CZ20022809A3

CZ20022809A3 - Koňský herpes virus

Info

Publication number: CZ20022809A3
Application number: CZ20022809A
Authority: CZ
Inventors: Christian Seyboldt; Nikolaus Osterrieder; Knut Elbers
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date: 2000-02-17
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2003-01-15
Also published as: US6703231B2; HUP0204446A3; WO2001060403A1; CO5280143A1; PL210441B1; CN101230336A; DK1259258T3; MXPA02008009A; KR100845192B1; CA2399846C; EP1259258B1; US20080160046A1; JP2003522542A; AU4831301A; UY26588A1; BR0108442A; CY1109023T1; US7309598B2; CN1400907A; CA2399846A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká gM-negativních mutant koňského herpes viru EHV. V těchto mutantách protein gM v podstatě chybí nebo je modifikován a není funkční, pokud jde o imunomodulační schopnost. Vynález se rovněž týká kódových nukleových kyselin, farmaceutického prostředku s obsahem těchto virů nebo nukleových kyselin a použití uvedených látek. Při použití uvedených mutant je možno zlepšit odpověď imunitního systému na podání vakcíny EHV proti infekcím divokým typem EHV.

Dosavadní stav techniky

Koňské herpetické viry 1, EHV-1 náleží do skupiny Alphaherpesvirinae, jde o hlavní příčinu virového zmetání u lichokopytníků, mimo to vyvolává tento virus onemocnění dýchacího a nervového systému. Byla určena úplná sekvence DNA pro EHV-1, kmen Ab4p podle publikace Telford E. A. E. a další 1992. Jen malý počet genů a produktů těchto genů však byl charakterizován s ohledem na jejich význam pro virulenci EHV.

V případě léčení infekcí EHV-1 jde o dva odlišné přístupy. Především byla vyvinuta modifikovaná živá vakcína MLV, včetně vakcíny pro kmen RacH (Mayr A. a další 1968, Hubert P. H. a další, 1996), tato vakcína je široce rozšířena v Evropě i ve Spojených státech. Mimo to byly podrobeny zkouškám inaktivované vakcíny a nezávisle exprimované virové glykoproteiny na imunogenní a ochrannou účinnost. Mezi glykoproteiny, které byly exprimovány při použití rekombinantních baculovirů je možno uvést glykoproteiny (g) B, C, D a H, které jsou schopné vyvolat částečnou ochranu proti následné infekci EHV-1 na krysím modelu (Awan A. R. a další, 1990, Tewari D. a další, 1994, Osterrieder N. a další, 1995, Stokes A. a další, 1996). Vakcíny typu MLV jsou však výhodnější než vakcíny, které obsahují usmrcené viry a jejich podjednotky. Vakcíny typu MLV jsou vysoce účinné při vyvolání buněčně zprostředkované odpovědi imunitního systému, tato odpověď patrně chrání proti uvedenému onemocnění (Allen G. P. a další, 1995, Mumford J. A. a další, 1995).

Glykoproteiny herpetických virů se vždy účastní jako podstatná složka v časných stádiích infekce, při uvolnění virionů z buněk a při přímém šíření virionů od buňky k buňce splýváním sousedních buněk. Až dosud bylo identifikováno 11 glykoproteinů viru herpes simplex typu 1, HSV-1, tyto glykoproteiny byly identifikovány včetně kódové sekvence a byly označeny gB, gC, gD gE, gG, gH, gl, gJ, gK, gL a gM. HSV-1 mutanty, kterým chybí gC, gE, gG, gl, gJ a gM, jsou životaschopné, což prokazuje, že tyto geny nejsou nezbytné pro replikaci při pěstování na buněčné kultuře. Při srovnání HSV-1 a nukleotidové sekvence koňského herpetického viru 1 se ukázalo, že všechny známé glykoproteiny HSV-1 jsou konzervovány také v EHV-1. Na základě běžného názvosloví jsou tyto glykoproteiny označovány názvem jejich HSV-1 homologů. Je známo, že EHV-1 gC, gE a gl nejsou podstatné pro růst v buněčné kultuře, kdežto gB a gD jsou pro růst viru na buněčné kultuře podstatné. Úloha jiných glykoproteinů EHV-1 při růstu na buněčných kulturách není známa (Flowers C. C. a další, 1992). Šest obalových • 4 glykoproteinů EHV-1 bylo identifikováno při použití Xgtll banky pro expresi a při použití monoklonálních protilátek (MAb) proti čištěnému EHV-1 (Allen G. P. a další 1987). Mimo to se pří analýze proteinů a při transkripci prokázalo, že k expresi glykoproteinů gB, gC, gD, gG, gH a gK dochází v buňkách, infikovaných EHV-1. Glykoprotein gM (kódem pro tento glykoprotein je gen UL10 podle Bainer J. D. a další, 1991, Baines J. D. a další, 1993) je glykoprotein, který byl v poslední době ze skupiny HSV-1 podrobně analyzován. Jde o jediný známý nepodstatný glykoprotein, který je konzervován ve všech podčeledích herpetického viru a který byl popsán i u cytomegaloviru člověka a krysy a u Gammaherpesvirinae ze skupiny EHV-2, u herpesvirus saimiri a u viru Epstein-Barr. Stejně jako u řady glykoproteinů herpetických virů je HSV-1 gM přítomen ve virionech a v membránách infikovaných buněk. Mutanty HSV-1, jimž chyběl pouze gM rostly až do titru, který byl přibližně lOkrát nižší ve srovnání s virem divokého typu a virulence těchto virů na krysím modelu byla snížena (Baines J. D. a další, 1991, MacLean C. A. a další 1993). Homolog EHV-1 gM (gp21/22a, dále bude označován EHV-1 gM) byl poprvé popsán v publikaci Allen G. P. a další 1987 a bylo prokázáno, že jde o hlavní složku obalu viru. Další výzkumy prokázaly, že gen 52, který je mologní genu HSV-1 UL10 je kódovým genem pro 450 aminokyselin polypeptidu EHV-1 gM (Pilling A. a další, 1994, Telford E. A. E. a další, 1992). EHV-1 gM představuje hydrofobní protein, který obsahuje 8 transmembránových domén a bylo prokázáno, že je.přítomen v infikovaných buňkách a v čištěných virionech jako protein s M_r 45 000 (Pilling A. a další, 1994, Telford E. A. R a další, 1992).

V roce 1996 provedli Osterrieder a další pokusy, při nichž srovnávali schopnosti průniku virových mutant (LllÁgM) s genem Escherichia coli lac Z, uložením do genu EHV-1 kmene RacLll gM (otevřený čtecí rámec 52), s vlastnostmi původního EHV-1 RacLll a došli k závěru, že EHV-1 gM hraje důležitou úlohu při průniku viru do cílových buněk a při šíření viru od buňky k buňce. V roce 1997 Neubauer a další prokázali, že svrchu popsaná mutanta EHV-1 gM může vyvolat ochrannou imunitu, jak je možno prokázat vyhodnocením protilátek, neutralizujících virus a přítomností EHV-l-specifických T-buněk ve slezinách imunizovaných myší.

Vynález si klade za úkol nalézt nové modifikované viry uvedeného typu, které by měly podstatně zlepšené imunogenní vlastnosti při použití k léčení a k prevenci infekcí EHV.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří koňský herpes virus, v němž v podstatě chybí protein gM.

Ve výhodném provedení chybí alespoň 70 % tohoto genu, podle dalšího výhodného provedení chybí až 80 % tohoto genu. V nejvýhodnějším provedení chybí alespoň 90 % tohoto genu.

Podle dalšího výhodného provedení je protein gM modifikovaný a nefunkční. Může jít o vypuštění, mutaci nebo zařazení jiných nukleotidů do kódového genu pro protein gM.

·_ββ· ........ ......

Bylo neočekávaně zjištěno, že v případě, že protein gM v podstatě chybí nebo je modifikován a je tedy nefunkční pokud jde o jeho předpokládanou imunomodulační schopnost, dochází ke znatelnému zlepšení ochranné imunity proti herpetickému viru. Bylo tedy poprvé prokázáno, že protein gM mění imunogenní vlastnosti EHV. Je zajímavé, že dříve známé virové mutanty LllAgM a HAgM-Ins mají také imunogenní vlastnosti, pokud jde o původní kmeny RacLll a RacH. Přestože autoři, Osterrieder a další, 1996 a Neubauer a další 1997, neprokazovali ve své době gM pro viry HAgM pomocí protilátek, má HAgM-Ins mutanta imunomodulační potenciál, podobný potenciálu původního kmene, produkujícího gM. Tato skutečnost je pravděpodobně způsobena zbývající částí gM, k jejíž exprexi dochází v HAgM-Ins navzdory uložení lacZ, jak bylo prokázáno analýzou Wester blot. Tato zbývající část gM tedy musí být zodpovědná za imunomodulační působení gM. Vynález tedy poprvé popisuje EHV, v němž protein gM v podstatě chybí nebo je modifikován a je nefunkční, pokud jde o jeho imunomodulační kapacitu v hostiteli viru.

Pojem „v podstatě chybí byl použit z toho důvodu, že poloha sousedního genu pro homolog proteinu UL9 (gen 53), a také jeho orientace, se překrývají s kódovým genem pro protein gM, takže musí zůstat alespoň minimální nukleotidová sekvence genu pro gM k umožnění exprese genu 53 a tím i k udržení životaschopnosti viru. Jak již bylo uvedeno, podle jednoho z výhodných provedení chybí alespoň 70 % genu pro gM, v dalším výhodném provedení chybí až 80 % a v nejvýhodnějším provedení až 90 % genu pro gM.

gM se rozumí s ohledem na o interakci mezi virem a

Pojem „nefunkční protein imunomodulační vliv, pokud jde hostitelem. Rozdíl mezi imunogenním potenciálem EHV podle vynálezu ve srovnání s jinými kmeny EHV, u nichž dochází k expresi funkčního gM je možno určit na standardním živočišném modelu, tak jak je to běžné ve veterinární virologii. Jeden z možných postupů pro stanovení, zda dochází k expresi funkčního nebo nefunkčního gM je uveden v následujícím příkladu 1. Tímto postupem je možno poměrně snadno a přesně stanovit rozdíl v imunomodulační schopností modifikovaného kmene EHV ve srovnání s kmeny, které se liší pouze tím, že u nich dochází k expresi úplného a nemodifikovaného funkčního proteinu gM. Postup, dále uvedený v příkladu 1, je zvláště vhodný z toho důvodu, že chování kmenů EHV u myší BALB/c je v korelaci s chováním těchto virů v přírodním hostiteli (Mayr, A. a další, 1968, vanWoensel, P. A. M. a další, 1995, Colle,

C. F. a další Hubert, P. H. a další, 1996, Matsumura, T. a další, 1996).

K odstranění proteinu gM z EHV nebo k dosažení toho, aby tento protein byl nefunkční, je možno použít různé postupy (Sambrook J. a další, 1989). Nelimitující příklady zahrnují vypuštění, mutaci nebo zařazení různých prvků do kódového řetězce pro protein gM. Při vypuštění odpovídající úplné nebo částečné nukleotidové sekvence z viru může dojít k úplné nepřítomnosti nebo k expresi nefunkčního proteinu gM. Téhož výsledku je možno dosáhnout mutací nukleotidové sekvence nebo uložením dalších nukleotidů do oblasti genu nebo do jeho řídící oblasti. Ve výhodném provedení se vynález týká EHV, modifikovaného vypuštěním, mutací nebo zařazením dalších prvků do kódové sekvence genů pro protein gM.

Sekvence gM ORF se překrývá s UL9 ORF a promotorovými sekvencemi (poloha 94389 až 97052, protein s vazbou na Ori, Telford a další, 1992). Protein, pro nějž je kódem UL9 ORF je podstatný pro růst viru, jak bylo prokázáno například pro HSV-1 (Garmichael a další, 1988, Malík a další, 1992). Z tohoto důvodu se výhodné provedení vynálezu týká EHV, v němž je kódová sekvence genu pro protein gM vypuštěna nebo modifikována a současně není exprese kódového genu pro homolog UL9 (gen 53) nijak ovlivněna. Pod tímto pojmem se nerozumí určité množství nebo vlastnosti UL9, avšak prostě skutečnost, že exprese genu není ovlivněna, dochází k expresi proteinu virem a toto množství jev podstatě dostatečné pro životaschopnost viru.

Vynález se týká ve velmi výhodném provedení EHV, v němž jsou nukleotidy 93254 až 94264 vypuštěny, číslování odpovídá číslování u kmene EHV-1 Ab-4p (Telford, E. A. R. a další, 1992) nebo u dalších kmenů. Po vypuštění těchto 1010 nukleotidů gM ORF z celkových 1352 nukleotidů dochází k tomu, že prokazatelné množství peptidu gM již není přítomné. Při tomto téměř úplném vypuštění nukleotidů genu pro gM však stále dochází k tomu, že virus je životaschopný, avšak v podstatě pro něj nedochází k expresi derivátů proteinu gM, přičemž exprese všech ostatních genů EHV-1 není ovlivněna. Specificky neovlivní toto vypuštění expresi UL9 ORF.

Svrchu uvedené polohy nukleotidů se týkají kmene EHV-1 Ab-4p, číslování je podle publikace Telford a další, 1992 (banka GenBank/EMBL, přírůstkové číslo M86664). Tyto polohy nukleotidů nejsou žádným způsobem omezeny přesnými polohami, definovanými pro kmen Ab4p EHV-1, nýbrž jsou prostě použity jako příklad, z něhož má být zřejmé, že jde o nukleotidy v této poloze nebo v odpovídající poloze genu pro gM u jiných kmenů EHV. Pro jiné kmeny EHV virů může být číslování poloh nukleových kyselin odlišné, avšak odborník v molekulární biologii virů čeledi Alphaherpesvirinae snadno identifikuje polohy těchto výhodných nukleotidů vzhledem k polohám jiných nukleotidů v sekvenci. Pro životaschopnost viru je důležité, aby docházelo k funkční expresi viru v těsném sousedství genu gM.

Nej výhodnějším kmenem EHV podle vynálezu je kmen EHV-1 HÁgM-3bl, který byl uložen pod přírůstkovým číslem 99101536 ve sbírce ECACC (Evropská sbírka buněčných kultur, Salisbury, UK).

Vynález je zvláště vhodný v případě EHV typu 1 a 4, protože oba tyto typy viru jsou velice blízce příbuzné (Telford, E. A. R. a další 1992 a 1998).

EHV podle vynálezu je zvláště vhodný k léčebným účelům, obecně pro přenos heterologního materiálu a zvláště pro přenos cizorodých antigenů pro použití v živých vakcinách. Informace o EHV jako heterologním vektoru jsou uvedeny například v dokumentech EP 507179,

WO 98/27216, WO 94/00587 a WO 98/27216. V případě, že u EHV podle vynálezu dochází k expresi heterologního materiálu u některého živočicha, nedochází k imunologickým vlastnostem na baží gM. EHV je proto zvláště vhodný pro imunizaci proti jiným patogenům v případě, že po uložení odpovídajících nukleotidových sekvencí do genomu viru EHV dochází k expresi antigenů s imunologickými vlastnostmi. Jinak náleží vakciny na bázi herpetických virů jako vektorů do známého stavu techniky (například Schmitt, J. a další, 1999, Peeters, B. a další, 1997, Yokoyama a další, 1998). Ve výhodném provedení se vynález týká také EHV, který nese jeden nebo větší počet heterologních genů.

Součást podstaty vynálezu tvoří rovněž kódové nukleové kyseliny pro EHV podle vynálezu. Nukleotidy jsou použitelné pro další modifikaci EHV nebo pro rekombinantní produkci EHV podle vynálezu. Je také možno je použít pro přípravu vakcín na bázi nukleových kyselin.

Vzhledem ke zlepšeným imunologickým vlastnostem, spojeným s EHV, u nějž dochází k expresi modifikovaného nefunkčního gM nebo u nějž nedochází vůbec k expresi gM je EHV podle vynálezu zvláště vhodný jako účinná složka farmaceutického prostředku, určeného k profylaxi a léčení infekcí EHV. Podle dalšího provedení tedy tvoří součást podstatu vynálezu také farmaceutické prostředky, které obsahují EHV podle vynálezu.

Nukleotidy podle vynálezu je také možno použít pro přípravu vakcín s obsahem DNA ve vektoru. V těchto vakcínách jsou nukleotidy aplikovány živočichům přímo nebo nepřímo přes vektory, odlišné od původního viru. Nukleotidové vakciny a vakciny s obsahem vektorů jsou známé a nebudou podrobněji probírány.

Podle dalšího provedení tvoří součást vynálezu farmaceutický prostředek, který obsahuje nukleovou kyselinu podle vynálezu. Vynález se také týká • ·« · • · · ·· ···· farmaceutického prostředku, obsahujícího EHV podle vynálezu.

Jako nelimitující příklad farmaceutického prostředku, obsahujícího EHV podle vynálezu je možno uvést prostředek, který je možno připravit následujícím způsobem: supernatant infikované buněčné kultury se smísí se stabilizátorem, například spermidinem a/nebo sérovým albuminem skotu, BSA a směs se lyofilizuje nebo se zbaví vody jiným způsobem. Před očkováním se ke směsi opět přidá voda, obvykle fyziologický roztok chloridu sodného, popřípadě s fosfátovým pufrem PBS nebo se přidá nevodný roztok, například olejová emulze nebo pomocný prostředek na bázi hliníku.

EHV a nukleotidy pro EHV jsou velmi vhodné pro použití k přípravě farmaceutického prostředku.

Farmaceutický prostředek obvykle obsahuje jednu nebo větší počet složek, které mají schopnost modifikovat fyziologické, například imunologické funkce organismu. Tyto prostředky se podávají živým organismům systemicky nebo na jejich povrch, nejde však o omezení na antibiotika a antiparazitické látky, je možno přidávat i jiné složky k dosažení některých výhodných vlastností, například jednoduchého zpracování, sterility, stability, vhodnosti prostředku pro enterální nebo parenterální podání, například pro perorální podání, podání nosní sliznicí, nitrožilní, nitrosvalové, podkožní nebo intradermální podání nebo podání jiným vhodným způsobem nebo podání s řízeným uvolněním účinné látky.

• · 9 · ·· 9« • ·· * · · * • 99

9999

Pomocí těchto prostředků je možno zlepšit odpověď imunitního systému, vyvolanou podáním vakcíny proti divokému typu viru EHV, zvláště v případě, že vakcina obsahuje EHV podle vynálezu.

Podle dalšího provedení je možno živou vakcínu EHV odlišit od viru divokého typu. EHV podle vynálezu se liší alespoň jednou důležitou vlastností od izolátů divokého typu. Aby bylo možno tyto kmeny odlišit, produkují kmeny podle vynálezu podstatně modifikovaný protein gM. Tento protein je modifikován tak, že jeho specifický antigenní cíl se podstatně liší od gM virů divokého typu nebo tento protein v podstatě chybí.

V jednom z možných provedení lze odlišit živočicha, infikovaného divokým typem EHV od živočicha, léčeného modifikovaným EHV podle vynálezu tak, že se stanoví totožnost proteinu gM u obou živočichů a prokáže se podstatná nepřítomnost tohoto proteinu u modifikovaného viru.

Ve výhodném provedení se postupuje tak, že se

a) zkoumaný vzorek přidá k izolovanému gM nebo jeho modifikovaným derivátům,

b) přidá se protilátka, specifická pro izolovaný protein gM nebo jeho modifikované deriváty a

c) stanoví se vazba protilátky.

4444

44 • 4 4

4 4

4444

Ve velmi výhodném provedení vynálezu je možno odlišit živočicha, infikovaného divokým typem EHV od živočicha, léčeného modofikovaným EHV podle vynálezu tak, že se stanoví rozdíl mezi kódovou sekvencí nukleových kyselin pro protein gM divokého viru a kódovou sekvencí nukleových kyselin pro modifikovaný protein gM nebo se prokáže nepřítomnost těchto nukleových kyselin.

Podle dalšího provedení se vynález týká zkušebních balíčků, určených pro odlišení živočichů, infikovaných EHV divokého typu od živočichů, léčených modifikovaným EHV podle vynálezu. Tyto balíčky obsahují běžné analytické pomůcky, pufry, rozpouštědla a mechanické pomůcky. Mimoto obsahují protein gM divokého typu, isolovaný modifikovaný protein gM, protilátky, specifické pro protein gM divokého typu, protilátky, specifické pro izolovaný modifikovaných protein gM a specifické nukleotidové sondy, schopné se vázat na nukleotidové kódové sekvence pro protein gM divokého typu a také specifické nukleotidové sondy, schopné se vázat na kódové nukleotidové sekvence pro modifikovaný protein gM.

·· ·* « · · • « · • · · • · ·

9999

Seznam literárních citací

Allen, G.P., Yeargan, M., Costa, L.R.R. and Cross, R., 1995. Major histocompatibiiity complex class Ι-restricted cytotoxic T-lymphocyte responses in horses infected with equine herpesvirus 1. J. Viroi. 69, 606-612.

Allen, G.P.and Yeargan, M.R., 1987. Use of Xgt11 and monoclonal antibodies to map the genes for the six major giycoproteins of equine herpesvirusl. J. Viroi. 61, 2454-2461.

Awan, A.R., Chong, Y.-C. and Field, H.J., 1990. The pathogenesis of equine herpesvirus type 1 in the mouše: A new model for studying host responses to the infection. J. Gen. Viroi. 71, 1131-1140.

Baines, J.D. and Roizman, B., 1991. The open reading frames UL3, UL4, UL10 and UL16 are dispensable vor the replication of herpes simplex virus 1 in cell culture. J. Viroi. 65, 938-944.

Baines, J.D. and Roizman, B., 1993. The UL10 gene of herpes simplex virus 1 encodes a novel viral glycoprotein, gM, which is present in the virion and in the plasma membrane of infected celis. J. Viroi. 67,1441-1452.

Carmichael, E.P., Kosovsky M.J. and Weiler, S.K., 1988. Isolation and characterization of herpes simplex virus type 1 host range mutanfs defective in viral· DNA synthesis. J. Viroi. 62(1), 91-99.

Day, L., 1999. Characterisation of selected giycoproteins of equine herpesvirus-1: immune responses in the murine model. PhD thesis, Department of Microbiology, University of Leeds, UK.

Flowers, C.C. and 0'CalIaghan, D.J., 1992. The equine herpesvirus type 1 (EHV1) homolog of herpes simplex virus type 1 US9 and the nátuře of a major deietion wethin the unique short segment of the EHV-1 KyA strain genome. Virology 190, 307-315.

Hubert, P.H., Birkenmaier, S., Rziha, H.J. and Osterrieder, N., 1996. Aiterations in the equine herpesvirus type-1 (EHV-1) strain RacH during attenuation. J. Vet. Med.

B 43, 1-14.

Kyhse-Andersen, J., 1984. Eiectroblotting of multiple geis: a simple apparatus without tank for rapid transfer of proteins from polyacryiamide gels to nitrocellulose. J. Biochem. Biophys. Methods 10, 203-210.

9999 »99

999 *, · * · • · • ·

9 9

9 9 · * • · 9

9999

Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nátuře 227, 680-685.

MacLean, C.A., Robertson, L.M. and Jamieson, F.E., 1993. Characterization of the UL10 gene product of herpes simplex virus type 1 and investigation of ist role in vivo. J. Gen. Virol. 74, 975-983.

Malík, A.K., Martinez, R., Muncy, L., Carmichael, E.P. and Weller, S.K., 1992. Genetic anatysis of the herpes simplex virus type 1 UL9 gene: isolatíon of a LacZ insertion mutant and expression in eukaryotic ceíls. Viroíogy 190(2), 702-715.

Mayr, A., Pette, J., Petzoldt, K. and Wagener, K., 1968. Untersuchungen zur Eníwickiung eines Lebendimpfstoffes gegen die Rhinopneumonitis (Stutenabort) der Pferde. J. Vet. Med. B 15, 406-418.

Meindl, A. and Osterrieder, N., The equine herpesvirus 1 Us2 homolog encodes a nonessentiai membrane-associated virion component J. Virol., 73(4):3430-7, 1999.

Mumford, J.A, Hannant, D.A., Jessett, D.M., 0'Neill, T., Smith, K.C, and Ostlund, E.N., 1995. Abortigenic and neurological disease caused by experimentai infecíion with liquid herpesvirus-1. In „Proceedings 7^th International Conference of Equine Infectious Disease“(H. Nakajima and W. Plowright, Eds.) pp. 261-175. R&W Publ., Newmarket, U.K. United Kingdom.

Neubauer, A., Beer, M., Brandmuller, C., Kaaden, O.-R. and Osterrieder, N., 1997. Equine herpesvirus 1 mutants devoid of glycoprotein B or M are apathohenic for mice but induce protecíion againsí challenge infection. Virology 239, 36-45.

Osterrieder, N., Neubauer, A, Brandmiiller, C., Braun, B., Kaaden, O.-R. and Baines, J.D., 1996. The equine herpesvirus 1 glycoprotein gp21/22a, the herpes simplex virus type 1 gM homolog, is involved in virus penetration and cell-to-cell spread of virions. Journal of virology, June 1996, p. 4110-4115.

Osterrieder, N., Wagner, R., Brandmuller, C., Schmidt, P., Wolf, H. and Kaaden, O.-R., 1995. Protection against EHV-1 challenge infection in the murine model after vaccinaíion with varíous formuíaíions of recombinant glycoprotein gp14 (gB). Virology 208, 500-510.

Peeters, B., Biendowska-Szewcyk, K., Huíst, M., Gieilens, A and Kimman, T., 1997. Biologicalíy safe, non-transmissible pseudorabies virus vector vaccine protects pigs against both Aujeszky's disease and ciassical swine fever. J. Gen. Virol. 78, 3311-3315.

Pilling, A., Davison, AJ., Teiford, E.A.R. and Meredith, D.M., 1994. The equine herpesvirus type 1 glycoprotein homologous to herpes simplex virus type 1 glycoprotein M is a major constituent of the virus particle. J. Gen. Virol. 75, 439-442.

tor»· · · *	99 9	9	99 9 9	•to to *
99 9 9 9	9 9
to	•
• ·	9	9 ·	9	9	*	to
• 9	999	999 99		··		• ···

Sambrook, J., Fritsch, D.F. and Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Schmitt, J., Becher, P., Thiel, H.J. and Keil, G.M., 1999. Expression of bovine viral diarrhoea virus giycoprotein E2 by bovine herpesvirus-1 from a sythetic ORF and incorporation of E2 into recombinant virions. J. Gen. Virol. 80, 2839-2848.

Stokes, A., Alber, D.G., Greensill, J., Amellal, B., Carvalho, FL, Tayior, L.A.,

Doel, T.R., Killington, R.A., Halliburton, I.W. and Meredith, D.M., 1996. The expression of the proteins of equine herpesvirus 1 which share homoiogy with herpes simplex virus 1 glycoproteins H and L. Virus Res. 40, 91-107.

TeJford, E.A.R., Watson, M.S., McBride, K. and Davison, A.J., 1992. The DNA sequence of equine herpesvirus-1. Virology 189, 304-316.

Telford, E.A.FL, Watson, M.S., Perry, J., Cuilinane, A.A. and Davison, A.J., 1998. The DNA sequence of equine herpesvirus-4. Journal of Gen. Virol. 79, 1197-1203.

Tewari, D., Whalley, J.M., Love, D.N. and Field, H.J., 1994. Characterisation of immune responses to bacuiovirus expressed equine herpesvirus type 1 glycoproteins D and H in a murine model. J. Gen. Virol. 75,1735-1741.

Yokoyama, N., Fujita, K., Damíani A., Sáto, E., Kurosawa, K., Miyazawa, T., Ishiguro, S,, Mochizuki, M'., Maeda, K. and Mikami, T., 1998. Further development of a recombinant feline herpesvirus type 1 vector expressing feline calicivirus. immunogenic antigen·. J. Vet. Med. Set. 60, 717-723.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny průměrné tělesné hmotnosti v procentech průměrné hmotnosti skupin ve dni infekce.

Skupiny, imunizované HÁgM-3bl, to znamená skupiny 7 až 9 byly srovnávány se všemi ostatními imunizovanými skupinami zvířat, aby bylo možno analyzovat potenciální příznivý účinek tohoto viru ve srovnání s ostatními dvěma

viry. Použitý virus má v podstatě vypuštěnou sekvenci nukleotidů pro glykoprotein M (vypuštěni AA 70-406), kdežto v případě HAgM-Ins ve skupinách 4 až 6 je otevřený čtecí rámec pro gM přerušen zařazením kazety LacZ. Tato mutanta viru je však stále ještě schopná exprimovat karboxyterminální část otevřeného čtecího rámce gM, pravděpodobně od methíoninového zbytku v poloze 226.

Virus RacH ve skupinách 1 až 3 je původní virus, z nějž byly připraveny viry HAgM-3bl a HAgM-Ins, jde o virus, široce využívaný pro vakcinaci.

Z výsledků, uvedených na obr. 1 je zřejmé, že u zvířat, očkovaných kmenem HAgM-3bl došlo k nejmenšímu přechodnému snížení tělesné hmotnosti v případě vakcinace myší při použití 10³ PFU ve skupině 10 ve srovnání se živočichy, vakcinovanými 10³ PFU kmene MAgM-Ins ve skupině 6 nebo 10³ PFU kmene RacH ve skupině 3. Závislost dávky na snížení tělesné hmotnosti po následné infekci je nižší u skupin, jimž byla podána vakcína s obsahem kmene HAgM-3bl ve skupinách 7 až 9 ve srovnání se skupinami, očkovanými kmenem HAgM-Ins ve skupinách 4 až 6 nebo kmenem RacH ve skupinách 1 až 3.

Na obr. 2 je znázorněna analýza titru viru. Ve dni 1 po infekci p.i. byly analyzovány plíce infikovaných myší u dvou zvířat, ve dni 3 p.i. u tří zvířat a ve dni 5 p.i. u dvou zvířat. Plíce myší byly vyjmuty, homogenizovány spolu s mořským pískem a uvedeny do suspenze v 1 mm prostředí DMEM s 10 % FCS. Titr viru v homogenátu plic byl určen počítáním plaků podle publikace Neubauer a další, 1997. Výsledky prokazují, že po imunizaci kmenem HAgM-3bl ve skupinách 7 až 9 je množství viru EHV, reizolované z plicní tkáně sníženo ve srovnání s infekcí kmene HÁgM-Ins ve skupinách 4 až 6 nebo kmene RacH ve skupinách 1 až 3. Každá plíce byla přitom vyjmuta odděleně, na výkrese je uveden průměrný titr viru z jednotlivých plic. Svrchu uvedený účinek je zvláště vyjádřen při použití nejnižší vakcinační dávky 10³ PFU uvedených virů a pak teprve při vyšších dávkách 10⁴ nebo 10⁵ PFU. Také trvání viremie je zkráceno, stejně jako je sníženo množství viru, které je možno zpětně izolovat ze zvířat, očkovaných kmenem HÁgM~3bl po 5 dnech ve srovnání s vakcinací kmenem HÁgM-Ins nebo RacH, a to zvláště ve skupinách, očkovaných dávkou 10³ PFU.

Na obr. 3 jsou znázorněny výsledky analýzy Western blot u lysátů infikovaných buněk při použití protilátky anti-gB mab 3F6 (Allen a Yeargan, 1987, laskavě dodáno od Dr. G. Allen, Lexington, Ky, USA) v případě A nebo při použití protilátky anti-gM mab A8 (od dr. R. A.

Killington, Leeds, UK) v případě B. Lysáty buněk byly uvedeny do suspenze v pufru pro vzorek a okamžitě byly děleny pomocí SDS-10%-PAGE. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózové membrány, které byly inkubovány s protilátkami a výsledky byly odečítány způsobem, uvedeným v následujícím odstavci. Dráha 1: buňky, infikované RacH. Dráha 2: buňky, infikované HÁgM-Ins mutantou. Dráha 3: buňky, infikované HÁgM-3bl. Dráha 4: buňky, infikované po druhé pasáži HÁgM-3bl na buňkách Rkl3. Z výsledků na panelu A specifická identifikace gB u buněk, infikovaných RacH, HÁgM-Ins a HÁgM-3bl jasně prokazuje expresi virového proteinu a replikaci viru v infikovaných buňkách. Je možno jasně pozorovat dimery a oligomery gB, takže je možno prokázat správné zpracování glykoproteinu.

Pokud jde o panel B, je možno pozorovat protein gM s očekávanou zjevnou molekulovou hmotností po detekci monoklonální protilátkou A8 u buněk, infikovaných RacH ve dráze 1. U buněk, infikovaných HÁgM-Ins je otevřený čtecí rámec přerušen uložením genu lacZ. Z tohoto důvodu má identifikovaný protein gM nižší zjevnou molekulovou hmotnost ve dráze 2. Vzhledem k tomu, že intenzita signálu western blot pro bílkovinu gM, k jejíž expresi dochází u HÁgM-Ins je srovnatelná se signálem, získaným u buněk, infikovaných RacH, je zřejmé, že při zkrácení genu nedochází k přerušení exprese gM proteinu nebo k okamžité degradaci proteinu v infikovaných buňkách. Mimo to dochází v případě HÁgM-Ins také k expresi karboxyterminální části gM vzhledem k tomu, že protilátka A8 je namířena proti hydrofilní části karboxyterminálního konce gM. V drahách 3 a 4 není možno prokázat podle očekávání žádný protein gM vzhledem k vypuštění odpovídající nukleotidové sekvence u HÁgM-3bl.

Materiály a metody (analýza Western blot)

K provedení analýzy Wester blot byly Usáty infikovaných buněk upraveny na stejnou koncentraci proteinu při použití zkoušky BCA™ (Pierce), vzorky byly uvedeny do suspenze v pufru pro vzorek s konečnou koncentrací 50 mM Tris-Cl o pH 6,8, 3,2 % dodecylsulfát sodný SDS, 5 % 2-merkaptoethanolu, 10 % glycerolu. Vzorky byly uloženy do ledu po celou dobu provedení zkoušky a nebyly zahřívány. Proteiny byly od sebe odděleny přerušovanou elektroforézou na polyakrylamidovém gelu (SDS-10% polyakrylamidový gel, Laemmli, 1970) a pak přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Schleicher &

Schull) podle publikace Kyhse-Andersen, 1984. Po přenosu byly membrány inkubovány v 10% odstředěném mléce ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem s obsahem 0,05 % Tween20 (PBS-T) po dobu 16 hodin při teplotě 4 °C. Pak byly membrány promyty 10 minut při použití PBS-T při teplotě místnosti, načež byla přidána monoklonální protilátka (mab) 3F6 podle Allen a Yeargan, 1987 nebo anti-gM mab A8 podle Day, 1999 v uvedeném ředění v PBS-T. Nitrocelulózové membrány pak byly inkubovány s monoklonálními protilátkami 1 hodinu při teplotě místností, načež byly 2krát promyty vždy 10 minut při použití PBS-T při teplotě místnosti. Vázané monoklonální protilátky byly prokazovány pomocí protilátek proti myšímu imunoglobulinu G, konjugovaných s peroxidázou (Sigma) celkem 1 hodinu při teplotě místnosti podle doporučení výrobce. Pak byly uskutečněny dva konečné promývací stupně při použití PBS-T vždy na 10 minut a reaktivní pásy byly zviditelněny pomocí chemoluminiscence (ECL™, Amersham-Pharmacia) podle návodu výrobce.

Na obr. 4 je schematicky znázorněn popis genomu HÁgM-3bl. Jsou uvedena restrikční místa pro enzym BamHI a organizace genomu v oblasti gM pro virus EHV-1 RacH a také struktura gM pro negativní virus RacH HÁgM-3bl. Jsou uvedena místa působení restrikčních enzymů, která je možno použít pro klonování.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

• * · • · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zkouška na ovlivnění imunogenních vlastností viru proteinem gM

Provedení pokusu

Myši BALB/c (Charles River) ve stáří 3 až 4 týdny byly náhodně rozděleny do 10 skupin po 14 zvířatech a byly nosní sliznicí imunizovány při použití RacH (skupiny 1 až 3) , negativní mutantou HAgM-Ins podle Neubauer a další, 1997 ve skupinách 4 až 6 nebo virem HAgM-3bl, jemuž chybí v podstatě celý otevřený čtecí rámec pro gM ve skupinách 7 až 9. Myši byly imunizovány jediným podáním 1 x 10⁵ jednotek pro tvorbu plaků PFU ve skupinách 1, 4, 7 nebo 1 x 10⁴ PFU ve skupinách 2, 5 a 8 nebo 1 x 10³ PFU 3, 6 a 9 vždy v objemu 2 μΐ. Simulovaná infekce myší ve skupině 10 byla provedena při použití 20 μΐ prostředí DMEM s 10 % FCS. 29 dnů po imunizaci byly myši infikovány nosní sliznicí dávkou 1 x 10⁵ PFU kmene RacLll ve formě suspenze v objemu 20 μΐ. Tělesné hmotnosti jednotlivých myší byly denně zaznamenávány ode dne infekce, který byl označen jako den 0. Ve dni 13 byly stanoveny relativní tělesné hmotnosti v procentech podle rovnice hmotnost ve dni n/hmotnost ve dni 0 x 100. Ve dni 1 po infekci p.i. byla usmrcena dvě zvířata, ve dni 3 p.i. byla usmrcena 3 zvířata a ve dni 5 p.i. byla usmrcena 2 zvířata v každé skupině a plíce byly analyzovány. Plíce myší byly opět homogenizovány s mořským pískem a uvedeny do suspenze v 1 ml prostředí DMEM s 10 % FCS podle Meindl a Osterrieder, 1999. Títr

viru v plicích myší byl stanoven s použitím buněk Rkl3 podle Neubauer a další 1997. Statistická analýza denně zaznamenávané tělesné hmotnosti byla uskutečněna dále uvedeným způsobem.

Výsledky

Primárním cílem svrchu uvedených pokusů bylo prokázat rozdíly v ochranném potenciálu po imunizaci kmenem HAgM-3bl ve skupinách 7 až 9 ve srovnání se skupinami 1 až 3, imunizovanými RacH a skupinami 4 až 6, imunizovanými HAgM-Ins, ukazatelem byla tělesná hmotnost myší po infekci virulentním kmenem EHV-1. Dalším cílem bylo srovnání skupin 1 až 9 se skupinou 10 se simulovanou infekcí. Skupiny 7 až 9, imunizované kmenem HAgM-3bl byly srovnávány se všemi ostatními imunizovanými skupinami k průkazu potenciálního příznivého účinku tohoto víru ve srovnání s oběma zbývajícími kmeny, že uvedený kmen má úplně vypuštěnou nukleotidovou sekvenci pro glykoprotein M, kdežto v případě kmene HAgM-Ins, použitého ve skupinách 4 až 6, je pouze přerušen otevřený čtecí rámec pro gM uložením kazety LacZ. Tato mutanta viru je však stále schopna exprese karboxyterminální částí otevřeného čtecího rámce gM. Kmen RacH, použitý u skupin 1 až 3 je původní virus, od nějž byly odvozeny oba další kmeny a představuje široce používaný kmen pro vakcinaci.

Statistické metody

Statistická analýza byla provedena při použití softwaru Win Version 6.12 na PC, který dodává SAS (Heidelberg).

• •44 « •	4 * · 4	4 4 4 4 4 4 4 4	• 4	4 4 • •	4 4 • · • 4
* 4	4	4 4	4	4	4 4
• 4	4 4 4	• 4 4 44		4 ·	4 4 4 4

Aby bylo možno vyhodnotit primární koncový bod, byla provedena opakovaně analýza variance při použití PROČ GLM (SAS) při použití programu CONTRAST pro specifické srovnání mezi vybranými skupinami, místo programu PROČ ANOVA byl použit program PROČ GLM (generalízovaný lineární model tak, aby bylo možno vzít v úvahu nevyvážené situace, vznikající odlišným počtem zvířat v různých dnech.

Program:

proč glm data=maus.obser;

clas group;

model coll--coll4=group;

repeated	time 14 (1	2	3 4	5 6 7 8 9	10	11 12 13	14	)/summary;
contrast	'skupina	10	ve	srovnání	s	ostatními	Z	group -	-1	-1
-1 -1 -1	-1 -1 -1	-1	9;
contrast	'skupina	7	ve	srovnání	se	skupinou	4'	group	0	0
0-100	1 0 0 0;
contrast	'skupina	7	ve	srovnání	se	skupinou	1'	group	-1	0
0 0 0 0	1 0 0 0;
contrast	'skupina	8	ve	srovnání	se	skupinou	2'	group	0	-1
0 0 0 0	0 10 0;
contrast	'skupina	8	ve	srovnání	se	skupinou	5'	group	0	0
0 0-10	0 10 0;
contrast	'skupina	9	ve	srovnání	se	skupinou	3'	group	0	0
-10 0 0	0 0 10;
contrast	'skupina	9	ve	srovnání	se	skupinou	6'	group	0	0
0 0 0 -1	0 0 10;

means group/waller; run; quit;

4 4

Výsledky vyhodnocení tělesné hmotnosti

Průměrná hmotnost myší ve skupinách v gramech: Kurzivou jsou uvedeny směrodatné odchylky.

DPI*	Skupina č.
	1		2		3		4		5 l
0	.16,58	0,8469	17,67	1,1585	17,12	1,0871	16,94	1,0603	16,801 1,1350
1	16,68	0,8432	17,69	0,9844	17,04	1,0058	17,00	1,1754	16,94! 1,0867
2	16,64	0,8437	17,36	0,9459	16,44	1,0390	16,91	1,2538	16,741 0,9904
3	15,021 0,8451	15,41	1,0361	14,71	0,9307	15,92	1,5361	15,761 1,2168
4	14,66 i 1,2315	14,57	1,1995	13,73	0,9326	15,52	1,8727	15,58 s 1,2695
5	15,51	1,7635	15,42	1,3433	13,92	1,2286	16,31	1,6221	16,61 í 1,1692
6	16,19	1,4357	16,02	1,2215	14,54	1,5804	16,68	1,1977	16,69] 1,1357
7	16,52 i 1,2090	16,66	1,2205	15,26	1,5153-	16,91	1,3459	16,70 j 0,9209
8	16,70	1,0296	17,26	0,9693	15,84	1,2634	17,14	1,4034	16,68 ί 0,8931
9	16,60	1,2506-	17,33	1,0436	16,31	1,2655	17,04	1,0628	16,75 [ 0,7635
10	16,88	1,0685	17,54	1,0293	16,44	1,0114	17,39	1,1305-	16,82 í 0,8035
11	16,55	1,0747	17,50	0,9092	16,81	0,9634	17,40	1,2689	16,78 i 0,6706
_; 12	16,67	0,9004	17,63	\ 0,9517	,16,87	0,8118	.17,31	. 0,8494	16,92'í 0,7808
13	16,73	0,8066	17,86	1,0130	16,93	1,1191	17,31	0,9100	16,92 i 0,5811
14	17,13	0,9873	17,99	1,3184	17,06	1,0518	17,56	0,8080	17,10 j 0,7099

*DPI = dny po infekci

I ’ «Μ· « · · • · • 9 • · ·

9 9 9 9

9 9 •* 9999

DPI*					Skupina S.
	6		7		8		9		10
0	17,27	1,1339	17,36	0,9500	17,14	2,3207	16,72	0,9839	16,71	1,0418
1	17,67	0,7016	17,53	1,0266	17,21	2,2860	16,81	0,9841	; 16,96	0,8949
2	17,73	0,8097	17,35	1,0713	17,27	2,2001	16,83	1,0572	'16,46	0,8653
3	16,76	1,0424	.16,33	1,7499	^: 16,29	2,5749	16,08	1,6208	15,04	0,8039
4	16,22	1,2952	: 16,52	, 2,2320	'16,05	2,7071	15,78	2,1063	Ί3.97	0,4880
ί 5	14,88	1,6816	'17,56	1,6396	; 16,81	2,8616	'16,64	2,1378	13,39	0,4947
θ	'15,31	1,8380	17,83	1,1386	; 16,92	2,8217	16,87	1,4950	12,85	0,6285
: 7	16,77	2,0265	: 18,20	1,1437	: 16,69	2,8737	.17,10	1,4787	12,70	1,2629
8	17,00	1,6817	18,10	1,1331	16,93	2,8099	17,19	1,1922	12,66	1,9100
9	17,38	1,4892	18,18	1,0759	17,01	2,5142	17,31	1,0699	13,80	2,0347
10	17,52	1,6130	18,27	1,0893	17,07	2,4635	17,51	1,0885	14,15	2,.1142
11	17,55	1,5333	18,32	1,1179	17,11	2,1721	17,44	1,0706	14,40 í 1,9849
12	17,77	1,5410	18,28	1,0962	17,24	2,2693	17,49	1,0007	14,78	1,8945
13	17,72	1,5211	18,55	1,0095	17,37	2,4432	17,47	1,0128	15,40	1,5033
14	17,68	1,4959	18,53	1,0093	17,43	2,3915	17,43	1,1086	15,83	1,1615

*DPI = dny po infekci

1. Srovnání zvířat se simulovanou infekcí ve skupině 10 s imunizovanými zvířaty. Následující tabulka uvádí průměrnou tělesnou hmotnost simulované imunizovaných zvířat, tato tělesná hmotnost byla statisticky významně vyšší ve dni 3 nebo vysoce statisticky významně nižší ve dnech 4 až 13 po infekci ve srovnání s hmotností v ostatních skupinách.

Tabulka 1.

Skupina 10 proti ostatním	Hodnota F¹	Hodnota p
Den 1^{2 * 4}	2.56	0.1156
Den 2	1.33	. 0.2541
Den 3	9.03	0.0040*
Den 4	' 20.46	0.0001**
Den 5	54.83	0.0001**
Den 6	72.31	0.0001**
Den 7	84.82	0.0001**
Den 8	61.62	0.0001**
Den 9	52.91	0.0001**
De& 10	40.47	0.0001**
Den11	35.21	0.0001**
Den 12	24.18	0.0001**
Den 13	18.52	0.0001·**

= statistický test = statistické výsledy jsou uvedeny ode dne 1 do dne 13, ve dni 0 jsou všechny výpočty totožné (tyto hmotnosti jsou považovány za 100 %) * = statisticky významné (<0,05) ★★ = statisticky vysoce významné (<0,0001)

2. V následující tabulce je uvedeno srovnání myší ve skupině 7, imunizovaných kmenem HAgM-3bl v dávce 10⁵

PFU/myš se skupinou myší, imunizovaných RacH (skupina 1, 10⁵ PFU) a skupinou myší, imunizovaných HAgM-Ins (skupina

4, 10 ⁵ PFU), pokud jde o prevenci snížení tělesné hmotnosti po infekci.

.1 υ

·*

Výsledky prokazují, že nebylo možno pozorovat statisticky významné rozdíly v průměrné tělesné hmotnosti u skupin, imunizovaných nejvyššími dávkami viru nezávisle na tom, který kmen byl použit k imunizaci.

Tabulka 2.

Skupina 7 proti Hodnota F¹ Hodnota p skupině 4

Den 1²	0.00	0.9452
Den 2	0.27	0.6047
Den 3	1.50	0.2257
Den 4	1.85	0.1800
Den 5	0.82	0.3693
Den 6	0.82	0.3683
Den 7	0.06	0.8112
Den 8	0.38	0.5396
Den 9	0.00	0.9765
Den 10	0.01	0.9246
Den 11	0.03	0.8552
Den 12	0.65	0.4228
Den	0.03	0.8535

Skupina 7 proti skupině 1

Den 1	0.50	0.4831
Den 2	2.54	0.1167
D en3	3.22	0.0782
Den 4	1.23	0.2719
D«n 5	0.40	0.5281
Den 6	0.27	0.6030
Den?	0.01	0.9287
Den 8	0.12	0.7288.
Den θ'	0.03	0.8720
Den 10	0.45	0.5048
Den 11	0.13	0.7213
Den	0.64	0.4266
Den 13	0.03	0.8588

= statistický test = statistické výsledy jsou uvedeny ode dne 1 do dne 13, ve dni 0 jsou všechny výpočty totožné (tyto hmotnosti jsou považovány za 100 %) * = statisticky významné (<0,05) ** = statisticky vysoce významné (<0,0001)

3. Srovnání zvířat ve skupině 8, imunizovaných kmenem HÁgM-3bl v dávce 10⁴ PFU/myš se zvířaty, imunizovanými RacH ve skupině 2 při použití dávky 10⁵ PFU a se zvířaty, imunizovanými HAgM-Ins ve skupině 5 při použití 10⁴ PFU, pokud jde o prevenci snížení tělesné hmotnosti po infekci. V následující tabulce je uvedena statistická analýza pro skupiny myší, jimž byla podána dávka 10⁴ PFU. Rozdíly v průměrné tělesné hmotnosti byly statisticky významné mezi zvířaty ze skupiny 8 (10⁴ PFU HAgM-3bl) a ze skupiny 5 (HAgM-Ins) ve dnech 1 a 11 až ·· ·♦··

13. Avšak u zvířat ve skupině 2, imunizovaných RacH byly průměrné tělesné hmotnosti statisticky nebo vysoce statisticky významně nižší ve všech dnech po infekci při srovnání se skupinou 8, imunizovanou HÁgM-3bl.

Tabulka 3.
Skupina 8 proti	Hodnota F¹	Hodnot
skupině 5
	6.91	0.0112*
Den - ¹
Den 2	3.23	0.0782
Den . 3	3.08	0.0849
Den 4	0.85	0.3614
Den 5	1.67	0.2014
Den θ	0.75	0.3911
7	2.62	0.1113
Den
Den 8	3.23	0.0779
Den θ	3.19	0.0800
Den 10	4.00 -	0.0506
Den 11	4.20	0.0453*
Den 12	5.75	0.0200*
Den 13	4.98	0.0299*
Skupina 8 proti
skupině 2
Den1	11.06	0.0016*
Den 2	10.75	0.0018*
Den 3	18.26	0.0001**
Den 4	14.56	0.0004*
Den 5	13.66	0.0005*
Den 6	12.44	0.0009*

·♦*·

	29	• * · · · * · 9 · « » ·· ·*· ♦·· ··
Den 7	9.87	0.0028*
Den 8	11.07	0.0016*
Den 9	8.75	0.0046*
Den 1θ	10.08	0.0025*
Den tj	10.83	0.0018*
Den 12	10.36	0.0022*
Den 13	10.50	0.0021*

= statistický test = statistické výsledy jsou uvedeny ode dne 1 do dne 13, ve dni 0 jsou všechny výpočty totožné (tyto hmotnosti jsou považovány za 100 %) * = statisticky významné (<0,05) *★ = statisticky vysoce významné (<0,0001)

4. Srovnání myší, imunizovaných HÁgM-3bl ve skupině 9 při použití 10³ PFU/myš se skupinou 3, imunizovanou RacH v dávce 10³ PFU a skupinou 6, imunizovanou HÁgM-Ins v dávce 10³ PFU, pokud jde o prevenci snížení tělesné hmotnosti po infekci.

V následující tabulce jsou uvedeny výsledky pro nejnižší dávku, použitou k imunizaci. Je možno shrnout, že myši, jimž byl podán kmen HÁgM-3bl v nejnižší dávce, měly statisticky významně nebo vysoce statisticky významně vyšší průměrnou tělesnou hmotnost ve dnech 4 až 9 ve srovnání se zvířaty, jimž byla podána stejná dávka kmene HÁgM-Ins nebo RacH. Mimoto došlo u zvířat, imunizovaných kmenem RacH k podstatnému snížení tělesné hmotnosti ve srovnání se zvířaty, imunizovanými HÁgM-3bl ve dnech 1 až 3 po infekci.

4444

	30	4 · 4 4 · 4 * • 4 4 4 · 4 44 »·· 444 44
Tabulka 4.
Skupina 9 proti	Hodnota F¹	Hodnota
skupině 6
Den 1	0.00	0.9505
9	1.55	0.2193
Den *
Den 3	2.51	0.1190
Den 4	22.95	0.0001**
Den 5	24.34	0.0001**
Den 6	8.23	0.0059*
Den 7	6.81	0.0118*
Den 8	4.22	0.0449*
Den g	4.87	0.0316*
Den 10	3.60	0.0631
Den 11	2.64	0.1103
Den j2	3.33	0.0735
Den 13	3.45	0.0687
Skupina 9 proti
skupině 3
Den 1	16.62	0.0002*
Den 2	15.11	0.0003*
Den 3	32.13	0.0001**
Den 4	35.92	0.0001**
' Den 5	36.46	0.0001**
Dean 6	23.68	0.0001**
Den 7	14.81	0.0003*
Den 8	9.03	0.0041*
Den g	9.45	0.0033*
Den 10	3.77	0.0574
Den 11'	3.88	0.0542
Den 12	3.87	0.0543
Den 13	2.55 '	0.1161

··♦· ·♦ ·· ·« «·· 99 9 * · « « • ♦ >··*♦ 9

9 9 9 9 9 9 9 9 · οι · « · ♦·♦♦··

O -L »· «»· 99» 99 99 9999 = statistický test = statistické výsledy jsou uvedeny ode dne 1 do dne 13, ve dni 0 jsou všechny výpočty totožné (tyto hmotnosti jsou považovány za 100 %) * = statisticky významné (<0,05) ** = statisticky vysoce významné (<0,0001)

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Koňský herpes virus, vyznačující se tím, že je v podstatě prostý proteinu gM.
2. Koňský herpes virus podle nároku 1, vyznačující se tím, že chybí alespoň 70 % genu pro gM.
3. Koňský herpes virus podle nároku 2, vyznačující se tím, že chybí alespoň 80 % genu pro gM.
4. Koňský herpes virus podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že chybí alespoň 90 % genu pro gM.
5. Koňský herpes virus, vyznačující se tím, že jeho protein gM je modifikovaný a nefunkční.
6. Koňský herpes virus, vyznačující se tím, že jeho protein gM je modifikovaný a nefunkční s ohledem na svou imunomodulační účinnost při interakci mezi virem a hostitelem.
7. Koňský herpes virus podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že protein gM je modifikován vypuštěním, mutací nebo uložením dalších prvků do kódového genu pro protein gM.‘
8. Koňský herpes virus podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že kódový gen pro protein gM je vypuštěn nebo modifikován, přičemž exprese φφφφ φ φ φ'φ φφ φφ φφφ φφφ φ · · · • φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φφφ φφ φφφ φφφ Φφ φφ φφφφ kódového genu pro homolog UL9, to znamená gen 53 není ovlivněna.
9. Koňský herpes virus podle nároku 1 až 8, vyznačující se tím, že nukleotidy 93254 až 94264 podle kmene viru EHV-1 Ab4p nebo odpovídající nukleotidy u jiných kmenů EHV jsou vypuštěny.
10. Koňský herpes virus kmene HÁgM-3bl, vyznačující se tím, že je uložen pod přírůstkovým číslem 99101536 ve sbírce EACC.
11. Koňský herpes virus podle některého z nároků 1 až lé, vyznačující se tím, že běží o typ 1 nebo typ 4 EHV.
12. Koňský herpes virus podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že nese 1 nebo větší počet heterologních genů.
13. Nukleová kyselina pro koňský herpes virus podle některého z nároků 1 až 12.
14. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje koňský herpes virus podle některého z nároků 1 až 12.
15. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku

13.
16. Použití koňských herpes virů podle některého z nároků 1 až 12 pro výrobu farmaceutického prostředku.

··»· · · »♦ 4« ·· • 44 4· · · « · 4 • 4 · · · · · 4

444 4 4 · 444

44 999 999 99 99 4444
17. Použití nukleové kyseliny podle nároku 13 pro výrobu farmaceutického prostředku.
18. Způsob zlepšení odpovědi imunitního systému, vyvolané vakcínou koňského herpes viru proti infekcím divokého typu, vyznačující se tím, že vakcína obsahuje koňský herpes virus podle některého z nároků 1 až 12.
19. Způsob profylaxe a/nebo léčení živočichů, vyznačující se tím, že se podává farmaceutický prostředek podle nároku 14 nebo 15.
20. Způsob rozlišení živočicha, infikovaného divokým typem koňského herpes viru od živočicha, léčeného modifikovaným koňským herpes virem podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se stanoví totožnost proteinu gM divokého typu viru nebo identita proteinu gM, k jehož expresi dochází nebo jeho podstatná nepřítomnost v modifikovaném viru.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se

a) zkoumaný vzorek přidá k izolovanému proteinu gM nebo jeho modifikovanému derivátu,

b) přidá protilátka specifická proti izolovanému proteinu gM nebo jeho modifikovaným derivátům,

c) stanoví vazba této protilátky.
22. Zkušební balíček k provádění způsobu podle nároku 20 a/nebo 21, vyznačující se tím, že obsahuje izolovaný protein gM nebo jeho izolované ··»· 4 · 44 »4 44

4 44 44 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4

444 4·4 4>4

44 444 444 44 4· 4444 modifikované deriváty a/nebo protilátky, které jsou specifické pro divoký typ proteinu gM nebo pro modifikovaný protein gM.
23. Způsob odlišení živočicha, infikovaného divokým typem koňského herpes viru od živočicha, léčeného modifikovaným koňským herpes virem podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se stanoví rozdíl v kódovém řetězci nukleové kyseliny pro protein gM divokého typu a nukleové kyseliny pro modifikovaný protein gM nebo se stanoví nepřítomnost tohoto proteinu.
24. Zkušební balíček k provádění způsobu podle nároku 23, vyznačující se tím, že obsahuje 1 nebo větší počet specifických sond pro nukleotidové sekvence, schopných se vázat na kódové nukleotidy pro protein gM divokého typu nebo na kódové nukleotidy pro modifikovaný protein gM.