CZ2009717A3 - Způsob přípravy vzorků pro izolaci nukleových kyselin z rostlinných pletiv - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy směsného rostlinného vzorku pro izolaci nukleových kyselin, u kterého je homogenizace prováděna v keramické třecí misce v tekutém dusíku. Způsob umožňuje vytvořit směsný vzorek z libovolného počtu různých druhů rostlin přímo v terénu na lokalitě s využitím speciálních vzorkovacích sáčků, odběrové pinzety a přenosného mrazicího boxu s teplotou -18 .degree.C, ve kterém je transportován do laboratoře. Odebraný vzorek již nevyžaduje další úpravu v laboratoři a je přímo použit pro izolaci nukleových kyselin.

Description

Způsob přípravy vzorků pro izolací nukleových kyselin z rostlinných pletiv.

Oblast techniky

Vynález se týká široké oblasti laboratorních molekulárně biologických diagnostických metod, kde je prováděna analýza nukleových kyselin izolovaných z rostlinných pletiv a kde homogenizace vzorků probíhá v tekutém dusíku.

Dosavadní stav techniky

Metody molekulární diagnostiky s využitím principů hybridizace a polymerázové řetězové reakce (PCR) jsou stále více používány také v oblasti aplikované a sériové diagnostiky rostlinných patogenů (RT-PCR, Reál Time PCR, RFLP, AFLP, nested PCR apod.). Používané analytické metody a přístroje, kterými se provádí, jsou stále citlivější, spolehlivější a automatizovanější, vlastní proces testu se velmi zjednodušuje a urychluje, zvyšuje se i objem a rychlost provedených analýz.

Přes všechny tyto progresivní změny zůstává základem úspěšné diagnostiky postup vzorkování rostlin. Tento postup má ve standardní podobě dvě základní části, které jsou zpravidla z časových důvodů rozloženy do dvou a více dnů.

První, terénní částí vzorkování, je odběr „základního vzorku“ (dále jen ZV) na lokalitě v podobě různých částí rostlin (listů, květů apod.), nebo celých kontejnerovaných rostlin, jeho označení, zaevidování, uložení, následný transport do laboratoře a skladování do doby zahájení vlastního testu. Cílem terénního vzorkování je získat reprezentativní vzorek vhodný pro testování předpokládaného patogena v daném druhu hostitelské rostliny anebo v souvislosti s určitými symptomy, a tento uchovat v neporušeném stavu až do doby testování.

Ve druhé, laboratorní části vzorkování, je ze skladovaného ZV vytvořen „finální vzorek“ (dále jen FV) rostlinných pletiv. FV se vytvoří tak, že ze ZV je postupně odebráno různé množství dílčích Částí rostlinných pletiv, které reprezentují sledovaný symptom a splňují známá, nebo předpokládaná kriteria pro optimální zachyceni testovaného patogena. Odebrané části rostlinných pletiv jsou průběžně vkládány do keramické třecí misky s tekutým dusíkem a za pomocí tloučku jsou mechanicky zhomogenizovány. Vytvořený homogenát v podobě hmoty rozdrcených pletiv je základem pro vlastní diagnostiku. Cílem laboratorního • 4 · * , * · * « * · i* • * » · » * · · * · t « · ř · ’ · >

- » «· + ♦ · * vzorkování je vytvořit ze ZV reprezentativní směsný vzorek o limitované velikosti a připravit z něho homogenát v co možná nejkratším čase.

Optimalizace jednotlivých kroků obou částí vzorkování u různých druhů rostlin je poměrně složitá, často pracovně a manipulačně obtížná. Kromě řady kritérií, které je nezbytné zohlednit, aby použitý postup umožňoval splnění výše uvedených cílů, v terénní i laboratorní části vzorkování, je nutné dodržovat také pravidla fytohygieny, aby nedocházelo k šíření patogenních mikroorganismů a jejích vektorů. Tento přístup je základní podmínkou při práci s karanténními patogeny, které jsou na indexech European Plant Protection Organization (EPPO) a podléhají zvláštnímu režimu v rámci pravomoci Státní rostlinolékařské správy (SRS). Standardní postup vzorkování je v praktické sériové diagnostice nejčastější. Jiné metody vzorkování, založené např. na principu fixace nukleových kyselin do speciálních membrán (Osman F. & Rowhani A., 2005) přímo z pletiva testované rostliny, nebo metody, kdy se odebíraný vzorek rostlinných pletiv ponoří přímo do média, jež fixuje nukleové kyseliny (McKenzie & Shatters, 2009; Yingru et a!., 2002) se používají v menší míře z důvodu vyšších finančních nákladů, jakož i omezení z hlediska odběru směsných vzorků, zohlednění nerovnoměrného rozložení patogena v rostlinách, nebo Časové a manipulační náročnosti a omezené kvantity vzorků.

Přehled rizik, kterými jsou zatíženy standardně používané postupy vzorkování

1. Riziko kontaminace

a) Kontaminace Z V při odběru a manipulaci v terénu, nebo kontaminace FV v laboratoří. Dochází k ní vzájemným dotykem vzorků, šťávou ulpěiou na ruce, nebo odběrových pomůckách (rukavice, skalpel, nůž, nůžky, zahradnické nůžky apod.). Výsledkem je nespecifická reakce testu,

b) Kontaminace vzorkovaných rostlin na lokalitě. Dochází k ní vzájemným dotykem rostlin při manipulaci s nimi, šťávou ulpěiou na ruce, nebo odběrových pomůckách (skalpel, nůž, nůžky, zahradnické nůžky apod.). Velké riziko je zvláště u mechanicky snadno přenosných patogenů, které nemusí být ani cílovým organismem diagnostiky, ale jsou v rostlině přítomni. Je to řada široce rozšířených virů ze skupin Potex, Tobamo, Carmo, a také viroidů z čeledi Pospiviroidae (např. Brunt et 1996) Pro minimalizaci rizika kontaminace je nutné provádět opakovanou dezinfekci rukou a odběrových pomůcek nejčastěji za použití koncentrovaného ethanolu, nebo chlornanovým přípravkem SÁVO. Při používáni ochranných rukavic (guma, latex.

«· ««*« · ♦ · · * • * « » » * • ·*·4 · « « • · · *··* «·* « * ·»· ♦♦ * · 4·· »· vinyl) při terénním vzorkování se snižuje citlivost a zhoršuje manipulovatelnost vzorkovatele, a opakování jednotlivých úkonů pak riziko kontaminace zvyšuje.

2. Riziko šíření patogenů

c) K šíření karanténních patogenů může snadno docházet transportem jejich vektorů (třásněnky, molice, mšice, atd...,) na odebraných ZV. Toto riziko úměrně stoupá s velikostí ZV a nejvyšší je v případě transportu celých rostlin v pěstebních nádobách se substrátem (květináče, kontejnery). ZV jak v podobě části rostlin (listy, květy, stonky, pupeny apod.), tak i v podobě celých rostlin je proto nutné transportovat v uzavřených plastových sáčcích, což zvyšuje možnost jejich zapaření v průběhu transportu a ohrožuje detekovatelnost patogenů. Při následném přechovávání celých rostlin v izolačních vegetačních boxech, komorách a fytotronech je nutné zajistit likvidaci nejen potenciálních vektorů patogenů, ale í obecných škůdců rostlin, kteří mohou ve velmi krátké době vzorky znehodnotit (svilušky, slimáci, smutníce, housenky apod.).

3. Riziko znehodnocení vzorků

d) (J ZV, kdy jsou odebrány části rostlin (listy, květy, stonky, pupeny apod.) do plastových sáčků dochází v závislosti na použitém obalu a teplotě v průběhu transportu a následném skladování k odparu vody a vadnutí, což může ovlivnit stav patogenů v pletivech a spolehlivost diagnostiky. Manipulovatelnost se zavadlými ZV při odběru FV v laboratoři je navíc obtížnější.

e) Při skladování nezamražených ZV v plastových sáčcích ve tmě v chladničce při 4 C (standardní postup) do doby odběru FV dochází k dílčím rozkladným procesům v důsledku mechanického poškození pletiv, vysoké vlhkosti, přítomnosti houbových a bakteriálních mikroorganismů a také ke žloutnutí pletiv vlivem tvorby ethylenu. Tento proces může ovlivnit stav patogenů v pletivech a spolehlivost diagnostiky. Tento způsob skladování ZV je také časově omezený v závislosti na druhu rostliny a typu vzorku, a náročný z hlediska prostoru, manipulace, vyhledávání a evidence.

f) Přechovávání celých rostlin v kontejnerech do doby odběru FV je z důvodů uvedených v budu „cj“ nutné provádět buďto v plastových pytlích, nebo ve speciálních zařízeních jako jsou vegetační boxy, pěstební komory a fytotrony. Přechovávání celých rostlin v plastových obalech přináší rizika uvedená v bodu ,.cF.

» · ·*»· · » »*·· · · · ·· ♦· · ·♦ ·· í * »♦* » · ·· ·· ·*·« ·· * ·· «« · · 4 · · · · * * · a » « ·· · · · · · ·

g) Pokud izolační vegetační boxy, pěstební komory a fytotrony použité pro uchování celých kontejnerovaných rostlin nesplňují vegetační požadavky daného druhu rostliny dochází ke chřadnutí rostlin, což může ovlivnit stav patogenu v pletivech a spolehlivost diagnostiky.

h) Transport ZV vytvořených z různých částí rostlin (viz. bod „d“) v zamraženém stavu s použitím speciálního přenosného mrazicího boxu (teplota -18 °C) a rychlé přendání těchto ZV do mrazáku v laboratoři a skladování v zamraženém stavu (-20 až

O

-80 C) až do doby odběru FV je z hlediska ochrany před znehodnocením ZV velmi výhodným postupem. Vážné problémy ale nastávají při laboratorní části vzorkování, kdy je ze zamražených ZV nutno vytvořit FV. U celé řady rostlin dochází v laboratoři ve velmi krátké době po vyndání ZV z mrazáku pří teplotě místnosti ke změně jejich struktury - změknou, jsou mazlavé a slepené. Odběr FV je pak manipulačně velmi obtížný a z hlediska výběru nevhodnějších částí pro vytvoření směsného vzorku je někdy i prakticky neproveditelný. V každém případě dochází k dílčímu rozmrznutí vzorku před jeho vložením do tekutého dusíku, čím se zvyšuje pravděpodobnost poškození nukleových kyselin testovaného patogenu. Určitým negativem tohoto postupu může být také omezená prostorová kapacita přenosného mrazicího boxu, která limituje množství ZV a jejich velikost.

i) Manipulace se ZV v laboratoři při vytváření FV může být s ohledem na druh rostlin relativně složitá a časově náročná. Zahrnuje dílčí kroky, jako vyjmutí ze sáčku, kontrolu fyzického stavu vzorku, posouzení symptomů s odběrovým protokolem, výběr nejvhodnějších částí pro otestováni, odběr směsných vzorků a jejích vložení do třecí misky. Vytváření FV v laboratoři je i při potřebné kvalifikaci a praxi personálu laboratoře a jeho maximální snaze dodržovat jednotlivé kroky postupu vždy zatíženo riziky uvedenými v bodech ,,d)“ a „ hf‘. Ve většině případů vyžaduje vytváření FV v laboratoři také znalost o rozložení testovaného patogena v konkrétním druhu rostliny, specifických symptomech a potřebné velikosti FV tak, aby příprava FV byla optimalizována podle aktuálního stavu ZV.

j) Při provádění postupného monitoringu na různých lokalitách ve více dnech za sebou bez možnosti každodenního návratu do laboratoře a uloženi ZV v příslušných přechovávačích zařízeních se rizika znehodnocení ZV uvedená v bodu ,,d)“ výrazně zvyšuji, a proto je nutné udržovat ZV v přenosném chladicím zařízení. Vícedenní přechovávání ZV v chladicím zařízení zvyšuje rizika uvedená v bodu „e)‘\ Limitující je také velikost přenosných chladících zařízení.

-4 • * b*«« * ♦ » »«* · · · * ♦ i · * · ·«« ··· + » »· * · 1« · ♦ * · ·

k) Při větším množství vzorků než lze aktuálně v laboratoři zpracovat, je nezbytné skladovat vzorky do doby testování. V nezamrazeném stavu je tento proces značně časově omezený a prostorově a manipulačně náročný. Skladování větších vzorků v chladicích zařízeních je z hlediska prostorové náročnosti a evidence vzorků (vyhledávání, opakovaná manipulace se vzorky, riziko záměny apod.) obtížné, a je zatíženo riziky uvedenými v bodu ,,d)“ a ,,e)“.

l) Nutnost dvojí manipulace se vzorky v rámci použití standardního způsobu vzorkování (tj, nejprve vytvoření ZV a následně FV) obecně zvyšuje rizika znehodnocení vzorku.

V této oblasti techniky se dále vyskytují dokumenty jako článek „Způsob sběru suchých rostlinných vzorků pro analýzy DNA“ publikovaný v Annals of the Missouri Botanical Garden, Vol. 77, No. 4 (1990), ve kterém je uvedena možnosti transportu odebraných vzorků na ledu či v tekutém dusíku, tuto metodu však uvádí jako nevýhodnou a dále využívají postup s vysušením vzorků zabalených v hedvábném papíru nad CaSO4 (anhydrous) a takto upravené vzoiky jsou skladovány v -20^C. Metoda transportu vzorků na ledu je problematická z hlediska udržení stálé teploty, skladování a transport v tekutém dusíku vyžaduje speciální režim zacházení a oba postupy jsou manipulačně náročné. Abstrakt dokumentu CN 200977227Y(zveřejněn ve třídě A61F13/00 dne 21.11.2007) uvádí využití transparentního plastového sáčku jehož vnitřek je opatřen gázou jako ochranným prostředkem proti kontaminaci vzorku bakteriemi ze znečištěných rukou. Sáček je využíván v oblasti zdravotnictví, neřeší problematiku ochrany rostlinných pletiv ani hledisko rizika degradace nukleových kyselin, ale pouze živočišných tkání z hlediska kontaminace vzorku,

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je způsob přípravy směsného rostlinného vzorku pro izolaci nukleových kyselin, u kterého je homogenizace prováděna v keramické třecí misce v tekutém dusíku.

Způsob umožňuje vytvořit směsný vzorek z libovolného počtu různých druhů rostlin přímo v terénu na lokalitě s využitím speciálních vzorkovacích sáčků, odběrové pinzety a uiožení do přenosného mrazicího boxu s teplotou -18 °C, ve kterém je takovýto vzorek transportován do laboratoře. Odebraný vzorek již nevyžaduje úpravu v laboratoři a je přímo použit pro izolaci nukleových kyselin.

- 5 »11« »

« *

k · «

t

» * . » ·· • «· t ♦· ·· » · · · ·

Způsob eliminuje všechna rizika uvedená v kapitole „Dosavadní stav techniky“ v bodech 1. až 3.

Příklady provedení vynálezu

Způsob byl vyvinut a odzkoušen v letech 2007 až 2009 pro vzorkování okrasných rostlin, zelenin a plevelů se zaměřením na čeleď Solanaceae pro testování karanténního patogenu Potato spindle tuber pospiviroid (PSTVd) v zahradnických komplexech v celé ČR. Vzorkování v rámci plošného monitoringu bylo prováděno v několika dnech po sobě bez možnosti návratu do laboratoře. V každém skleníkovém komplexu byly odebírány směsné vzorky z vybraných rostlin z květů, listů a plodů s hlavním zaměřením na reprezentativnost konkrétní partie vzorkovaného rostlinného materiálu a ověření specifičnosti testů. Současně byly používány kontrolní vzorky z rostlin s již prokázanou infekcí PSTVd a vzorky bez této infekce z kolekce rostlin udržovaných ve VÚKOZ, v.v.i.

Způsob zahrnuje postupný odběr mikrovzorků z různých části vybraných rostlin přímo vmiste jejich růstu do speciálního odběrového plastového sáčku sdvojitou vrstvou pouze lehce zatavené gázy tak, aby byla ze sáčku snadno vytrhnutelná, který byl opatřen papírovou polepkou pro evidenční údaje vzorku. Při rozevření sáčku se současně rozevřou i dvě vrstvy gázy, mezi které jsou postupně vkládány jednotlivé odebírané mikrovzorky.

Mikrovzorky byly odbírány pomocí tvrdé kovové pinzety, přičemž jejich velikost a celkové odebrané množství byly přizpůsobeny požadované konečné hmotnosti směsného vzorku v závislosti na zvolené metodě izolace nukleových kyselin. Pro testování PSTVd byly odebírány směsné vzorky o konečné hmotnosti cca 200 pg. Pro jednotlivé druhy vzorkovaných rostlin a jejich částí byla předem provedena přesná navážka jako vodítko pro stanovení přibližné velikosti odebíraných vzorků. Při odběru mikrovzorků z jedné rostliny nebo z jedné partie rostlin byla použita jedna pinzeta, a při přechodu na jinou partii nebo při potřebě odděleného testování jednotlivých rostlin byly použity různé pinzety. Dezinfekce pinzet byla prováděna ponořením do roztoku SÁVO s následným omytím vodou pomocí ručního tlakového plastového postřikovače a osušením buničinou, V průběhu odběru vzorků byly odběrové sáčky uloženy v plastové krabičce nebo chladící tašce. Po skončení odběru byly odběrové sáčky se vzorky vloženy do přenosného mrazicího boxu s teplotou -18 °C uloženého v automobilu a takto transportovány. Současně byly v přenosném mrazicím boxu po celou dobu terénního vzorkování transportovány také kontrolní vzorky. Do laboratoře byly vzorky přeneseny v mrazicím boxu. Jednotlivé vzorky byly postupně vyndávány z mrazicího

-6* · · « boxu, sáček byl rozevřen a byla z něho vytržena gáza se zmraženým směsným vzorkem, který byl z gázy vyklepnut přímo do připravené keramické misky s tekutým dusíkem a pomocí dolíčku zhomogenizován. V případě, že izolace nukleových kyselin nebyla provedena ihned po dovozu vzorků, byly vzorky přendány 2 přenosného mrazicího boxu do příslušného mrazicího zařízení v laboratoři.

Způsob výrazně snížil pracovní, časovou i prostorovou náročnost procesu vzorkování, minimalizoval manipulaci se vzorky, zvýšil reprezentativnost vzorků, usnadnil evidenci a zvýšil tak spolehlivost testování PSTVd při použití metody izolace nukleových kyselin v tekutém dusíku. Způsob umožnil provádět odběry vzorků na různých lokalitách v rámci vícedenního monitoringu PSTVd bez nutnosti návratu do laboratoře s minimalizací rizik jejich znehodnocení, což bylo zvláště významné v době teplého a slunečného počasí.

Průmyslová využitelnost

Využití způsobu je v celé oblasti provádění laboratorní diagnostiky metodami molekulární biologie. Využití je zvláště přínosné zejména u případů, kdy je potřeba testovat směsné vzorky z většího počtu rostlin a je nezbytný dlouhodobější transport vzorků a následné skladování vzorků, při tvorbě referenčních kontrolních vzorků, a v případech, kdy je nutné testovat uvedeným způsobem zvláště nebezpečné (karanténní) patogeny a kde hrozí šíření patogenu pomocí vektorů a rostlinného materiálu.

Seznam citované literatury

Brunt A.A., Crabtree K.., Dalwitz M.J., Gibbs A.J., Watson L. (1996): Viruses of plants. Descriptions and Lists from the VIDE Database. CAB International, Oxon, United Kmgdom. 1484pages.

McKenzie C. L. and Shatters R. G. Jr, (2009):,First Report of '‘Candidatus Liberibacter psyllaurous” Associated with Psyllid Yellows of Tomato in Colorado. Plant Disease Vol. 93/10, p. 1074.

Gugerli P., 1984. Revue Suisse Vitic. Arboric. Hortic.16; 87-88.

Osman F. et Rowhani A. (2005): Application of a spotting sample preparation technique for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and real-time PCR (TaqMan). Journal of Virotogical Methods. Vol. 122, Issue 2, p. 130-136.

YingruWu, Danny J. Llcwellyn and Elizabeth S. Dennis (2002): A quick and easy method for isolating good-quality RNA from cotton (Gossypium hirsutum L.) tissues. Planí Ndolecular Biology Reportér. Volume 20, Number 3, p. 213-218.

Claims (1)

1. I. Způsob přípravy reprezentativního směsného rostlinného vzorku se zaměřením na snížení časové, pracovní a prostorové náročnosti vzorkování, eliminaci nezbytnosti opakované manipulace s ním, minimalizaci rizik jeho znehodnocení a snadnější evidenci, zejména pro použití při izolaci nukleových kyselin v tekutém dusíku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující sestavu kroků:

   a) přímo v místě růstu rostlin^ se kovovou pinzetou postupně odebírají mikrovzorky z různých částí vybraných rostliní/.do speciálního odběrového plastového sáčku s dvojitou vrstvou lehce zatavené gázy pro snadné vyjmutí a s polepkou pro evidenční údaje, přičemž jednotlivé mikrovzorky se postupně vkládají do rozevřeného sáčku mezi dvě vrstvy gázy;

   b) odběrový sáček se vzorkem se po skončení odběru, .vloží do přenosného mrazicího boxu s teplotou -18 °C pro stabilizaci a uskladnění v průběhu transportu do laboratoře;

   c) v laboratoři se po vyjmutí z mrazicího boxu odběrový sáček rozevře a vyjme se gáza se zamraženým směsným vzorkem, který se vyklepne přímo do misky s tekutým dusíkem bez nutnosti dotyku rukou.