CZ2005114A3 - Způsob přípravy hyaluronanu s nízkou a velmi nízkou molekulovou hmotností a oligosacharidů hyaluronanu - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje způsob přípravy kyseliny hyaluronové nebo hyaluronanu s nízkou a velmi nízkou molekulovou hmotností pro použití v kosmetice a ve farmacii, kdy je hyaluronan se střední nebo vysokou molekulovou hmotností depolymerizován za pomoci mikrovlnného záření.

Description

Způsob přípravy hyaluronanu s nízkou a velmi nízkou molekulovou hmotností a oligosacharidů hyaluronanu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy hyaluronanu s nízkou a velmi nízkou molekulovou hmotností a oligosacharidů hyaluronanu pro použití v kosmetice a ve farmacii, kdy je hyaluronan se střední nebo vysokou molekulovou hmotností depolymerizován za pomoci mikrovlnného záření.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronan je aniontový glykosaminoglykan, který se skládá z pravidelně se opakujících disacharidických jednotek, složených z D-glukuronové kyseliny a Macetyl-D-glukosaminu. j Hyaluronan může být volnou kyselinou hyaluronovou nebo kteroukoliv její solí.

··

Vysokomolekulámí kyselina hyaluronová hraje důležitou roli v mnoha biologických procesech jako je hydratace tkáně, proteoglykanové uspořádání v extracelulámí matrix nebo obnova tkáně. Použití má v klinické léčbě (Goa K.L., Benfield P.: Hyaluronic acid. A review of its pharmacology and use as a surgical aid in opthalmology and its therapeutic potential in joint disease wound healing. Drugs 1994, 47, 536-66; Huskisson E.C., Donnelly S.: Hyaluronic acid in the treatment of osteoarthritis of the knee. Rheumatology 1999, 38, 602-607; Lindblad G.T., Pharmacia AB: US 4801619) i v kosmetice. Středem zájmu je také hyaluronan s velmi nízkou molekulovou hmotností a oligosacharidy hyaluronanu, které jsou prezentovány jako stimulátor angiogeneze (West D.C., Hampson I.N. et ak: Angiogenesis induced by degradation product of hyaluronic acid. Science 1985, 228,1324-6).

Doposud byly zkoušeny různé metody snižování molekulové hmotnosti polysacharidů, např. pomocí γ-zárení (Miller R., Shiedlin A., Genzyme Corporation: WO 02/06348 A2) nebo chemickou cestou použitím Fentonova Činidla Fe²⁺/H2O2 (Marritt W., Seiko Epson Corporation:

US 2002/0016453 AI), v obou případech jde však o radikálovou degradaci, tedy špatně ovladatelný proces. Enzymatická degradace hyaluronanu je oproti tomu relativně zdlouhavý proces (Callegaro L., Romeo A., Fidia S.p.A., WO 93/20827, US 5646129; Akima K., Yoshida Y. et ak, Shisedo Company Limited: EP 0889055 AI) a vede až ke vzniku oligosacharidů hyaluronanu.

Snižování molekulové hmotnosti polysacharidů za pomocí ultrazvuku je zavedená metoda a byla aplikována i na hyaluronan (Kubo K., Nakamura T. et al.: Depolymerization of hyaluronan by sonification. Glycoconjugate Journal 1993, 10, 435-9; Miyazaki T., Yomota C. et al.: Ultrasonic depolymerization ofhyaluronic acid. Polymer Degradation and Stability 2001, 74, 77-85). Ultrazvuková degradace byla kombinována i s chemickou degradací (Calleraro L., Renier D., Fidia Advanced Biopolymers S.r.l.: WO 97/22629; US 6020484; Hokputsa, S., Jumel,

K., Alexander, C., & Harding, S. E, Carbohydrate Polymers 2003, 52, 111-117), přitom rozsah degradace může být regulován podmínkami sonifikace nebo množstvím chemikálií. Problémem je však hlučnost procesu a dodržení základního požadavku na zachování původní struktury polymeru během depolymerizace a zamezení nebo minimalizace vzniku nových funkčních skupin nebo kontaminace vedlejšími reakčními produkty, které by mohli negativně ovlivnit biologickou aktivitu degradovaného polymeru. Problém se zachováním struktury polymeru zůstává i u tepelné degradace kombinované s chemickou jako je tzv. kyselá nebo zásaditá hydrolýza (Tokita Y., Okamoto A.: Hydrolytic degradation of hyaluronic acid. Polymer Degradation and Stability 1995, 48, 269-273; Ishioroshi M., Horiike S., Q.P, Corporation: Showa 63-57602). Významnou roli hraje také doba degradace.

Uvedené nedostatky řeší metoda degradace pomocí mikrovlnného záření, o kterou je zvyšující se zájem v organické syntéze i hydrolytických procesech z důvodu pozoruhodného zvýšení reakčních rychlostí a významného účinku proti klasickému ohřevu.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je vyvinout novou metodu přípravy hyaluronanu s nízkou a velmi nízkou molekulovou hmotností a oligosacharidů hyaluronanu, přičemž se vychází z hyaluronanu se střední nebo vysokou molekulovou hmotností. Metoda by měla umožnit připravovat oligosacharidy a polysacharidy v širokém rozsahu molekulových hmotností s nízkým indexem polydisperzity a v krátkých časových intervalech tak, aby byla zachována základní struktura polymeru, to znamená, aby při depolymerizaci nedocházelo ke vzniku nových funkčních skupin nebo ke kontaminaci vedlejšími reakčními produkty, které by mohly negativně ovlivnit biologickou aktivitu degradovaného polymeru a bylo jej tak možno použít jako aktivní látku nebo nosič v kosmetice a ve farmacii.

Hyaluronan s nízkou a velmi nízkou molekulovou hmotností a oligosacharidy hyaluronanu s molekulovou hmotností v rozmezí od 2,4 do 1300 kDa se připravují v několika krocích.

Princip přípravy spočívá v tom, že se nejprve u vodného roztoku hyaluronanu, se střední nebo vysokou molekulovou hmotností vyrobeného fermentačně, upraví pH do kyselé oblasti v rozmezí 2,5 až 6,0 podle toho, jak nízké molekulové hmotnosti je potřeba dosáhnout. Se snižující se požadovanou molekulovou hmotností hyaluronanu je třeba volit nižší pH roztoku hyaluronanu.

Koncentrace hyaluronanu v roztoku se volí podle jeho výchozí molekulové hmotnosti tak, aby výsledná viskozita roztoku neomezovala manipulaci s ním. Koncentrace roztoku kyseliny pro úpravu pH není nijak omezena, s výhodou se však používá 2 - 5% roztok kyseliny sírové, kyseliny trifluoroctové nebo kyseliny chlorovodíkové, případně se roztok hyaluronanu neupravuje, pokud má hodnotu pH 6,0 nebo nižší.

Baňka s roztokem hyaluronanu připraveným podle vynálezu se potom umístí pod zpětný chladič v mikrovlnném reaktoru a působením mikrovlnného záření se přivede k varu. Přitom se uplatňuje tak zvaný „superheating effect“ podle Kingston Η. M., Haswell S. J.: MicrowaveEnhanced Chemistry, American Chemical Society, Washington, D.C., 1997. Doba varu roztoku se opět řídí požadovanou molekulovou hmotností hyaluronanu a závisí i na maximálním výkonu mikrovlnného reaktoru, kmitočtu vln (s výhodou 2,45 GHz) a množstvím roztoku hyaluronanu, vloženého do reaktoru.

Po skončení hydrolýzy se roztok hyaluronanu ochladí studenou vodou nebo ledem a jeho pH se upraví zpět do neutrální oblasti. Polysacharidy nebo olígosacharidy, které jsou výsledkem štěpení se izolují z roztoku vysrážením vhodným organickým rozpouštědlem jako je např. etanol, 2-propanol, aceton a nebojsou po dialýze a ultrafiltraci usušeny lyofilizací.

V následující tabulce jsou uvedeny dosažené molekulové hmotnosti hyaluronanu při použití mikrovlného ohřevu roztoku hyaluronanu za různých podmínek jako je koncentrace hyaluronanu v roztoku, pH roztoku, množství roztoku hyaluronanu a doba degradace. Molekulové hmotnosti byly stanovovány ze změřených kinematických viskozit (fosfátový pufr pH 7,0, Ubbelohdeho viskozimetr, K = 0,01 mmV, 25 °C +/- 0,2 °C.)

Molekulová hmotnost hyaluronanu po štěpení v mikrovlnném reaktoru
PH 6-65 min	864 kDa
PH 5-20 min	990 kDa
PH 4-40 min	330 kDa

PH 3 - 20 min	126 kDa
pH 2,5 - 300 min	6 kDa

Porovnání FT-IR spekter původního hyaluronanu a hyaluronanů s nízkou a velmi nízkou molekulovou hmotností připravených hydrolytickou reakcí za pomoci mikrovlnného záření je na obrázku 1. Z obrázku je zřejmé, že primární struktura hyaluronanu zůstává při tomto postupu zachována. Nemění se ani poloha pásů, mění se jen jejich intenzita. Nevznikají zde nové pásy, tudíž není vidět tvorba nových funkčních skupin v detekovatelných množstvích.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. FT-IR spektra (zdola nahoru) původního hyaluronanu a hyaluronanů s nízkou a velmi nízkou molekulovou hmotností, připravených depolymerizační hydrolytickou reakcí za pomoci mikrovlnného záření: 120 minut při pH6 (H2SO4) - 630 kDa; 300 minut při pH 5 (H2SO4) - 169 kDa; 540 minut při pH 5 (HC1) - 93 kDa; 120 minut při pH 4 (H2SO4) - 62 kDa; 120 minut při pH 3 (H2SO4) - 17 kDa.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

4.5 g hyaluronanu sodného o molekulové hmotnosti 1,36 MDa se rozpustilo ve 450 ml demineralizované vody, přitom pH roztoku se neupravovalo, protože bylo 6,0. Baňka s takto připraveným roztokem hyaluronanu se umístila pod zpětný chladič mikrovlnného reaktoru nastaveného na maximální výkon 800 W. Po ohřátí roztoku k varu se odměřil čas reakce 60 minut. Po uplynutí této doby se roztok ochladil vodou. Hyaluronan se vyizoloval z roztoku srážením 2-propanolem a vysušil. Molekulová hmotnost produktu byla stanovena na 864 kDa.

Příklad 2

1.5 g hyaluronanu sodného o molekulové hmotnosti 1,50 MDa se rozpustilo ve 150 ml demineralizované vody, pH roztoku se upravilo 5 % roztokem HC1 na hodnotu 5,0. Baňka s takto připraveným roztokem hyaluronanu se umístila pod zpětný chladič mikrovlnného reaktoru nastaveného na maximální výkon 800 W. Po ohřátí roztoku k varu se odměřil čas reakce 15 minut. Po uplynutí této doby se roztok ochladil vodou. Hyaluronan se vyizoloval z roztoku srážením 2-propanolem a vysušil. Molekulová hmotnost produktu byla stanovena na 990 kDa.

Příklad 3

4,5 g hyaluronanu sodného o molekulové hmotnosti 1,36 MDa se rozpustilo ve 450 ml demineralizované vody, pH roztoku se upravilo 5 % roztokem H2SO4 na hodnotu 4,0. Baňka s takto připraveným roztokem hyaluronanu se umístila pod zpětný chladič mikrovlnného reaktoru nastaveného na maximální výkon 800 W. Po ohřátí roztoku k varu se odměřil čas reakce 35 minut. Po uplynutí této doby se roztok ochladil vodou. Hyaluronan se vyizoloval z roztoku srážením 2-propanolem a vysušil. Molekulová hmotnost produktu byla stanovena na 330 kDa.

Příklad 4

4,5 g hyaluronanu sodného o molekulové hmotnosti 1,36 MDa se rozpustilo ve 450 ml demineralizované vody, pH roztoku se upravilo 5 % roztokem H2SO4 na hodnotu 3,0. Baňka s takto připraveným roztokem hyaluronanu se umístila pod zpětný chladič mikrovlnného reaktoru nastaveného na maximální výkon 800 W. Po ohřátí roztoku k varu se odměřil čas reakce 15 minut. Po uplynutí této doby se roztok ochladil vodou. Hyaluronan se vyizoloval z roztoku srážením etanolem a vysušil. Molekulová hmotnost produktu byla stanovena na 126 kDa.

Příklad 5

2,25 g hyaluronanu sodného o molekulové hmotnosti 1,51 MDa se rozpustilo ve 450 ml demineralizované vody, pH roztoku se upravilo 5 % roztokem HC1 na hodnotu 2,5. Baňka s takto připraveným roztokem hyaluronanu se umístila pod zpětný chladič mikrovlnného reaktoru nastaveného na maximální výkon 800 W. Po ohřátí roztoku k varu se odměřil čas reakce 300 minut. Po uplynutí této doby se roztok ochladil vodou. Hyaluronan se vyizoloval z roztoku srážením etanolem a vysušil. Molekulová hmotnost produktu byla stanovena na 6 kDa.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy hyaluronanu s nízkou nebo velmi nízkou molekulovou hmotností nebo oligosacharidů hyaluronanu, vyznačující se tím, že tento hyaluronan se připraví v kyselém prostředí za použití mikrovlnného záření.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že molekulová hmotnost hyaluronanu připraveného způsobem uvedeným v nároku 1 je v rozmezí od 2,4 do 1 300 kDa.
3. 3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že hyaluronan může být volnou kyselinou hyaluronovou nebo kteroukoliv její solí.
4. 4. Způsob podle nároku 1 až 3, vyznačující se tím, že hyaluronan se depolymerizuje ve vodném roztoku, přitom jeho pH se pohybuje v rozmezí 2,5 až 6,0.
5. 5. Způsob podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že depolymerizace hyaluronanu probíhá při varu roztoku za atmosférického tlaku pod chladičem.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kmitočet zdroje mikrovlnného záření je 2,45 GHz a výkon zdroje mikrovlnného záření je větší než 750 W.