CZ2013539A3 - Bifidobacterium longum CCM 7952 bacterium strain and use thereof in human nourishment - Google Patents
Bifidobacterium longum CCM 7952 bacterium strain and use thereof in human nourishment Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2013539A3 CZ2013539A3 CZ2013-539A CZ2013539A CZ2013539A3 CZ 2013539 A3 CZ2013539 A3 CZ 2013539A3 CZ 2013539 A CZ2013539 A CZ 2013539A CZ 2013539 A3 CZ2013539 A3 CZ 2013539A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- strain
- ccm
- composition
- pro
- bifidobacterium longum
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Průmyslový kmen bakterie Bifidobacterium longum uložený v České sbírce mikroorganismů, Tvrdého 14, .BETA.rno pod číslem CCM 7952 a prostředek obsahující tento kmen pro modulaci imunitní odpovědi. Prostředek může obsahovat i další probiotické kmeny, případně různá prebiotika, bílkoviny, vitamíny nebo minerální látky a může být ve formě kapsle, tablety nebo prášku nebo potraviny jako jsou mléčné výrobky, dresinky nebo nápoje. Výhodně je kmen obsažen v koncentraci vyšší než 10.sup.6.n.KTJ/g. Prostředek lze použít pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity a pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí alergické odpovědi na pyl.An industrial strain of Bifidobacterium longum deposited in the Czech Collection of Microorganisms, Hard 14, BETA.rno under CCM 7952 and a composition containing this strain for modulating the immune response. The composition may also contain other probiotic strains, possibly various prebiotics, proteins, vitamins or minerals, and may be in the form of a capsule, tablet or powder or food such as dairy products, dressings or beverages. Preferably, the strain is present in a concentration higher than 10.sup.6. The composition can be used to reduce the level of pro-inflammatory cytokines in preventing and / or treating undesirable pro-inflammatory activity and for preventing and / or treating an adverse allergic response to pollen.
Description
Kmen bakterie Bifidobacterium longum CCM 7952 a jeho využití v lidské výživěBifidobacterium longum strain CCM 7952 and its use in human nutrition
Oblast technikyTechnical field
Vynález se týká živých buněk kmene bakterie Bifidobacterium longum CCM 7952, který je zároveň prostředkem pro využití k přípravě protizánětlivých preparátů pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity. Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, jako prostředek pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí allergické odpovědí na pyl.The present invention relates to living cells of a strain of Bifidobacterium longum CCM 7952 which is also a means for use in the preparation of anti-inflammatory agents for reducing the level of pro-inflammatory cytokines in preventing and / or treating unwanted pro-inflammatory activity. The invention provides a live cell strain as a means for preventing and / or treating an undesirable allergic response to pollen.
Kmen Bifidobacterium longum CCM 7952 byl vyselektován ze souboru osmdesáti bifídobakteriálních izolátů ze stolice zdravých kojených dětí na základě příznivých imunomodulačních vlastností.The strain Bifidobacterium longum CCM 7952 was selected from a group of eighty bifidobacterial isolates from faeces of healthy breastfed babies on the basis of favorable immunomodulatory properties.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Je známa řada kmenů bakterií s probiotickými účinky používaná pro účely lidské výživy. Dostupné probiotické kmeny nebyly zpravidla testovány z hlediska schopnosti snižovat alergickou odpověď na různé druhy pylu. V klinické studii Ouwehand a kol.(2009) Ouwehand AC1, Nermes M, Collado MC, Rautonen N, Salminen S, Isolauri E. (2009) Specific probiotics alleviate allergic rhinitis during the birch pollen season. World J Gastroenterol. 15(26):3261-8. zjistili, že denní podávání dvou probiotických kmenů v určitém poměru (Lactobacillus acidophilus ATCC 700396 a Bifidobacterium lactis ATCC SD5219) snižuje zánětlivou odpověď nosní sliznice na březový pyl a zmírňuje příznaky jako je rýma a ucpaný nos zhruba o 20 %. Jelikož z řady studií je známo, že probiotické vlastnosti jsou kmenově specifické je účelem vynálezu získání kmene lidského původu schopného příznivě ovlivňovat immunitní odpověď organismu.A number of strains of bacteria with probiotic effects used for human nutrition are known. The available probiotic strains were generally not tested for their ability to reduce the allergic response to different types of pollen. In the clinical study Ouwehand et al (2009) Ouwehand AC 1 , Nermes M, Collado MC, Rautonen N, Salminen S, Isolauri E. (2009) Specific probiotics alleged allergic rhinitis during the birch pollen season. World J Gastroenterol. 15 (26): 3261-8. found that daily administration of two probiotic strains at a certain ratio (Lactobacillus acidophilus ATCC 700396 and Bifidobacterium lactis ATCC SD5219) reduced the inflammatory response of the nasal mucosa to birch pollen and alleviated symptoms such as runny nose and nasal congestion by approximately 20%. Since probiotic properties are known to be strain-specific from a number of studies, it is an object of the invention to provide a strain of human origin capable of favorably affecting the immune response of an organism.
»» « »· ···· * * ♦ · ♦ · w «··« ···· · * · ·· · • ······ · · · ····· • · · ♦ · ··»W w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w w ··
I κ t » · · ··· > · ·»I κ t »· · ···
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Výše uvedené nedostatky odstraňuje kmen bakterie Bifidobacterium longum CCM 7952, který byl vyselektován ze souboru osmdesáti bifidobakteriálních izolátů ze stolice zdravých kojených dětí na základě příznivých imunomodulačních vlastností a je uložený v České sbírce mikroorganismů, Tvrdého 14, Brno pod číslem CCM 7952 .The above-mentioned deficiencies are eliminated by the strain of the bacterium Bifidobacterium longum CCM 7952, which was selected from the group of eighty bifidobacterial isolates from stool of healthy breast-fed infants based on favorable immunomodulatory properties and is deposited in the Czech Collection of Microorganisms, Tvrdého 14, Brno.
V jiném provedení vynálezu je kmen obsažen v prostředku, který může obsahovat i další probiotické kmeny, případně různá prebiotika, bílkoviny, vitamíny nebo minerální látky. Kmen může být dodán ve formě kapsle, tablety nebo prášku nebo potraviny jako jsou mléčné výrobky, dresinky nebo nápoje. Kmen je obsažen v koncentraci vyšší než 106 KTJ/g. Vynález poskytuje kmen louhující kiiruií Bifidobacterium longum a jeho složky pro využití při přípravě protizánětlivých prostředků pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity.In another embodiment of the invention, the strain is included in the composition, which may contain other probiotic strains, optionally various prebiotics, proteins, vitamins or minerals. The strain can be supplied in the form of a capsule, tablet or powder or food such as dairy products, dressings or drinks. The strain is present at a concentration greater than 10 6 cfu / g. The invention provides a Bifidobacterium longum leaching strain and components thereof for use in the preparation of anti-inflammatory agents for reducing the level of pro-inflammatory cytokines in preventing and / or treating unwanted pro-inflammatory activity.
Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, pro modulaci imunitní odpovědi.The invention provides a strain in the form of viable cells for modulating an immune response.
Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí al/ergické odpovědí na pyl.The invention provides a strain in the form of viable cells for the prevention and / or treatment of undesirable α1 / ergic pollen responses.
Objasnění výkresůClarification of drawings
Vynález a jeho použití bude blíže osvětleno pomocí výkresů, kde na obr. 1 je identifikace bakteriálního kmene CCM 7952 metodou amplifikované ribozomální DNA restrikční analýzy (ARDRA). Dendrogram znázorňuje výsledky shlukové analýzy (UPGMA, unweighted pair method using arithmetic average) fragmentů DNA vzniklých štěpením PCR produktu (rodově specifická PCR podle Roy D, Sirois S. (2000) Molecular differentiation of Bifidobacterium species with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of the ldh gene FEMS Microbiol Lett. 191:17-24) restrikčními enzymy TEw/Hl, Ncil, SaulAI, Taqa\ (Šrůtková a kol., 2011| Efficiency of PCR-based methods in discriminating Bifidobacterium longum ssp. longum and Bifidobacterium longum ssp. infantis strains of human origin. J Microbiol Methods. 87(1): 10-β). Obr. 2 představuje vliv bakterie B. longum ssp. longum CC0M 7952, kdy byl sledován v modelu akutního zánětu střev indukovaném ·* ···· ·· *BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the identification of bacterial strain CCM 7952 by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). Dendrogram shows results of cluster analysis (UPGMA) of DNA fragments generated by PCR product cleavage (genus-specific PCR according to Roy D, Sirois S. (2000) Molecular differentiation of Bifidobacterium species with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of the ldh gene FEMS Microbiol Lett. 191: 17-24) with restriction enzymes TEw / HI, Ncil, SaulAI, Taq and \ (Šrůtková et al., 2011 | Efficiency of PCR-based methods in discriminating Bifidobacterium longum ssp. Bifidobacterium longum ssp. Infantis strains of human origin, J Microbiol Methods, 87 (1): 10-β). Giant. 2 shows the effect of the bacterium B. longum ssp. Longum CC0M 7952 when it was studied in a model of acute intestinal inflammation induced by · * ···· ·· *
9 9 · · · ···9 9 · · · ···
9 · · 9 9 9 9 999 · · 9 9 9 9 99
999*99 φ · 9 999 99999 * 99 φ · 9 999 99
9 9 9 9 999
9 99 9 9999 podáváním 2,5% dextransulfátu sodného u myší BALB/c. Bakterie CCM 7952 (skupina 2) nebo PBS (kontrolní skupina 1) byly podávány intragastricky po dobu 10 dnů. Následně byl vyvolán zánět střeva podáváním 2,5% dextransulfátu sodného (DSS) v pitné vodě po dobu 7 dnů. Poté byl pokus ukončen a byly sledovány níže popsané parametry zánětu střeva. Na obr.B je znázorněn účinek kmene CCM 7952 na vývoj experimentálního zánětu střeva 'Τ' 'Τ' indukovaného u myší podáváním 2,5 % roztoku dextran) sulfátu sodného. Skupina myší,9,999,9999 by administering 2.5% sodium dextran sulfate in BALB / c mice. CCM 7952 (Group 2) or PBS (Control Group 1) were administered intragastrically for 10 days. Subsequently, inflammation of the intestine was induced by administration of 2.5% sodium dextran sulfate (DSS) in drinking water for 7 days. The experiment was then terminated and the inflammatory bowel parameters described below were monitored. Figure B shows the effect of strain CCM 7952 on the development of experimental colon inflammation induced in mice by administration of a 2.5% sodium dextran sulfate solution. Group of mice,
VÍZ kterým byly aplikovány bakterie kmene CCM 7952, vykazovala v porovnání s kontrolní skupinou bez bakteriálního přídavku, signifikantně nižší váhový úbytek (parametr vývoje střevního zánětu). Obr. 4 představuje histologický snímek sliznice tlustého střeva (coIon descendens), barveno metodou hematoxilin-eosin. A- histologický snímek tlustého střeva zdravé myši, B - tlusté střevo kontrolní myši, které nebyla podávána bakterie CCM 7952, a u které byly vyvolány zánětlivé změny na sliznici podáváním DSS. C - tlusté střevo myši, která byla ochráněna podáváním bakterie CCM 7952 před zánětlivými změnami na sliznici způsobenými DSS. Obr. 5 je schéma situace k ochraně myší proti střevnímu zánětu podáváním bakterií kmene CCM 7952, kdy vzrůstá koncentrace ochranných protilátek IgA, které také přispívají ke snížení prozánětlivých hladin cytokinů TNF-alfa a IFN-gama v mezenteriálních lymfatických uzlinách. Obr. 6 představuje navození tolerance k březovému pylu bakterií B. longum CCM 7952 na úrovni specifických protilátek. Systémová senzibilizace hlavní složkou březového pylu Bet v 1 u myší, které byly neonatálně kolonizovány B. longum CCM 7952 a bezmikrobních kontrol. Osmitýdenní bezmikrobní myši a myši kolonizované od narození přirozeným přenosem z matky na mládě bakterií CCMThe VIS applied to bacteria of strain CCM 7952 showed a significantly lower weight loss (parameter of development of intestinal inflammation) compared to the control group without bacterial addition. Giant. 4 is a histological image of the colonic mucosa (colon descendens) stained with the hematoxilin-eosin method. A-colon histology of a healthy mouse, B-colon of a control mouse that was not given CCM 7952 and that developed mucosal inflammatory changes by DSS. C - colon of a mouse that was protected by CCM 7952 from DSS inflammatory mucosal changes. Giant. 5 is a schematic diagram of the situation to protect mice against intestinal inflammation by administering the strain CCM 7952 as the concentration of protective IgA antibodies also increases, which also contribute to the reduction of pro-inflammatory levels of the TNF-alpha and IFN-gamma cytokines in mesenteric lymph nodes. Giant. 6 shows the induction of birch pollen by B. longum CCM 7952 at specific antibody level. Systemic sensitization by the major component of birch pollen Bet v 1 in mice that were neonatally colonized with B. longum CCM 7952 and germ-free controls. Eight-week germ-free mice and mice colonized from birth by natural transmission from mother to chick CCM
7952 byly senzibilizovány (3 x s.c.) hlavní složkou březového pylu Bet v 1. Po skončení pokusu byly stanoveny protilátky charakterizující navození alergické senzibilizace (IgE, IgG2a, IgGl, IgA) v sérech a střevních výplaších myší metodou ELIS A. Výsledky byly vyjádřeny jako průměry ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01. Bylo potvrzeno, že neonatální kolonizace bakterií CCM 7952 ochránila myši před alergickou senzibilizací. Obr. 7 je navození tolerance k březovému pylu bakterií B. longum CCM 7952 na úrovni cytokinové odpovědi. Na konci pokusu byly slezinné buňky jak kontrolních bezmikrobních myší, tak myší neonatálně kolonizovaných bakterií CCM 7952 kultivovány (60 hod) s hlavní složkou březového pylu Bet v 1 a v supematantech pak byly stanoveny hladiny cytokinů IL-13 (A),7952 were sensitized (3 x sc) with the main component of birch pollen Bet v 1. Antibodies characterizing the induction of allergic sensitization (IgE, IgG2a, IgG1, IgA) in the sera and intestinal washes of mice by ELIS were determined after the experiment. Results were expressed as means ± SEM. * P <0.05, ** P <0.01. It was confirmed that neonatal colonization of CCM 7952 bacteria protected mice from allergic sensitization. Giant. 7 is the induction of birch pollen by B. longum CCM 7952 at the level of the cytokine response. At the end of the experiment, spleen cells of both control germ-free and neonatally colonized CCM 7952 bacteria were cultured (60 h) with the major component of birch pollen Bet 1 and the cytokine levels of IL-13 (A) were determined in supernatants.
IL-5 (B), IL-4 (C), IL-10 (D), IFN-γ (E), IL-17 (F) a TNF-α (G) metodou ELISA. Výsledky byly vyjádřeny jako průměry ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01. Bylo potvrzeno, že neonatální kolonizace bakterií CCM 7952 ochránila myši před alergickou senzibilizací.IL-5 (B), IL-4 (C), IL-10 (D), IFN-γ (E), IL-17 (F), and TNF-α (G) by ELISA. Results were expressed as means ± SEM. * P <0.05, ** P <0.01. It was confirmed that neonatal colonization of CCM 7952 bacteria protected mice from allergic sensitization.
Příklady uskutečnění vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Příklad 1Example 1
V jednom provedení vynálezu je kmen ve formě biologicky čisté kultury.In one embodiment, the strain is in the form of a biologically pure culture.
Příklad 2Example 2
V jiném provedení vynálezu je kmen obsažen v prostředku, který obsahuje i další probiotické kmeny, případně různá prebiotika, bílkoviny, vitamíny nebo minerální látky. Kmen může být dodán ve formě kapsle, tablety nebo prášku nebo potraviny jako jsou mléčné výrobky, dresinky nebo nápoje. Kmen je obsažen v koncentraci vyšší než 106 KTJ/g.In another embodiment of the invention, the strain is contained in a composition comprising other probiotic strains, optionally various prebiotics, proteins, vitamins or minerals. The strain can be supplied in the form of a capsule, tablet or powder or food such as dairy products, dressings or drinks. The strain is present at a concentration greater than 10 6 cfu / g.
Příklad 3Example 3
Vynález poskytuje kmen nebo prostředky obsahující kmen Bifidobacterium longum a jeho složky pro využití při přípravě protizánětlivých prostředků pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity.The invention provides a strain or compositions comprising a strain of Bifidobacterium longum and components thereof for use in the preparation of anti-inflammatory agents for reducing the level of pro-inflammatory cytokines in preventing and / or treating unwanted pro-inflammatory activity.
Příklad 4Example 4
Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, jako prostředek pro modulaci imunitní odpovědi.The invention provides a live cell strain as a means of modulating an immune response.
Příklad 5Example 5
Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, jako prostředek pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí alergické odpovědí na pyl.The invention provides the strain in the form of viable cells as a means for preventing and / or treating an undesirable allergic response to pollen.
Pracovní postup:Workflow:
1) Odběr vzorků1) Sampling
Jeden gram stolice kojených dětí byl rozmíchán v 9 ml PBS a desítkově ředěn na TPY agar s mupirocinem (100 mg/1) a kyselinou octovou (1 ml/1) a anaerobně kultivovány při 37 °C po dobu 72 hodin. Kolonie typického morfologického vzhledu byly odpíchnuty, přečištěny naOne gram of faeces of breast-fed infants was mixed in 9 ml PBS and decimally diluted in TPY agar with mupirocin (100 mg / L) and acetic acid (1 ml / L) and cultured anaerobically at 37 ° C for 72 hours. Colonies of typical morphological appearance were tapped, purified on
TPY agaru a následně kultivovány v TPY bujónu. Narostlé izoláty byly uloženy v TPY(MRS) bujónu s 20 % glycerolu a skladovány při -70 °C.TPY agar and subsequently cultured in TPY broth. The grown isolates were stored in TPY (MRS) broth with 20% glycerol and stored at -70 ° C.
2) Identifikace a typizace kmene2) Identification and typing of the strain
Příslušnost kmene krodu Bifidobacterium byla zjištěna reakcí enzymu fruktoso-6-fosfát ketolázy(Orban JI, Patterson JA (2000) Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of bifidobacteria. J Microbiol Methods. 40:221-4), molámím poměrem vzniklé kyseliny mléčné a octové zjištěným pomocí kapilární isotachoforézy (ZKL 01, Slovensko) a metodou FISH se sondou specifickou pro rod Bifidobacterium (Ribo technologies, Holandsko). Všechny tři testy potvrdily příslušnost kmene k rodu Bifidobacterium (positivní test F6FK, molámí poměr octové a kys.|nléčné 1,96).The affinity of the Bifidobacterium strain was determined by the reaction of the enzyme fructose-6-phosphate ketolase (Orban JI, Patterson JA (2000)), by the molar ratio of the lactic acid formed. and acetic acid detected by capillary isotachophoresis (ZKL 01, Slovakia) and by the FISH method with a probe specific for the genus Bifidobacterium (Ribo technologies, The Netherlands). All three tests confirmed that the strain belonged to the genus Bifidobacterium (F6FK positive test, molar acetic / lactic acid ratio 1.96).
Γ'Γ '
Test API 50CH (bioMérieux, Francie) byl použit pro druhovou identifikaci na základě fermentačních profilů sacharidů a cukerných alkoholů s následujícími výsledky:The API 50CH test (bioMérieux, France) was used for species identification based on the fermentation profiles of carbohydrates and sugar alcohols with the following results:
0 0 0 + + +:0.0 0 + + + + 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 +.+(+) + + + + +’: 0 +·......+ 009 +...... + 0 0 0 0: 0 0 0 o o0 0 0 + + +: 0.0 0 + + + + 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 +. + (+) + + + + + ': 0 + · ...... + 009 +. ..... + 0 0 0 0: 0 0 0 oo
Pro stanovení enzymatických aktivit byl použit test APIZYM (bioMérieux, Francie) s pozitivním výsledkem na aktivitu leucinarylamidázy, cystinarylamidázy, kyselé fosfatázy, naftol-AS-BI-fosfohydrolázy, alfa a beta galaktosidázy, alfa a beta glukosidázy, N-acetyl— beta-glukosaminidázy a alfa-mannosidázy.APIZYM assay (bioMérieux, France) with positive result for leucinarylamidase, cystinarylamidase, acid phosphatase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, alpha and beta galactosidase, alpha and beta glucosidase, N-acetyl-beta-glucosaminidase activity was used to determine enzymatic activities. and alpha-mannosidase.
Identifikace molekulárně biologickými metodami (rodově a druhově specifická PCR, rep- PCR, ARDRA) (obrj).Identification by molecular biological methods (genus- and species-specific PCR, rep-PCR, ARDRA) (fig).
ΛΛ
3) Možnost využít bakterii jako probiotikum je podmíněná jejím přežitím v prostředí gastrointestinálního traktu. Byla detekována schopnost přežití kyselého prostředí žaludku (pH 3) a žlučových kyselin.3) The possibility of using the bacteria as a probiotic is conditioned by its survival in the environment of the gastrointestinal tract. The ability to survive the acidic environment of the stomach (pH 3) and bile acids was detected.
Stanovení odolnosti vůči působení solí žlučových kyselin bylo prováděno na miskách s polotuhými médii obsahujícími různé koncentrace solí žlučových kyselin (0,3; 0,7 a 1^0 %, OXOID L55). Dosažené počty kolonie tvořících jednotek (cfu, colony forming units) na jednotlivých médiích se solemi žlučových kyselin byly porovnávány s počty na kontrolnímThe determination of resistance to bile salts was carried out on plates with semi-solid media containing different concentrations of bile salts (0.3, 0.7 and 10%, OXOID L55). The numbers of colony forming units (cfu) on the individual bile salt media were compared with those on the control
. _ ··· ······ · · £ · · · ·· · · · · ···· ·· ♦ ··· • ······ · · · · ···· • · · · · · · ·· · · · · ··· · X agaru (kultivace 72/96 hodin za stejných podmínek). Za výše uvedených podmínek přežilo 27|0, 1j2 a Op % buněk při koncentraci 0f3, 0(7 a l(0 % solí žlučových kyselin.. · £ £ £ £ £ £ £ £ · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · X agar (cultivation for 72/96 hours under the same conditions). Under the above conditions survived 27 | 0, 1j2 and OP% cells at f 0 3, 0 (7 Al (0% bile salts.
Stanovení odolnosti vůči působení nízkého pH bylo prováděno následujícím estovaný kmen byl kultivován do stacionární fáze růstu při 37 °C v MRSC bujónu s Oj 05 % (m/v) L-cystein hydrochloridu. Následně byly buňky odděleny odstředěním při 4000 g po dobu 15 minut. Supematant byl oddělen dekantací a buňky zality MRS bujónem s 0f05 °/o (m/v) L-cystein hydrochloridu a pH upraveným HC1 na hodnotu pH 3,0. Po rozmíchání byl vzorek naočkován pomocí desítkového ředění fyziologickým roztokem na MRS57 agar a stanoven počáteční počet cfu. Po inkubaci MRS pH 3 po dobu 3 hodin při teplotě 3^°C byly opět stanoveny počty cfu stejným způsobem. Procento přežívajících buněk bylo stanoveno dělením počtu cfu na MRS agaru v čase 3 a 0 hodin. Za výše uvedených podmínek přežilo Oj 2 % buněk.Determination of resistance to low pH was carried out as follows the tested strain was cultured to a stationary phase of growth at 37 ° C in MRSC broth with 0 05% (w / v) L-cysteine hydrochloride. Subsequently, the cells were collected by centrifugation at 4000 g for 15 minutes. The supernatant was separated by decantation and the cells were flooded with MRS broth with 0 ° F 0 O / m (v / v) L-cysteine hydrochloride and adjusted to pH 3.0 with HCl. After mixing, the sample was inoculated by decimal dilution with saline on MRS57 agar and the initial cfu count was determined. After incubating the MRS pH 3 for 3 hours at 3 ° C, the cfu counts were again determined in the same manner. The percentage of surviving cells was determined by dividing the number of cfu on MRS agar at 3 and 0 hours. Under the above conditions, 2% of the cells survived.
4) Možnost využití bakterie jako probiotika také závisí na jeho schopnosti adherence na střevní stěnu.4) The possibility of using bacteria as probiotics also depends on its ability to adherence to the intestinal wall.
4.1. Adherence kmenů bakterií mléčného kvašení4.1. Adherence of lactic acid bacteria strains
Na narostlou vrstvu eukaryontních buněk byla přidána suspenze zkoumaných probiotických prokaryontních buněk v podmínkách in vitro. Po aplikační době byly buňky opláchnuty a zhotoveny preparáty jednak pro optickou mikroskopii, jednak pro elektronovou mikroskopii. Všechny laboratorní úkony byly prováděny ve standardním řízeném režimu, pracoviště vlastní certifikáty norem ISO 2001.A suspension of probiotic prokaryotic cells under investigation in vitro was added to the grown layer of eukaryotic cells. After the application period, the cells were rinsed and preparations were prepared for both optical microscopy and electron microscopy. All laboratory operations were carried out in standard controlled mode, the workplace owns ISO 2001 standards.
4.2. Užité buňky λ/4.2. Used cells λ /
Modelo^vé buňky eukaryontního charakteru byly vybrány jako héíFoploidní buněčné linie epiteloidního charakteru a to zejména HeLa a Caco2.Eukaryotic model cells were selected as hello-phloloid epithelioid cell lines, in particular HeLa and Caco2.
4.3. Kultivační média4.3. Culture media
Eukaryontní buňky byly kultivovány v mediu MEM s obvyklými doplňky fetálního bovinního sera, antibiotiky a neesenciálními aminokyselinami. Kokultivace byla prováděna v MEM médiu doplněném fetálním bovinním sérem a L-glutaminem. Prokaryontní buňky byly kultivovány v LB, nebo MRSC médiu.Eukaryotic cells were cultured in MEM medium with the usual supplements of fetal bovine serum, antibiotics and non-essential amino acids. Co-cultivation was performed in MEM medium supplemented with fetal bovine serum and L-glutamine. Prokaryotic cells were cultured in LB or MRSC medium.
4.4. Podmínky kultivace4.4. Conditions of cultivation
Kultivace eukaryontních buněk byla standardní v atmosféře 5% CO2 při teplotě 37 °C. Pasážování bylo prováděno pomocí trypsinu. Buňky byly pravidelně kontrolovány mikroskopicky ve fázovém kontrastu. Kultivace prokaryontních buněk byla opět standardní a to ve zkumavkách při teplotě 37 °C. Pro aplikaci na vrstvu eukaryontů byla kultura v exponenciální fázi růstu.Cultivation of eukaryotic cells was standard in an atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C. Passaging was performed with trypsin. Cells were regularly checked microscopically in phase contrast. Cultivation of prokaryotic cells was again standard in tubes at 37 ° C. For application to the eukaryotic layer, the culture was in an exponential phase of growth.
4.5. Aplikace bakterií mléčného kvašení4.5. Application of lactic acid bacteria
Kmeny bakterií mléčného kvašení byly přidávány ke kultuře eukaryontních buněk a tato směs byla kultivována při 37 °C po dobu 24 hodin. Poté byla buněčná vrstva opláchnuta PBS, fixována a připravena k další preparaci.Lactic acid bacteria strains were added to the eukaryotic cell culture and this mixture was cultured at 37 ° C for 24 hours. The cell layer was then washed with PBS, fixed and ready for further preparation.
4.6. Preparace k mikroskopii4.6. Preparation for microscopy
Krycí skla s buněčnou vrstvou byla fixována, a to pro optickou mikroskopii v alkohol-octové fixáži a následně barvena v May-Griinwald / Giemza. Po vyschnutí byla skla preparována do kanadského balzámu a připravena pro vyhodnocení. Pro elektronovou mikroskopii byla buněčná vrstva na krycím skle fixována v glutaraldehydu a po odvodnění připravena na preparaci pro rastrovací elektronovou mikroskopii.Cell-lenses were fixed for optical microscopy in alcohol-acetic fixation and subsequently stained in May-Griinwald / Giemza. After drying, the glasses were prepared into a Canadian balsam and prepared for evaluation. For electron microscopy, the cell layer on the cover glass was fixed in glutaraldehyde and, after dewatering, prepared for preparation for scanning electron microscopy.
Adherence na eukaryontní linii Caco2 byla 26,4 %.The adherence to the eucaryotic line Caco2 was 26.4%.
5) Bezpečnost bakterie pro hostitele byla ověřena na modelu kolonizace bezmikrobních myší. Stabilita kolonizace (1O7 * * 10 CFU/ g stolice) byla potvrzena i u následných generací myší.5) The safety of the bacteria for the host was verified in a germ-free mouse colonization model. Colonization stability (10 7 * * 10 CFU / g faeces) was also confirmed in subsequent generations of mice.
6) Imunomodulační účinky bakterií kmene CCM 7952 byly testovány v podmínkách in vitro systému. Bakterie kmene CCM 7952 byly kultivovány s imunitními buňkami (slezinnými, dendritickými a liniovými makrofágy) a byla sledována schopnost kmene CCM 7952 stimulovat tvorbu protizánětlivých a zánětlivých cytokinů. Testováním na imunitních buňkách bylo zjištěno, že přídavek bakterií kmene CCM 7952 stimuluje produkci protizánětlivého cytokinů IL-10.6) Immunomodulatory effects of CCM 7952 were tested under in vitro system conditions. Bacteria of strain CCM 7952 were cultured with immune cells (spleen, dendritic and lineal macrophages) and the ability of strain CCM 7952 to stimulate the production of anti-inflammatory and inflammatory cytokines was studied. Testing on immune cells revealed that the addition of CCM 7952 bacteria stimulated the production of anti-inflammatory cytokines IL-10.
7) V následném kroku byl sledován účinek kmene CCM 7952 na vývoj experimentálního zánětu střeva indukovaného u myší podáváním roztoku dextran (sulfátu sodného. Zánětlivé parametry (pokles tělesné váhy, zkrácení délky tlustého střeva, krvácení z rekta, rektální prolapsy, změna konzistence stolice, změna morfologie střeva, produkce zánětlivých • · · · · · · • · · · · · · ·· · cytokinů) byly u zvířat, kterým byly podávány preventivně bakterie kmene CCM 7952 před vyvoláním experimentálního zánětu, výrazně nižší v porovnání s kontrolní skupinou.7) The effect of strain CCM 7952 on the development of experimental intestinal inflammation induced in mice by administration of dextran (sodium sulfate) solution was followed. Inflammatory parameters (weight loss, shortening of colon length, rectal bleeding, rectal prolapse, stool consistency change, change) intestinal morphology, inflammatory production (cytokines) were significantly lower in animals receiving preventive CCM 7952 bacteria prior to induction of experimental inflammation compared to the control group.
8) Nejvýraznější probiotický protektivní účinek kmene CCM 7952 byl prokázán v modelu alergie k březovému pylu. Bylo prokázáno, že bezmikrobní myši osazené neonatálně matkou bakteriemi kmene CCM 7952 byly ochráněny před vývojem alergické senzibilizace k hlavní složce březového pylu Bet v 1. Zatímco u bezmikrobních kontrol byla vyvolána alergická senzibilizace na úrovni tvorby protilátek (IgE, IgGl) a proalergických cytokinů (IL-4, IL-5, IL-13, IL-17), myši osazené bakteriemi kmene CCM 7952 byly bez příznaků alergické reakce a hladiny sledovaných parametrů byly výrazně snížené. Bylo zjištěno, že tato bakteriální kolonizace dokonce indukuje tvorbu regulačních Fox P3-pozitivních buněk.8) The most prominent probiotic protective effect of strain CCM 7952 was demonstrated in the birch pollen allergy model. It has been shown that germ-free mice with neonatal maternal CCM 7952 bacteria were protected from the development of allergic sensitization to the major component of birch pollen Bet v 1. Whereas germ-free controls induced allergic sensitization at the level of antibody production (IgE, IgG1) and proallergic cytokines (IL). (IL-5, IL-13, IL-17), mice with CCM 7952 strains were free from allergic reactions and the levels of endpoints were significantly reduced. This bacterial colonization was found to induce the formation of regulatory Fox P3-positive cells.
Základní výsledky studieBasic results of the study
tnb. 1tnb. 1
Tab. 1 Stanovení imunomodulačních vlastností deseti vybraných kmenů roduTab. 1 Determination of immunomodulatory properties of ten selected strains of the genus
Bifidobacterium (včetně kmene CCM 7952) v podmínkách in vitro. Bakterie vybraných kmenů byly inaktivovány 1% formaldehydem a poté kultivovány se slezinnými buňkami izolovanými ze zdravých (neovlivněných) myší a se slezinnými buňkami skupiny myší, u kterých bylo indukováno zánětlivé onemocnění tlustého střeva podáváním roztoku 2,5]% dextransulfátu sodného v pití po 48 hodinové kultivaci v kultivačních mediu při 37^C, ve vlhké atmosféře obohacené o 5% CO2. Poměr bakterií k imunitní buňce byl 10: 1.Bifidobacterium (including strain CCM 7952) under in vitro conditions. Bacteria of selected strains were inactivated with 1% formaldehyde and then cultured with spleen cells isolated from healthy (untreated) mice and with spleen cells from a group of mice that were induced inflammatory bowel disease by administering a 2.5]% sodium dextran sulfate solution for 48 hours. cultivation in culture media at 37 ° C, in a humidified atmosphere enriched with 5% CO 2 . The ratio of bacteria to immune cell was 10: 1.
(Amrouche a kol., 2006).(Amrouche et al., 2006).
V supematantu po kultivaci buněk byly metodou ELISA stanoveny hladiny cytokinů. Kmen CCM 7952 výrazně stimuloval tvorbu protizánětlivého cytokinů IL-10, zatímco produkce prozánětlivých cytokinů INF-γ, IL-6 a TNF-α slezinnými buňkami byla u kmene CCM 7952 výrazně nižší u obou skupin myší v porovnání s ostatními bakteriálními kmeny a pozitivní kontrolou (LPS ljjlg/ml). Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SEM, statistické z-x vyhodnocení jednotlivých hladin cytokinů bylo provedeno testem ANOVA v porovnání s cytokinovou produkcí nestimulovaných buněk (v tabulce uvedeno jako medium) *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 .Cytokine levels were determined in the supernatant after cell culture by ELISA. The strain CCM 7952 markedly stimulated the production of anti-inflammatory cytokines IL-10, while the production of proinflammatory cytokines INF-γ, IL-6 and TNF-α by spleen cells in CCM 7952 was significantly lower in both groups of mice compared to other bacterial strains and positive control ( LPS (1 µg / ml). Values are presented as mean ± SEM, statistical z-x evaluation of individual cytokine levels was performed by ANOVA compared to cytokine production of unstimulated cells (medium in the table) * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
- viz obr. 2 a obr. 3- see Fig. 2 and Fig. 3
Experimentální skupina Index stupně závažnosti oneinotněni Délka tlustého střevaExperimental group Index of severity severity Length of colon
Stupeň poškozeni slizniee (cm) (Cooper a spol. 1993)Degree of mucosal damage (cm) (Cooper et al 1993)
CCM ”9? 2CCM ”9? 2
Kontrola (PBS) l,24±0.29 1 Control (PBS) 1.24 ± 0.29 L
2,8” ±0,18 ”,86 ±0.12 ' 0-1 ”,39 ±0.18 3-42.8 ”± 0.18”, 86 ± 0.12 '0-1 ”, 39 ± 0.18 3-4
Obě skupiny myší pily po dobu 1 týdne 2,5]% roztok DSS. První skupina myší dostávala 10 dní před pitím roztoku a během sedmidenního pití DSS roztoku denně dávku 2x108 CFU v 0,2 ml pufrovaného fyziologického roztoku. Kontrolní myší dostávaly tento roztok bez přídavku bakterií.Both groups of mice saw a 2.5 µl DSS solution for 1 week. The first group of mice received a dose of 2x10 8 CFU in 0.2 ml of buffered saline 10 days before drinking the solution and during the seven-day drinking of the DSS solution daily. Control mice received this solution without the addition of bacteria.
Index stupně závažnosti onemocnění: pokles tělesné váhy myši (0 = žádný pokles váhy, 1 =Disease severity index: mouse body weight decrease (0 = no weight loss, 1 =
X >A,<X> A, <
1-5% úbytek váhy, 2 = 5r 10% úbytek, 3 body 10|20% úbytek), konzistence stolice (0 - pevná stolice, 2 = ztráta stolice v dolní části tlustého střeva, 4 = průj movitá stolice), krvácení z rekta a tlustého střeva (0 = bez krvácení z rekta a tlustého střeva, 2 = pozitivní reakce - hemokult, 4 = silné krvácení). Součet skóre jednotlivých parametrů u každé myši je podělen číslem 3 (počet sledovaných parametrů) a vytváří tak skóre závažnosti onemocnění1-5% weight loss, 2 = 5r 10% loss, 3 points 10 | 20% loss), stool consistency (0 - solid stool, 2 = lower bowel stool loss, 4 = movable stool diarrhea), bleeding from rectum and colon (0 = no bleeding from rectum and colon, 2 = positive reaction - hemocult, 4 = severe bleeding). The sum of the scores of each parameter in each mouse is divided by 3 (the number of endpoints) to produce a disease severity score
A od 0 (zdravá myš) do 4 (maximální stupeň závažnosti onemocnění) (Cooper a spol., 1993)And from 0 (healthy mouse) to 4 (maximum degree of disease severity) (Cooper et al., 1993)
Clinicopathologic study of dextran sulfáte sodium experimental murine colitis, Lab Invest.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis, Lab Invest.
69(2):238-49.. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny Studentovým t-testem.69 (2): 238-49. Results were statistically evaluated by Student's t-test.
Claims (7)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2013-539A CZ2013539A3 (en) | 2013-07-09 | 2013-07-09 | Bifidobacterium longum CCM 7952 bacterium strain and use thereof in human nourishment |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2013-539A CZ2013539A3 (en) | 2013-07-09 | 2013-07-09 | Bifidobacterium longum CCM 7952 bacterium strain and use thereof in human nourishment |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ304791B6 CZ304791B6 (en) | 2014-10-22 |
CZ2013539A3 true CZ2013539A3 (en) | 2014-10-22 |
Family
ID=51730146
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2013-539A CZ2013539A3 (en) | 2013-07-09 | 2013-07-09 | Bifidobacterium longum CCM 7952 bacterium strain and use thereof in human nourishment |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ2013539A3 (en) |
-
2013
- 2013-07-09 CZ CZ2013-539A patent/CZ2013539A3/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ304791B6 (en) | 2014-10-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7263622B2 (en) | Lactobacillus paracasei 207-27 and uses thereof | |
JP5147402B2 (en) | Probiotic Lactobacillus strains for improving vaginal health | |
EP2179028B1 (en) | A novel strain of bifidobacterium and active peptides against rotavirus infections | |
Surono et al. | Effect of probiotic L. plantarum IS-10506 and zinc supplementation on humoral immune response and zinc status of Indonesian pre-school children | |
EP4012019B1 (en) | Bifidobacterium breve 207-1 and use thereof | |
TW201100087A (en) | Lactobacillus johnsonii La1 NCC533 (CNCM I-1225) and immune disorders | |
KR20120125359A (en) | Anti-allergic composition | |
EP2220210B1 (en) | Strains of lactobacillus plantarum as probiotics with immunomodulatory specific effect | |
CZ2013539A3 (en) | Bifidobacterium longum CCM 7952 bacterium strain and use thereof in human nourishment | |
TWI779358B (en) | Lactobacillus gasseri strain, composition and use thereof | |
Beccati | Investigations of prebiotics and of inter-and intra-molecular glycan-protein interactions | |
Bhargava et al. | Probiotics in dentistry | |
WO2021130647A1 (en) | Probiotic formulations for liver and oral health and enhancement of immunity | |
Johnson et al. | Assessment of probiotic potentials of deger sold in tamale |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20200709 |