CZ2008440A3 - Method of increasing evolutionary ability of growing oocytes by histone deacetylase inhibition - Google Patents
Method of increasing evolutionary ability of growing oocytes by histone deacetylase inhibition Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2008440A3 CZ2008440A3 CZ20080440A CZ2008440A CZ2008440A3 CZ 2008440 A3 CZ2008440 A3 CZ 2008440A3 CZ 20080440 A CZ20080440 A CZ 20080440A CZ 2008440 A CZ2008440 A CZ 2008440A CZ 2008440 A3 CZ2008440 A3 CZ 2008440A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- oocytes
- histone deacetylase
- concentrations
- metaphase
- hours
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Zpusob zvýšení vývojové schopnosti rostoucích oocytu inhibicí histon deacetylázy se provádí tak, že se na oocyty s neukonceným rustem pusobí behem jejich zrání v podmínkách in vitro látkami, které specificky brání deacetylaci histonu a navozují tak jejich hyperacetylaci. Tato kultivace má velké využití pri reprodukcních biotechnologiích zejména u hospodárských zvírat.The method of enhancing the developmental ability of growing oocytes by inhibiting histone deacetylase is accomplished by causing oocytes with incomplete growth during their maturation under in vitro conditions by substances that specifically inhibit histone deacetylation and thereby induce their hyperacetylation. This cultivation has a great use in reproductive biotechnology, especially in farm animals.
Description
Způsob zvýšení vývojové schopnosti rostoucích oocytů inhibicí histon deacetylázyA method of increasing the developmental capacity of growing oocytes by inhibiting histone deacetylase
Oblast technikyTechnical field
Vynález se týká zvýšení vývojové schopnosti rostoucích oocytů v podmínkách kultivace in vitro s využitím látek inhibujících histon deacetylázy. Tento způsob kultivace má velký význam zejména při asistované reprodukci hospodářských zvířat.The invention relates to enhancing the developmental ability of growing oocytes under in vitro culture conditions using histone deacetylase inhibiting agents. This method of cultivation is of particular importance in assisted reproduction of farm animals.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
V současné době se pro asistovanou reprodukci savců (klonování, in vitro oplozeni, transgenoze) včetně hospodářsky významných druhů využívají oocyty, což jsou samičí pohlavní buňky, které ukončily v těle samice růstovou fázi. Těchto oocytů je vdaný okamžik od jednoho zvířete dostupný jen omezený početla to limituje využití metod asistované reprodukce. Kromě oocytů s ukončenou růstovou fází se nachází ve vaječnících samice i mnohonásobně vyšší počet oocytů, které ještě růstovou fázi neukončily. Tyto oocyty ale mají sníženou vývojovou schopnost a pro metody asistované reprodukce je nelze použít. To významně snižuje možnosti využití šlechtitelského potenciálu samic s vysokou plemennou hodnotou a omezuje možnosti asistované reprodukce, protože se často nedaří získat dostatek vajíček ve fázi ukončeného růstu. Pokud by se podařilo zvýšit vývojové schopnosti oocytů s neukončenou růstovou fází, využití šlechtitelského potenciálu samic by se zvýšilo a zefektivnily by se i postupy asistované reprodukce.Currently, oocytes, which are female sex cells that have completed the growth phase in the female body, are used for assisted reproduction of mammals (cloning, in vitro fertilization, transgenesis), including economically important species. These oocytes are married from one animal available only to a limited number that limits the use of assisted reproduction methods. In addition to oocytes with a terminated growth phase, there are many times higher numbers of oocytes in the ovaries of the female who have not yet completed the growth phase. However, these oocytes have reduced developmental capacity and cannot be used for assisted reproductive methods. This significantly reduces the possibility of exploiting the breeding potential of high breeding females and limits the possibility of assisted reproduction, as often enough eggs cannot be obtained in the phase of growth. If the developmental abilities of oocytes with an unfinished growth phase could be increased, the utilization of the breeding potential of females would increase and assisted reproductive procedures would be more effective.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Uvedené problémy odstraňuje způsob zvýšení vývojové schopnosti oocytů inhibicí histon deacetyláz, podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že na oocyty s neukončeným růstem se působí během jejich zrání v podmínkách in vitro látkami, které specificky brání deacetylaci histonů a navozují tak jejich hyperacetylaci.The problem is overcome by a method of enhancing the developmental ability of oocytes by inhibiting histone deacetylases according to the invention, characterized in that oocytes with unfinished growth are treated during their maturation under in vitro conditions with substances specifically preventing histone deacetylation and thus inducing hyperacetylation thereof.
Způsob podle vynálezu se dále provádí tak, že se oocyty s neukončenou růstovou fázi kultivují in vitro bez inhibitorů histon deacetyláz po dobu, která je u daného živočišného druhu běžně nutná pro dosažení stádia metafáze I., následně . i » > v 1« i t l I a I <The method of the invention is further carried out by culturing oocytes with unfinished growth phase in vitro without histone deacetylase inhibitors for a period of time which is normally necessary for a given species to reach metaphase I stage, subsequently. i »v 1« i t l I and I <
. * . » » » t > · » » 4 * » / » » 1 · ‘ t t » » i « t » I. *. »» »T> ·» »4 *» / »» 1 · 'tt »» i «T» I
2t · »11 ř » >2t · »11 ø»>
itiia .* » 4* jsou oocyty kultivovány 24 hodin v přítomnost1 inhibitoru histon deacetyláz, poté jsou oocyty opět kultivovány v médiu bez inhibitoru histon deacetyláz po dobu, která je běžně u daného druhu nutná pro postup zrání oocytů z metafáze I do metafáze II.The oocytes are cultured for 24 hours in the presence of 1 histone deacetylase inhibitor, after which the oocytes are cultured again in a medium without a histone deacetylase inhibitor for a period normally required for the maturation of oocytes from metaphase I to metaphase II.
Způsob podle vynálezu se výhodně provádí tak, že se na oocyty s neukončeným růstem během kultivace in vitro v určité fázi působí 24 hodin inhibitory histon deacetyláz, zejména trichostatinem A v koncentracích od 100 do 1000 nM, kyselinou 2-propylpentanovou v koncentracích od 0,5 do 5 mM, scriptaidem v koncentracích od 1 do 10 mikroM, oxamflatinem v koncentraci od 10 do 100 nM a apicidinem v koncentracích od 50 do 500 nM.The method according to the invention is preferably carried out by treating oocytes with unfinished growth during in vitro culture at a certain stage for 24 hours with histone deacetylase inhibitors, in particular trichostatin A at concentrations from 100 to 1000 nM, 2-propylpentanoic acid at concentrations from 0.5 up to 5 mM, scriptaid at concentrations from 1 to 10 microM, oxamflatin at concentrations from 10 to 100 nM, and apicidin at concentrations from 50 to 500 nM.
Způsob zvýšení vývojové schopnosti oocytů podle vynálezu se konkrétně provádí tak, že se nezralé savčí oocyty s neukončeným růstem a neúplně vyvinutou vývojovou schopností in vitro nejprve kultivují v médiu bez inhibitorů histon deacetyláz. Doba této kultivace odpovídá času, za jaký nezralé, dorostlé oocyty spinou vývojovou schopností dosáhnou stádia metafáze I (24 hodin u prasete, 12 hodin u skotu, ovce). Následně jsou oocyty vystaveny na 24 hodin účinku specifického inhibitoru histon deacetyláz. Např. trichostatin A se používá v koncentracích od 100 do 1000 nM, kyselina 2-propylpentanová se používá v koncentracích od 0,5 do 5 mM, scriptaid v koncentracích od 1 do 10 μΜ, oxamflatin v koncentraci od 10 do 100 nM a apicidin v koncentracích od 50 do 500 nM. Po 24 hodinách jsou oocyty důkladně promyty a kultivovány v médiu bez inhibitorů histon deacetylázy po dobu, za jakou dorostlé oocyty s plnou vývojovou schopností dospějí ze stádia metafáze I do stádia metafáze II a dokončí tak zrání (např. prase 20 hodin, skota ovce 10 hodin).In particular, the method of enhancing oocyte developmental capacity of the invention is performed by culturing immature mammalian oocytes with unfinished growth and incompletely developed in vitro developmental ability in a histone deacetylase inhibitor-free medium first. The time of this cultivation corresponds to the time for immature, overgrown oocytes to reach metaphase I stage (24 hours in pig, 12 hours in cattle, sheep). Subsequently, oocytes are exposed for 24 hours to a specific histone deacetylase inhibitor. E.g. trichostatin A is used at concentrations from 100 to 1000 nM, 2-propylpentanoic acid is used at concentrations from 0.5 to 5 mM, scriptaid at concentrations from 1 to 10 μΜ, oxamflatin at concentrations from 10 to 100 nM, and apicidin at concentrations from 50 to 500 nM. After 24 hours, the oocytes are thoroughly washed and cultured in a medium free of histone deacetylase inhibitors for as long as the mature oocytes with full developmental capacity reach the metaphase I stage to the metaphase II stage and complete maturation (eg pig 20 hours, cattle 10 hours ).
Způsobem podle vynálezu jsou voocytech specificky inhibovány histon deacetylázy a dochází k hyperacetylaci histonů. To se ukazuje jako velmi výhodné, protože experimenty původců prokázaly, že inhibice histon deacetylázy a následná hyperacetylace histonů po počáteční kultivaci oocytů má příznivý efekt na další průběh zrání oocytů. Pokud není použít způsob podle vynálezu, zastaví většina kultivovaných oocytů s neukončeným růstem a neúplnou vývojovou schopnosti zrání ve stádiu metafáze I a jsou pro většinu biotechnologií již nepoužitelné. Způsobem podle vynálezu je dosaženo úplného zrání oocytů do metafáze II u 75 % oocytů. Tyto oocyty lze použít pro další reprodukční biotechnologie, protože jsou s to se vyvíjet v embrya.The method of the invention specifically inhibits histone deacetylase in the lymphocytes and hyperacetylation of histones occurs. This has proven to be very advantageous because experiments by the inventors have shown that inhibition of histone deacetylase and subsequent histone hyperacetylation after initial oocyte cultivation has a beneficial effect on the further course of oocyte maturation. If the method of the invention is not used, most cultured oocytes with unfinished growth and incomplete developmental capacity stop metaphase I maturation and are no longer useful for most biotechnologies. The method of the invention achieves complete oocyte maturation into metaphase II in 75% of oocytes. These oocytes can be used for other reproductive biotechnologies because they are able to develop into embryos.
Výsledkem způsobu kultivace podle vynálezu je podstatné zvýšení podílu oocytů, jež dokončí zrání a jsou využitelné pro další reprodukční biotechnologie. Ve srovnání s tradičními postupy kultivace je nárůst podílu dozrálých oocytů zhruba trojnásobný, což má velký hospodářský význam. Způsob kultivace oocytů in vitro s cílenou inhibici histon deacetyláz ve specifické fázi podle vynálezu lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat (např. klonování, ICSI). Uplatnění by mohl najít i v humánní medicíně.The cultivation method of the invention results in a substantial increase in the proportion of oocytes that complete maturation and are useful for other reproductive biotechnologies. Compared to traditional cultivation practices, the increase in the proportion of mature oocytes is about threefold, which is of great economic importance. The method of in vitro cultivation of oocytes with the targeted inhibition of histone deacetylases in a specific phase according to the invention can be used in particular in animal reproductive biotechnology (eg cloning, ICSI). It could also find application in human medicine.
Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.The following examples illustrate the process according to the invention without limiting it in any way.
Příklady provedení ·/ .« <EXAMPLES · /. «<
Příklad 1Example 1
Při klasické kultivaci prasečích oocytů s neukončeným růstem dochází v podmínkách in vitro k dokončení zrání do stádia metafáze II u 20 % oocytů. Při způsobu podle vynálezu jsou prasečí oocyty s neukončenou růstovou fází kultivovány nejprve po 24 hodin v kultivačním médiu bez přídavku inhibitorů histon deacetyláz, následně pak jsou kultivovány dalších 24 hodin s přídavkem 100 nM trichostatinu A a poté jsou kultivovány opět 20 hodin v kultivačním médiu bez přídavku inhibitorů histon deacetyláz. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II (75 %). Takto získané oocyty lze podrobit standardní partenogenetické aktivaci a navodit u nich vývoj do stádia blastocysty. Takto získané savčí partenogenetické zárodky ve vývojovém stádiu blastocyty lze využít například pro tvorbu embryonálních kmenových buněk.In classical in vitro growth of porcine oocytes with complete growth, maturation to metaphase II stage is completed in 20% of oocytes under in vitro conditions. In the method of the invention, porcine oocytes with unfinished growth phase are first cultured for 24 hours in the culture medium without the addition of histone deacetylase inhibitors, then cultured for a further 24 hours with the addition of 100 nM trichostatin A and then cultured again for 20 hours in the culture medium without. histone deacetylase inhibitors. In this procedure, the proportion of mature oocytes reaching the metaphase II stage (75%) increases significantly. The oocytes thus obtained can be subjected to standard parthenogenetic activation and induce development to the blastocyst stage. The thus obtained mammalian parthenogenetic germs in the developmental stage of blastocytes can be used, for example, for the production of embryonic stem cells.
Příklad 2Example 2
Při tradiční kultivaci oocytů skotu s neukončeným růstem dochází v podmínkách in vitro k dokončení zrání do stádia metafáze II u 15 % oocytů. Při způsobu podle vynálezu jsou oocyty skotu s neukončenou růstovou fází kultivovány nejprve po 12 hodin v kultivačním médiu bez přídavku inhibitorů histon deacetyláz, následně pak jsou kultivovány dalších 12 hodin s přídavkem 5 mikromolů inhibitoru histon deacetyláz scriptaidu a poté jsou kultivovány opět 10 hodin v kultivačnímTraditional in vitro cultivation of bovine oocytes with unfinished growth completes maturation to metaphase II stage in 15% of oocytes under in vitro conditions. In the method of the invention, bovine oocytes with unfinished growth phase are first cultured for 12 hours in culture medium without the addition of histone deacetylase inhibitors, then cultured for a further 12 hours with 5 micromoles of the histone deacetylase scriptaid inhibitor and then cultured again for 10 hours in culture
I « v II «in I
- i *- i *
I · » J · 1 · i » ♦ » 1 · l · · * * médiu bez přídavku inhibitorů histon deacetyláz. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze 11 (78 %). Takto získané oocyty lze podrobit standardnímu oplození in vitro. Úspěšně oplozené oocyty se dále vyvíjejí v embrya vhodná pro přenos náhradní matce.The medium without the addition of histone deacetylase inhibitors. In this procedure, the proportion of mature oocytes reaching metaphase 11 stage (78%) increases significantly. The oocytes thus obtained can be subjected to standard in vitro fertilization. Successful fertilized oocytes further develop into embryos suitable for transmission to the surrogate mother.
Přiklad 3Example 3
Při klasické kultivaci prasečích oocytů s neukončeným růstem dochází v podmínkách in vitro k dokončení zrání do stádia metafáze II u 20 % oocytů. Při způsobu podle vynálezu jsou prasečí oocyty s neukončenou růstovou fází kultivovány nejprve po 24 hodin v kultivačním médiu bez přídavku inhibitorů histon deacetyláz, následně pak jsou kultivovány dalších 24 hodin s přídavkem inhibitoru oxamflatinu v koncentraci 30 nM a poté jsou kultivovány opět 20 hodin v kultivačním médiu bez přídavku inhibitorů histon deacetyláz. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II (70 %). Takto získané oocyty lze použít pro produkci cytoplastů pro klonování přenosem jader somatických buněk.In classical cultivation of porcine oocytes with unfinished growth, 20% oocytes complete maturation to the metaphase II stage under in vitro conditions. In the method of the invention, porcine oocytes with unfinished growth phase are first cultured for 24 hours in the culture medium without the addition of histone deacetylase inhibitors, then cultured for a further 24 hours with the addition of the 30nM oxamflatin inhibitor and then cultured again for 20 hours in the culture medium. without the addition of histone deacetylase inhibitors. In this procedure, the proportion of mature oocytes reaching metaphase II stage (70%) increases significantly. The oocytes thus obtained can be used to produce cytoplasts for cloning by somatic cell nucleus transfer.
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Řešení se týká zdokonaleného kultivačního postupu oocytů in vitro, jenž využívá specifické inhibice histon deacetyláz v určité fázi kultivace, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích zejména u hospodářských zvířat.The present invention relates to an improved in vitro oocyte culture procedure that utilizes specific inhibition of histone deacetylases at a particular stage of culture, which is of great importance in reproductive biotechnology, particularly in livestock.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080440A CZ2008440A3 (en) | 2008-07-15 | 2008-07-15 | Method of increasing evolutionary ability of growing oocytes by histone deacetylase inhibition |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080440A CZ2008440A3 (en) | 2008-07-15 | 2008-07-15 | Method of increasing evolutionary ability of growing oocytes by histone deacetylase inhibition |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ301317B6 CZ301317B6 (en) | 2010-01-13 |
| CZ2008440A3 true CZ2008440A3 (en) | 2010-01-13 |
Family
ID=41500980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20080440A CZ2008440A3 (en) | 2008-07-15 | 2008-07-15 | Method of increasing evolutionary ability of growing oocytes by histone deacetylase inhibition |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2008440A3 (en) |
-
2008
- 2008-07-15 CZ CZ20080440A patent/CZ2008440A3/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ301317B6 (en) | 2010-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Glutathione and cysteine enhance porcine preimplantation embryo development in vitro after intracytoplasmic sperm injection | |
| Srirattana et al. | Developmental potential of vitrified goat oocytes following somatic cell nuclear transfer and parthenogenetic activation | |
| No et al. | Scriptaid improves the reprogramming of donor cells and enhances canine-porcine interspecies embryo development | |
| Kim et al. | Altering histone acetylation status in donor cells with suberoylanilide hydroxamic acid does not affect dog cloning efficiency | |
| Samiec et al. | Molecular conditions of the cell nucleus remodelling/reprogramming process and nuclear-transferred embryo development in the intraooplasmic karyoplast injection technique: a review | |
| Zhou et al. | Scriptaid affects histone acetylation and the expression of development-related genes at different stages of porcine somatic cell nuclear transfer embryo during early development | |
| CZ2008440A3 (en) | Method of increasing evolutionary ability of growing oocytes by histone deacetylase inhibition | |
| Mizutani et al. | Treatment of donor cell/embryo with different approaches to improve development after nuclear transfer | |
| US10190093B2 (en) | Artificial oocyte activation | |
| CZ299271B6 (en) | Use of histone deacetylase inhibitor for preparing culture medium for prolonging life span of mammalian oocytes in vitro | |
| CZ2018320A3 (en) | A method of eliminating glyphosate B-induced maturation defects in mammalian oocytes | |
| CZ2008441A3 (en) | Method of increasing evolutionary ability of growing oocytes by calcineurin inhibition | |
| CZ307949B6 (en) | A method of eliminating glyph-induced C maturation defects in mammalian oocytes | |
| CZ2018344A3 (en) | A method of eliminating glyphosate C-induced maturation defects in mammalian oocytes | |
| CZ308182B6 (en) | A method for eliminating bisphenol A or bisphenol S maturation defects in mammalian oocytes | |
| Lee et al. | Cloning pigs by somatic cell nuclear transfer | |
| Kagami | Perspectives on avian stem cells for poultry breeding | |
| CZ2010394A3 (en) | Method of increasing evolutionary capability of growing oocytes by activating protein kinases C | |
| CZ307943B6 (en) | A method of eliminating glyphosate A-induced maturation defects in mammalian oocytes | |
| Beigh et al. | Role of trichostatin A as reprogramming enhancer on in vitro development of cloned embryos: a review | |
| CZ297528B6 (en) | Use of MAP kinase JNK inhibitor for preparing culture medium for prolongation of life of mammalian oocytes in vitro | |
| WO2021193596A1 (en) | Temporary treatment medium, treatment kit, embryo developmental arrest inhibitor, method for inhibiting embryo developmental arrest, method for producing developmental engineering product, transfer method, therapeutic method, and developmental engineering product | |
| JP6829435B2 (en) | Method for improving the incidence of mammalian nuclear transplanted embryos | |
| CZ2014809A3 (en) | In vitro culturing growing oocytes of animals | |
| Loi et al. | Epigenetic mechanisms in mammals and their effects on cloning procedures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20150715 |