CZ2002344A3 - Způsob přípravy izotransgenních linií a rostliny, připravené tímto způsobem - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy izotransgenních linií, který spočívá v tom, že obsahuje krok umožňující zacílit (identifikovat) genom, který získal T-DNA po transformaci hybrida, a dále se vynález týká komerčních hybridů připravených užitím izotransgenních linií.

Stav techniky

Termín „izotransgenní linie znamená izogenní transgenní linie, přičemž izogenie je definována jako takový stav genomu, kdy se genotypy od sebe liší pouze v malém počtu genů (1 nebo 2), a kterého lze často dosáhnout při zpětném křížení. Izotransgenní linie podle vynálezu jsou charakterizovány jako linie se stabilním čistým genotypem „požadované linie v celém genomu a mají stabilně integrovanou T-DNA obsahující transgen.' Tyto linie jsou jedinečné tím, že neobsahují žádný fragment pocházející z transformační linie, a tedy nepředstavují genetickou zátěž v následujících selekčních krocích.

Termínem „T-DNA nebo také transferová DNA se rozumí fragment DNA, obsahující požadovaný gen se sekvencemi umožňujícími jeho expresi, který je přenesen a integrován do hostitelského genomu při transformaci.

Podle vynálezu jsou rozlišovány dva typy linií: transformační linie neboli linie vhodné k transformaci, například typ A188; a linie nevhodné k transformaci, viz dále zmiňované jako požadované linie nebo agronomicky významné • · φ φ · · · · · φ · • ΦΦΦ φφφ φ · φ · φφφφ φφφφ φφ « φ φφ φφφ ΦΦΦΦΦΦΦ φ φ

- 2 linie. Pojem „elitní linie označuje agronomicky významné linie se značným potenciálem komerčního využití v současné době. Elitní linie jsou linie s žádoucími agronomickými vlastnostmi spojené s určitými fenotypovými znaky, především růstovými parametry a výnosovými charakteristikami linie. Tyto zemědělsky významné vlastnosti jsou potom technickými parametry, které určují potenciál jejich komerčního využití, mj. možnosti využití v různých selekčních programech souvisejících s uvedením komerčních linií na trh.

Obecně příprava komerčních hybridů probíhá v několika krocích: (1) získání čistě homozygotních parentálních linií s využitím genetického materiálu vybraného na základě jeho potenciálu; (2) křížení těchto linií a získání hybridů a (3) zhodnocení komerčního potenciálu těchto hybridů, který je funkcí požadovaných fenotypových znaků a vitality hybridů, nebo heteroze (růstové parametry a výnos). Komerční potenciál hybridů se zvyšuje, pokud rodičovské linie patří k různým heterotickým skupinám a pokud tyto linie mají výhodné vlastnosti. Důraz je proto kladen na výzkum a vývoj vylepšených rodičovských linií získaných především transgenozí.

Dosavadní transformační techniky bohužel neumožňují přímou cestou efektivně transformovat velkou většinu zemědělsky významných linií, včetně výběrových (elitních) linií, jež se dosud nedařilo transformovat, nebo nebyly vhodné pro transformaci (nulová úspěšnost transformace nebo úspěšnost řádu 1/100 až 1/10), což platí zejména pro kukuřici.

V současnosti je k dispozici řada studií týkajících se jak vylepšování podmínek transformace a následných regeneračních kroků v podmínkách in vitro, tak také hledání výchozího rostlinného materiálu s.vysokou úspěšností transformace.

• · • · • · • · · · · · • · · · · · • · ··· · · <

·· ·· > · · I

I · fl · · ·

Hlubší znalosti vlivu vnějších faktorů na rostlinu umožnily optimalizovat postup kultivace v podmínkách in vitro (transformace a regenerace) tak, aby byla vhodná pro větší počet genotypů. Tato vylepšení však nejsou dostačující pro některé genotypy, zvláště pro ty zemědělsky atraktivní (Armstrong et al., 1992).

V současnosti se proto doporučuje pro vývoj metodiky nevybírat jako výchozí rostlinný materiál čisté linie, které se často nedaří transformovat.

doporučuje především následující:

1) transformace donorové k transformaci, např. typ A188 a následné několikanásobné

Pro genotypy kukuřice se (dárcovské) linie (Armstrong et al., zpětné křížení liniemi vhodné 1985), s čistými nevhodnými recipientními (příjemcovskými) k transformaci vedoucí k·získání (k dosažení úplné izogenie je nutné provést nejméně 5 až 6 zpětných křížení). V praxi je v optimálním případě výsledkem těchto zpětných křížením „pseudoizogenie, tzn. že fragment genomu donorové linie bývá ireverzibilně spojen s transgenem. Takovýto fragment potom může představovat genetickou zátěž komplikující následné selekční kroky, a to v závislosti na velikosti a povaze fragmentu, což je závislé na rekombinačních procesech anebo na dostupnosti molekulárního markéru selekce. Rekombinace, jež by mohla tuto zátěž snižovat, probíhá navíc jen výjimečně, protože rekombinace homeologních sekvencí nebývá tak častá jako u sekvencí homologních, což snižuje pozitivní efekt zpětného křížení. V případě, že je použit jako výchozí materiál genotyp vhodný pro transformaci, např. A188, představuje tato metoda velké riziko vzniku nežádoucích genetických odchylek u produkovaných hybridů.

2) přímá transformace hybrida „transformační linie x linie zemědělsky významné (Ishida et al., 1996). U tohoto hybrida se kombinují transformačně regenerační vlastnosti ,izotransgenní linie' ·· 44 444 44 44 • 444 444 444 4

4444 4444 44 4

44 444 4444444 4 4

4444 44 4 444

44 44 4 444444 s agronomickými parametry rodičovských linií, a zdá se tedy být vhodnějším výchozím materiálem pro výslednou produkci komerčních hybridů. Přesto ale výsledky dosažené Ishidou et al. (1996) ukazují na jasný pokles účinnosti transformace hybridů v porovnání s linií genotypu A188. Nelze se ani vyhnout riziku genetické zátěže výsledného produktu, protože k integraci transgenu může dojít na jednom ale i více chromozómech hybrida (např. na chromozómu donorové linie typu A188 k tomuto dochází v 50 % případů).

Mezinárodní patentová přihláška WO 98/32326 (Pioneer) navrhuje upravovat dva parametry - podmínky kultivace in vitro a výchozí rostlinný materiál - tak, aby se zlepšila efektivita transformace a umožnila tak aplikovat výchozí metodu popsanou Ishidou et al. (1996) na další linie, tedy také na A188. Tato přihláška uvádí, že dojde ke zvýšení účinnosti transformace v porovnání s účinností dosažitelnou při použití základního protokolu, přesto však zůstává nízká u linií nevhodných pro transformaci.

Dosud tedy nebyl popsán ani způsob ani rostlinný materiál, které by vedly k získání skutečných „izotransgenních linií, které by vyhovovaly jak požadavku vysoké frekvence transformace (což vylučuje použití čistých linií nevhodných pro transformaci), tak nutnosti opravdové izogennie připravovaných transgenních linií (což naproti tomu upřednostňuje čisté linie, aby byla vyloučena genetická zátěž pocházející z transformace hybridních linií).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje originální postup přípravy izotransgenních linií. Jedná se o nový způsob přípravy, který zahrnuje postup vedoucí k identifikaci genomu s vnesenou T-DNA. Tento způsob, který vychází z transformace hybrida, zahrnuje krok selekce primárních transformantů linií nevhodných pro transformaci, u nichž došlo pouze k integraci T-DNA do genomu (podle předpokladu 50% transformantů). Tyto vybrané transformanty dají zpětným křížením s agronomicky významnou rodičovskou linií vznik izotransgenním liniím.

Tento postup selekce transformantů s transgenem integrovaným do genomu linie nevhodné k transformaci nebyl dosud ve stavu techniky ani navržen ani popsán. Výhodou způsobu podle vynálezu je možnost přípravy „skutečně izotransgenní linie, tedy linie, která neobsahuje žádný fragment pocházející z linie vhodné k transformaci, a to i že si současně udržuje dostatečnou transformační Navíc tento způsob nabízí urychlení přenosu požadovaného genu do genomu tím, že se sníží potřebný počet zpětných křížení.

Způsob podle vynálezu zahrnuje krok selekce primárních transformantů, který lépe uspokojuje požadavky na průmyslové využití, a to svou rychlostí a účinností, které dosud popsané metody nesplňovaly.

Způsob podle vynálezu je velmi cenný, zejména v případě, že požadovaná linie je součástí mnoha hybridních postupů, nebo že je použitelná i pro komerčně žádané linie. Metoda také dovoluje přípravu transgenních rostlin, které například, jak je dále popsáno, exprimují antisense RNA, který udílí rostlině rezistenci přesto, účinnost.

protein, patogenům ribozym, nebo k chorobám či anebo vylepšuje její kvalitu z hlediska agronomického či výživového (aminokyseliny, olej, škrob atd.).

Způsob variabilitu podle vynálezu také nabízí větší genetickou zdrojových linií z rozsáhlých heterotických skupin, jež jsou použity jako rodičovské linie pro přípravu komerčních hybridů. Dále tento postup umožňuje nahromadění * · různých vlastností v zemědělsky zajímavých transformovaných liniích bez další genetické zátěže způsobené vnesením DNA fragmentů transformované linie. Z tohoto hlediska je zajímavá zvláště možnost rozšíření i na zdrojové genotypy použité pro přípravu komerčních hybridů, které mají dostatečnou, či dokonce zvýšenou vitalitu.

Podle prvního provedení způsob přípravy izotransgenních rostlinných linií, tak jak je popsána ve vynálezu, zahrnuje tyto kroky:

a) transformaci buněk hybridní linie pocházející z křížení dvou rodičovských linií, linie našeho zájmu a linie vhodné pro transformaci, vektorem nesoucím T-DNA obsahující transgen;

b) selekci primárních transformantů, tedy těch hybridů, které mají integrovanou T-DNA do genomu linie našeho zájmu;

c) zpětné křížení vybraných primárních transformantů z bodu b) s rodičovskou linií - linií našeho zájmu, a selekci jedinců vzniklých opakovaným zpětným křížením až do získání izotransgenní linie.

Při počáteční selekci jsou upřednostňovány hybridní primární transformanty, které vykazují přítomnost jednoho lokusu, nebo jedné kopie inzertu T-DNA, např. tedy ty, u kterých došlo k integraci transgenu v jedné kopii nebo několika kopií v tandemu do stejného chromozomálního lokusu. Jedinci s jednou kopií transgenu jsou pak zvláště výhodní, protože se u nich neprojevuje fenomén genové extinkce, vyskytující se v případě inzerce několika kopií do genomu, a také je u nich snazší monitorování transgenu. Výraz „inzerce bez extra-hraničních sekvencí se používá pro transformanty s integrovanou T-DNA obsahující pouze transgen bez sekvencí pocházejících z plazmidu, které leží vně T-DNA, tj. bez extra-hraničních sekvencí.

4 · · · 4 · ·· ·· • · · · 4 4 · · · · * ···· · 4 4 · ·· »

44 444 4444444 4 4

4444 44 4 444

Transformanty, které mají T-DNA integrovanou v jednom lokusu a pokud možno v jedné kopii a které neobsahují extra-hraniční sekvence, se selektují pomocí Southernovy hybridizace s využitím různých restrikčních enzymů a DNA hybridizačních sond (Southern, 1975). Tato metoda umožňuje identifikaci a charakterizaci inzerce do genomu rostliny, a tedy rozlišení různých transformačních událostí.

Pro způsob podle vynálezu je charakteristické, že krok selekce hybridních primárních transformantů obsahuje identifikaci genomových sekvencí přiléhajících k vnesené T-DNA tak, aby bylo možné určit rodičovský genom, který přijal T-DNA.

U každého primárního transformanta, který odpovídá očekávanému fenotypu a který byl vybrán na základě výše popsaných kritérií (inzerce v jedné kopii do jednoho lokusu bez extra-hraničních sekvencí), jsou izolovány a identifikovány sekvence hostitelského genomu přiléhající k T-DNA, např. pomocí metody PCR (Polymerase Chain Reaction polymerázová řetězová reakce, Saiki Rk. Et al., 1988), nebo lépe pomocí IPCR (Inverse PCR- inverzní PCR, Does Mp. Et al., 1991). Cílem je pak identifikovat, který rodičovský genom přijal transgen (požadovaná linie nebo transformační linie).

U každého transformanta se nakonec provádí identifikace rodičovského genomu, do něhož byla T-DNA inkorporována, především se ověřuje polymorfizmus velikosti restrikčních fragmentů (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism polymorfizmus délky restrikčních fragmentů, Burr B. et al. , 1983) mezi rodičovskými liniemi a transformantem, a to s využitím DNA hybridizačních sond navržených podle předem identifikované(ných) přiléhájící(ch) sekvence(í) genomu.

Alternativně je také možné identifikovat recipientní rodičovský genom sekvencováním hraničních sekvencí T-DNA a ověřením SNP (Single Nucleotide Polymorphism - polymorfizmus • · 9· • Μ · • · ·· • Φ · · • Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ

jednotlivých nukleotidů) mezi rodičovskými liniemi a transformantem.

Identifikované genomové sekvence přiléhající k T-DNA se dále využívají jako hybridizační sondy pro mapování populace podle dobře popsaných mapovacích technik (např. Murigneux et al., 1993). Výsledkem je určení chromozómu, kde došlo k inzerci, a detekce místa inzerce. Tato technika umožňuje také výběr určitých markérů v okolí místa inzerce, které v následných krocích usnadňují selekci jedincůpři zpětném křížení.

Konstrukce expresních vektorů pro transformaci (krok a) odpovídá standardním protokolům popsaným např. v Sambrook et al. (1989). Takové expresní vektory obsahují nukleotidové sekvence v sense nebo antisense orientaci, které kódují např. protein našeho zájmu (významný zemědělsky, nutričně nebo terapeuticky), nebo kódující protein rezistence k chorobám anebo patogenům (herbicid, insekticid), selekční markér, antisense RNA nebo ribozym atd., a také regulační sekvence ovlivňující expresi v rostlinném materiálu (konstitutivní nebo promotor, specifický signální peptid anebo Regulační sekvence využitelné podle vynálezu inducibilní terminátor).

popisuje Weising et al. (1988)

Jedná se především o promotory, polyadenylační sekvence, geny selekčních markérů, reportérové geny, enhancery a introny. Mimo cílové nukleotidové sekvence je třeba se ještě zmínit o všech nukleových kyselinách umožňujících vnesení nebo vylepšení užitečných znaků výsledných transgenních rostlin. Nukleové kyseliny mohou např. kódovat proteiny nebo antisense RNA transkripty, které zvyšuji u transformantů nutriční hodnotu, výtěžek, rezistenci k patogenům, k chorobám aj . . Takové geny jsou popsány především v patentových přihláškách WO 91/02071 a WO 95/06128.

φφ φφ φφ φ φφ φφ • φ φ · φ φ φ Φφφφ φφφφ φφφφ φφ φ φ φφ φφφ φφφφφφφ φ φ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ φφ φ φφφφφφ

Jako příklady lze uvést:

— bakteriální gen dapA zvyšující hladinu lyzinu;

— geny kódující endotoxin Bt, inhibitor proteáz, proteiny extrahované z baktérie rodu Photorabus (WO 97/17432 a WO 98/08932), anebo geny kódující rezistenci vůči hmyzu;

— proteiny či peptidy našeho zájmu nesoucí nové vlastnosti jako rezistenci k chorobám patří především chitinázy (WO 92/01792), glukanázy (WO 93/02197), oxalátoxidáza (WO 94/13790) nebo baktericidní či fungicidní peptidy, především peptidy tvořené méně než 100 aminokyselinami bohaté na cystein. Do této skupiny patří rostlinné thiony nebo defenziny, zvláště pak lytické peptidy různého původu obsahující jeden nebo více disulfidických můstků mezi zbytky cysteinu a oblasti se zvýšeným množstvím bazických aminokyselin. Jedná se především o následující lytické peptidy: androctonin (WO 97/30082 a

WO 99/09189), drosomicin (WO 99/02717), thanatin (WO 99/24594) a heliomycin (WO 99/53053). Podle specifického provedení vynálezu je protein nebo peptid našeho zájmu vybírán ze skupiny houbových eíicitorových peptidů, zejména ze skupiny elicitinů (Kamoun et al., 1993; Panabiěres et al., 1995).

— geny bar nebo pat nesoucí toleranci k bialafosu, bakteriálnímu nebo rostlinnému genu EPSPS kódujícímu rezistenci k herbicidu glyofosátu (US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,312,910, US 5,633,435, US 5,627,061, US 5,310,667, WO 97/04103); gen kódující glyofosátoxidoreduktázu (US 5,463,175), bakteriální nebo rostlinné geny kódující nativní, mutovaný nebo chimérický HPPD

ΦΦ ΦΦ φφφ 99

9 9 9 9 9 9 9 9 0 9

Φ Φ ΦΦ Φ Φ Φ Φ φφ Φ

Φ Φφ ΦΦΦ ΦΦΦΦΦΦΦ φ Φ ΦΦΦΦ ΦΦ Φ ΦΦΦ ·· 99 99 9 ΦΦ ΦΦΦΦ

- 10 (WO 96/38567, WO 98/02562, WO 99/24585, WO 99/24586), který udílí rostlině tolerancí k herbicidům, anebo proteiny, jejichž cílovým místem účinku je HPPD (diketony, izoxazoly, mezotrion atd.);

geny spojené s biosyntetickými procesy ovlivňujícími kvalitu produktů transgenních rostlin jako jsou geny kódující enzymy biosyntézy a degradace škrobu (např. syntézy, „rozvětvující enzymy atd.); geny kódující zásobní proteiny v zrnech (např. podjednotky gluteninů, gliadinů, hordeinů); anebo geny, které souvisí s pevností zrn u pšenice (např. puroindoliny).

geny pozměňující konstituci modifikované rostliny, obzvlášť množství a kvalitu některých esenciálních mastných kyselin (EP 666 918), nebo množství a kvalitu proteinů, především v listech a zrnech zmíněných rostlin. Zvláště pak se to týká genů kódujících proteiny s vysokým obsahem aminokyselin obsahujících síru (Kořit, A. A. et al.; WO 98/20133; WO 97/41239; WO 95/31554; WO 94/20828; WO 92/14822). Tyto proteiny bohaté na sirnaté aminokyseliny zachytávají nadbytečný cystein a metionin a fungují také jako jejich zásobárna, jinými slovy vychytáváním těchto aminokyselin zabraňují možným následkům spojeným s toxicitou vyvolanou jejich nadprodukcí. Patří sem geny kódující peptidy bohaté na sirnaté aminokyseliny, především na cystein, mající též významné baktericidní anebo fungicidní účinky. Zvláštní pozornost zasluhují zejména rostlinné defenziny a lytické peptidy různého původu, především následující peptidy: androctonin (WO 97/30082 a

0 00 #0*0 0

0 00 0

0 0 0 0 0

0 0 0 0

00

00 00 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 ·

0000000 0 0 0 0 0 0 0

00 0000

- 11 WO 99/09189), drosomicin (WO 99/02717), thanatin (WO 99/24594) a heliomycin (WO 99/53053).

— geny vytvářející samčí sterilitu (např. barnáza a PR-glukanáza pod kontrolou vhodného promotoru), které se používají pro přípravu hybridních semen.

Sekvence nukleových kyselin našeho zájmu se používají také jako genetický nástroj k vytváření mutantů a nebo jako pomocná agens při identifikaci, molekulárním značení nebo izolaci částí rostlinných genů. Další příklady jsou popsány v publikaci Weising et al..

Expresní vektory obsahující sekvenci nukleové kyseliny našeho zájmu, která má být vnesena do rostliny sestávají obvykle také ze selekčního markéru nebo reportérového genu, příp. obou. Jejich přítomnost zjednodušuje identifikaci a selekci transgenních buněk. Další možností je vnesení selekčního markéru ve druhém vektoru, který je použit při kotransformaci. K těmto sekvencím je třeba připojit na koncích regulační sekvence umožňující jejich expresi v rostlině. Selekční markéry jsou odborníkům velmi dobře známy a patří mezi ně např. geny pro rezistenci k antibiotikům a herbicidům. Konkrétní případy jsou popsány v práci Weising et al. nebo patentových přihláškách EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 nebo WO 97/04103. Nejčastěji používaný selekční markér je fosfotransferáza hygromycinu B (hpt) získaná z E. coli. Používá se také gen pro aminoglykozidfosfotransferázu transpozónu n5 (AphII) kódující rezistenci k antibiotikům kanamycinu, neomycinu a G418, dále také geny kódující toleranci ke glyofosátu, bialafosu, methotrexátu, imidazolinům, sulfonylmočovině, bromoxynilu, dalaponu a jejich derivátům. Geny selekčních markérů kódující toleranci k herbicidům se užívají také komerčně při práci s transgenními rostlinami. Obecně se za reportérový gen považuje φφ Φφ φφ · ·φ φφ • · · φ φ φ φ φ φ φ « φφφφ φφφφ φφ φ φ φ φ φφφ φ φφφφ φφφ φ φφφφ φφ φ φφφ φφ «φ φφ φ φφ φφφφ

- 12 takový gen, který není přítomen nebo exprimován v recipientním organizmu nebo pletivu a který kóduje protein, jehož exprese je snadno detekovatelná, např. vyvolává fenotypovou změnu nebo změnu aktivity enzymu. Příklady uvádí opět Weising et al.. Mezi takové výhodné geny patří gen pro chloramfenikolacetyltransferázu (cat) z tn9 E. coli, beta-glukuronidázu (gus) z uidA lokusu E. coli, zelený fluorescenční protein (GFP, „green-fluorescent protein) z Aequoria victoria a luciferázu z Photinus pyralis.

Regulační sekvence dále obsahují konstitutivní promotory, inducibilní promotory, tkáňově nebo orgánově specifické promotory anebo promotory specifické pro určité stádium vývoje, jež mohou být exprimovány v rostlinných buňkách. Tyto promotory jsou také popsány v práci Weising et al. a patří sem:

regulační sekvence T-DNA A. tumefaciens, včetně manopinsyntázy, nopalinsyntázy a oktopinsyntázy; promotor alkoholdehydrogenázy z kukuřice, promotory indukovatelné světlem jako je gen pro malou podjednotku ribulózobisfosfátkarboxylázy z různých rostlinných druhů a promotor genu pro chlorofyl a/b vázající protein;

histonové promotory (EP 507 698), které je možné volitelně kombinovat s prvním intronem genu pro aktin z rýže (WO 99/34005);

promotor ubikvitinu 1 z kukuřice (Christensen et al., 1996);

35S promotor viru mozaiky květáku, případně 19S promotor, nebo vhodnější konstitutivní dvojitý 35S promotor (pd35S) popsaný v článku Kay et al. (1987); pCRU promotor genu kruciferinu z ředkve, umožňující expresi připojených sekvencí pouze v semenech (nebo ·· ·4 94 4 44 44

9 4 9 4 4 9 4 4 4 4 • 9 44 4 4 9 4 4 4 ·

49 494 4 4444 944 4

4 9 4 4 4 4 4 4 4 ·· ·4 94 9 499449 zrnech) odvozených transgenních rostlin (Depigny-This et al., 1992);

pGEAl a pGEA6 promotory odpovídající 5'-nekódující oblasti genů zásobních proteinů GEAl a GEA6 z Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), které taktéž umožňují specifickou expresi pouze v semenech; aktinový promotor spojený s intronem aktinového genu z rýže (pRA-RAI), který je součástí plazmidu pActl-F4 popsaného v McElroy et al. (1990);

HMWG (vysokomolekulární glutenin, „high molecular weight glutenin) promotor z pšenice (Robert et al.,

1989);

promotory umožňující regulaci v průběhu vývoje, např.

promotory genů „waxy, kukuřice;

orgánově specifické ,bronze a genů pro zein z promotory nebo promotory specifické pro určité vývojové stádium, jakým je např.

alfa-tubulinový US 5,635,618; promotor zeinu promotor popsaný v přihlášce z kukuřice („Pzéine) umožňující expresi v albumenu kukuřičných semen (Reina et al.,

1990);

N promotor genomového klonu kukuřice, jehož cDNA sekvenci uvádějí ve své publikaci Shen et al. (1994);

Dále se používají také regulační sekvence promotorů, které jsou specifické pro určité části nebo pletiva rostliny, zejména promotory funkční v semenech (Datla et al., 1997), především promotory napinu (EP 255 378), faseolinu, gluteninu, heliantininu (WO 92/17580), albuminu (WO 98/45460), oelosinu (WO 98/45461) a ATS1 nebo ATS3 promotory (WO 99/20775).

Využívá se také inducibilních promotorů, zejména jsou vhodné promotory fenylalaninamoniaklyázy (PAL), reduktázy

00 > » 0 0 • 00 0 0

0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 «0 0

0000

00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0000

- 14 HMG-CoA (HMG), chitinázy, glukanázy, inhibitorů proteináz (PI) , promotory PR1 genové rodiny, promotor nopalinsyntázy (nos) anebo vspB genu (US 5, 670, 349), promotor HMG2 (US 5,670,349), promotor jablečné beta-galaktozidázy (ABG1) anebo promotor jablečné aminocyklopropankarboxylátsyntázy (ACC syntézy) (WO 98/45445).

Pro zlepšení exprese či funkce požadované sekvence nukleové kyseliny se připojují i další elementy jako introny, enhancery, polyadenylační sekvence a jejich deriváty. Příkladem používaného enhanceru je translační aktivátor viru mozaiky tabáku (TMV) popsaný v přihlášce WO 87/07644, nebo virus leptání tabáku (TEV) popsaný Carringtonem a Freedem (1990). Mezi používané introny patří první intron AdhlS z kukuřice umístěný mezi promotor a kódující sekvenci požadované nukleové kyseliny. Tento intron zabudovaný do genetického konstruktu zvyšuje expresi proteinu v buňkách kukuřice (Callis et al. , 1987). Používá se také první intron kukuřičného genu shrunken-1 (Maas et al., 1991), první intron z genu pro katalázu (cat-1) ze skočce (Ricínus communis) (Ohta et al., 1990); druhý intron genu pro katalázu ST-LS1 z bramboru (Vancanneyt et al., 1990); intron viru žluté zakrslosti tabáku (DSV) (Morris et al., 1992); intron aktinu-1 z rýže (McElroy et al. , 1990) a intron 1 genu pro triózafosfátizomerázu (TPI) (Snowden et al., 1996). Dostatečné exprese sekvence našeho zájmu lze však často dosáhnout i bez přítomnosti jakéhokoli intronu (Battraw et al., 1990).

Expresní vektor také může obsahovat sekvenci(e) kódující signální peptid(y) sloužící k navedení proteinu kódovaného heterologním genem do chloroplastu rostlinné buňky. Tyto signální peptidy jsou dnes již odborníkům velmi dobře známy a patří mezi ně jak jednoduché signální peptidy, tak i složené signální peptidy sestávající z kombinace sekvencí nejméně dvou signálních peptidů. Mezi jednoduché signální peptidy patří

9

19 * 1 1

1» 99 » · · ··«« 9··· 1 1 9

19 19 9 4 9919 19 1 9 • 1 9 9 9 9 9 Λ 9 9

19 99 · «4 1991

- 15 EPSPS signální peptid (popsaný v US patentu 5,188,642) nebo rostlinný signální peptid malé podjednotky ribulózobisfosfátkarboxylázy/oxygenázy (RuBisCO ssu), který může obsahovat několik aminokyselin z N-terminální části zralé RuBisCO ssu (viz EP 189 707) . Složené signální peptidy jsou produktem fúze jednoho rostlinného signálního peptidu fúzovaného s N-terminální sekvencí zralého proteinu lokalizovaného v plastidu a druhého rostlinného signálního peptidu (popsáno v patentu EP 508 909). V konkrétním případě se složený optimalizovaný signální peptid skládá ze signálního peptidu RuBisCO ssu ze slunečnice a signálního peptidu s 22 aminokyselinami N-konce RuBisCO ssu z kukuřice fúzovanými se signálním peptidem RuBisCO SSU z kukuřice. Tento příklad včetně kódující sekvence peptidu je popsán v patentu EP 508 909. Výhodným tranzitním peptidem je Optimalizovaný Signální Peptid (OTP) popsaný v patentu US 5,635,618.

Rostlinné buňky se transformují standardními technikami, které jsou odborníkům známy.

V této souvislosti je třeba se zmínit zejména o metodách přímého přenosu genů, přímé mikroinjekci do rostlinného embryoida (Neuhaus et al., 1987), vakuové infiltraci (Bechtold et al., 1993) a elektroporaci (Chupeau et al., 1989) i alternativních metodách přímé precipitace s použitím PEGu (Schocher et al., 1986) nebo „biobalistické metodě ostřelování mikročásticemi („particle bombardment, (Fromm M. et al., 1990).

Další možnou transformační metodou je infekce rostliny bakteriálním kmenem, zejména Agrobacteriem. Podle jednoho provedení metody vynálezu, se rostlinné buňky transformují vektorem daného kmene podle vynálezu, který je schopen infikovat uvedené rostlinné buňky a integrovat do jejich genomu DNA sekvenci našeho zájmu, jež byla původně součástí vektoru. Výhodným infekčním kmenem je již zmíněný buněčný • · • · • · « • · ·«

Agrobacterium tumefaciens, zejména podle metody článku An et al. (1986), nebo Agrobacterium podle metody popsané v článku Jouanin et al.,

- 16 hostitel, popsané v rhizogenes,

1987 .

Nejčastěji se rostlinné buňky transformují tak, že dojde k přenosu T oblasti extrachromozomálního tumor-indukujícího Ti plazmidu Agrobacteria tumefaciens do rostliny. K přenosu se využívá binárního systému, kdy jsou do rostliny přeneseny dva vektory (Watson et al·.). U jednoho vektoru je deletována T-DNA oblast s výjimkou pravé a levé hraniční sekvence, mezi které je vnesen markerový gen umožňující selekci rostlinných buněk. Druhý vektor binárního systému je pomocný Ti plazmid, tedy pozměněný plazmid, který již neobsahuje T-DNA, ale stále nese oblast vir (oblast virulence) podmiňující transformaci rostlinných buněk. Tento plazmid se udržuje v Agrobacteriu.

Transformace rostlinných buněk Agrobacteriem se výhodně provádí podle protokolu popsaného Ishidou et al. (1996), především se jako vhodný transformační materiál používají nezralá embrya 10 dní po fertilizaci.

Podobná metoda, používaná pro transformaci nezralých popsána v mezinárodní patentové přihlášce při transformaci květenství jednoděložných rostlin se pak vychází z metody popsané v patentové přihlášce WO 99/67357.

embryí, je WO 98/32326,

Výběr obou rodičovských linií má následující kritéria:

1) schopnost transformace (rodičovské transformační linie), a

2) polyvalence nebo komerční význam s ohledem na poptávku trhu (požadovaná rodičovská linie).

V současnosti je za linii s nejvyšší schopností transformace Agrobacteriem považována linie A188 běžně používaná k transformacím. Mezi známé komerčně významné elitní linie a transformační linie patří zejména linie popsané • · ·· ·· • 11 i • 1 1

111

- 17 Ishidou et al. (1996) a v patentové přihlášce firmy Pioneer (WO 98/32326,).

Podle způsobu podle vynálezu jsou k transformaci vhodné mj. buňky významných hospodářských plodin (kukuřice, pšenice, řepka olejka, slunečnice, hrách, sója, ječmen atd.), nebo různé druhy zeleniny a okrasných květin.

Výše popsaný postup transformace (krok a) a selekce (krok b - podle vynálezu) umožňuje selekci transformantů s transgenem integrovaným do genomu, a to i u genotypů nevhodných k transformaci. Takto vybrané transformanty mají 50% genomu transformační rodičovské linie a 50% zemědělsky významné linie.

Rekonverze na genom linie s požadovaným stabilním čistým genomem (krok c) zahrnuje následné zpětné křížení s požadovanou rodičovskou linií a selekci získaných jedinců standardními metodami fenotypové analýzy, nebo častěji selekci pomocí mapovacích markérů (Hospital et al., 1992).

Tato selekce je založena především na následujících kritériích:

(i) Variabilitě okolí místa integrace transgenu, eliminaci všech fragmentů pocházejících z donorové transformační linie (selekce rekombinací). Žádoucí genetická rekombinace je selektována na jedné straně genu v jedné generaci zpětného křížení a na druhé straně v generaci následující.

(ii) Vyhledávání nejvyššího podílu požadovaného v celém genomu (procentuální poměr agronomicky zajímavého genomu k celému genomu).

Krok (i) je limitující v případě, že je transgen inzertován např. do genomu typu A188, kdy je nutné odstranit všechny fragmenty pocházející z této transformační linie výběrem jedinců, u nichž došlo k rekombinaci v nejbližším okolí integrace transgenu (stává se jen výjimečně). To vyžaduje: provedení zpětného křížení u velkého počtu rostlin

4

444 44 44

444 4 · 4 4

4444 4444 44 · ·4 444 4444444 · ·

4444 44 4 444

44 44 4 444444

- 18 tak, aby bylo možné selektovat nejméně jednu rostlinu, u níž bude transgen správně rekombinovaný na obou stranách inzerčního místa (druhé zpětné křížení); a dále provedení dalšího zpětného křížení s dostatečným množstvím rostlin k aplikaci selekčního tlaku na celý genom. Protože je možné získat rostliny se stabilním 99% podílem požadovaného genomu teprve až ve čtvrtém zpětném křížení, rostliny zůstávají přinejmenším pseudoizogenní v místě inzerce transgenu.

Pokud se transgen začlení do genomu agronomicky významné linie (požadovaná rodičovské linie) a pokud je možné selektovat primární transformanty s těmito vlastnostmi podle vynálezu, není již nutné provádět krok (i) selekce rostlin se vzácnými rekombinacemi. Proto je možné snížit počet potřebných zpětných křížení, počet testovaných jedinců anebo počet selekčních markérů tak, jak bude popsáno v Příkladu 4. Objasnění celé metody rekonverze na čistý genom našeho zájmu zvyšuje prospěšnost tohoto vynálezu, který se týká přípravy pravých izogenních transgenních linií.

Předmětem vynálezu je také způsob, kde jsou jedinci selektováni již v prvním zpětném křížení podle bodu c) , pokud mají chromozóm, do kterého se integrovala T-DNA, s konzervovaným genotypem v celém genomu požadované linie a kde požadovaný genom je zastoupen v poměru ku celému genomu alespoň ze 75 %.

Do rozsahu vynálezu spadá také způsob vnesení různých transgenních vlastností do rostlin, aniž by došlo k vnesení fragmentu spojeného s transgenem, který by mohl představovat pro rostlinu genetickou zátěž.

Vynález se dále také týká způsobu zacílení (identifikace) rodičovského genomu s vnesenou T-DNA po transformaci hybrida a identifikaci genomových sekvencí přiléhajících k vnesené T-DNA.

4 4 4 4 4 4 4 4 ··

4 4 4 · · · 4 4 4 ·

4 4 4 ···· 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4444 4 4 4 4

4444 44 4 444

4 44 44 4 444444

- 19 Předmětem vynálezu jsou také jakékoli transgenní rostliny, a především jejich semena, získané podle vynálezu v jednom nebo více krocích popsaných v přihlášce.

Předmětem vynálezu jsou dále pravé izotransgenní linie připravené z hybridních transformantů a charakterizované požadovaným stabilním čistým genotypem v celém genomu, se stabilně integrovanou T-DNA obsahující transgen. Podle vynálezu jsou takto připravenými pravými izotransgenními liniemi především linie elitní.

Způsob podle vynálezu je charakterizován dále tím, že podle dalšího provedení zahrnuje navazující kroky křížení izotransgenní linie podle vynálezu a další požadované linie, především pak další izotransgenní linie podle vynálezu, která obsahuje odlišný transgen, což sloužící k přípravě komerčních hybridů.

Vynález se také vztahuje na takto připravené komerční hybridy.

Dále popsané obrázky a příklady ilustrují předmět vynálezu, aniž by jakkoliv omezovaly jeho rozsah.

Popis obrázků

Obrázek 1: mapa plazmidu konstruktu odvozeného od pBIOS273

Obrázek 2: příklad rodičovského genomu s přijatou T-DNA pomocí RFLP analýzy primárních transformantů

- 20 Příklady provedení vynálezu

Transformace kukuřice popsaná v příkladech byla provedena zejména podle protokolu Ishida et al. (1996) využívajícího přirozených vlastností Agrobacteria tumefaciens a strategie binárních vektorů (Hiei et al., 1994).

Příklad 1

Příprava vektorů

Příprava podvojného plazmidu sestává z homologní rekombinace mezi přechodným konstruktem nesoucím T-DNA s klonovaným genem našeho zájmu (nebo také se selekčním markérem) a vektorem „Japan tobacco pSBl (viz EP 672 752). Tento vektor obsahuje geny virB a virG z plazmidu pTiBo542, který byl izolován ze supervirulentního kmene Agrobacteria tumefaciens A281 (ATCC 37349), a také homologní oblast, která je přítomna i v přechodném vektoru, což dovoluje provést homologní rekombinaci.

Přechodný (intermediátní) vektor pro vložení požadovaného genu je pBIOS 273. Tento konstrukt se připravuje ve dvou hlavních krocích:

Vložení fragmentu (pAct-Bar-terNos) štěpeného restrikčními enzymy BspDI a Xhol pocházejícího z vektoru pDM 302 (Cao et al., 1992) do vektoru pSBl2 (Komáři T. et al., 1996) štěpeného enzymy Smál a BspDI: vektor pDM302 je nejprve štěpen enzymem Xhol, který rozeznává pouze jediné restrikční místo v tomto vektoru. Tímto štěpením vznikají 5'-přesahující kohezní konce, které jsou posléze pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerázy I zatupeny. Druhé štěpení probíhá pomocí BspDI • · · · · · ·

- 21 (kohezní konce). Spojení zatupeného Xhol místa a místa pro Smál umožňuje vytvořit znovu restrikční místo pro Xhol (v pozici 2363). Výše popisované kroky dovolují orientované vložení fragmentu do vektoru pSBl2. Takto upravený vektor je označován pBIOS 272.

- Odstranění Xhol místa v pozici 3363 z vektoru pBIOS 272 pomocí parciálního štěpení Xhol a následném zatupení konců účinkem velkého fragmentu DNA polymerázy I. Takto upravený vektor s jediným Xhol místem je označován jako pBIOS 273.

Do vektoru pBIOS 273 může být vloženo velké množství sekvencí představujících geny našeho zájmu za účelem získání nových vynálezů, a to pomocí dobře popsaných technik (obr. 1).

Přechodný vektor je posléze vpraven do buněk kmene A. tumefaclens LBA 4404 (Hoekema et al., 1983), které obsahují pSBl vektor. pSBl je vložen do buněk standardní metodou elektroporace. Buňky Agrobacteria, které obsahují podvojný plazmid, jsou selektovány na médiu YT CaCl₂ obsahujícím příslušná antibiotika (a to taková, pro které mají selektované plazmidy geny pro rezistenci) , např. tetracyklin a spektinomycin v koncentraci 50 mg/1. Pouze rekombinantní podvojné plazmidy mohou nést rezistenci k spektinomycinu, a to z toho důvodu, že se přechodný plazmid obsahující také gen pro tuto rezistenci nemůže replikovat v buňkách Agrobacteria, protože nemá počátek replikace z Agrobacteria. Podvojné plazmidy jsou posléze charakterizovány restrikčním štěpením a pomocí Southernovy hybridizace.

·· 4

4 4

44444 4 4

4444

Příklad 2

Transformace hybridů kukuřice

a) Produkce hybridů

Rostlinná linie vybraná pro přípravu hybridů a následnou transformaci (linie A188 a linie našeho zájmu) je vyseta a přikryta skleněnou deskou. Pěstování probíhá v kultivační komoře, po přesazení také pod sklem. Rostliny se pěstují v rašelině a jsou zalévány denně roztokem živin Superplantora (NPK obsah: 14-10-14 + 3 % MgO). Kultivační podmínky jsou následující: fotoperioda 16 hod, světelná intenzita 3-4000 Lux, hlavní teplota 25°C. V okamžiku, kdy se objeví klasy, jsou rostliny přikryty papírovým sáčkem, který zamezí kontaminaci cizím pylem. Sáčky jsou na klasech ponechány až do sklizně.

Hybridní embryo se získá opylením linie A188 pylem elitní linie, nebo opylením elitní linie pylem linie A188.

až 10 dní po opylení se zkontroluje velikost embryí v klasech. Pokud je jejich velikost mezi 1 až 1,2 mm, klasy jsou sklizeny, embrya extirpována a bezprostředně použita pro transformaci podle protokolu publikovaného Ishidou et al. (1996).

b) Transformace a regenerace

Pro popisovaný příklad byl vybrán protokol transformace popsaný Ishidou et al. (1996). Všechny popisovaná média lze nalézt v této publikaci. Transformace začíná kokultivační fází, kdy se nezralá kukuřičná embrya dostávají do kontaktu, a to alespoň na 5 minut, s buňkami Agrobacteria tumefaciens kmene LBA 4404, který nese binární vektor. Embrya jsou poté umístěna na LSAs médium a kultivována ve 25°C ve tmě po dobu 3 dní. První selekce probíhá ve fázi transformovaných kalusů:

• φ φφφφ φφφ φ φφφφ φφφφ φ φ · φ φ φ φφφ φ φφφφ φφφ φ φφφφ φφ φ φφφ φφ φφ φφ φ ΦΦΦΦΦΦ

- 23 „směs embryí s kalusy je přenesena na LSD5 médium, které obsahuje fosfinotricin 5 mg/1 a cefotaxim v koncentraci 250 mg/1 (eliminace a zamezení kontaminace Agrobacteriem tumefaciens) . Tento krok trvá 2 týdny ve tmě a 25°C. Druhý selekční krok sestává z přenesení embryí, která se vyvinula na LSD5 médiu, na médium LSD10, které obsahuje fosfinotricin v koncentraci 10 mg/1 a cefotaxim. Kultivace probíhá 3 týdny za výše popsaných podmínek. Ve třetím stupni selekce jsou vyříznuty kalusy typu I (fragmenty o velikosti 1 až 2 mm) a přeneseny na LSD10 médium v přítomnosti cefotaximu a pěstovány ve tmě ve 25°C po dobu 3 týdnů.

Regenerace rostlin probíhá na LSZ médiu obsahujícím fosfinotricin v koncentraci 5 mg/1 a cefotaxim, kam jsou přeneseny vyříznuté kalusy typu I, které narostly na LSD10 médiu. Kultivace probíhá 2 týdny při konstantním světle.

Regenerované rostliny jsou přesazeny na RM + G2 médium, které obsahuje 100 mg/1 augmentinu a pěstovány ve 22°C po dobu 2 týdnů pod kontinuálním osvitem, aby se dále vyvíjely. Získané rostliny jsou dány do kultivační komory k aklimatizaci.

Alternativně pro transformaci nezralých embryí kukuřice lze použít protokol popsaný v patentové přihlášce WO 98/32326.

Příklad 3

Selekce transformantů, které mají	transgen	integrován	do
požadovaného genomu (rodičovský transformaci)	genom	nevhodný	pro
a) Selekce transformantů s jednou nežádoucích plazmidových sekvencí	kopií	transgenu	bez

• Φ ·· φ φ φ · ·*·· · φ · · φφ φ • φ · · · · · ΦΦΦ· · · φ φ

Φ··· · · φ · φ φ • φ · · ·· · ······

- 24 Mezi primárními transformanty jsou preferenčně vybíráni takový jedinci, u kterých je prokázána inzerce jedné kopie, nebo inzerce více kopií do jednoho lokusu bez nežádoucích plazmidových sekvencí. Případně může být použita i Southernova hybridizace s několika restrikčními enzymy a několika vhodnými hybridizačními sondami pro identifikaci a charakterizaci inzerce do rostlinného genomu, tak aby bylo možno rozlišit jednotlivé transformační události. Jinými slovy, pomocí této metody je možno ukázat individuální rozdíly ve velikosti jednotlivých restrikčních fragmentů získaných štěpením určitým enzymem a hybridizovaných s určitou hybridizační sondou, což koresponduje s určitou pozicí v genomu.

V následujícím příkladu lze použít protokol popisovaný v Sambrook et al. (1989). Genomová DNA z listů se vyizoluje pomocí CTAB extrakčního protokolu (Dean et al., 1992). Tato DNA je dále štěpena podle dobře známých molekulárně biologických metod restrikčním enzymem, který rozeznává alespoň jedno místo v T-DNA. Pomocí vhodných hybridizačních sond, které jsou homologní k jedné straně restrikčního místa, je takto možné charakterizovat inzerci na obou vnitřních stranách, pravé a levé hranici, T-DNA za použití vhodné metody. U dané hybridizační sondy lze pak u několika jedinců ukázat rozdíly ve velikosti restrikčních fragmentů, což odráží rozdílná místa inzerce. Získané DNA fragmenty jsou separovány na 0,9 až 1% agaróze a poté přeneseny na membránu Hybond N+ (Amersham). DNA přechodného plazmidu obsahující T-DNA s požadovaným genem a selekční markér jsou začleněny do pokusu jako kontrola. Membrána je hybridizována s hybridizačními sondami homologními k sekvencím studovaného transgenu :

- sonda Sl, která je specifická pro selekční markér

- sonda S2, která je specifická pro požadovaný gen • 0

0 • « 0

0

0 0

0 0

0 00 00 0 000 0000 0 0 0 0 0 0 0 000 0000000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · ·0 0000

- 25 - dvě sondy označené ex RB a ex LB (pro extra pravou hranici a extra levou hranici), které se používají pro hybridizaci dohromady.

Následná hybridizace umožňuje eliminovat rostliny se sekvencemi přiléhajícími k T-DNA (extra-hraniční sekvence). Správná integrace totiž předpokládá pouze vložení T-DNA bez extra-hraničních sekvencí. Vzhledem k tomu, že sekvence základního plazmidu je známá (pBIOS273 odvozený z pSB12), lze ex RB a ex LB hybridizační sondy získat pomocí amplifikace s oligonukleotidy specifickými pro plazmidové extra-hraniční oblasti T-DNA, RB2 a 3 pro ex RB a LB2 a 3 pro ex LB.

Sek.	ID	č.	1,	oligonukleotid	RB2:	5'	ATCATCCTGTGACGGAACTTTG	3'
Sek.	ID	č.	2,	oligonukleotid	RB3:	5'	AAGGGCGTGAAAAGGTTTATCC	3'
Sek.	ID	č.	3,	oligonukleotid	LB2:	5'	GCTCGGCACAAAATCACCAC 3'
Sek.	ID	č.	4,	oligonukleotid	LB3:	5'	CATAGT T C T CAAGATC GACAGC	3'
	Na	konci	těchto molekulárních	analýz jsou selektovány

rostliny, u kterých nelze detekovat signál při hybridizaci s ex RB a ex LB sondami a u kterých je detekován jediný proužek při hybridizaci s SI a S2 sondami, což ukazuje na inzerci pouze jediné kopie (jedna kopie genu našeho zájmu a jedna kopie selekčního markéru). V závislosti na použité metodě, rozdíly ve velikosti proužků mezi jednotlivými rostlinami odrážejí různá místa integrace, která odpovídají různým transformačním událostem.

b) Identifikace genomových sekvencí, které přiléhají k vložené T-DNA

U každého primárního transformanta s očekávaným fenotypem, který splňuje podmínku integrace do jediného lokusu a v jedné kopii a u kterého byla zkontrolována absence extra-hraničních sekvencí, lze izolovat a identifikovat genomovou DNA, která přiléhá k T-DNA a to např. metodami založenými na PCR. Cílem ·· ·· • · · ·· ·· » · · fl

4· · • · · • · · · • · ··♦· • · ·

4· · ►· ·»·* primárních naštěpena 5 je identifikovat rodičovský genom, který přijal transgen (linie použitá pro transformaci nebo linie našeho zájmu).

Lze použít několik technik založených na PCR, např. „PCR walking (Devic et al., 1997). V kontextu našeho vynálezu se výhodně používá komerční souprava (kit) Genom Walker firmy Clontech. Následující návod je nutno provádět za dodržení instrukcí uvedených v tomto kitu. DNA transformantů, které byly předem vybrány, je restrikčními enzymy (enzymy generující tupé konce), a to každým zvlášť. Použité enzymy mohou být ty, které doporučuje výrobce kitu, tj . rozeznávající restrikční místo s 6 páry bází: Dral, EcoRV, PvuII, Seal a Stul, nebo jiné enzymy s 4 nebo 5 páry bází dlouhým restrikčním místem. U každého vzorku je ke vzniklým restrikčním fragmentům ligován adaptor (Genom Walker kit), a to z obou stran. Každý vzorek je pak rozdělen na 2 alikvoty, aby bylo možné stanovit genomické sekvence přiléhající k obou hranicím T-DNA. Získání přilehlých genomických sekvencí umožňuje nejen potvrdit integraci, ale také usnadňuje identifikaci rodiče, do jehož genomu integrace proběhla a je-li potřeba, umožňuje ověřit výsledky genetického mapování.

Dva druhy oligonukleotidů jsou navrženy pro provedení úspěšné PCR amplifikace, adaptorový primer, AP, který pochází z kitu, a genově specifické primery, GSP, jejichž výběr záleží na sekvenci vektoru odvozeného z pBS12 a na parametrech stanovených v návodu na používání kitu. Mezi GSP oligonukleotidy, které lze použít v tomto vynálezu, stojí za zmínku ty, které byly nalezeny pomocí programu MacVector (verze 6) a u nichž byly stanoveny charakteristiky popsané v níže uvedené tabulce.

• 4 44 ·4 4 44 44

4444 444 4444

4444 4444 44 4

4 4 4 4 4 4 4444 4 4 4 4

4444 44 4 444

44 44 4 44 4444

jméno	sekvence	velikost	Tm (°C)	pozice (pBIOS273)	% GC
GSPLB1	Id. č.	5	29	71,3	3020	58,6
GSPLB2	Id. č.	6	29	64,9	3081	41,4
GSPLB3	Id. č.	7	28	70,1	3021	57,1
GSPLB4	Id. č.	8	27	70,1	3018	59,3
GSPLB5	Id. č.	9	27	70,1	3019	59,3
GSPLB6	Id. č.	10	27	68,7	3022	55,6
GSPLB7	Id. č.	11	27	63,3,	3064	40,7
GSPLB8	Id. č.	12	27	63,3	3077	40,7
GSPLB9	Id. č.	13	26	68,7	3019	557,7
GSPLB11	Id. č.	14	26	68,7	3023	57,7
GSPLB13	Id. č.	15	26	63,0	3078	42,3
GSPRB1	Id. č.	16	29	67,5	571	48,3
GSPRB2	Id. č.	17	29	67,5	592	48,3
GSPRB3	Id. č.	18	29	67,5	655	48,3
GSPRB4	Id. č.	19	29	66,2	656	44,8
GSPRB5	Id. č.	20	28	67,4	570	50
GSPRB6	Id. č.	21	28	66,1	591	46, 4
GSPRB7	Id. č.	22	28	66,1	654	46, 4
GSPRB8	Id. č.	23	28	66,1	655	46,4
GSPRB9	Id. č.	24	27	67,4	569	51, 9
GSPRB10	Id. č.	25	27	66,0	590	48,1
GSPRB11	Id. č.	26	27	70,1	614	59, 3
GSPRB12	Id. č.	27	27	64,6	653	44,4
GSPRB13	Id. č.	28	27	64,6	654	44,4
GSPRB14	Id. č.	29	26	65,9	568	50
GSPRB15	Id. č.	30	26	64,5	589	46,2

flfl *· flfl · ·· ·· • flfl* flflfl flfl·· • · ·· · · · · flfl · • flfl » · · fl ···· flflfl · • · · a ·« · ··· *· ·· ·· · a· ····

První PCR amplifikace používající např. GSPLB a GSPRB typ oligonukleotidů (což záleží na tom, zda jsou specifické pro vnitřní sekvence T-DNA na RB nebo LB straně), je provedena následovně:

- s API primerem specifickým pro adaptor a GSPRBx primerem pro vzorek 1,

- s API primerem a GSPLBx pro vzorek 2.

Amplifikační produkty jsou naředěny a poté použity pro druhou amplifikaci:

- s AP2 primerem specifickým pro adaptor a GSPRBy primerem pro vzorek 1,

- s AP2 primerem a GSPLBy primerem pro vzorek 2.

GSP oligonukleotidy je možné zejména použít pro všechny vektory odvozené od pBIOS273, v kterém se nahrazuje pouze sekvence genu našeho zájmu. Lze použít také sekvence specifické pro geny vložené v T-DNA.

Získané amplifikační produkty jsou analyzovány na agarózovém gelu, kde jsou pak přednostně vybrány fragmenty delší než 200-300 párů bází. Tyto amplifikační produkty totiž obsahují známou část sekvence (mezi primerem GSP a hranicí TDNA) spojenou s neznámou částí genomové DNA (mezi primerem AP a hranicí T-DNA). Tyto fragmenty jsou poté klonovány, např. do vektoru pGEM-T (Promega) dle instrukcí uvedených dodavatelem tohoto vektoru a posléze sekvenovány pomocí univerzálních přímých („direct) a zpětných („reverse) primerů. V případě potřeby lze pro doplnění dat použít také vnitřní oligonukleotidy. Tímto je také možné připravit hybridizační sondy „specifické pro hostitelskou genomovou T-DNA, která hraničí s T-DNA.

c) Identifikace genomu recipientního rodiče

Tento poslední krok, který vede u každého transformanta k identifikaci rodičovské linie, do které se integrovala •Φ φφ « · φ r* 9 • · · · » · · » · ·· φφφφ φ φ φ

Β · · Φ · · · ΦΦΦΦ 0 φ Φ φ

I Φ · Φ · · · «·Φ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ Φ ΦΦ ΦΦΦΦ

- 29 restrikčními restrikčních

T-DNA, lze provádět podle následujícího návodu (Sambrook et al., 1989). Získané hraniční sekvence jsou použity jako próby k hybridizaci s membránou, na kterou byla přenesena elektroforeticky rozdělená DNA různých transformantů a také rodičovských linií. Tato DNA byla štěpena nezávisle několika enzymy. Takto získaný polymorfizmus délky fragmentů (Restriction Fragment Length

Polymorphism, RLFP) pro danou homologní hybridizační sondu, a tedy také pro daný inzerční lokus, umožňuje určit mezi rodičovskými liniemi recipientního rodiče. Provádí se na základě srovnání s profilem transformanta, který je heterozygotní pro inzerci. Výrazem „heterozygotní (hemizygotní) pro inzerci se rozumí transformant nesoucí T-DNA s transgenem pouze na jednom ze dvou chromozómů. Integrace do požadovnaé linie způsobí, že profil RLFP odráží profil požadované linie, ale neodpovídá druhému rodiči. V případě jediné inzerce do požadován linie je profil RLFP primárního transformanta charakterizován 2 proužky, proužkem o stejné velikosti jako je proužek rodiče transformanta a proužkem lišícím se velikostí od požadované linie. Např. obr.2 ukazuje očekávané profily pro oba rodiče a transformanta, v případě inzerce do jednoho z chromozómů jednoho nebo druhého rodiče (2 případy).

Identifikaci recipientního rodiče lze také získat jiným způsobem, s využitím tzv. SNP („Single Nucleotide Polymorphism) rodičovských linií za pomoci sekvenčních údajů hraničních oblastí T-DNA, jak bylo popsáno v odstavci b) . Po nakloňování získaných genomových sekvencí přiléhajících k T-DNA do pGEM-T a stanovení celé sekvence, je možno navrhnout nové primery a použít je pro PCR amplifikaci s DNA rodičovských linií a transformanta. Pokud existuje nějaký nukleotidový polymorfizmus mezi rodiči v oblasti, do které nasedají dané oligonukleotidy, inzerce do linie našeho zájmu

- 30 umožní získat amplifikační produkt u linie našeho zájmu a u transformanta, zatímco u druhého rodiče nikoliv. Naopak, pokud žádný polymorfizmus není zjištěn (amplifikace stejného produktu, v případě konzervovaných genomových úseků), je nutné stanovit sekvenci těchto produktů u rodičovských linií. Srovnáním se sekvencí hraničící s T-DNA u transformanta, identifikované a osekvenované, jak bylo popsáno v odstavci b) , je pak možné určit rodiče, který získal transgen. První nebo druhá metoda pak umožňuje rozlišit pseudogenní linii získanou pomocí výše popsaných metod od linie izotransgenní získané způsobem podle vynálezu.

Příklad 4

Zpětné křížení s požadovaným rodičem a selekce jedinců až do vzniku izotransgenní linie

Předchozí kroky umožňují vybrat transformanty s transgenem integrovaným do genomu našeho zájmu, navíc tyto transformanty obsahují 50 % rodičovského transformačního genomu a 50 % požadovaného genomu.

Selekce rostlin získaných zpětným křížením s požadovanou linií je výhodně prováděna za pomoci markérů běžně používaných v těchto metodách, zvláště těch popsaných v Ragot et al. (1995) .

Pro srovnání a demonstraci výhod selekce primárních transformantů podle předkládaného vynálezu, je v úvodní části popsán případ selekce po inzerci transgenu do genomu linie A188.

• · · ·

- 31 Případ inzerce do chromozómu linie A188 (žádná selekce primárních transformantů).

Všeobecně lze říci, že vhodná genetická rekombinace na jedné straně genu je selektována v první generaci zpětného křížení, na druhé straně v generaci následující. Vzhledem k tomu, že velikost kukuřičného genomu je odhadována na 2000 centimorganů (cM), požadovaná selektovaná rekombinace v prvních dvou zpětných kříženích (BC1 a BC2) musí být lokalizována do vzdálenosti 1 cM od jedné nebo druhé strany inzerce, což odpovídá přenosu jedné tisíciny nežádoucího genomu spojeného s transgenem.

Selekce požadované rekombinace s pomocí předdefinovaných markérů (v blízkosti transgenu) v prvních dvou zpětných kříženích je prováděna na počtu rostlin vypočteném podle následujícího vzorce: počet testovaných rostlin N k získání jedné rostliny s rekombinací ve vzdálenosti do 1 cM s 95% pravděpodobností je podle dobře známého zákona pravděpodobnosti: N = (log 0,05) / (log (1-0,01) ) , což je asi 300 rostlin. Z těchto znalostí plyne, že jedna rekombinovaná rostlina je získána po prvních dvou zpětných kříženích. Ukazuje se však, že je obtížné vybrat optimální požadovaný genom, protože jeho očekávaný podíl je v průměru 75 % v BC1 a 87,5 % v BC2. Selekční tlak na celý genom může být proveden pouze v BC3 a to s pomocí stovek markérů rozmístěných po celém genomu kukuřice (databanka University of Missouri).

Znovuzískání požadovaného genomu v tomto konkrétním provést zpětná křížení na velkém počtu vzácné rekombinační události na daném chromozómu) a počkat alespoň 3 zpětná křížení k navození druhého selekčního tlaku na celý genom. I potom ale zůstávají tyto rostliny nakonec v nej lepším případě pseudoizogenní (potenciální genetické zatížení).

případě vyžaduje rostlin (selekce

00

0 0 • · » ·

Zpětné křížení	Selekce rekombinace v místě inzerce transgenu	Charakterizace celého genomu pro požadovaný gennotyp
	Počet testovanýc h rostlin	Rostliny se správnou rekombinaci	Počet markérů testovaných na reziduálním heterozy.gotním genomu	% požadovaného genomu
BC1	300	1	100	75
BC2	300	1	50	87,5
BC3	100		25	96, 8
BC4	100		7	99,2

Celkový počet testů:

(300x1)+100+(300x1)+50+(100x25)+(100x7) = 3950 testů k vybrání jedné rostliny, která je pseudoizogenní v místě

integrace transgenu	(nese 1/1000	genomu	linie A188	spoj eného
s transgenem, což	je	v průměru	50	až	80 genů	pro genom
kukuřice, u které	je	v průměru	50	000	až 80 000 genů) a
s ustáleným požadovaným	genomem v	BC4	ve více než 99	g. o ·

Případ inzerce do chromozómu požadované linie (selekce podle vynálezu, která odpovídá primárním transformantům zpětně kříženým s požadovaným rodičem).

V závislosti na stanoveném cíli vybraném danými prioritami v biotechnologii a/nebo produktivitě či výnosových charakteristikách a/nebo selekci, či každého zvlášť, je možné použít několik selekčních postupů. Tyto postupy (podle vhodnosti) spojují preselekci na chromozómu s inzercí. Oproti případu inzerce do genomu linie A188, je v následujícím textu popsán případ rekombinace, ke které došlo daleko od transgenu nebo případ, kdy nedošlo k rekombinaci na chromozómu nesoucím transgen. Pro tento příklad jsou zmíněny následující možnosti.

- 33 Možnost 1: žádná selekce v místě integrace transgenu, poměr selektovaného genu našeho zájmu od BC1.

Zpětné křížení	Selekce rekombinace v místě inzerce transgenu	Charakterizace celého genomu pro požadovaný gennotyp
	Počet testovaných rostlin	Rostliny se správnou rekombinací	Počet markérů	% požadovaného genomu
BC1	100		100	87,5
BC2	100		25	asi 100
BC3	100		7	asi 100

Celkový počet testů: (100x100)+(100x25)+(100x7)=13200 testů k výběru jedné skutečně izogenní rostliny v místě transgenu a s genomem obsahujícím téměř 100 % ustáleného požadovaného genomu v BC3 (zisk jednoho zpětného křížení).

Možnost 2: Selekce v BC1 jedince nesoucího celý transgen na chromozómu požadované linie, selekci v BC3 na poměr pro požadovaný gen.

Jelikož chromozóm, do kterého byla včleněna T-DNA, je znám (genetické mapování), je možné v BC1 za pomoci 10 markérů rozmístěných po daném chromozómu vybrat rostlinu, u které je celistvost recipientního chromozómu zachována (žádná rekombinace). Vzhledem k tomu, že je známo, že délka chromozómů je v průměru 200 cM, pravděpodobnost získání rostliny, u které neproběhla žádná rekombinace je P = (O, 99) ²⁰⁰, což je asi 0,14. Počet rostlin, které musí být otestovány s 95% pravděpodobností na získání takovéto rostliny, je N=(logO,05)/(log(1-0,14)), tedy přibližně 20.

Takto vybraná rostlina je zpětně křížena s požadovaným rodičem, dokud neproběhne úplná rekonverze (100%) k požadovanému genomu.

·· · *· ··

4 9 4 4 9 4

4 4 · 9 4 · • ······· · * • · · · · · ·· · ·»·»··

Zpětné křížení	Selekce integrity elitního genomu na chromozómu nesoucím transgen	Charakterizace celého genomu pro požadovaný genotyp
	Počet testovaných rostlin	Rostliny s elitním chromozómem	Počet markérů	% požadovaného genomu
BC1	20	1		75
BC2	100			87,5
BC3	100		25	asi 100
BC4	100		7	asi 100

Celkový počet testů: (20x10)+(100x25)+(100x7) = 3400 testů k selekci 1 opravdu izogenní rostliny v místě transgenu a s genomem fixovaným v přibližně 100 % požadovaného genomu z BC3.

Jak vyplývá ze schématu, snížení počtu zpětných křížení (rychlosti přípravy), nebo snížení počtu rostlin použitých pro zpětná křížení, je součástí přípravy izogenních linií způsobem podle vynálezu, ještě navíc k dosažení skutečné izogenie.

Příklad 5

Produkce komerčních hybridů

Za účelem přípravy komerčních hybridů lze křížit popisované izotransgenní linie připravené v příkladu 4, a to s použitím standardních technik odborníkovi známých, vzhledem ke kvetení každé z vybraných rodičovských linií (Gallais A. et al., 1983).

• · « ·

·· ·· • · · ♦ • · · • · · « · · • · · · · ·

- 35 Příklad 6

Určení genomu s inzercí transgenu

Bylo získáno 13 (inzerčních) událostí po transformaci hybridních embryí podle protokolu popsaném v příkladu 2. Ke zjištění počtu kopií transgenu, byly tyto inzerce analyzovány poté pomocí Southernovy hybridizace, jak výše popisuje příklad 3. Prokázalo se, že 3 z nich jsou v jedné kopii na genom.

Transformant 152-2E byl vybrán pro získání genomických sekvencí přiléhajících k T-DNA, jak je popsáno níže. Transformant 152-2E byl získán po transformaci pREC 290 rekombinantním podvojným plazmidem odvozeným od pBIOS 290, který vznikl z vektoru pBIOS 273 vložením kazety „Pro HMWGPhytl-Nos 3' - Pro HMWG-PhytlI-Nos 3' do Xhol místa. Tato kazeta vznikla pomocí běžných klonovacích technik za použití Pro HMWG sekvence z pšenice (Roberts et al., The Plant Cell 1: 569-578, 1989), Phytl nukleotidové sekvence (accession No.

EMBL, Genbank: AJ223470) a PhytlI nukleotidové sekvence (accession No. EMBL, Genbank: AJ223471) a 3' sekvence Nos (Depicker et al., Mol. Gen. Genet. 235 (2-3): 389-396, 1992) a vhodných restrikčních enzymů.

Získání hraničních genomových sekvencí bylo provedeno na pravé hranici (RB) pomocí „ukotvené PCR za použití kitu Genome Walker (Clontech laboratories inc., Palo Alto, California). Jak bylo popsáno v příkladu 3(b), identifikace genomových sekvencí přiléhajících k vložené T-DNA sestávala z následujících kroků:

Nejprve bylo provedeno PCR z DNA transformanta 152-2E

štěpené EcoRV	pomocí	oligonukleotidů	GSPRB3 a API.
Amplifikační produkt	byl	použit	pro	druhé PCR
s oligonukleotidy	GSPRBP a	AP2.

φφ φ · φ φ • ·· φ φ φ φ φφφ φφφφφ

- 36 Vlastnosti těchto oligonukleotidů jsou popsány v tabulce u příkladu 3 a sekvence jsou uvedeny v příloze sekvencí pod identifikačními čísly 18 a 24.

Oligonukleotidy API a AP2 jsou součástí Genome Walker kitu, proto také podmínky PCR jsou takové, jaké doporučuje výrobce kitu, Clontech. V posledním kroku byl získaný 380 pb dlouhý hraniční fragment byl klonován do vektoru pGEMT (Promega Corporation, Madison, Wisconsin), aby bylo možné tento fragment amplifikovat a použít jako hybridizační sondu.

Určení recipientního genomu, tak jak bylo popsáno v příkladu 3, se skládalo z hybridizace, která probíhala pomocí získaného hraničního fragmentu, který byl použit jako hybridizační sonda, s membránou, na kterou byla přenesena elektroforeticky separovaná DNA transformanta 152-2E a také DNA obou rodičovských linií hybrida (A188 a L2) a ostatních 6 transformantů. DNA byly štěpeny enzymem EcoRV.

Výsledek hybridizace ukazuje obrázek 3: na tomto autoradiografickém snímku je zviditelněna DNA sedmi různých transformantů s tím, že byly použity 1 až 3 rostliny na transformanta.

Po hybridizaci s hybridizační sondou odpovídající hraniční sekvenci, byl detekován 1 proužek specifický pro genotyp A188 (1,7 kpb) a jeden specifický pro vybranou linii L2 (2,5 kpb) . Tyto 2 proužky byly nalezeny u všech transformantů (což potvrzuje, že vznikly z původního hybrida), kromě případu tl52-lE, u kterého byl detekován menší proužek přibližně o velikosti 0,8 kpb. Z tohoto lze vyvodit, že transgen se vložil do očekávaného 1,7 kpb velikého EcoRV fragmentu linie A188.

Tento experiment potvrzuje možnost identifikace genomu, do kterého byla vložena T-DNA v případě přípravy transformantů technikou transformace hybridů, podle výše popsaného protokolu, v tomto konkrétním případě genomu A188.

• ·

- 37 Podle téhož protokolu je také možné získat transformanty, u kterých proběhla inzerce T-DNA do elitního genomu, a to v průměru s pravděpodobností 1 transformant ze dvou.

Pokud je identifikován jako genom, který přijal T-DNA, genom elitní linie, provedení zpětných křížení s požadovaným rodičem a selekční testování umožňuje připravit izotransgenní linie, jak popisuje příklad 4.

49

9 4

9 • 49 <

*· ·· ·· · • · · · * 9 9

9 44 4 9 4 ·

44 4 4 9 44449

4 4 4 9 4 4

44 44 4

- 38 Použitá literatura

An et al, Plant Physiol., 81 : 86-91, 1986.

Armstrong, C.L. et al., Maize Genet. Coop. News Letter 59:9293, 1985.

Armstrong C.L. et al., Theor Appl Genet 84 :755-762, 1992.

Battraw et al., Plant Mol. Biol. 15 :527, 1990.

Bechtold N. et al., Comptes rendu Academie des Sciences Paris [Reports of the Academy of Sciences, Paris] Serie [Series] 3, 316 : 1194-1199, 1993.

Burr B. et al., Genetic Engineering methods. Setlow A, Hollaender (eds.) 1983.

principles and 15 Plenům press NY 5: 45-59,

Cao et al., Plant Cell Reports : 11 : 586-591, 1992.

Callis et al., Genes Dev., 1 : 1183, 1987.

Carrington J.C. and Freed D.D, Journal of Virology, 20 64(4): 1590-1597, 1990.

Chupeau et al., Biotechnology, 7(5): 503-508, 1989.

Christensen et al., Transgenic Res., 5: 213, 1996.

Datla R. et al., Biotechnology Ann. Rev., 3: 269-296, 1997. Dean C. et al., Plant Journal, 2, 69-81, 1992.

Depigny-This et al., Plant. Mol. Biol 20: 467-479, 1992.

Devic et al., Plant Physiol and Biochem, 35(4): 331-33, 1997. Does Mp et al., Plant. Mol. Biol., 17(1): 151-3, 1991.

Fromm M. et al., Biotechnology, 8: 833-839, 1990.

Gallais A. et al., Agromais [Agromaize], 20, 40, 1983. Gaubier et al., Mol. Gen. Genet., 238: 409-418, 1993.

Hiei et al., The plant Journal 6: 271-282, 1994.

Hospital et al., Genetics, 132: 1199-1210, 1992.

Hoekema et al, Nátuře, 303, 179-180, 1983.

Ishida et al., Nátuře Biotechnology, 14: 745-750, 1996.

Jouanin et al., Plant Sci., 53: 53-63, 1987.

Kamoun S. et al., Mol Plant Microbe Interact, 6(5): 573-81, Sept-Oct 1993.

1 1 ·

1

1

1111 ·« ·· ♦ ·

1111 11 • · ·· i i

11 111 1

1111 11 1 •ι ιι ι· i • · · ·

- 39 Kay et al., Science 236: 1299-1302. 1987.

Komáři T. et al., The Plant Journal. 10(1): 165-174, 1996.

Kořit A.A. et al., Eur. J. Biochem., 195, 329-334, 1991.

Maas et al., Plant Mol. Biol., 16: 199, 1991.

McElroy et al., Plant Cell, 2: 163-171, 1990.

Morris et al., Virology, 187: 633, 1992.

Murigneux et al., Theor. Appl. Genet. 87: 278-287, 1993.

Neuhaus G. et al., Theoretical and Applied Genetics, 25 75(1): 30-36, 1987.

Ohta et al., Plant Cell Physiol, 31: 805, 1990.

Panabieres F. et al., Mol Plant Microbe Interact, 86(6): 9961003, Nov-Dec 1995.

Ragot et al., Techniques et utilisations des marqueurs moleculaires [Techniques and uses of molecular markers], Les Colloques, No. 72, Ed Reina et al., N.A.R., 18: 6426, 1990. Robert et al., Plant Cell, 1: 569-578, 1989.

Saiki Rk. et al., Science 29: 487-491, 1988. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989.

Schocher et al., Biotechnology, 4: 1093-1096, 1986.

Shen et al., Plant. Mol. Biol., 26: 1085-1101, 1994.

Snowden et al., Plant Mol. Biol., 31: 689, 1996.

Southern, Journal of molecular Biology, 98: 503-517, 1975. Vancanneyt et al., Mol Gen. Genet. 220: 245, 1990.

Watson et al., Adn recombinant [recombinant DNA], Ed. De Boeck universitě [De Boeck University], 273-292.

Weising et al., Annual Rev. Genet, 22: 241, 1988.

• · 4 ·

4 4

4« ·»

4 4 ·

4 ··

4 · 4

4 4 4 • 4 4· ♦ 4 ··

4 4 ·

4 «

4 4

4 4

SEZNAM SEKVENCÍ <160> 30 <170> Patentln Ver. 2.1 <2io> :

<211> 22 <212> ONA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 1 atcatcctgt gacggaactt tg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 2 atcatcctgt gacggaactt tg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <<00> 3 gctcggcaca aaatcaccac 20 <210> <

<211> 22 <2i2> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <<00> 4 catagttctc aagatcgaca gc 22 <210> 5 <211> 29 <212> ONA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 5 gcaggcatgc iagcttcagc tgctcgatc 29 <210> f.

<211> 23 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 6 ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagc 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA • 4

4» 4· ·· ·

4 · · 4 · ♦

4 44 4 · 4 · ·· 44* 44444 • 4 9 4 4 4 4 •449 49 4

4 · *

4 9

9 9

9 9

9999 <213> syntetizovaný konstrukt.

<400 1 caggcatgca agcttcagct gctcgatc 28 <210 8 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 6 ctgcagccat gcaagcttca gctgctc 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 9 tgcagccatg caagcttcag ctgctcc 27 <210 10 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 10 aggcatgcaa gcttcagctg ctcgatc 27 <210 11 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 li cagtacatta aaaacgtccg caatgtg 27 <210 12 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 12 acgtccgcaa tgtgttatta agitgtc 27 <210 13 <211> 26 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 13 tgcaggcatg caagcttcag ctgctc 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <21 i> syntetizovaný konstrukt <400 14 ggcatgcaag cttcagctgc tcgatc 26 <210 15 <211> 26 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt « · • · « • »···

I · · « > · « <

·· ·· ·* ·· ···· «00> 15 cgtccgcaat gtgttattaa gttgtc <210 16 <211> 29 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 16 atgatcagat tgtcgtttcc :gccctoag <210 17 < 211> 29 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 17 gactccctta attctccgct cazgatcag <210 16 <211> 29 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 18 gcggttctgt cagttccaaa cgtaaaacg <210 19 <211> 29 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 19 tgcggttctg tcagttccaa acgtaatac <21O> 20 <211> 28 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 20 tcaccaoitt otcatttccc cccttcac <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 21 actcccttaa ttctccgctc etgetcag <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 22 cggttctgtc agttccaaac gtaaaacg <210 23 <2U> 28 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400 23 • · • * · • aaaa

- 43 • · ·-» * » · · • · ·♦ • * · « * · · a »· «· ·* ·· > · · <

i * <

gcggttctgt cagttccaaa cgtaaaac <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 24 gatcagattg tcgtttcccg ccttcaa <210> 25 <::i> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný' konstrukt <400> 25 ctcccttaat tctcccctca tgatcag <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 26 tcatcggcgg gggtcataac gtgactc <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 27 ggttctgcca gttccaaacg taaaacg <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 28 ccgitctgtc agttccaaac rtaaaec <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 29 atcagattgt cgtttcccgc cttcag <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> syntetizovaný konstrukt <400> 30 tcccttaatt ctccgctcat gatcag

Claims (11)

1. Způsob přípravy izotransgenních linií rostlin vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) transformují se rostlinné buňky rostlinného hybrida, sestávajícího z křížení dvou rodičovských linií, požadované linie a linie vhodné pro transformaci, vektorem nesoucím T-DNA obsahující transgen;

b) selektují se hybridní primární transformanty, které mají T-DNA integrovanou pouze do genomu požadované linie;

c) selektované primární transformanty z bodu b) se zpětně kříží s požadovanou rodičovskou linií, a dále se selektují jedinci vzniklí opakovanými zpětnými kříženími až do získání izotransgenních linií.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok selekce hybridních primárních transformantů spočívá v identifikaci genomických sekvencí přiléhajících k vložené T-DNA, takže se určí rodičovský genom, který přijal T-DNA.

3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že určení rodičovského genomu, který přijal T-DNA, pomocí genomických sekvencí přiléhajících k T-DNA, se provádí technikou RFLP nebo sekevncováním.

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že v prvním zpětném křížení podle bodu c) se selektují jedinci, u kterých chromozóm, do kterého se integrovala T-DNA, má plně konzervovaný genotyp požadované linie, a kde podíl požadovaného genomu k celému genomu je alespoň 75 %.

♦ * ·· 99 9 99

9 9 9 9 *99 9«

99 9« 9*99 99

9 9 9 999 9999999 9

9999 *9 9 «9

99 99 9* 9 99

9999 podle kteréhokoliv z předchozích nároků ící se tím, že obsahuje následný krok, kdy izotransgenní linie podle vynálezu a další linie, zejména jiná izotransgenní linie odlišný transgen, čímž se připraví hybridní

- 45 Způsob vyznačuj se kříží požadovaná obsahuj ící linie.

6. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že rostlinné buňky pocházejí ze skupiny plodin obsahující kukuřici, pšenici, řepku, slunečnici, hrách, sóju a ječmen, nebo z různých druhů zeleniny nebo květin.

kteréhokoliv se tím, že kóduj ící

7. Způsob podle vyznačuj ící nukleotidovou sekvenci z předchozích nároků T-DNA obsahuje zejména protein, který uděluje agronomicky výhodné vlastnosti a/nebo vlastnosti rezistence k chorobám.

8. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že připravené izotransgenní linie jsou komerční elitní linie.

Použití způsobu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro vnesení několika transgenních znaků do rostliny, aniž by se přidaly fragmenty spojené s transgenem, které představují genetickou zátěž.

10. Způsob umožňující identifikovat rodičovský genom, který inkorporoval T-DNA po transformaci hybrida, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se identifikují genomické sekvence přilehlé k vložené T-DNA.

• 4 4 9 • · 4 9

9 4 · 4 9

9 4 9 4

11. Transgenní rostlina nebo část této rostliny, zejména semeno, získané užitím jednoho nebo více kroků ze způsobu podle nároku 1 nebo 5.

12. Skutečná izotransgenní linie připravená z hybridních transformantů způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kterážto linie je charakterizována tím, že má stabilní čistý genotyp požadované linie v celém genomu, a má stabilně integrovanou T-DNA obsahující transgen.

13. Komerční hybridi připravení způsobem podle nároku 5.