktivní model struktury chimérického OspA polyepitopu (polyOspA) podle příkladu 1. Predikce byla provedena pomocí programu Phyre 2.

Obr. 2 Výsledky purifikace rekombinantního chimérického OspA polyepitopu (polyOspA) podle příkladu 1 pomocí afinitní chromatografie s Ni-NTA agarosou. Bakterie exprimující polyOspA byly lyžovány za nativních podmínek a lyzát byl nanesen na Ni-NTA kolonu a poté byla kolona postupně promývána pufrem s rostoucí koncentrací imidazolu. Jednotlivé promývací frakce (Promytí 1-10 mM imidazol, Promytí 2-30 mM imidazol, Promytí 3-40 mM imidazol, Promytí 4 - 60 mM imidazol, Promytí 5 - 80 mM imidazol) a eluění frakce, provedené pufrem s koncentrací imidazolu 250 mM tvořené 3 objemy kolony (Eluce 1 až Eluce 6) byly naneseny na 10% SDS-PAGE, rozděleny v elektrickém poli. Gel byl poté barven pomocí Coomassie Brilliant Blue.

Obr. 3 Trojrozměrný prediktivní model struktury chimérického OspC polyepitopu (polyOspC) podle příkladu 2. Predikce byla provedena pomocí programu Phyre 2.

Obr. 4 Výsledky purifikace rekombinantního chimérického OspC (polyOspC) polyepitopu podle příkladu 2 pomocí afmitní chromatografie s Ni-NTA agarosou. Bakterie exprimující polyOspC byly lyžovány za nativních podmínek a lyzát byl nanesen na Ni-NTA kolonu a poté byla kolona postupně promývána pufrem s rostoucí koncentrací imidazolu. Jednotlivé promývací frakce jsou označeny použitou koncentrací imidazolu 10 mM - až 80 mM imid a eluční frakce, provedené pufrem s koncentrací imidazolu 250 mM tvořené 1.5 objemu kolony (Eluce 1 až Eluce 10) byly naneseny na 10% SDS-PAGE, rozděleny v elektrickém poli. Gel byl poté barven pomocí Coomassie Brilliant Blue.

Obr. 5 Distribuce velikostí OspA polyepitopu (polyOspA) (Příklad 3).

Velikost polyOspA (200pg/ml v PBS) byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla na přístroji ZetaSizer ZS (Malvem, UK).

Obr. 6 Graf teplotní stability antigenů polyOspA (Příklad 3).

Teplotní stabilita polyOspA (200pg/ml v PBS) byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla na přístroji ZetaSizer ZS (Malvem, UK).

Obr. 7 Distribuce velikostí OspC polyepitopu (polyOspC) (Příklad 3).

Velikost polyOspC (200pg/ml v PBS) byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla na přístroji ZetaSizer ZS (Malvem, UK).

Obr. 8 Graf teplotní stability antigenů polyOspC (Příklad 3).

Teplotní stabilita polyOspC (200pg/ml v PBS) byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla na přístroji ZetaSizer ZS (Malvern, UK)

Obr. 9 Vliv polohy His tag-u na C- a N- konci na termální denaturaci antigenů polyOspC (Příklad 3). Charakteristiky byly získány pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (koncentrace proteinů 1 mg/ml v PBS). A) polyOspC His tag na N-konci; B) polyOspC His tag na C-konci.

Obr. 10 Charakteristika termálního přechodu antigenů polyOspA (Příklad 3). Charakteristika byly získány pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (koncentrace proteinu 1 mg/ml v PBS). PolyOspA His tag na N-konci.

Obr. 11 Schéma struktury liposomální vakcinační částice na bázi metalochelatačních nanoliposomů s molekulárním adjuvans (Příklad 4). Vlevo je výsek povrchu liposomu z nějž vystupuje do středu obrázku DOGS-NTA (pro vazbu antigenů na povrch liposomu) a v dolní části obrázku lipofilní nepyrogenní derivát muramyl dipeptidu (norAbuMDP) jako adjuvans.

Vpravo nahoře rekombinantní protein s kotvou 6 histidinů, které se prostřednictvím komplexů niklu (Ni) na metalochelatačním lipidu DOGS-NTA nekovalentně navazují na povrch liposomu.

Obr. 12 Průkaz vazby rekombinantního antigenu na metalochelatační liposomy pomocí změny distribuce velikosti liposomů po vazbě polyepitopového antigenu (polyOspC) (Příklad 4). Změna distribuce velikosti byla měřena pomocí přístroje ZetaSizer ZS (Malvem, UK). Vložený obrázek z TEM ukazuje liposom bez navázaného proteinu (A) a molekuly polyOspC vázány na povrch liposomu (bíle šipky) a průkaz proteinu pomocí imunoznačení nanočásticemi zlata (černé šipky) (B).

Obr. 13 Výsledky stanovení hladiny sérových protilátek myší imunizovaných polyepitopem polyOspA a polyOspC (Příklad 5). Reaktivita protilátek byla stanovena pomocí ELISA. Na dno ELISA panelu byl navázán rekombinantní polyOspA (horní řada panelů) nebo polyOspC (dolní řada panelů). Myší séra byla naředěna identicky a poté nanesena do jednotlivých jamek. Vazba sérové protilátky specificky reagující s OspA nebo OspC byla prokázána sekundární protilátkou proti celkovému myšímu IgG, nebo IgGl, nebo IgG2a značenou peroxidázou a poté barevnou reakcí s orthofenylendiaminem. Rekombinantní polyepitopy polyOspA a polyOspC použité k imunizaci mají N-terminální His tag.

A. polyOspC nebo polyOspA

B. polyOspC nebo polyOspA (adjuvans: Alum)

C. polyOspC nebo polyOspA (adjuvans: Montanid - PET GEL A)

D. polyOspC nebo polyOspA (adjuvans: metalochelatační liposomy s molekulárním adjuvans MT06)

E. polyOspC nebo polyOspA (adjuvans: metalochelatační liposomy s molekulárním adjuvans MT06)

Obr. 14 Reakce sér myší imunizovaných polyOspC s divokými OspC proteiny izolovanými z různých druhů borelií (Příklad 5). Séra myší imunizovaných rekombinantními OspC proteiny s N terminálně připojenou His kotvou byla testována s diagnostickými stripy (Anti-Borrelia EUROLINE-RN-AT (IgM) obsahujícími políčka s OspC všech tří patogenních kmenů - B. garinii, B. burgdorferi, B. afzelii. A - sérum myši imunizované chimérickým polyepitopem OspC (polyOspC), B - sérum myši imunizované rekombinantním OspC z B. burgdorferi B31, C - kontrola - sérum myši vakcinované rekombinantním HIS značeným antigenem z Candida albicans hps90.

A - chimérický OspC polyepitop (polyOspC)

B - OspC z B. burgdorferi B31

C - kontrolní sérum (negativní)

Obr. 15 Stanovení protilátkové odpovědi psů proti OspA B. afzelii (A), B. garinii (B) a B. burgdorferi (C) po aplikaci chimérického rekombinantního antigenů polyOspA v kombinaci s různými adjuvans.

Experimentální vakcíny byly podány i.d. a s.c., protilátková odpověď byla sledována v průběhu 83 dnů. Molekulární adjuvans MT03 v kombinaci s PET GEL A bylo podáno ve formě micel.

Obr. 16: Stanovení protilátkové odpovědi psů proti OspC B. afzelii (A), B. garinii (B) a B. burgdorferi (C) po aplikaci chimérického rekombinantního antigenů polyOspC v kombinaci s různými adjuvans.

Experimentální vakcíny byly podány i.d. a s.c., protilátková odpověď byla sledována v průběhu 83 dnů.

Obr. 17 Indukce specifické protilátkové odpovědi psů proti rekombinantnímu Ferritinu II formulovanému s různými adjuvans.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Příprava antigenů: OspA polyepitop

Polyepitop OspA je připraven rekombinantní technologií z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii náležejících do skupin PHei, PKa, (Borrelia burgdorferi s.s.), PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 (Borrelia garinii) a PKo (Borrelia afzelii), charakteristických svou invazivitou a tedy schopností vyvolat systémové infekce. V databázi GenBank jsou OspA proteiny, jejichž fragmenty byly složeny do vakcinačního OspA polyepitopu, uvedeny pod následujícím označením s aminokyselinovou sekvencí:

X80257.1 - gi|258153: OspA-PBi B. garinii (SEQ ID NO. 8)

1	MKKYLLGIGL	ILALIACKQN	VSSLDEKNSV	SVDLPGEMKV	LVSKEKDKDG
51	KYSLMATVDK	LELKGTSDKS	NGSGTLEGEK	SDKSKAKLTI	SEDLSKTTFE
101	IFKEDGKTLV	SKKVNSKDKS	SIEEKFNAKG	ELSEKTILRA	NGTRLEYTEI
151	KSDGTGKAKE	VLKDFALEGT	LAADKTTLKV	TEGTVVLSKH	IPNSGEITVE
201	LNDSNSTQAT	KKTGKWDSNT	STLTISVNSK	KTKNIVFTKE	DTITVQKYDS

251 AGTNLEGNAV EIKTLDELKN ALK

S48322 - gi|258151: OspA-PKo B. qfzelii (SEQ ID NO. 9)

MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSA SVDLPGEMKV LVSKEKDKDG

KYSLKATVDK IELKGTSDKD NGSGVLEGTK DDKSKAKLTI ADDLSKTTFE

101 LFKEDGKTLV SRKVSSKDKT STDEMFNEKG ELSAKTMTRE NGTKLEYTEM

151 KSDGTGKAKE VLKNFTLEGK VANDKVTLEV KEGTVTLSKE IAKSGEVTVA

201 LNDTNTTQAT KKTGAWDSKT STLTISVNSK KTTQLVFTKQ DTITVQKYDS

251 AGTNLEGTAV EIKTLDELKN ALK

X80251 - gi|984067: OspA-PHei B. burgdorferi (SEQ ID NO. 10)

MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGGMKV LVSKEKDKDG

KYSLMATVEK LELKGTSDKN NGSGTLEGEK TDKSKVKLTI AEDLSKTTFE

101 IFKEDGKTLV SKKVTLKDKS STEEKFNEKG EISEKTIVRA NGTRLEYTDI

151 KSDKTGKAKE VLKDFTLEGT LAADGKTTLK VTEGTVTLSK NISKSGEITV

201 ALDDTDSSGN KKSGTWDSGT STLTISKNRT KTKQLVFTKE DTITVQNYDS

251 AGTNLEGKAV EITTLKELKN ALK

X80252 - gi|984085:OspA-TN, N34, VS307, G25 B. garinii, PWudll B. burgdorferi (SEQ

ID NO. 11)

1	MKKYLLGIGL	ILALIACKQN	VSSLDEKNSV	SVDLPGGMTV	LVSKEKDKDG
51	KYSLEATVDK	LELKGTSDKN	NGSGTLEGEK	TDKSKVKLTI	ADDLSQTKFE
101	IFKEDGKTLV	SKKVTLKDKS	STEEKFNEKG	ETSEKTIVRA	NGTRLEYTDI
151	KSDGSGKAKE	VLKDFTLEGT	LAADGKTTLK	VTEGTVVLSK	NILKSGEITV
201	ALDDSDTTQA	TKKTGKWDSK	TSTLTISVNS	QKTKNLVFTK	EDTITVQKYD
251	SAGTNLEGKA	VEITTLKELK	DALK

X80182 - gi|984069: OspA-PKa B. burgdorferi (SEQ ID NO. 12)

1	MKKYLLGIGL	ILALIACKQN	VSSLDEKNSV	SVDLPGEMKV	LVSKEKNKDG
51	KYDLIATVDK	LELKGTSDKN	NGSGVLEGVK	ADKSKVKLTI	SDDLGQTTLE
101	VFKEDGKTLV	SKKVTSKDKS	STEEKFNEKG	EVSEKIITRA	DGTRLEYTGI
151	KSDGSGKAKE	VLKGYVLEGT	LTAEKTTLVV	KEGTVTLSKN	ISKSGEVSVE
201	LNDTDSSAAT	KKTAAWNSGT	STLTITVNSK	KTKDLVFTKE	NTITVQQYDS

251 NGTKLEGSAV EITKLDEIKN ALK

X80256 - gi|984079: OspA-PBr B. garinii (SEQ ID NO. 13)

MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGGMKV LVSKEKDKDG

KYSLMATVEK LELKGTSDKS NGSGVLEGEK ADKSKAKLTI SQDLNQTTFE

101 IFKEDGKTLV SRKVNSKDKS STEEKFNDKG KLSEKVVTRA NGTRLEYTEI

151 KNDGSGKAKE VLKGFALEGT LTDGGETKLT VTEGTVTLSK NISKSGEITV

201 ALNDTETTPA DKKTGEWKSD TSTLTISKNS QKPKQLVFTK ENTITVQNYN

251 RAGNALEGSP AEIKDLAELK AALK

X80254 - gi|984081: OspA-T25 B. garinii (SEQ ID NO. 14)

MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGEMKV LVSKEKDKDG

KYSLEATVDK LELKGTSDKN NGSGVLEGVK AAKSKAKLTI ADDLSQTKFE

101 IFKEDGKTLV SKKVTLKDKS STEEKFNDKG KLSEKVVTRA NGTRLEYTEI

151 QNDGSGKAKE VLKSLTLEGT LTADGETKLT VEAGTVTLSK NISESGEITV

201 ELKDTETTPA DKKSGTWDSK TSTLTISKNS QKTKQLVFTK ENTITVQKYN

251 TAGTKLEGSP AEIKDLEALK AALK

Pro konstrukci polyepitopu OspA byly použity úseky odpovídající C terminální soudkovité oblasti tvořené β14 až β21 listy jednotlivých výše uvedených OspA proteinů viz následující tabulka. Polyepitop je ukončen C' terminálním a helixem. Chimérický OspA polyepitop neobsahuje sekvence, které byly v dřívějších studiích identifikovány jako potenciálně zkříženě autoreaktivní s lidským LFA-1 proteinem (oblast aminokyselin 165-173). OspA polyepitop dále obsahuje na Ν' konci tři peptidové úseky: 1) hexa His kotvu (His tag) umožňující purifikaci proteinu pomocí Ni-NTA afmitní chromatografie a přípravu metalochelatačních proteoliposomů, 2) štěpné místo pro thrombin umožňující odstranit His tag kotvu z rekombinantního proteinu pro imunodetekční ELISA aplikace stanovující hladiny antigenem navozených specifických protilátek u imunizovaných jedinců, 3) T7 epitop umožňující snadnou detekci rekombinantního proteinu během biotechnologické přípravy a purifikace pomocí anti T7 protilátky.

Označení v databázi GeneBank

Oblast sekvence v aminokyselinách

Zařazení OspA antigenu podle skupiny

X80257.1 - gi|258153	178-258	B. garinii PBi
S48322- gi 258151	178-258	B. afzelii PKo
X80251 -gi|984067	179-258	B. burgdorferi PHei
X80252 - gi|984085	178-259	B. garinii TN, N34, VS307, G25 B. burgdorferi PWudll
X80182 - gi|984069	179-258	B. burgdorferi PKa
X80256 - gi|984079	179-259	B. garinii PBr
X80254 - gi|984081	179-259	B. garinii T25

Výsledný polyepitop OspA má následující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO. 15):

1	MGSSHHHHHH	SSGLVPRGSH	MASMTGGQQM	GRGSLKVTEG	TVVLSKHIPN
51	SGEITVELND	SNSTQATKKT	GKWDSNTSTL	TISVNSKKTK	NIVFTKEDTI
101	TVQKYDSAGT	NLEGNLEVKE	GTVTLSKEIA	KSGEVTVALN	DTNTTQATKK
151	TGAWDSKTST	LTISVNSKKT	TQLVFTKQDT	ITVQKYDSAG	TNLEGTLKVT
201	EGTVTLSKNI	SKSGEITVAL	DDTDSSGNKK	SGTWDSGTST	LTISKNRTKT
251	KQLVFTKEDT	ITVQNYDSAG	TNLEGKTLKV	TEGTVVLSKN	ILKSGEITVA
301	LDDSDTTQAT	KKTGKWDSKT	STLTISVNSQ	KTKNLVFTKE	DTITVQKYDS
351	AGTNLEGKLV	VKEGTVTLSK	NISKSGEVSV	ELNDTDSSAA	TKKTAAWNSG
401	TSTLTITVNS	KKTKDLVFTK	ENTITVQQYD	SNGTKLEGSL	TVTEGTVTLS
451	KNISKSGEIT	VALNDTETTP	ADKKTGEWKS	DTSTLTISKN	SQKPKQLVFT
501	KENTITVQNY	NRAGNALEGS	LTVEAGTVTL	SKNISESGEI	TVELKDTETT
551	PADKKSGTWD	SKTSTLTISK	NSQKTKQLVF	TKENTITVQK	YNTAGTKLEG
601	SAVEITKLDE	IKNALKKDLE	ALKAALK

Trojrozměrný prediktivní model struktury tohoto chimérického OspA polyepitopu je na Obr. 1. Fúzní chimérický rekombinantní protein (polyOspA), složený z imunodominantních oblastí OspA proteinů popsaných u klinicky nej významnějších kmenů Borelií, fúzovaný na Ν' konci s His tag kotvou pro metaloafmitní purifikaci. Genový konstrukt pro polyOspA byl vložen do plasmidu pET28 umožňujícím indukovanou expresi genu v bakteriálním systému po přídavku isopropyl-3-D-thiogalaktosidu. Protein byl exprimován v bakteriálním kmeni E. coli BL21 (DE3) a purifikován z bakteriálního lyzátu pomocí metaloafmitní chromatografie za nativních podmínek s využitím vazby His tágu na Ni-NTA agarosu. K promytí kolony a eluci cílového proteinu byly použity pufry obsahující imidazol jako kompetitor afmitní vazby.

Výstup purifikace OspA polyepitopu pomocí afmitní chromatografie s Ni-NTA agarosou je na Obr. 2.

Příklad 2: Příprava antigenů: OspC polyepitop

Polyepitop OspC je připraven rekombinantní technologií z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii náležejících do skupin A, B, I a Kb (Borrelia burgdorferi s. s.), Pbi (Borrelia garinii) a PKo, (Borrelia afzelii), charakteristických svou invazivitou a tedy schopností vyvolat systémové infekce. V databázi GenBank jsou OspC proteiny, jejichž fragmenty byly složeny do vakcinačního OspC polyepitopu, uvedeny pod následujícím označením s aminokyselinovou sekvencí:

NP_047005 - gi| 11497007: OspC skupina A (B31MI) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 1)

1	MKKNTLSAIL MTLFLFISCN NSGKDGNTSA NSADESVKGP NLTEISKKIT
51	DSNAVLLAVK EVEALLSSID EIAAKAIGKK IHQNNGLDTE NNHNGSLLAG
101	AYAISTLIKQ KLDGLKNEGL KEKIDAAKKC SETFTNKLKE KHTDLGKEGV
151	TDADAKEAIL KTNGTKTKGA EELGKLFESV EVLSKAAKEM LANSVKELTS
201	PVVAESPKKP

EF053525 - gi| 117574163: OspC skupina B (LDP73) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 2)

1	NNSGKDGNTS ANSADESVKG PNLTEISKKI TDSNAVLLAV KEVEALLSSI
51	DELAKAIGKK IKNDGSLDNE ANRNESLLAG AYTISTLITQ KLSKLNGSEG
101	LKEKIAAAKK CSEEFSTKLK DNHAQLGIQG VTDENAKKAI LKANAAGKDK
151	GVEELEKLSG SLESLSKAAK EMLANSVKEL TSPVVAESPK KP

AF467874 - gi|23507072: OspC skupina I (B331) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 3)

1	MKKNTLSAIL MTLFLFISCN NSGKDGNTSA NSADESVKGP NLTEISKKIT
51	ESNAVVLAVK EVETLLTSID ELAKAIGKKI KNDVSLDNEA DHNGSLISGA
101	YLISTLITKK ISAIKDSGEL KAEIEKAKKC SEEFTAKLKG EHTDLGKEGV
151	TDDNAKKAIL KTNNDKTKGA DELEKLFESV KNLSKAAKEM LTNSVKELTS
201	PVVAESPKKP

EF053517 - gi| 117574147: OspC skupina K (LDP74) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 4)

101

151

NNSGKDGNTS

DELATKAIGK

KLKEKIENAK

GAAELEKLFK

ANSADESVKG

KIQQNGGLAV

KCSEDFTKKL

AVENLAKAAK

PNLTEISKKI

EAGHNGTLLA

EGEHAQLGIE

EMLANSVKEL

TESNAVVLAV

GAYTISKLIT

NVTDENAKKA

TSPIVAESPK

KEIETLLASI

QKLDGLKNSE

ILITDAAKDK

KP

YP_063261 - gi|51038597: OspC skupina PBi B. garinii (SEQ ID NO. 5)

1	MKKNTLSAIL	MTLFLFISCN	NSGGDSASTN	PDESAKGPNL	TVISKKITDS
51	NAFLLAVKEV	EALLSSIDEL	SKAIGKKIKN	DGTLDNEANR	NESLIAGAYE
101	ISKLITQKLS	VLNSEELKEK	IKEAKDCSEK	FTTKLKDSHA	ELGIQSVQDD
151	NAKKAILKTH	GTKDKGAKEL	EELFKSLESL	SKAAQAALTN	SVKELTNPVV
201	ΆΕΤΡΚΚΡ

YP709265 - gi| 111074118: OspC skupina PKo B. afzelii (SEQ ID NO. 6)

1	MKKNTLSAIL	MTLFLFISCN	NSGKGGDSAS	TNPADESAKG	PNLTEISKKI
51	TDSNAFVLAV	KEVETLVLSI	DELAKKAIGQ	KIDNNNGLAA	LNNQNGSLLA
101	GAYAISTLIT	EKLSKLKNLE	ELKTEIAKAK	KCSEEFTNKL	KSGHADLGKQ
151	DATDDHAKAA	ILKTHATTDK	GAKEFKDLFE	SVEGLLKAAQ	VALTNSVKEL
201	TSPVVAESPK	KP

Pro konstrukci polyepitopu OspC byly použity úseky odpovídající a3-L5-a4-L6-a5 úsekům jednotlivých OspC proteinů, viz následující tabulka. Polyepitop je ukončen C' terminálním úsekem odvozeným z OspC PKo. Protein dále obsahuje na Ν' konci tři peptidové úseky: 1) hexa His kotvu (His tag) umožňující purifíkaci proteinu pomocí Ni-NTA afinitní chromatografie a přípravu metalochelatačních proteoliposomů, 2) štěpné místo pro thrombin umožňující odstranit His tag kotvu z rekombinantního proteinu pro imunodetekční ELISA aplikace stanovující hladiny antigenem navozených specifických protilátek u imunizovaných jedinců, 3) T7 epitop umožňující snadnou detekci rekombinantního proteinu během biotechnologické přípravy a purifikace pomocí anti T7 protilátky.

Označení v databázi GeneBank	Vybraný sekvenční úsek - pořadí aminokyselin	Zařazení OspC antigenu podle skupiny
NP_047005 - gi| 11497007	128-196	B. burgdorferi skupina A (B31MI)

EF053525 - gi|l 17574163	109-178	B. burgdorferiskwpina B (LDP73)
AF467874 - gi|23507072	128-196	B. burgdorferi skupina I (B331)
EF053517 - gi|l 17574147	110-178	B. burgdorferi skupina K (LDP74)
YP_063261 - gi|51038597	125-193	B. garinii skupina PBi
YP_709265- gi|l 11074118	130-211	B. afzelii skupina Pko

Výsledný polyepitop OspC má následující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO. 7):

1	MGSSHHHHHH	SSGLVPRGSH	MASMTGGQQM	GRGSMKKCSE	EFSTKLKDNH
51	AQLGIQGVTD	ENAKKAILKA	NAAGKDKGVE	ELEKLSGSLE	SLSKAAKEML
101	ANSVKKKCSE	DFTKKLEGEH	AQLGIEQVTD	ENAKKAILIT	DAAKDKGAAE
151	LEKLFKAVEN	LAKAAKEMLA	NSVKKKCSET	FTNKLKEKHT	DLGKEGVTDA
201	DAKEAILKTQ	GTKTKGAEEL	GKLFESVEVL	SKAAKEMLAN	SVKKKCSEEF
251	TAKLKGEHTD	LGKEGVTDDN	AKKAILKTNN	DKTKGADELE	KLFESVKQLS
301	KAAKEMLTNS	VKKDCSEKFT	TKLKDSHAEL	GIQSVQDDNA	KKAILKTHGT
351	KDKGAKELEE	LFKSLESLSK	AAQAALTNSV	KKKCSEEFTN	KLKSGHADLG
401	KQDATDDHAK	AAILKTHATT	DKGAKEFKDL	FESVEGLLKA	AQVALTNSVK
451	ELTSPVVAES	PKKN

3-D prediktivní model struktury tohoto chimérického OspC polyepitopu je na Obr. 3. Fúzní chimérický rekombinantní protein (polyOspC), složený z imunodominantních oblastí OspC proteinů popsaných u klinicky nej významnějších kmenů Borelií, fúzovaný na Ν' konci s His tag kotvou pro metaloafmitní purifikaci. Genový konstrukt pro polyOspC byl vložen doplasmidu pET28 umožňujícím indukovanou expresi genu v bakteriálním systému po přídavku isopropyl-[3-D-thiogalaktosidu. Protein byl exprimován v bakteriálním kmeni E. coli BL21 (DE3) a purifikován z bakteriálního lyzátu pomocí metaloafmitní chromatografie za nativních podmínek s využitím vazby His tágu na Ni-NTA agarosu. K promytí kolony a eluci cílového proteinu byly použity pufry obsahující imidazol jako kompetitor afinitní vazby. Výstup purifikace OspC polyepitopu pomocí afinitní chromatografie s Ni-NTA agarosou je na Obr. 4.

Příklad 3: Charakterizace antigenů

Velikost antigenu a teplotní stabilita

Hydrodynamický poloměr a teplotní stabilita antigenu byla hodnocena metodou dynamického rozptylu světla (DLS).(ZetaSizer ZS, Malvem). Teplotní gradient byl zvolen v rozmezí 10 až 60 °C, rychlost gradientu 0,5 °C/ min. Hydrodynamický průměr u antigenu polyOspA byl určen 5,3 nm, u antigenu polyOspC 6,1 nm. Výpočet byl proveden v modu maximálního počtu částic.

Obr. 5 a 6 ukazují distribuci velikostí, resp. teplotní stabilitu polyOspA . Obr. 7 a 8 ukazují distribuci velikostí, resp. teplotní stabilitu polyOspC.

Termální přechody a vliv polohy His tágu na C- a N- konci na termální denaturaci antigenu polyOspC včetně termodynamických parametrů termálního přechodu jsou zobrazeny na Obr.

9. Charakteristiky byly získány pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (NanoDSC II, TA Instruments, USA) (koncentrace proteinů 1 mg/ml v PBS). A) polyOspC His tag na Nkonci; B) polyOspC His tag na C-konci. Poloha His tag na N-konci zvyšuje teplotní stabilitu o přibližně 2 °C oproti C-terminálnímu umístění. polyOspA byl připraven s His tag na N-konci a jeho termální stabilita je vyšší než u polyOspA (Obr. 10).

Příklad 4: Liposomální formulace rekombinantních vakcín

Liposomální preparáty byly připraveny smícháním antigenů polyOspA nebo polyOspC (20 ug/dávka) s liposomy (0,3 mg lipidu/dávka). Jako komponenty pro tvorbu liposomů byly použity následující lipidy od firmy Avanti Polar Lipids (USA): Vaječný fosfatidyl cholin (EPC) (71 mol. %), palmitoyl-oleoyl fosfatidyl glycerol (POPG) (19 mol. %) a syntetický metalochelatační lipid DOGS-NTA-Ni (l,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-[(N-(5-amino1-carboxypentyl)iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt)) (pro vazbu antigenu na povrch liposomů; 5 mol. %). Všechny lipidy byly pořízeny od firmy Avanti Polar Lipids, USA. Liposomy byly připraveny metodou hydratace lipidního filmu s následnou extruzí přes polykarbonátové filtry o velikosti pórů 200 nm (Millipore). Jako molekulární adjuvans inkorporované do liposomů byly použity monofosforyl lipid A (MPLA) nebo lipofilní derivát norAbuMDP (MT03) (struktura a chemický název je v příloze 1) v dávce 5 mol. %. Toto molekulární množství odpovídá 32,6 pg MPLA nebo 21,4 pg MT03 na vakcinační dávku.

Charakterizace liposomů

Kvalita liposomálních preparátů byla hodnocena metodami DLS (ZeteSizer ZS, Malvern) a TEM (EM Philips 208 S, Morgagni software, FEI, Brno, ČR). Povrch liposomů byl modifikován antigenem. Antigen se navázal pomocí His tag kotvy na metalochelatační lipid obsažený v liposomů.

Obr. 11 schematicky znázorňuje strukturu liposomální vakcinační částice. Obr. 12 znázorňuje změřené změny distribuce velikosti (metodou DLS), které jednoznačně potvrzují vazbu antigenu na metalochelatační lipid v liposomů - střední velikost metalochelatačních nanoliposomů je 48 nm, o navázání OspC polyepitopu se změní na 67 nm. Metoda TEM ukázala jednoznačně metalochelatační vazbu antigenů na liposom (vložený snímek na Obr.

13).

Příklad 5. Imunizace myší

Myši byly imunizovány rekombinantním OspA polyepitopem (panel OspA) nebo rekombinantním OspC polyepitopem (panel OspC) dvěma dávkami aplikovanými i.d. v intervalu 14 dní dle níže uvedených schémat.

A) bez adjuvans a liposomů polyOspA (20 pg/dávka) nebo polyOspC protein volný (20 pg/dávka)

B) ALUXID

Preparáty byly připraveny smícháním antigenu polyOspA nebo polyOspC (50 pg/dávka) a ALUXIDU (25 obj. % finálního objemu aplikované dávky).

C) PET GEL A

Preparáty byly připraveny přidáním antigenu polyOspA nebo polyOspC (50 pg/dávka) a PET GEL A (Seppic) (5 obj. % finálního objemu aplikované dávky).

D) liposomy MT03

Preparáty byly připraveny přidáním antigenu polyOspA nebo polyOspC (20 pg/dávka) k liposomům (0,3 mg lipidu/dávku) s obsahem MT03 (21,3 pg/dávku) a inkubovány nejméně 30 min při pokojové teplotě.

E) liposomy MPLA

Preparáty byly připraveny přidáním antigenu polyOspA nebo polyOspC (20 pg/dávka) k liposomům (0,3 mg lipidu na dávku) s obsahem MPLA (32,6 pg na dávku) a inkubovány 30 min při pokojové teplotě.

Jeden měsíc po druhé dávce byla odebrána séra a koncentrace OspA nebo OspC-specifických protilátek byly stanoveny pomocí ELISA, kde byly na dna jamek navázány rekombinantní proteiny v dávce 100 ng na jamku. Na ose jsou jednotlivé vakcinační preparáty označeny písmeny ve shodě s textem. V případě imunizace solubilním rekombinantním OspA polyepitopem prokázala ELISA jen prahovou antigenně specifickou reakci ve všech izotypech IgG i IgM (IgG viz Obr. 13, IgM neuvedeno). Imunizace rekombinantním solubilním OspC polyepitopem indukovala výraznější, byť stále velmi slabou imunitní protilátkovou odpověď. Naopak imunizace rekombinantními OspA a OspC polyepitopy ve formě metalochelatačních liposomů s jednotlivými adjuvans indukovala mnohem vyšší titry protilátek v jednotlivých izotypech IgG a IgM (pro IgM neuvedeno na obrázku). Klíčovým pozorováním je schopnost proteoliposomální formulace OspA i OspC polyepitopů s MT03 a MPLA adjuvans indukovat dominantní antigenně specifickou protilátkovou odpověď v izotypu IgG2a, který je u myší charakteristický schopností aktivovat klasickou dráhu komplementu a zprostředkovat opsonizační funkci, dva mechanismy, které v případě boreliových infekcí patří mezi hlavní obranné nástroje hostitele. Oproti tomu imunizace OspA a OspC proteoliposomy s hliníkovým adjuvans (Aluxid) a s GEL PET A indukovala převážně specifickou protilátkovou odpověď v izotypu IgGl, který zajišťuje neutralizční aktivitu protilátek, která v případě boreliových infekcí v protektivitě nedominuje.

Byla dokumentována (Obr. 14) schopnost chimérického OspC polyepitopů po imunizaci experimentálních myší indukovat protilátky, které reagují s OspC antigeny různých boreliových druhů: Borrelia. garinii, B. burgdorferi, B. afzelii (proužek A). Naopak imunizace myší rekombinantním OspC z B. burgdorferi indukovala pouze slabou odpověď protilátek, které nereagovaly se všemi testovanými OspC od hlavních druhů borelií (proužek B). Sérum neimunizované myši nereaguje s žádným OspC antigenem (proužek C).

Příprava micel adjuvans na bázi muramyl dipeptidu

Lipofilní analoga muramyldipeptidu (MDP) mají amfifilní charakter a proto jsou schopné se spontánně formovat do micel. Micelámí forma lipofilních analog MDP může být využita jako adjuvantní formulace pro přípravu rekombinantních vakcín buď samotná, nebo v kombinaci s dalšími látkami vykazujícími adjuvantní účinky.

Lipofilní derivát MDP se rozpustí v minimálním množství etanolu nebo DMSO a tento roztok je rychle zředěn vodou, roztokem vhodného pufru či fyziologickým roztokem.

Příklad složení roztoku micelámí formy MT03 o koncentraci Img MT03/ml :

Složka	Množství
MT03	1 mg
Ethanol (96%)	30pl
0,9% NaCl	970 pl

Takto připravený roztok se smíchá s roztokem antigenu nebo případně dalšího adjuvans (PET GEL, Alum) tak, aby finální koncentrace obou složek odpovídala požadované imunizační dávce.

Velikost micel MT03 je vyjádřena jako hydrodynamický průměr v nanometrech a činí 8-10 nm. Kritická micelámí koncentrace MT03 při 25°C byla stanovena na 100 pg/ml, při 37 °C na 30 pg/ml (metoda DLS).

Kombinace lipofilních derivátů MDP s dalšími adjuvantními látkami

Micelámí formy lipofilních derivátů MDP mohou být kombinovány s dalšími adjuvantními látkami, jako jsou například soli aluminia nebo PET GEL A. Tím je dosaženo synergického účinku obou adjuvancií.

Příprava formulace PET GEL A potencované micelámí formou MT03

Připraví se roztok micel MT03 tak, jak je uvedeno výše. Odděleně se naředí roztok PET GEL A tak, aby po smíchání s roztokem micel MT03 bylo dosaženo požadované koncentrace obou adjuvancií.

Takto připravený roztok se smíchá s roztokem antigenu tak, aby finální koncentrace nebo množství všech složek odpovídala požadované imunizační dávce. Molekulární adjuvans MT03 nepůsobí agregaci antigeny nebo částic PET GEL (měřeno pomocí DLS, data neuváděna)

Formulace GEL PET A potencované micelámí formou MT03:

Složka	Finální množství/dávka
MT03 GEL PET A 0,9% NaCl antigen polyOspA	40,2 pg 10% roztok objem doplněn do finálního objemu 0,1 nebo 1 ml 50 pg

Příklad 6: Sledování protilátkové odpovědi proti OspA u psů po imunizaci chimérickým proteinem polyOspA s adjuvantními přípravky Aluxid a PET GEL A, liposomální MT03 a PET GEL A + micelární MT03

Antigen: K imunizaci byl použit fuzní chimérický rekombinantní protein (polyOspA, polyOspA).

Zvířata

Do pokusu bylo zařazeno 20 psů ve věku 11-12 měsíců. Zvířata byla rozdělena do deseti skupin po dvou kusech. Jednotlivým zvířatům byl aplikován antigen nebo placebo s příslušným imunitním adjuvans ve třech dávkách v intervalu tří týdnů. Dávka antigenu (chimérický rekombinantní OspA protein - polyOspA, polyOspA) byla jednotně 50 pg v dávce. Vakcinační dávka byla 1,0 ml s.c. nebo 0,1 ml i.d. Placebo (= příslušné imunitní adjuvans) bylo zvířatům aplikováno subkutánně ve stejných časových intervalech a ve stejných dávkách (1,0 ml).

Adjuvancia:

Aluxid - Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant, Brenntag Biosector Denmark

PETGEL A-SEPPIC

MT03 liposomální

MT03 micelární + PET GEL A

Příprava liposomů

Liposomální preparáty (MT03 nebo MPLA) byly připraveny smícháním antigenů polyOspA (50 pg/dávka) s liposomy (0,82 mg lipidu/dávka). Jako komponenty pro tvorbu liposomů byly použity následující lipidy: EPC (71 mol. %), POPG (19 mol. %) a syntetický metalochelatační lipid DOGS-NTA-Ni (pro vazbu antigenu na povrch liposomů; 5 mol. %). Všechny lipidy byly pořízeny z Avanti Polar Lipids, USA. Liposomy byly připraveny metodou hydratace lipidního filmu s následnou extruzí přes polykarbonátové filtry o velikosti pórů 200 nm (Millipore). Jako molekulární adjuvans inkorporované do liposomů byly použity monofosforyl lipid A (MPLA) nebo lipofílní derivát norAbuMDP (MT03) v dávce 5 mol. %. Toto molekulární množství odpovídá 88 pg MPLA nebo 40 pg MT03 na vakcinační dávku.

V případě kontrolních skupin MT03 a MPLA byly použity pouze liposomy (0,82 mg/dávka) s obsahem 40 pg MT03 či 88 pg MPLA bez přídavku antigenů.

Příprava vakcinačních dávek:

polyOspA + Aluxid

Antigen - 50 pg

Aluxid - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.

polyOspA + PET GEL A

Antigen-50 pg

PET GEL A - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.

polyOspA + MT 03 liposomální

Antigen - 50 pg

Navázání antigenů na imunitní adjuvans bylo provedeno viz Příklad 4.

polyOspA + MT03 micelární + PET GEL A

Antigen - 50 pg

PET GEL A - 10% objemových

MT03 micelární - dle předpisu ( viz. Příklad 4))

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním

PLACEBO = Aluxid

Antigen - 0 pg

Aluxid -10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)

PLACEBO = PET GEL A

Antigen - 0 pg

PET GEL A - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)

PLACEBO = MT 03

Antigen - 0 pg

Příprava - VÚVeL

PLACEBO =MT03 micelární + PET GEL A

Antigen - 0 pg

PET GEL A + MT03 micelární - 10% objemových (dle předpisu viz. Příklad 4)

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)

Odběry krve

Krev byla všem zvířatům odebrána v den 0 (před primární vakcinací), v den 20 (před 1. revakcinací), v den 53 (před 2. revakcinací) a dále pak v intervalu přibližně jedenkrát za 4 týdny až do doby ukončení pokusu (minimálně 12 měsíců). Ze vzorků krve byla po koagulaci separována séra.

Sledování zvířat v průběhu pokusu:

Zvířata byla sledována denně, po dobu 14 dnů po každé aplikaci a byl hodnocen výskyt lokálních a celkových postvakcinačních reakcí.

Lokální, ani celkové postvakcinační reakce nebyly u žádného ze zvířat pozorovány.

Denně, 3 dny před každou aplikací, v den aplikace, 4 hodiny po aplikaci a dále pak po dobu 4 dnů po aplikaci byla všem zvířatům měřena tělesná teplota. V průběhu sledování nebyly naměřeny hodnoty tělesné teploty mimo fyziologické rozmezí.

Schéma experimentu:

Skupina	Číslo pořadové	Číslo evidenční	Pohlaví	Imunizace	Dávka antigenu	Adjuvans	Aplikace	Dávka
1	1	2404	d'	3 dávky (vakcinace + 2 revakcinace) v intervalu cca 21 dnů	50 pg	ALUXID	s.c.	1,0 ml
2	2431	?	50 pg	ALUXID	s.c.	1,0 ml
2	3	2412	a	50 pg	ALUXID	i.d.	0,1 ml
4	2406	?	50 pg	ALUXID	i.d.	0,1 ml
3	5	2418	d'	50 pg	PET GEL A	s.c.	1,0 ml
6	2413	?	50 pg	PET GEL A	s.c.	1,0 ml
4	7	2428	(d	50 pg	PET GEL A	i.d.	0,1 ml
8	2407	?	50 pg	PET GEL A	i.d.	0,1 ml
5	9	2424	d	50 pg	MT 03	s.c.	1,0 ml
10	2409	?	50 pg	MT 03	s.c.	1,0 ml
6	11	2405	cd	50 pg	MT 03	i.d.	0,1 ml
12	2419	?	50 pg	MT 03	i.d.	0,1 ml
7	13	2422	d'	50 pg	PET GEL A +MT03 Mlč	s.c.	1,0 ml
14	2414	?	50 pg	PET GEL A +MT03 Mlč	s.c.	1,0 ml
8	15	2429		50 pg	PET GEL A +MT03 MIC	i.d.	0,1 ml
16	2408	2	50 pg	PET GEL A +MT03 MIC	i.d.	0,1 ml

9	17	2417	d'		-	ALUXID	s.c.	1,0 ml
18	2415	?	-	PET GEL A	s.c.	1,0 ml
10	19	2427	c?	-	MT 03	s.c.	1,0 ml
20	2416	?	-	PET GEL A +MT03 MIC	s.c.	1,0 ml

Časový harmonogram:

Den —>

0

20

53

83

111

133

139

166

195

223

251

279

307

335

363

2

m

Datum —>

11.

ri

rr

rZ

τί

TT

iZ

sd

r-

00

OS

o

11.

iZ

•Z

so

so

OO n

rZ

o

Os n

sd n

oč

sd

tZ

Imunizace

+

+

+

Odběr krve

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Stanovenípostvakcinačních anti OspA protilátek v sérech psů metodou EL1SA

Antigeny použité pro potažení mikrotitrační destičky • Antigen rOspA B. afzelii

Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7010 (E coli BL21(DE3)/pDEST17).

• Antigen rOspA B. garinii

Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7019 (E. coli BL21(DE3)/pCRT7/NT).

• Antigen rOspA B. burgdorferi sensu stricto

Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7012 (E. coli BL21(DE3)/pDEST17).

Příprava antigenu pro potažení mikrotitrační destičky

Pro potažení mikrotitrační destičky byly použity rekombinantní OspA proteiny uvedené výše.

Kontrolní pozitivní séra

Kontrolní pozitivní séra byla připravena imunizací psů inaktivovanými kmeny B. afzelii, B. garinii a B. burgdorferi sensu stricto s Freundovým adjuvans. Kontrolní negativní sérum bylo připraveno z nevakcinovaného psa.

Vyhodnocení protilátkové odpovědi po imunizaci pokusných zvířat na základě dosažených hodnot OD450

Měření OD: OD se měří při vlnové délce 450 nm proti hodnotě BLANK.

Hodnocení: Pro hodnocení se použije průměrná hodnota OD450 replikátů testovaného vzorku.

Zkouška je hodnotitelná, je-li: CV replikátů < 15%

Vyšetření zahrnuje 4 po sobě jdoucí odběry

1) iniciální (před vakcinací)

2) 3 týdny po vakcinaci (před 1. revakcinací)

3) 53 dnů pol. revakcinací (před 2. revakcinací)

4) 4 týdny po 2 revakcinací

Hodnoty OD450 jsou v grafech srovnávány s hodnotami OD450 kontrolního pozitivního a kontrolního negativního séra.

Průběh imunitní odpovědi psů na různé experimentální formulace vakcín s antigenem polyOspA jsou na Obr. 15.

Závěr:

Všechna adjuvans byla schopna navodit produkci specifických protilátek. Z hlediska indukce protilátkové odpovědi proti OspA B. afzelii, OspA B. garinii a OspA B. burgdorferi sensu stricto po vakcinaci psů chimérickým OspA (polyOspA) proteinem se jako nej lepší imunitní adjuvans jeví PET GEL A a PET GEL A ve směsi s micelámím MT03.

Příklad 7: Sledování protilátkové odpovědi proti OspC u psů po imunizaci chimérickým proteinem polyOspC s adjuvantními přípravky Aluxid a PET GEL A a s liposomálními adjuvans MT03 a MPLA

Antigen: K imunizaci byl použit fúzní chimérický rekombinantní protein (polyOspC, polyOspC).

Zvířata

Do pokusu bylo zařazeno 20 psů ve věku 10-13 měsíců. Zvířata byla rozdělena do deseti skupin po dvou kusech. Jednotlivým zvířatům byl aplikován antigen nebo placebo s příslušným imunitním adjuvans ve třech dávkách v intervalu tří týdnů. Dávka antigenů (chimérický rekombinantní OspC protein - polyOspC, polyOspC) byla jednotně 50 pg v dávce. Vakcinační dávka byla 1,0 ml s.c. nebo 0,1 ml i.d. Placebo (= příslušné imunitní adjuvans) bylo zvířatům aplikováno subkutánně ve stejných časových intervalech a ve stejných dávkách (1,0 ml).

Adjuvancia:

Aluxid - Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant, Brenntag Biosector Denmark

PET GEL A - SEPPIC liposomální MT03 liposomální MPLA

Příprava liposomů

Liposomální preparáty (MT03 nebo MPLA) byly připraveny smícháním antigenů polyOspC (50 pg/dávka) s liposomy (0,82 mg lipidu/dávka) analogicky k Příkladu 6.

Příprava vakcinačních dávek:

polyOspC + Aluxid

Antigen - 50 pg

Aluxid - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.

polyOspC + PET GEL A

Antigen - 50 pg

PET GEL A - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.

polyOspC + liposomální MT 03

Antigen - 50 pg Liposomy - 0,82 mg

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Roztoky antigenů a liposomů byly smíchány a inkubovány při pokojové teplotě alespoň 30 minut.

polyOspC + liposomální MPLA

Antigen - 50 pg

Liposomy - 0,82 mg

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Roztoky antigenů a liposomů byly smíchány a inkubovány při pokojové teplotě alespoň 30 minut.

PLACEBO=Aluxid

Antigen - 0 pg

Aluxid - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)

PLACEBO=PET GEL A

Antigen - 0 pg

PET GEL A - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)

PLACEBO =MT 03

Antigen - 0 pg

PLACEBO =MPLA

Antigen - 0 pg

Odběry krve

Krev byla všem zvířatům odebrána v den 0 (před primární vakcinací), v den 21 (před 1. revakcinací), v den 42 (před 2. revakcinací) a dále pak v intervalu přibližně jedenkrát za 4 týdny až do doby ukončení pokusu (minimálně 12 měsíců). Ze vzorků krve byla po koagulaci separována séra.

Sledování zvířat v průběhu pokusu:

Zvířata byla sledována analogicky k Příkladu 6.

Schéma experimentu:

Skupina	Číslo pořadové	Číslo evidenční	Pohlaví	Imunizace	Dávka antigenu	Adjuvans	Aplikace	Dávka
1	1	2214	?	3 dávky (vakcinace + 2 revakcinace) v intervalu 21 dnů	50 pg	ALUXID	s.c.	1,0 ml
2	2267	<3	50 pg	ALUXID	s.c.	1,0 ml
2	3	2228	?	50 pg	ALUXID	i.d.	0,1 ml
4	2288	3	50 pg	ALUXID	i.d.	0,1 ml
3	5	2236	?	50 pg	PET GEL A	s.c.	1,0 ml
6	2303	?	50 pg	PET GEL A	s.c.	1,0 ml
4	7	2289	?	50 pg	PET GEL A	i.d.	0,1 ml
8	2247	3	50 pg	PET GEL A	i.d.	0,1 ml
5	9	2294	?	50 pg	MT 03	s.c.	1,0 ml
10	2304	?	50 pg	MT 03	s.c.	1,0 ml
6	11	2292	3	50 pg	MT 03	i.d.	0,1 ml
12	2215	?	50 pg	MT 03	i.d.	0,1 ml
7	13	2216	?	50 pg	MPLA	s.c.	1,0 ml
14	2305	?	50 pg	MPLA	s.c.	1,0 ml
8	15	2266	3	50 pg	MPLA	i.d.	0,1 ml

	16	2270	$		50 pg	MPLA	i.d.	0,1 ml
9	17	2123		-	ALUXID	s.c.	1,0 ml
18	2211		-	PET GEL A	s.c.	1,0 ml
10	19	2212		-	MT 03	s.c.	1,0 ml
20	2246		-	MPLA	s.c.	1,0 ml

Časový harmonogram:

Den		1	2	9	7	25	53	81	09	37	65	93	17	49	76
Datum	26.4.13	17.5.13	7.6.13	4.7.13	1.8.13	29.8.13	26.9.13	24.10.13	21.11.13	19.12.13	16.1.14	13.2.14	9.3.14	10.4.14	7.5.14
Imunizace	+	+	+
Odběr krve	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+

Stanovenípostvakcinačních anti OspC protilátek v sérech psů metodou ELISA

Antigeny použité pro potažení mikrotitrační destičky

Antigen rOspC B. afzelii

Antigen je rekombinantníprotein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7002 (E. coli BL21(DE3)/ pET28a).

Antigen rOspC B. garinii

Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7004 (E. coli BL21(DE3)/ pET28a).

Antigen rOspC B. burgdorferi sensu stricto

Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7003 (E coli BL21(DE3)/ pET28a).

Příprava antigenů pro potažení mikrotitrační destičky

Pro potažení mikrotitrační destičky byly použity rekombinantní rOspC proteiny uvedené výše.

Kontrolní pozitivní séra

Byla připravena imunizací psů inaktivovanými kmeny B. afzelii, B. garinii a B. burgdorferi sensu stricto s Freundovým adjuvans. Kontrolní negativní sérum bylo připraveno z nevakcinovaného psa.

Vyhodnocení protilátkové odpovědi po imunizaci pokusných zvířat na základě dosažených hodnot OD450

Měření OD: OD se měří při vlnové délce 450 nm proti hodnotě BLANK.

Hodnocení: Pro hodnocení se použije průměrná hodnota OD₄₅oreplikátůtestováného vzorku.

Zkouška je hodnotíte lná,je-li:CV replikátů< 15%

Vyšetření zahrnuje 4 po sobě jdoucí odběry

1) iniciální (před vakcinací)

2) 3 týdny po vakcinaci (před 1. revakcinací)

3) 3 týdny pol. revakcinací (před 2. revakcinací)

4) 4 týdny po 2 revakcinací

Hodnoty OD450 jsou v grafech srovnávány s hodnotami OD450 kontrolního pozitivního a kontrolního negativního séra.

Průběh imunitní odpovědi psů na různé experimentální formulace vakcín s antigenem polyOspA jsou na Obr. 16.

Závěr:

Vyhodnoceni antigenně specifické reakce protilátek indukovaných imunizací psů rekombinantním OspC polyepitopem sledovalo dva faktory: A) zkříženou reaktivitu psích hyperimunních sér s OspC antigeny z různých druhů borelií, B) schopnost konkrétního použitého adjuvans indukovat OspC-specifické sérové protilátky v jednotlivých izotypech IgG u psů. Jako příklad uvedena reakce jednotlivých izotypů psích IgG (po imunizaci OspC polyepeitopem s různými adjuvans) s OspC polyepitopem navázaným na dna jamek ELISA panelů a s purifikovaným rekombinantním OspC B. afzelii.

Všecha použitá testovaná adjuvans byla schopna navodit tvorbu specifických protilátek schopných rozeznat všechny tři typy OspC. Z hlediska indukce protilátkové odpovědi proti OspC B. afzelii, OspC B. garinii a OspC B. burgdorferi sensu stricto po vakcinaci psů chimérickým rekombinantním OspC proteinem (polyOspC) se jako nej lepší imunitní adjuvans jeví Aluxid (2% gel hydroxidu hlinitého).

Příklad 8 Protilátková odpověď proti rekombinantnímu antigenu rFerritin II. Sledování protilátkové odpovědi proti Ferritinu II u psů po aplikaci antigenu formulovaného s různými adjuvans

Antigem

Byl použit rekombinantní protein FERRITIN II.

Ferritin II je identifikovaný a charakterizovaný protein sekretovaný do plasmy klíštěte. Byly stanoveny nukleotidové sekvence genu Ferritinu II a byla určena jejich primární struktura. (Kopaček et al. 2003. Insect Biochemistry and Molecular Biology 33, 103-113) Ferritin II v těle klíštěte plní funkci protektivního proteinu, který váže a uchovává ionty železa uvolněné z hemoglobinu a zároveň výrazně eliminuje oxidativní stres způsobený vysokou koncentraci iontů železa. Ferritin je zodpovědný za eliminaci toxicity iontů železa přijatých z krve hostitele (Galay, et al.2014 PLOS ONE 9, e90661). Jestliže se podaří blokovat funkci Ferritinu, nebude schopno přisáté klíště parazitovat na hostiteli, protože dojde k jeho intoxikaci nehemově vázanými ionty železa. Zkrácením doby sání na hostiteli může dojít k zamezení přenosu klíšťaty přenášených patogenů (Hajdusek et al. 2010 Vaccine 28, 29932998). Blokování Ferritinu II lze provést reakcí se specifickou protilátkou za vzniku imunokomplexu. Specifické protilátky vzniknou v organismu po imunizaci antigenem.

Jako vhodný antigen pro imunizaci lze použít rekombinantní Ferritin II nebo jeho fragment připravený jak v prokaryotických (E. coli) tak eukaryotických (Pichia pastor is) expresních systémech.

Zvířata

Do pokusu bylo zařazeno 10 nevakcinovaných psů ve věku 3 - 4 měsíce. Zvířata byla rozdělena do 4 skupin po dvou nebo třech kusech. Jednotlivým zvířatům byl aplikován antigen s příslušným imunitním adjuvans ve třech dávkách v intervalu tří týdnů. Dávka antigenu (FERRITIN II) byla jednotně 50 pg v dávce. Vakcinační dávka byla 1,0 ml s.c.

Adjuvancia:

Aluxid - Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant, Brenntag Biosector Denmark PET GEL A - (SEPPIC) liposomální MT05 liposomální MT06

Příprava vakcinačních dávek’.

FERRITIN II + Aluxid

Antigen-50 pg

Aluxid - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.

FERRITIN II + PET GEL A

Antigen - 50 pg

PET GEL A - 10% objemových

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.

FERRITIN II + MT 05

Antigen - 50 pg liposomální MT05 - 0,88mg

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.

FERRITIN II + MT 06

Antigen - 50 pg liposomální MT06 - 0,88mg

Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 ml

Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním

Příprava liposomů

Liposomální preparáty (MT05 nebo MT06) byly připraveny smícháním antigenu FERRITIN II (20 pg/dávka) s liposomy (0,88 mg lipidu/dávka). Jako komponenty pro tvorbu liposomů byly použity následující lipidy: EPC (71 mol. %), POPG (19 mol. %) a syntetický metalochelatační lipid DOGS-NTA-Ni (pro vazbu antigenů na povrch liposomů; 5 mol. %). Všechny lipidy byly pořízeny z Avanti Polar Lipids, USA. Liposomy byly připraveny metodou hydratace lipidního filmu s následnou extruzí přes polykarbonátové filtry o velikosti pórů 200 nm (Millipore). Jako molekulární adjuvans inkorporované do liposomů byly použity lipofilní deriváty norAbuMDP (MT05 nebo MT06) v dávce 5 mol. %. Toto molekulární množství odpovídá 56,4 nmol látky na vakcinační dávku (odpovídá 50 pg MT05 nebo 65 pg MT06).

Antigen použitý pro potažení mikrotitrační destičky

Rekombinantní klíštěcí FERRITIN II (Parazitologický ústav BC AV České Budějovice)

Odběry krve

Krev byla všem zvířatům odebrána v den 0 (před primární vakcinací), v den 21 (před 1. revakcinací), v den 42 (před 2. revakcinací) a dále pak v intervalu přibližně jedenkrát za 4 týdny až do doby ukončení pokusu (minimálně 12 měsíců). Ze vzorků krve byla po koagulaci separována séra.

Sledování zvířat v průběhu pokusu

Zvířata byla sledována denně, po dobu 14 dnů po každé aplikaci a byl hodnocen výskyt lokálních a celkových postvakcinačních reakcí. Lokální, ani celkové postvakcinační reakce nebyly u žádného ze zvířat pozorovány. Denně, 3 dny před každou aplikací, v den aplikace, 4 hodiny po aplikaci a dále pak po dobu 4 dnů po aplikaci byla všem zvířatům měřena tělesná teplota. V průběhu sledování nebyly naměřeny hodnoty tělesné teploty mimo fyziologické rozmezí.

Schéma experimentu:

Skupí na	Číslo porado vé	Číslo evidenč ní	Pohlav i	Vakcinace 1,0 ml s.c.	Revakcinace 1,0 ml s.c.	2. revakcinace 1,0 ml s.c.
Dávka antige nu	Adjuv ans	Dávka antige nu	Adjuv ans	Dávka antige nu	Adjuv ans
1	1	2003	?	50 pg	Aluxid	50 pg	Aluxid	50 pg	Aluxid
2	2004	?	50 pg	Aluxid	50 pg	Aluxid	50 pg	Aluxid
2	3	2012	Z	50 pg	PET GEL A	50 pg	PET GEL A	50 pg	PET GEL A
4	2013	<3	50 pg	PET GEL A	50 pg	PET GEL A	50 pg	PET GEL A
3	5	2032	?	50 pg	MT05	50 pg	MT05	50 pg	MT05
6	2037	3	50 pg	MT05	50 pg	MT05	50 pg	MT05
7	2043	3	50 pg	MT05	50 pg	MT05	50 pg	MT05
4	8	2053	3	50 pg	MT06	50 pg	MT06	50 pg	MT06
9	2054	e	50 pg	MT06	50 pg	MT06	50 pg	MT06
10	2056	3	50 pg	MT06	50 pg	MT06	50 pg	MT06

Časový harmonogram:

Den	0	21	42	70	98	126	154	182	210	238	266	294	322	351	378
Datum	16.5.12	6.6.12	27.6.12	25.7.12	22.8.12	19.9.12	17.10.12	14.11.12	12.12.12	9.1.13	6.2.13	6.3.13	3.4.13	2.5.13	29.5.13
Imunizace	+	+	+
Odběr krve	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+

Stanovení postvakcinačních anti FERII protilátek v sérech psů metodou ELISA

Antigeny použité pro potažení mikrotitrační destičky

Rekombinantní FERRITIN II (Parazitologický ústav BC AV České Budějovice)

Rekombinantní protein se skladuje v zamraženém stavu při teplotě -80°C.

Substance

Kontrolní pozitivní sérum FERRITIN II

Kontrolní sérum negativní

Kontrolní pozitivní séra byla připravena imunizací psů rekombinantním FERII s Freundovým adjuvans. Kontrolní negativní sérum bylo připraveno z nevakcinovaného psa.

Postup ELISA

ELISA panely byly potaženy 100 μΐ rekombinantního FERRITINU II.

Hodnocení

Pro hodnocení se použije průměrná hodnota OD₄₅₀ replikátů testovaného vzorku.

Zkouška je hodnotitelná, je-li: CV replikátů <15%

Vyšetření zahrnuje 15 po sobě jdoucích odběrů

Hodnoty OD₄₅₀ jsou v grafech srovnávány s hodnotami OD₄₅₀ kontrolního pozitivního a kontrolního negativního séra.

Sledování protilátkové odpovědi psů proti FER II po subkutánní aplikaci je znázorněno na Obr. 17

Formulace rFerritinu II s různými adjuvans

FERRITIN II + Aluxid

FERRITIN II + PET GEL A

FERRITIN II + MT05

FERRITIN II + MT06

Závěr:

Použitá adjuvans jsou schopna navodit specifickou imunitní protilátkovou odpověď. Z hlediska indukce protilátkové odpovědi proti FER II po imunizaci psů se jako nej lepší imunitní adjuvans jeví Aluxid (2% gel hydroxidu hlinitého) a PET GEL A.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Chimérický polyepitopový rekombinantní antigen, vyznačený tím, že obsahuje dva až deset imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, PKa, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko, a orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B, I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borrelia garinii Pbi.
2. 2. Antigen podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje dva až deset, s výhodou sedm, imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující OspC orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B, I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borrelia garinii Pbi.
3. 3. Antigen podle nároku 2, vyznačený tím, že OspC sekvence jsou vybrány ze skupiny zahrnující:

   OspC-type B B. burgdorferi (SEQ ID NO. 18) KKCSEEFSTKLKDNHAQLGIQGVTDENAKKAILKANAAGKDKGVEELEKLSGSLESL SKAAKEMLANSVK

   OspC-type K B. burgdorferi (SEQ ID NO. 19) KKCSEDFTKKLEGEHAQLGIEQVTDENAKKAILITDAAKDKGAAELEKLFKAVENLA KAAKEMLANSVK

   OspC-type A B. burgdorferi (SEQ ID NO. 20) KKCSETFTNKLKEKHTDLGKEGVTDADAKEAILKTQGTKTKGAEELGKLFESVEVLS KAAKEMLANSVK

   OspC-type I B. burgdorferi (SEQ ID NO. 21) KKCSEEFTAKLKGEHTDLGKEGVTDDNAKKAILKTNNDKTKGADELEKLFESVKQL SKAAKEMLTNSVK

   OspC-PBi B. garinii (SEQ ID NO. 22)

   KDCSEKFTTKLKDSHAELGIQSVQDDNAKKAILKTHGTKDKGAKELEELFKSLESLS

   KAAQAALTNSVK

   OspC-Pko B. afzelii (SEQ ID NO. 23)

   KKCSEEFTNKLKSGHADLGKQDATDDHAKAAILKTHATTDKGAKEFKDLFESVEGL

   LKAAQVALTNSVK

   OspC C-terminální úsek (SEQ ID NO. 24)

   ELTSPVVAESPKKN
4. 4. Antigen podle nároku 2, vyznačený tím, že má sekvenci (SEQ ID NO. 7)

   1 MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSMKKCSE EFSTKLKDNH

   51 AQLGIQGVTD ENAKKAILKA NAAGKDKGVE ELEKLSGSLE SLSKAAKEML 101 ANSVKKKCSE DFTKKLEGEH AQLGIEQVTD ENAKKAILIT DAAKDKGAAE 151 LEKLFKAVEN LAKAAKEMLA NSVKKKCSET FTNKLKEKHT DLGKEGVTDA 201 DAKEAILKTQ GTKTKGAEEL GKLFESVEVL SKAAKEMLAN SVKKKCSEEF 251 TAKLKGEHTD LGKEGVTDDN AKKAILKTNN DKTKGADELE KLFESVKQLS 301 KAAKEMLTNS VKKDCSEKFT TKLKDSHAEL GIQSVQDDNA KKAILKTHGT 351 KDKGAKELEE LFKSLESLSK AAQAALTNSV KKKCSEEFTN KLKSGHADLG 401 KQDATDDHAK AAILKTHATT DKGAKEFKDL FESVEGLLKA AQVALTNSVK 451 ELTSPVVAES PKKN
5. 5. Antigen podle nároku 2, vyznačený tím, že má sekvenci (SEQ ID NO. 16)

   1 MASMTGGQQM GRGSMKKCSE EFSTKLKDNH AQLGIQGVTD ENAKKAILKA

   51 NAAGKDKGVE ELEKLSGSLE SLSKAAKEML ANSVKKKCSE DFTKKLEGEH

   101 AQLGIEQVTD ENAKKAILIT DAAKDKGAAE LEKLFKAVEN LAKAAKEMLA

   151 NSVKKKCSET FTNKLKEKHT DLGKEGVTDA DAKEAILKTQ GTKTKGAEEL

   201 GKLFESVEVL SKAAKEMLAN SVKKKCSEEF TAKLKGEHTD LGKEGVTDDN

   251 AKKAILKTNN DKTKGADELE KLFESVKQLS KAAKEMLTNS VKKDCSEKFT

   301 TKLKDSHAEL GIQSVQDDNA KKAILKTHGT KDKGAKELEE LFKSLESLSK

   351 AAQAALTNSV KKKCSEEFTN KLKSGHADLG KQDATDDHAK AAILKTHATT

   401 DKGAKEFKDL FESVEGLLKA AQVALTNSVK ELTSPVVAES PKKN
6. 6. Antigen podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje dva až deset, s výhodou osm, imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, PKa, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko.
7. 7. Antigen podle nároku 6, vyznačený tím, že OspA sekvence jsou vybrány ze skupiny zahrnující:

   OspA-PBi B. garinii (SEQ ID NO. 25) LKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNI VFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGN

   OspA-PKo B. afzelii (SEQ ID NO. 26) LEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQ LVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGT

   OspA-PHei B. burgdorferi (SEQ ID NO. 27) LKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLV FTKEDTITVQNYDSAGTNLEGK

   OspA-TN, N34, VS307, G25 B. garinii, PWudll B. burgdorferi (SEQ ID NO. 28) TLKVTEGTVVLSKNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKN LVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGK

   OspA-PKa B. burgdorferi (SEQ ID NO. 29)

   LVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKD LVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGS

   OspA-PBr B. garinii (SEQ ID NO. 30) LTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQL VFTKENTITVQNYNRAGNALEGS

   OspA-T25 B. garinii (SEQ ID NO. 31)

   LTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLV

   FTKENTITVQKYNTAGTKLEGS

   OspA C-terminální úsek (SEQ ID NO. 32)

   AVEITKLDEIKNALK
8. 8. Antigen podle nároku 6, vyznačený tím, že má sekvenci (SEQ ID NO. 15):

   1 MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSLKVTEG TVVLSKHIPN

   51 SGEITVELND SNSTQATKKT GKWDSNTSTL TISVNSKKTK NIVFTKEDTI 101 TVQKYDSAGT NLEGNLEVKE GTVTLSKEIA KSGEVTVALN DTNTTQATKK 151 TGAWDSKTST LTISVNSKKT TQLVFTKQDT ITVQKYDSAG TNLEGTLKVT 201 EGTVTLSKNI SKSGEITVAL DDTDSSGNKK SGTWDSGTST LTISKNRTKT 251 KQLVFTKEDT ITVQNYDSAG TNLEGKTLKV TEGTVVLSKN ILKSGEITVA 301 LDDSDTTQAT KKTGKWDSKT STLTISVNSQ KTKNLVFTKE DTITVQKYDS 351 AGTNLEGKLV VKEGTVTLSK NISKSGEVSV ELNDTDSSAA TKKTAAWNSG 401 TSTLTITVNS KKTKDLVFTK ENTITVQQYD SNGTKLEGSL TVTEGTVTLS 451 KNISKSGEIT VALNDTETTP ADKKTGEWKS DTSTLTISKN SQKPKQLVFT 501 KENTITVQNY NRAGNALEGS LTVEAGTVTL SKNISESGEI TVELKDTETT 551 PADKKSGTWD SKTSTLTISK NSQKTKQLVF TKENTITVQK YNTAGTKLEG 601 SAVEITKLDE IKNALKKDLE ALKAALK
9. 9. Antigen podle nároku 6, vyznačený tím, že má sekvenci (SEQ ID NO. 17):

   1 MASMTGGQQM GRGSLKVTEG TVVLSKHIPN SGEITVELND SNSTQATKKT

   51 GKWDSNTSTL TISVNSKKTK NIVFTKEDTI TVQKYDSAGT NLEGNLEVKE

   101 GTVTLSKEIA KSGEVTVALN DTNTTQATKK TGAWDSKTST LTISVNSKKT

   151 TQLVFTKQDT ITVQKYDSAG TNLEGTLKVT EGTVTLSKNI SKSGEITVAL

   201 DDTDSSGNKK SGTWDSGTST LTISKNRTKT KQLVFTKEDT ITVQNYDSAG

   251 TNLEGKTLKV TEGTVVLSKN ILKSGEITVA LDDSDTTQAT KKTGKWDSKT

   301 STLTISVNSQ KTKNLVFTKE DTITVQKYDS AGTNLEGKLV VKEGTVTLSK

   351 NISKSGEVSV ELNDTDSSAA TKKTAAWNSG TSTLTITVNS KKTKDLVFTK

   401 ENTITVQQYD SNGTKLEGSL TVTEGTVTLS KNISKSGEIT VALNDTETTP

   451 ADKKTGEWKS DTSTLTISKN SQKPKQLVFT KENTITVQNY NRAGNALEGS

   501 LTVEAGTVTL SKNISESGEI TVELKDTETT PADKKSGTWD SKTSTLTISK

   551 NSQKTKQLVF TKENTITVQK YNTAGTKLEG SAVEITKLDE IKNALKKDLE

   601 ALKAALK
10. 10. Vakcinační konstrukt, vyznačený tím, že obsahuje nano- nebo mikro-partikulámí nosič obsahující metalochelatačně vážící složku, chimérický polyepitopový rekombinantní antigen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 vázaný prostřednictvím metalochelatačně vážící složky, a dále jedno nebo více adjuvans a/nebo Ferritin II.
11. 11. Vakcína k léčbě a prevenci Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití, vyznačená tím, že obsahuje chimérický polyepitopový rekombinantní antigen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, a alespoň jedno adjuvans a/nebo Ferritin II.
12. 12. Vakcinační konstrukt podle nároku 10 nebo vakcína podle nároku 11, vyznačené tím, že adjuvans je vybrané ze skupiny zahrnující fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý, síran hlinitodraselný a molekulární adjuvans na bázi normuramylových glykopeptidů, adjuvans na bázi disperse částic připravených z biokompatibilních polymerů.
13. 13. Vakcína podle nároku 11 nebo 12, vyznačená tím, že obsahuje vakcinační konstrukt podle nároku 10.