CZ2001424A3

CZ2001424A3 - Phosphorylated polymers conjugates thereof

Info

Publication number: CZ2001424A3
Application number: CZ2001424A
Authority: CZ
Inventors: Shalaby Wahba Shalaby; Joel Thomas Corbett
Original assignee: Poly-Med Inc.
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2001-08-15

Abstract

Nové absorbovalelné polyestery zahrnujíjednu nebo více monofosfátových funkcí a konjugáty těchto polyesterů s peptidem nebo bioaktivní sloučeninou, kteréjsou vhodné pro přípravu mikročástic s řízeným uvolňovánímužitečných ve farmaceutických přípravcích.New absorbable polyesters include one or more monophosphate functions and conjugates of these polyesters with a peptide or bioactive compound that are suitable for preparing controlled release microspheres in pharmaceutical preparations.

Description

(57) Anotace:(57)

Nové absorbovalelné polyestery zahrnují jednu nebo více monofosfátových funkcí a konjugáty těchto polyesterů s peptidem nebo bioaktivní sloučeninou, které jsou vhodné pro přípravu mikročástic s řízeným uvolňováním užitečných ve farmaceutických přípravcích.Novel absorbable polyesters include one or more monophosphate functions and conjugates of these polyesters with a peptide or bioactive compound that are suitable for the preparation of controlled release microparticles useful in pharmaceutical compositions.

CZ 2001 - 424 A3CZ 2001 - 424 A3

Fosforylované polymery a jejich konjugátyPhosphorylated polymers and their conjugates

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká absorbovatelných polyesterů zahrnujících jednu nebo více monofosfátových funkcí, dále se týká konjugátů zahrnujících výše zmíněné polyestery a peptid nebo bioaktivní činidlo; mikročástic zahrnujících absorbovatelný polyester, konjugátů zahrnujících mikročástice a peptid a/nebo bioaktivní činidlo, acylovaný nebo alkylovaný polysacharid mající jeden nebo více monofosfátových funkcí, konjugátů obsahujících acylovaný nebo alkylovaný polysacharid a peptid a/nebo bioaktivní činidlo a jejich farmaceutických přípravků.The invention relates to absorbable polyesters comprising one or more monophosphate functions, further to conjugates comprising the aforementioned polyesters and a peptide or bioactive agent; microparticles comprising an absorbable polyester, conjugates comprising microparticles and a peptide and / or a bioactive agent, an acylated or alkylated polysaccharide having one or more monophosphate functions, conjugates comprising an acylated or alkylated polysaccharide and a peptide and / or a bioactive agent, and pharmaceutical compositions thereof.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Polymery s řetězci obsahujícími fosfor jsou v patentové a technické literatuře citovány v souvislosti s (1) nehořlavými a/nebo hydrofilními polyamidy (Shalaby, S. W. et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed., 12, 2917 (1974), Shalaby, S. W., et al., J. Polym. Sci., Polym. chem. Ed., 13, 669 (1975), Shalaby S. W., et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed., 14, 2675 (1976), Shalaby S. W. a McCaig S., U. S. Patent 5,491,198, Shalaby S. W. a Rogers. K. R., U. S. Patent 5,558,517); (2) nehořlavými polyestery (Heffner R. E., U. S. Patent 4,420,587, Koch P. J. et al., J. Appl. Polym. Sci, 19, 227 (1975), Japonský patent 51-40432); (3) nehořlavými polyurethany a epoxypryskyřicemi (German patent DE 1,292,862, US Pat 3,321,555); (4) termicky stabilními polyestery s koncovými skupinami řetězce reagujícími s fosforylthiokyanátem (U. S. Patent 3,838,045); (5) foaforylovanou celulosou jako výměníkem kationtů (DD 286600) a (6) fosforylovanými polyestery jako polovodivými materiály (SU 672878). V literatuře ovšem není známo zabudování fosfátových skupin na dostupné koncové hydroxyskupiny absorbovatelného polyesteru, přičemž tato místa jsou typicky přítomna na jednom nebo dvou koncích řetězce. To není překvapující, protože podmínky chemických reakcí známých pro fosforylaci hydroxyskupiny by mohly způsobovat hydrolýzu vysoce reaktivního absorbovatelného polyesterového řetězce. Je zde velký zájem o vyvinutí absorbovatelných polyesterů nesoucích karboxyly pro použití při tvorbě konjugátů s bioaktivními peptidy pro tvorbu systémů s řízeným uvolňováním (Shalaby S. W. et al., U. S. Patent 5,672, 659).Polymers with phosphorus-containing chains are cited in the patent and technical literature in connection with (1) non-flammable and / or hydrophilic polyamides (Shalaby, SW et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed., 12, 2917 ( 1974), Shalaby, SW, et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed., 13, 669 (1975), Shalaby SW, et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed., 14, 2675 (1976), Shalaby SW and McCaig S., US Patent 5,491,198, Shalaby SW and Rogers, KR, US Patent 5,558,517); (2) non-combustible polyesters (Heffner R.E., U.S. Patent 4,420,587, Koch P.J. et al., J. Appl. Polym. Sci, 19, 227 (1975), Japanese Patent 51-40432); (3) non-combustible polyurethanes and epoxy resins (German patent DE 1,292,862, US Pat 3,321,555); (4) thermally stable phosphorous thiocyanate-reactive polyesters (U. S. Patent 3,838,045); (5) phosphorylated cellulose as a cation exchanger (DD 286600); and (6) phosphorylated polyesters as semiconducting materials (SU 672878). However, it is not known in the literature to incorporate phosphate groups on the available hydroxyl end groups of the absorbable polyester, these sites being typically present at one or two chain ends. This is not surprising since the chemical reaction conditions known for phosphorylation of the hydroxy group could cause hydrolysis of the highly reactive absorbable polyester chain. There is a great interest in developing absorbable carboxyl-bearing polyesters for use in the formation of conjugates with bioactive peptides for the production of controlled release systems (Shalaby S.W. et al., U.S. Patent 5,672, 659).

• · · ♦ · · · » ·· ··· ···.• · · · · · · · · · · · ·

··· ···· ·· ···· ·· ······ ···· ·· ···· ·· ···

Je zde tedy motivace připravit přímo fosforylované absorbovatelné polyestery pro systémy s řízeným uvolňováním, bez toho, aniž bychom způsobili významnou degradaci řetězce.Thus, there is an incentive to prepare directly phosphorylated absorbable polyesters for controlled release systems without causing significant chain degradation.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

V jednom aspektu je tento vynález směrován k absorbovatelnému polymeru s alespoň jednou monofosfátovou funkční skupinou v jednom absorbovatelném řetězci. Preferované provedení výše jmenovaného absorbovatelného polyesteru je takové, kde polyesterový řetězec zahrnuje jeden nebo více monomerů, vybraných ze skupiny obsahující kyselinu L-mléčnou, kyselinu D- mléčnou, kyselinu DL-mléčnou, kyselinu jablečnou, kyselinu citrónovou, kyselinu vinnou, ε-kaprolaktam, ε-kapronovou kyselinu, alkylenoxalát, cykloalkylenoxalát, alkylensukcinát, β-hydroxybutyrát, glykolid, kyselinu glykolovou, L-laktid, D-laktid, DL-laktid, meso-laktid, trimethylenkarbonát, p-dioxanon, l,5-dioxepan-2-on a l,4-dioxepan-2-on a libovolný opticky aktivní izomery, racemáty nebo jejich kopolymery. Více preferované provedení zmíněného vynálezu je takové, kde absorbovatelný polyester dále zahrnuje jeden nebo více polyethylenglykolových segmentů kovalentně vázaných k polyesteru. Další aspekt tohoto vynálezu je směřován ke konjugátům zahrnujícím polyester podle tohoto vynálezu a peptid a/nebo bioaktivní činidlo, kde peptid a bioaktivní činidlo mají alespoň jednu interaktivní aminoskupinu, kde monofosfátová funkční skupina tvoří spojení s touto aminoskupinou. Preferované provedení těchto konjugátů je takové, kde je peptid vybrán ze skupiny obsahující pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, Η-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-CysThr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou, N-hydroxyethylpiperazinylacetyl-DPhe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou a Nhydroxyethylpiperazinylethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli.In one aspect, the present invention is directed to an absorbable polymer having at least one monophosphate functionality in one absorbable chain. A preferred embodiment of the aforesaid absorbable polyester is one wherein the polyester chain comprises one or more monomers selected from the group consisting of L-lactic acid, D-lactic acid, DL-lactic acid, malic acid, citric acid, tartaric acid, ε-caprolactam, ε-caproic acid, alkylene oxalate, cycloalkylene oxalate, alkylene succinate, β-hydroxybutyrate, glycolide, glycolic acid, L-lactide, D-lactide, DL-lactide, meso-lactide, trimethylene carbonate, p-dioxanone, 1,5-dioxepane-2- one α1,4-dioxepan-2-one and any optically active isomers, racemates or copolymers thereof. A more preferred embodiment of said invention is one wherein the absorbable polyester further comprises one or more polyethylene glycol segments covalently bonded to the polyester. Another aspect of the invention is directed to conjugates comprising the polyester of the invention and a peptide and / or bioactive agent, wherein the peptide and bioactive agent have at least one interactive amino group, wherein the monophosphate functional group forms a linkage with that amino group. A preferred embodiment of these conjugates is that wherein the peptide is selected from the group consisting of pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, β-D-Nal-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-CysThr-NH2 wherein two Cys are disulfide bonded, N-hydroxyethylpiperazinylacetyl-DPhe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2 wherein the two Cys are disulfide bonded and Nhydroxyethylpiperazinylethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH 2 wherein the two Cys are disulfide bonded or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

V dalším aspektu se vynález zabývá konjugáty zahrnujícími absorbovatelný polyester s alespoň jednou monofosfátovou funkční skupinou na absorbovatelném polyesterovém řetězci a peptid a/nebo bioaktivní činidlo, kde peptid a bioaktivní činidlo mají alespoň jednu interaktivní aminoskupinu, kde monofosfátová funkční skupina je spojena s touto aminoskupinou. Preferovaný konjugát je takový, kde je peptid vybrán ze skupiny obsahující p-Glu-His-Trp-SerTyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, H^-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NHh, kde dva Cys jsou spojeny disulfidickou vazbou, N-hydroxyethylpiperazinyl-acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D2In another aspect, the invention relates to conjugates comprising an absorbable polyester with at least one monophosphate functionality on an absorbable polyester chain and a peptide and / or bioactive agent, wherein the peptide and bioactive agent have at least one interactive amino group, wherein the monophosphate functionality is linked to the amino group. A preferred conjugate is one wherein the peptide is selected from the group consisting of p-Glu-His-Trp-SerTyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2, H 4 -D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp -Lys-Val-Cys-Thr-NHh wherein two Cys are linked by a disulfide bond, N-hydroxyethylpiperazinyl-acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D2

Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou a Nhydroxyethylpiperazinyl-ethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli.Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2 wherein two Cys are disulfide bonded and Nhydroxyethylpiperazinyl-ethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2 wherein two Cys are disulfide bonded or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje k tuhým absorbovatelným mikročásticím, zahrnujícím absorbovatelný polyester s alespoň jednou monofosfátovou funkční skupinou na jednom absorbovatelném řetězci a majícím povrch, kde více než jedno procento monofosfátových zbytků je umístěno na povrchu absorbovatelné mikročástice. Další aspekt tohoto vynálezu je konjugát zahrnující právě zmíněné absorbovatelné mikročástice a peptid a/nebo bioaktivní činidlo, přičemž peptid a bioaktivní činidlo mají alespoň jednu interaktivní aminoskupinu, přičemž monofosfátová funkční skupiny na povrchu absorbovatelné mikročástice tvoří spojení s touto aminoskupinou. Preferované provedení právě popsaných konjugátů zahrnuje konjugáty jejichž peptid je vybrán za skupiny obsahující p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-ArgPro-Gly-NH2, H-P-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou, N-hydroxyethylpiperazinylacetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-CysThr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou a Nhydroxyethylpiperazinylethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli.In another aspect, the invention relates to solid absorbable microparticles comprising an absorbable polyester having at least one monophosphate functionality on one absorbable chain and having a surface wherein more than one percent of the monophosphate residues are located on the surface of the absorbable microparticle. Another aspect of the invention is a conjugate comprising the aforesaid absorbable microparticles and a peptide and / or a bioactive agent, wherein the peptide and the bioactive agent have at least one interactive amino group, wherein the monophosphate functional groups on the surface of the absorbable microparticle form a linkage with the amino group. A preferred embodiment of the just described conjugates includes those whose peptide is selected from the group consisting of p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-ArgPro-Gly-NH2, HPD-Nal-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-Thr-NH ₂ wherein two Cys are disulfide bonded, N-hydroxyethylpiperazinylacetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-CysThr-NH 2 wherein the two Cys are disulfide bonded and Nhydroxyethylpiperazinylethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH 2 wherein the two Cys are disulfide bonded or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k acylovanému nebo alkylovanému polysacharidu, majícímu jednu nebo více koncových monofosfátových funkčních skupin v molekule. Preferované provedení je takové, kde absorbovatelným polysacharidem je acylovaný γcyklodextrin. Další aspekt tohoto vynálezu zahrnuje alkylovaný nebo acylovaný absorbovatelný polysacharid mající jednu nebo více terminálních monofosfátových skupin v molekule a peptid a/nebo bioaktivní činidlo, kde peptid a bioaktivní činidlo mají alespoň jednu interaktivní aminoskupinu, přičemž monofosfátová skupina tvoří vazbu s touto aminoskupinou. Preferované provedení těchto konjugátů je takové, kde je peptid vybrán ze skupiny obsahující p-Glu-His-TrpSer-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, H-P-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou, N-hydroxyethylpiperazinylacetyl-D-Phe-Cys-Tyr-DTrp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou a Nhydroxyethylpiperazinylethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfidickou vazbou nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli.In another aspect, the invention relates to an acylated or alkylated polysaccharide having one or more terminal monophosphate functional groups per molecule. A preferred embodiment is one wherein the absorbable polysaccharide is acylated γcyclodextrin. Another aspect of the invention includes an alkylated or acylated absorbable polysaccharide having one or more terminal monophosphate groups in the molecule and a peptide and / or bioactive agent, wherein the peptide and bioactive agent have at least one interactive amino group, wherein the monophosphate group forms a bond with that amino group. A preferred embodiment of these conjugates is that wherein the peptide is selected from the group consisting of p-Glu-His-TrpSer-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2, HPD-Nal-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-Thr-NH ₂ wherein two Cys are disulfide bonded, N-hydroxyethylpiperazinylacetyl-D-Phe-Cys-Tyr-DTrp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH 2 wherein the two Cys are disulfide bonded and Nhydroxyethylpiperazinylethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH 2 wherein the two Cys are disulfide bonded or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje k farmaceutickým přípravkům zahrnujícím jeden nebo více výše popsaných konjugátů.In another aspect, the present invention relates to pharmaceutical compositions comprising one or more of the above-described conjugates.

• ·φ ·« ·· ·· 9 • · · Φ · · · · ·· · · · · · · ··· ···· ·· ···· ·» ···· Φ 9 9 9 • 9 9 9 · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

V dalším aspektu se tento vynález zabývá absorbovatelnými polymery s alespoň jednou monofosfátovou skupinou pro použití jako kyselý excipient kyanoakrylátových přípravků.In another aspect, the invention relates to absorbable polymers with at least one monophosphate group for use as an acidic excipient of cyanoacrylate formulations.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje ke způsobu výroby nízkotajících polyesterů nesoucích fosforylované hydroxylové skupiny, majících krystalinitu 1 až 60%, který zahrnuje reakci polyesteru nesoucího hydroxylové skupiny s přebytkem pyrofosforečné kyseliny za vzniku polyesteru s fosforylovanými hydroxylovými skupinami.In another aspect, the present invention relates to a process for producing low melting polyesters bearing phosphorylated hydroxyl groups having a crystallinity of 1 to 60%, comprising reacting a hydroxyl bearing polyester with an excess of pyrophosphoric acid to form a polyester with phosphorylated hydroxyl groups.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje ke způsobu výroby fosforylovaného acylovaného cyklodextrinu, zahrnujícímu reakci acylovaného cyklodextrinu s přebytkem pyrofosforečné kyseliny za vzniku fosforylovaného acylovaného cyklodextrinu.In another aspect, the present invention relates to a method for producing a phosphorylated acylated cyclodextrin, comprising reacting an acylated cyclodextrin with an excess of pyrophosphoric acid to form a phosphorylated acylated cyclodextrin.

V dalším aspektu se tento vynález zabývá způsobem výroby fosforylovaného alkylovaného cyklodextrinu, zahrnujícím reakci alkylovaného cyklodextrinu s přebytkem pyrofosforečné kyseliny za vzniku fosforylovaného alkylovaného cyklodextrinu.In another aspect, the present invention is directed to a process for producing a phosphorylated alkylated cyclodextrin, comprising reacting an alkylated cyclodextrin with an excess of pyrophosphoric acid to form a phosphorylated alkylated cyclodextrin.

V dalším aspektu je tento vynález směřován ke způsobu výroby fosforylovaných mikročástic, zahrnujícímu reakci mikročástic nesoucích hydroxyly s přebytkem pyrofosforečné kyseliny za vzniku fosforylovaných mikročástic.In another aspect, the present invention is directed to a process for producing phosphorylated microparticles comprising reacting hydroxyl-bearing microparticles with an excess of pyrophosphoric acid to form phosphorylated microparticles.

V dalším aspektu popisuje tento vynález způsob výroby acylovaného fosforylovaného polysacharidu, zahrnující reakci polysacharidu se zahřívanou směsí pyrofosforečné kyseliny a acylačního činidla za vzniku acylovaného fosforylovaného polysacharidu. Preferovaný způsob výroby je takový, kde polysacharidem je cyklodextrin a acylačním činidlem je anhydrid kyseliny propionové nebo octové. Reakce může být prováděna při teplotách od pokojové teploty do 100 °C.In another aspect, the invention provides a method of making an acylated phosphorylated polysaccharide, comprising reacting the polysaccharide with a heated mixture of pyrophosphoric acid and an acylating agent to form an acylated phosphorylated polysaccharide. A preferred process is one wherein the polysaccharide is cyclodextrin and the acylating agent is propionic or acetic anhydride. The reaction may be carried out at temperatures ranging from room temperature to 100 ° C.

V dalším aspektu se tento vynález zabývá fosforylovaným roubovaným acylovaným cyklodextrinem, majícím jednu nebo více monofosfátových skupin.In another aspect, the invention relates to a phosphorylated grafted acylated cyclodextrin having one or more monophosphate groups.

V dalším aspektu se vynález zabývá způsobem přípravy fosforylovaného roubovaného acylovaného cyklodextrinu, který je roubován s heterocyklickým monomerem, zahrnujícím takové, které jsou používané při přípravě absorbovatelných polymerů jako např. laktid, glykolid, trimethylenkarbonát a/nebo ε-kaprolakton, přičemž způsob výroby zahrnuje zahřívání monomeru s acylovaným cyklodextrinem v přítomnosti katalytického množství oktanoátu cínatého po dobu 2-24 hodin při teplotách 100 °C až 200 °C za vzniku reakční směsi obsahující roubovaný acylovaný cyklodextrin, rozpuštění reakční směsi obsahující roubovaný acylovaný cyklodextrin v acetonu za vzniku acetonového roztoku, vysrážení acetonového roztoku v ledové vodě za vzniku sraženiny, izolaci sraženiny, sušení sraženiny za vzniku sušené sraženiny a reakci sušené • « ··· «·· ······· «· ···· «* · · · sraženiny s přebytkem pyrofosforečné kyseliny za vzniku fosforylovaného roubovaného acylovaného cyklodextrinu.In another aspect, the invention provides a process for preparing a phosphorylated grafted acylated cyclodextrin that is grafted with a heterocyclic monomer, including those used in the preparation of absorbable polymers such as lactide, glycolide, trimethylene carbonate and / or ε-caprolactone, the process comprising heating monomer with acylated cyclodextrin in the presence of a catalytic amount of stannous octanoate for 2-24 hours at temperatures of 100 ° C to 200 ° C to form a reaction mixture containing grafted acylated cyclodextrin, dissolving the reaction mixture containing grafted acylated cyclodextrin in acetone to form acetone solution; solution in ice water to form a precipitate, isolating the precipitate, drying the precipitate to form a dried precipitate, and drying the precipitate with an excess of pyrophosphorus. acid to form a phosphorylated grafted acylated cyclodextrin.

V dalším aspektu se tento vynález zabývá konjugáty obsahujícími peptid a/nebo bioaktivní činidlo a fosforylovaný roubovaný acylovaný cyklodextrin, kde peptid a bioaktivní činidlo mají alespoň jednu interaktivní aminoskupinu a monofosfátová funkční skupina tvoří spojku s touto aminoskupinou.In another aspect, the invention relates to conjugates comprising a peptide and / or a bioactive agent and a phosphorylated grafted acylated cyclodextrin, wherein the peptide and the bioactive agent have at least one interactive amino group and the monophosphate functional group forms a linker to the amino group.

Termín „roubovaný“ popisuje polyesterový roub, vzniklý z heterocyklického monomeru jako je laktid, glykolid, trimethylenkarbonát a/nebo ε-kaprolaktam.The term "grafted" describes a polyester graft formed from a heterocyclic monomer such as lactide, glycolide, trimethylene carbonate and / or ε-caprolactam.

Termín „absorbovatelný“ odkazuje na vodo-nerozpustný materiál jako je třeba polymer, který podléhá disociaci řetězce v biologickém prostředí za vzniku vodo-rozpustných produktů jako funkci času a nezanechává v místě implantace nebo podání prakticky žádný zbytek.The term "absorbable" refers to a water-insoluble material such as a polymer that undergoes chain dissociation in a biological environment to produce water-soluble products as a function of time and leaves virtually no residue at the site of implantation or administration.

V tomto vynálezu se označují aminokyseliny pomocí standardních třípísmenných zkratek známých v oboru, jako např. Ala pro alanin.In this invention, amino acids are referred to by standard three letter abbreviations known in the art, such as Ala for alanine.

Termín „mikročástice“ označuje částice absorbovatelného polyesteru mající prakticky kulový tvar.The term "microparticles" refers to absorbable polyester particles having a practically spherical shape.

Termín „monofosfátová funkční skupina“ označuje, že polymerní řetězec je kovalentně svázán s fosforečnou kyselinou pomocí jedné fosfátové vazby což nechává zbylé dvě hydroxylové skupiny dostupné pro konjugaci nebo neutralizaci jak je doloženo na následující struktuře: -CHR-O-P(O)(OH)2, kde R je např. H nebo CH3.The term " monophosphate functionality " denotes that the polymer chain is covalently bound to phosphoric acid via a single phosphate bond leaving the remaining two hydroxyl groups available for conjugation or neutralization as exemplified by the following structure: -CHR-OP (O) (OH) 2 wherein R is e.g. H or CH 3.

Termín „peptid“ označuje peptidy, polypeptidy a proteiny. Příklady peptidů zahrnují (ovšem nejsou omezeny pouze na vyjmenované příklady) peptid uvolňující růstový hormon (GHRP), LHRH, somatostatin, bombesin, peptid uvolňující gastrin (GRP), kalcitonin, bradykinin, galanin, hormon stimulující melanocyt (MSH), faktor uvolňující růstový hormon (GRF), amylin, tachykininy, sekretin, parathyroidní hormon (PTH), encefalon, endothelin, peptid uvolňující kalcitoninový gen (CRP), neuromediny, protein uvolňující parathyrtoidní hormon (PTHrP), glukagon, neurotensin, adrenokortikotropní hormon (ACTH), peptid YY (PYY), peptid uvolňující glukagon (GLP), vasoaktivní intestinální peptid (VIP), peptid aktivující adenylát cyklázu podvěsku mozkového (PACAP), motilin, látku P, neuropeptid Y (NPY), TSH, růstový hormon, erythropoietin, faktor stimulující kolonie granulocytů, faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů, interferony, LHRH analogy p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-ArgPro-Gly-NH₂ (Peptid A), somatostatinový analog Η-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH₂, kde dva Cys jsou vázány disulfídickou vazbou (Peptid B), N-hydroxyethylpiperazinyl5 ·· · · · * · · «······ ·» · ··· · · ··· acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, kde dva Cys jsou vázány disulfídickou vazbou a N-hydroxyethylpiperazinylethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou vázány disulfídickou vazbou (Peptid C) a jejich analogy a fragmenty nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli.The term "peptide" refers to peptides, polypeptides and proteins. Examples of peptides include (but are not limited to) growth hormone releasing peptide (GHRP), LHRH, somatostatin, bombesin, gastrin releasing peptide (GRP), calcitonin, bradykinin, galanin, melanocyte stimulating hormone (MSH), growth hormone releasing factor (GRF), amylin, tachykinins, secretin, parathyroid hormone (PTH), encephalone, endothelin, calcitonin gene releasing peptide (CRP), neuromedins, parathyrtoid hormone releasing protein (PTHrP), glucagon, neurotensin, adrenocorticotropic hormone (ACTH) (PYY), glucagon-releasing peptide (GLP), vasoactive intestinal peptide (VIP), adenylate pituitary cyclase activating peptide (PACAP), motilin, substance P, neuropeptide Y (NPY), TSH, growth hormone, erythropoietin, granulocyte colony stimulating factor granulocyte and macrophage colony stimulating factor, interferons, LHRH analogues of p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-ArgPro-Gly-NH ₂ (Peptide A), somatostatin analog Η-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH ₂ wherein two Cys are disulfide bonded (Peptide B), N-hydroxyethylpiperazinyl5 Acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH ₂ , wherein the two Cys are bonded by a disulfide bond and N-hydroxyethylpiperazinylethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH 2 wherein the two Cys are disulfide bonded (Peptide C) and analogs and fragments thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof.

Termín „bioaktivní činidlo“ označuje chemickou sloučeninu, včetně peptidů, která může být podávána pacientům pro terapeutické nebo profylaktické potřeby a zahrnuje tedy farmaceutické látky.The term "bioactive agent" refers to a chemical compound, including peptides, that can be administered to patients for therapeutic or prophylactic needs and thus includes pharmaceutical agents.

Termín „interaktivní aminoskupina“ označuje aminoskupinu, která je schopna chemicky reagovat s další chemickou funkční skupinou jako je hydroxyskupina monofosfátové funkční skupiny.The term "interactive amino" refers to an amino group that is capable of chemically reacting with another chemical functional group, such as a hydroxy group of a monophosphate functional group.

Termín „spojení“ označuje chemické vazby mezi jmenovanými entitami, které mohou být ionické a/nebo kovalentní povahy.The term "linkage" refers to chemical bonds between said entities, which may be ionic and / or covalent in nature.

Termín „terminální monofosfátové funkční skupiny v řetězci absorbovatelného polyesteru“ označuje, že každý konec polyesterového řetězce může mít monofosfátovou funkční skupinu.The term "terminal monophosphate functional groups in the absorbable polyester chain" denotes that each end of the polyester chain may have a monophosphate functional group.

Členové rodiny monofosfátů polyesterů, které jsou mísitelné s kyanoakrylátovými estery, mohou být použity jako kyselé excipienty v absorbovatelných tkáňových poj i věch zahrnujících alkoxyalkylkyanoakryláty. Kyselé skupiny těchto polyesterů mohou stabilizovat kyanoakryláty v přítomnosti stopového množství kontaminantů životního prostředí, které jsou bazické povahy.Members of the polyester monophosphate family that are miscible with cyanoacrylate esters can be used as acidic excipients in absorbable tissue terms including alkoxyalkylcyanoacrylates. The acid groups of these polyesters can stabilize cyanoacrylates in the presence of trace amounts of basic environmental contaminants.

Termín „nízkotající polyester“ označuje polyester mající teplotu tání v rozmezí od 25 °C do 120 °C.The term "low melting polyester" refers to a polyester having a melting point in the range of 25 ° C to 120 ° C.

Termín „krystalinita“ označuje frakci tuhé látky, která vykazuje troj dimenzionální uspořádání, udržované až do zahřátí materiálu nad teplotu tání, kdy materiál přechází na kapalinu.The term "crystallinity" refers to a solid fraction that exhibits a three-dimensional arrangement maintained until the material is heated above the melting point when the material is transferred to a liquid.

Detailní popisDetailed description

Tento vynález se zabývá monofosfátovými analogy několika typů hydroxylových oligomerů a polymerů, které mohou být při laboratorní teplotě kapaliny, amorfní tuhé látky nebo krystalické materiály. Volné -P(O)(OH)2 funkční skupiny fosforylovaných derivátů oligomerních a polymerních systémů jsou schopné konjugování, iontově nebo kovalentně, s bazickými aminovými skupinami bioaktivních činidel včetně peptidů a proteinů. Fosforylace může být prováděna na roztaveném polyesteru nebo tuhých mikročásticích polyesteru a předem • « 0 0 · · · ·» « · 0 0 0 · · 0 0 · ·The present invention relates to monophosphate analogs of several types of hydroxyl oligomers and polymers, which may be liquid at room temperature, amorphous solids or crystalline materials. The free -P (O) (OH) 2 functional groups of phosphorylated derivatives of oligomeric and polymeric systems are capable of conjugating, ionically or covalently, to the basic amine groups of bioactive agents including peptides and proteins. Phosphorylation can be carried out on molten polyester or polyester solid microparticles and in advance.

00« 000 0000000 00 0000 0· ·00 modifikovaném nebo in šitu modifikovaném polysacharidu, jako je třeba částečně acylovaný cyklodextrin. Fosforylované substráty podle tohoto vynálezu se používají pro výrobu nových iontových konjugátů s aminokyselinami, polypeptidy a proteiny nebo organickou sloučeninou, která má alespoň jednu dostupnou interaktivní aminoskupinu.00 · 000 0000000 00 0000 0 · · 00 a modified or in situ modified polysaccharide such as partially acylated cyclodextrin. The phosphorylated substrates of this invention are used to produce novel ionic conjugates with amino acids, polypeptides and proteins, or an organic compound having at least one available interactive amino group.

Hydroxylové oligomery a polymery, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují polyestery s terminálními hydroxyskupinami (HTPE) a acylované nebo alkylované cyklodextriny. Polyestery (HTPE) mohou být připraveny polymerizací otevřením kruhu laktonů (jako je glykolid, laktid, ε-kaprolakton, p-dioxanon) a/nebo cyklického karbonátu (jako je trimethylenkarbonát) v přítomnosti anorganického nebo organometalického katalyzátoru (jako je oktanoát cínatý) a iniciátoru nesoucím hydroxylové skupiny (jako je 1,6-hexandiol, 1,3propandiol a diethylenglykol) za podmínek, které jsou běžně používány v oboru pro podobné polymerizace (viz. Shalaby S. W. et al., „Absorbovatelné polyestery“ v Biomedical Polymers Designed to Degrade, kapitola 1, Shalaby S. W. Ed. Hansen Publ., NY 1994). Vzniklé polyestery, kopolyestery nebo kopolyestery-karbonáty mohou být ve formě kapalin, amorfní nebo vysoce krystalické materiály, mající nejméně jednu hydroxylovou skupinu v polymerním řetězci. Vysoce krystalické tuhé polyestery podle tohoto vynálezu mohou být redukovány pokud jde o jejich velikost za vzniku mikročástic majících v průměru 0,1 až 100 mikronů. Další hydroxylové oligomery a polymery zahrnují deriváty oligosacharidů, jako jsou alkylované cyklodextriny, mající alespoň jednu hydroxylovou skupinu v molekule. Tyto deriváty mohou být přímo fosforylovány nebo roubovány s polyesterem, kopolyesterem, nebo kopolyester-karbonátovým řetězcem, jako jsou např. ty, které byly popsány výše u polyesterů s terminálními hydroxyskupinami.The hydroxyl oligomers and polymers of the present invention include terminal hydroxyl group (HTPE) polyesters and acylated or alkylated cyclodextrins. Polyesters (HTPE) can be prepared by ring-opening polymerization of lactones (such as glycolide, lactide, ε-caprolactone, p-dioxanone) and / or cyclic carbonate (such as trimethylene carbonate) in the presence of an inorganic or organometallic catalyst (such as stannous octanoate) and initiator bearing hydroxyl groups (such as 1,6-hexanediol, 1,3-propanediol and diethylene glycol) under conditions commonly used in the art for similar polymerizations (see Shalaby SW et al., "Absorbable Polesters" in Biomedical Polymers Designed to Degrade, Chapter 1, Shalaby SW Ed. Hansen Publ., NY 1994). The resulting polyesters, copolyesters or copolyesters carbonates may be in the form of liquids, amorphous or highly crystalline materials having at least one hydroxyl group in the polymer chain. The highly crystalline solid polyesters of the present invention can be reduced in size to produce microparticles having an average of 0.1 to 100 microns. Other hydroxyl oligomers and polymers include oligosaccharide derivatives such as alkylated cyclodextrins having at least one hydroxyl group per molecule. These derivatives can be directly phosphorylated or grafted with a polyester, copolyester, or copolyester carbonate chain, such as those described above for polyesters with terminal hydroxy groups.

Konverze oligomerů a polymerů nesoucích hydroxyskupiny podle tohoto vynálezu se dosahuje fosforylací hydroxylových skupin s využitím reaktivních derivátů kyseliny fosforečné, jako třeba pyrofosforečné kyseliny. Používá se stechiometrické množství nebo přebytek fosforylačního činidla. Reakce se provádí s pomocí nebo bez pomoci nereaktivního rozpouštědla při teplotách pohybujících se od 10 °C do 150 °C po dobu několika minut až několika hodin, v závislosti na chemické struktuře reagujícího substrátu. Po ukončení reakce se produkt frakcionizuje aby byl odstraněn přebytek činidla a vedlejší produkty. Při použití pyrofosforečné kyseliny se vzniklá směs rozpustí v rozpouštědle mísitelném s vodou jako je třeba aceton. Vzniklý acetonový roztok se poté za míchání přidá do ledové vody. Poté se tuhý fosforylpvaný produkt izoluje centrifugací nebo filtrací. Po dostatečném promytí vodou se produkt suší za • « · φ φ φφφ * φ · φ · » · * • φφφ · · φ · • φ φ · · φφφφ φ φ φ φφφ «Φφ φφφφφφφ φφ φφφφ φφ φφφ sníženého tlaku. Jsou-li použity krystalické mikročásticové hydroxylové substráty mohou být reakční podmínky adjustovány tak, aby bylo zajištěno, že mikročástice po proběhnutí fosforylace udrží svoje originální rozměry. Reakce mikročástic může být vedena s využitím nebo bez využití kapalného nereaktivního organického média. Pyrofosforečná kyselina je typickým příkladem reaktivních kyselinových derivátů, které mohou být použity pro vnesení skupiny -O-P(O)(OH)₂do substrátu nesoucího hydroxyskupiny. Příklady dalších fosforylujících činidel, které mohou být použity podle tohoto vynálezu, zahrnují methylmonofosfát, ethylmonofosfát a fenylmonofosfát.The conversion of the hydroxyl-bearing oligomers and polymers of the invention is achieved by phosphorylating hydroxyl groups using reactive phosphoric acid derivatives such as pyrophosphoric acid. A stoichiometric amount or excess phosphorylating agent is used. The reaction is carried out with or without the aid of a non-reactive solvent at temperatures ranging from 10 ° C to 150 ° C for several minutes to several hours, depending on the chemical structure of the reacting substrate. After completion of the reaction, the product is fractionated to remove excess reagent and by-products. When pyrophosphoric acid is used, the resulting mixture is dissolved in a water-miscible solvent such as acetone. The resulting acetone solution was then added to ice water with stirring. Then, the solid phosphorylated product is isolated by centrifugation or filtration. After sufficient washing with water, the product is dried under reduced pressure. When crystalline microparticle hydroxyl substrates are used, the reaction conditions can be adjusted to ensure that the microparticles retain their original dimensions after phosphorylation. The microparticle reaction may be conducted with or without the use of a liquid non-reactive organic medium. Pyrophosphoric acid is a typical example of reactive acid derivatives that can be used to introduce the -OP (O) (OH) _{2 group} into a substrate bearing hydroxy groups. Examples of other phosphorylating agents that may be used according to the invention include methyl monophosphate, ethyl monophosphate and phenyl monophosphate.

Kvůli přípravě konjugátů různých polymemích mono fosfátů rozpouští se nebo suspendují jednotlivé polymerní mono fosfáty ve vhodném médiu „A“ jako je voda nebo směs vody a acetonitrilu a nechá se interagovat s bazickým bioaktivním činidlem přítomném v roztoku mísitelném s médiem „A“. V závislosti na chemii bioaktivního činidla může být požadována přítomnost anorganického bazického činidla kvůli tomu, aby bioaktivní činidlo bylo přítomno ve volné bazické formě. V případě soli peptidu, jako třeba peptid acetát, může být použita anorganická báze jako je hydrogenuhličitan sodný, k odstranění acetátového iontu z peptidu což dovoluje konjugaci volné báze, iontově nebo kovalentně, s monofosfátovou skupinou oligomemího nebo polymerního substrátu.To prepare conjugates of different polymeric mono-phosphates, the individual polymeric mono-phosphates dissolve or suspend in a suitable medium "A" such as water or a mixture of water and acetonitrile and interact with a basic bioactive agent present in a solution miscible with medium "A". Depending on the chemistry of the bioactive agent, the presence of an inorganic basic agent may be required for the bioactive agent to be present in the free base form. In the case of a peptide salt, such as a peptide acetate, an inorganic base such as sodium bicarbonate may be used to remove the acetate ion from the peptide allowing conjugation of the free base, ionically or covalently, with the monophosphate group of the oligomeric or polymeric substrate.

Mikročástice podle tohoto vynálezu se připravují mikronizací polymeru nejdříve mletím, a poté mikronizací v Aljetovo mikronizeru s využitím tlakového proudu suchého dusíku. Střední velikost částic je analyzována pomocí Malvem Masterizer/E s využitím distribučního modelu a 200/5 cS silikonového oleje jako disperguj ícího činidla.The microparticles of the present invention are prepared by micronizing the polymer first by grinding, and then micronizing in an Aljet micronizer using a dry nitrogen pressure stream. The mean particle size is analyzed by Malvem Masterizer / E using a distribution model and 200/5 cS of silicone oil as dispersant.

Mikročástice konjugátů podle tohoto vynálezu mohou být podávány pacientům cestami známými z oboru, jako je parenterální podávání, orální podávání nebo topické podávání. Přednostně se podávají ve formě prášku nebo suspenze intranasálně nebo jako inhalant prostřednictvím pulmonámího systému. Jsou-li podávány parenterálně, preferuje se podávání ve formě disperzí v isotonickém médiu nebo v nevodných, absorbovatelných kapalných polyesterech tvořících gel podle popisu vU. S. Patent 5,612,052, který je zde zahrnut jako reference. Přípravky obsahující mikročástice konjugátů podle tohoto vynálezu mohou také zahrnovat množství dalších komponent. Tyto komponenty zahrnují (výčet není úplný) surfaktanty, činidla pro kontrolu viskozity, léčiva, modulátory růstu buněk, barviva, komplexační činidla, antioxidanty, další polymery jako třeba karboxymethylcelulosa, gumy jako třeba guarová guma, vosky/oleje jako jsou ricínový olej, glycerín, dibutylftalát a di(2-ethylhexyl)ftalát a pod.The microparticles of the conjugates of the invention can be administered to patients by routes known in the art, such as parenteral administration, oral administration, or topical administration. They are preferably administered as a powder or suspension intranasally or as an inhalant via a pulmonary system. When administered parenterally, administration in the form of dispersions in an isotonic medium or in non-aqueous, absorbable, gel-forming liquid polyesters as described in UU is preferred. S. Patent 5,612,052, which is incorporated herein by reference. Compositions comprising microparticles of the conjugates of the invention may also include a number of other components. These components include, but are not limited to, surfactants, viscosity control agents, drugs, cell growth modulators, dyes, complexing agents, antioxidants, other polymers such as carboxymethylcellulose, gums such as guar gum, waxes / oils such as castor oil, glycerin, dibutyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate and the like.

• »· ·· ·· «· · «·< · · · · · * · · · • · · · 9 111 • 9 9 9 9 111• · 111 111 111 111 111 111 9 111 9 9 9 111

199 1119 11 1111 ·· ··»199 1119 11 1111 ·· ·· »

Jsou-li použity, tvoří takovéto složky od 0,1% do asi 20%, s výhodou od 0,5 do asi 5% celkového přípravku.When used, such components comprise from about 0.1% to about 20%, preferably from about 0.5% to about 5%, of the total formulation.

Účinná množství mikročástic konjugátu podle tohoto vynálezu, která se podávají pacientům, mohou být určena lékařem nebo veterinářem a budou záviset na patřičném dávkování zamýšleném pro peptid a/nebo bioaktivní činidlo konjugované v mikročásticích. Toto dávkování bude buď známé nebo může být určeno odborníkem v oboru.Effective amounts of the microparticles of the conjugate of the invention to be administered to patients may be determined by a physician or veterinarian and will depend upon the appropriate dosage contemplated for the peptide and / or bioactive agent conjugated in the microparticles. Such dosages will either be known or can be determined by one skilled in the art.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Následující příklady jsou zařazeny pro účely ilustrování a nejsou míněny jako limitující pro tento vynález.The following examples are included for purposes of illustration and are not intended to limit the invention.

Příklad 1Example 1

Příprava polyesteru s terminálními hydroxylyPreparation of polyester with terminal hydroxyls

CEG-1 byl vyroben z kaprolaktamu (137,3 g, 1,204 mol) a diethylglykolu (12,7 g, 0,12 mol) s využitím oktanoátu cínatého (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) jako katalyzátoru při poměru monomer/katalyzátor 5000:1 (1,3 ml 0,2 M toluenového roztoku). Baňka byla opatřena míchadlem a po vložení výchozích látek byla zahřívána 12 h při 150 °C pod suchým argonem. Polymer byl izolován a čištěn srážením acetonového roztoku reakční směsi v ledové vodě. Vzniklý polymer byl izolován, sušen, a poté analyzován na identitu látky, molekulární hmotnost a termální vlastnosti pomocí IR, NMR, GPC a DSC. Nezreagovaný monomer byl oddestilován za sníženého tlaku při 120 °C.CEG-1 was made from caprolactam (137.3 g, 1.204 mol) and diethyl glycol (12.7 g, 0.12 mol) using stannous octanoate (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) as a catalyst at a monomer ratio / Catalyst 5000: 1 (1.3 mL of 0.2 M toluene solution). The flask was equipped with a stirrer and after loading the starting materials was heated for 12 h at 150 ° C under dry argon. The polymer was isolated and purified by precipitation of an acetone solution of the reaction mixture in ice water. The resulting polymer was isolated, dried, and then analyzed for substance identity, molecular weight, and thermal properties by IR, NMR, GPC, and DSC. The unreacted monomer was distilled off under reduced pressure at 120 ° C.

Podle příkladu 1 byla náhradou 1,3-propandiolu za diethylenglykol při různých poměrech monomer/iniciátor, připravena řada polymerů s terminálními polymery, mající různé molekulární hmotnosti. Tyto polymery zahrnují CPD-1 a CPD-2, které jsou založeny na ε-kaprolaktonu a 1,3propandiolu.According to Example 1, by substituting 1,3-propanediol for diethylene glycol at various monomer / initiator ratios, a series of terminal polymer polymers having different molecular weights was prepared. These polymers include CPD-1 and CPD-2, which are based on ε-caprolactone and 1,3-propanediol.

S využitím směsi 70/30 1-laktid/glykolid, 85/15 dl-laktid/glykolid, 70/30 1-laktid/glykolid nebo 80/20 1-laktid/dl-laktid byly podle příkladu 1 získány odpovídající polymery označované jako PDLG-1, PDLG-2, PD-100 a PD-101, a to za podobných podmínek a různého množství 1,3propandiolu k dosažení požadované molekulární hmotnosti (Mn) pohybující se od 1 do 20 kDa.Using the 70/30 1-lactide / glycolide, 85/15 dl-lactide / glycolide, 70/30 1-lactide / glycolide or 80/20 1-lactide / dl-lactide mixture, the corresponding polymers referred to as PDLG were obtained according to Example 1. -1, PDLG-2, PD-100 and PD-101 under similar conditions and varying amounts of 1,3-propanediol to achieve the desired molecular weight (Mn) ranging from 1 to 20 kDa.

Příklad 2Example 2

0 0 0 0 0 0 · «0 0 00 04 · · · · · 0 · «0»0 0 0 0 0 0 · «0 0 00 04 · · · · · · · ·

Příprava fosforylovaných polyesterůPreparation of phosphorylated polyesters

CEG-l-Phos-5 byl připraven zCEG-1 (z Příkladu 1) a pyrofosforečné kyseliny bez použití rozpouštědla s využitím molárního poměru 4:1 pyrofosforečné kyseliny (1,3 g) ke CEG1 (5,0 g). Reakční směs byla nechána reagovat 80 min při laboratorní teplotě. Polymer byl rozpuštěn ve 30 ml acetonu a srážen ve studené vodě. Polymer byl izolován a sušen za sníženého tlaku a poté byl analyzován podle popisu v Příkladu 1. Kromě toho byl analyzován obsah fosforu pomocí elementární analýzy. Ekvivalentní hmotnost fosforylovaného produktu byla určena acidimetrií.CEG-1-Phos-5 was prepared from ECG-1 (from Example 1) and pyrophosphoric acid without solvent using a 4: 1 molar ratio of pyrophosphoric acid (1.3 g) to CEG1 (5.0 g). The reaction mixture was allowed to react for 80 min at room temperature. The polymer was dissolved in 30 ml of acetone and precipitated in cold water. The polymer was isolated and dried under reduced pressure and then analyzed as described in Example 1. In addition, the phosphorus content was analyzed by elemental analysis. The equivalent weight of the phosphorylated product was determined by acidimetry.

Za základě uvedeného postupu přípravy CEG-l-Phos-5 byly vyrobeny dvě další násady fosforylovaných CEG-1, jmenovitě CEG-l-Phos-6 a CEG-l-Phos-7. Podobně byl fosforylován CPD-2 za vzniku CPD-2-Phos-l a kopolymery PLDG-1, PLDG-2, PD-100 a PD-101 za vzniku PLDG-l-Phos-1, PDLG-l-Phos-1, PD-100-Phos-l a PD-101-Phos-l podle postupu na přípravu CEG-l-Phos-5.Two additional batches of phosphorylated CEG-1, namely CEG-1-Phos-6 and CEG-1-Phos-7, were produced following the above procedure for preparing CEG-1-Phos-5. Similarly, CPD-2 was phosphorylated to form CPD-2-Phos-1 and copolymers PLDG-1, PLDG-2, PD-100 and PD-101 to form PLDG-1-Phos-1, PDLG-1-Phos-1, PD-100-Phos-1 and PD-101-Phos-1 according to the procedure for preparing CEG-1-Phos-5.

Příklad 3Example 3

Příprava konjugátu fosforylovaného polyesteru/polypeptiduPreparation of phosphorylated polyester / polypeptide conjugate

CON-P3 byl připraven z Peptidů A a CEG-l-Phos-5 A (další násada CEG-l-Phos-5). CEG-l-Phos-5 A (0,9974 g) byl rozpuštěn v 10 ml acetonitrilu. Tento roztok byl zfiltrován přes filtr za účelem odstranění stop nerozpustných částic polymeru. Peptid A (199 mg) byl rozpuštěn ve 2 ml vody. V závislosti na obsahu acetátu v Peptidů A bylo do roztoku polymeru v acetonitrilu přidáno 25 mg uhličitanu sodného, aby došlo k výměně v peptidů. Roztok A byl poté přidán po kapkách k roztoku polymeru. Po přidání celého roztoku peptidů během 10 minut byl vzniklý roztok nechán míchat 0,5 h. Roztok byl poté vysrážen nalitím do studeného roztoku soli a produkt byl shromážděn pomocí centrifugace. Sraženina byla promyta destilovanou vodou a znovu centrifugována. Produkt byl poté sušen pod vakuem. Vzniklý konjugát byl analyzován na obsah peptidů s využitím elementární analýzy dusíku.CON-P3 was prepared from Peptides A and CEG-1-Phos-5 A (another batch of CEG-1-Phos-5). CEG-1-Phos-5 A (0.9974 g) was dissolved in 10 mL of acetonitrile. This solution was filtered through a filter to remove traces of insoluble polymer particles. Peptide A (199 mg) was dissolved in 2 mL of water. Depending on the acetate content of Peptide A, 25 mg of sodium carbonate was added to the polymer solution in acetonitrile to exchange the peptides. Solution A was then added dropwise to the polymer solution. After the whole peptide solution was added over 10 minutes, the resulting solution was allowed to stir for 0.5 h. The solution was then precipitated by pouring into cold salt solution and the product collected by centrifugation. The precipitate was washed with distilled water and centrifuged again. The product was then dried under vacuum. The resulting conjugate was analyzed for peptide content using elemental nitrogen analysis.

Pomocí podobného postupu jako v Příkladu 3 byly připraveny konjugáty popsané v Tabulce I, a to z peptidů a fosforylovaných polyesterů naznačených v tabulce a s využitím indikovaných poměrů a srážecích médií (PM, voda nebo isopropylalkohol).Using the procedure similar to Example 3, the conjugates described in Table I were prepared from the peptides and phosphorylated polyesters outlined in the table and using the indicated ratios and precipitation media (PM, water or isopropyl alcohol).

Příklad 4Example 4

Příprava krystalických hydroxyterminálních polyglykolidových mikročástic • »» ····· * · « ^ř · «·< ♦ « * * * * ··· • ··♦ · · · · * ♦ · · ♦ · « · · ·Preparation of crystalline hydroxyterminal polyglycolide microparticles ♦ ^ř * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ««

9 9 9 9-9··9 9 9 9-9 ··

9999999 99 9 9 9 9 9 9 9 9 99999999 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9

PDGLY-1 byl připraven jako tuhý krystalický materiál s využitím asi 25:1 molárního poměru glykolidu k 1,3-propandiolu. Glykolid (200 g, 1,724 mol) byl roztaven v baňce sušené v plameni kahanu pod argonem a byl přidán 1,3-propandiol (5,249 g, 69,1 mmol). Pak byl do baňky obsahující taveninu dán oktanoát cínatý (0,575 ml 0,2 M toluenového roztoku) a teplota byla zvýšena na 160 °C. Po přibližně 30 minutách byla teplota snížena na 110 °C. Nezreagovaný monomer byl odstraněn destilací při 120 °C za sníženého tlaku. Produkt byl poté rozemlet a mikronizován podle výše uvedeného postupu.PDGLY-1 was prepared as a solid crystalline material using about 25: 1 molar ratio of glycolide to 1,3-propanediol. The glycolide (200 g, 1.724 mol) was melted in a flame dried flask under argon and 1,3-propanediol (5.249 g, 69.1 mmol) was added. Stannous octanoate (0.575 mL of 0.2 M toluene solution) was then added to the melt-containing flask and the temperature was raised to 160 ° C. After approximately 30 minutes, the temperature was lowered to 110 ° C. Unreacted monomer was removed by distillation at 120 ° C under reduced pressure. The product was then milled and micronized as described above.

Podobným postupem jako v Příkladu 4 byl připraven PD-102 z 15/1 směsi glykolidu a 2,3-propandiolu.In a similar manner to Example 4, PD-102 was prepared from a 15/1 mixture of glycolide and 2,3-propanediol.

Příklad 5Example 5

Příprava povrchově fosforylovaných polyglykolidových mikročásticPreparation of surface phosphorylated polyglycolide microparticles

PDGLY-1 -Phos-2 byl vyroben tavením 9,7 g pyrofosforečné kyseliny při asi 60 °C a přidáním 4,4 g PDGLY-1 za míchání pod atmosférou argonu. Reakce byla prováděna 3 hod při stejné teplotě. Produkt byl ochlazen na asi 10 °C a poté smíchán s 20 ml studené vody. Směs byla sonifíkována po dobu 5 min, promyta třikrát s vodou a poté sušena za sníženého tlaku. Produkt byl analyzován na obsah fosforu a bylo měřeno T_m s využitím elementární analýzy a DSC.PDGLY-1 -Phos-2 was produced by melting 9.7 g of pyrophosphoric acid at about 60 ° C and adding 4.4 g of PDGLY-1 while stirring under an argon atmosphere. The reaction was carried out for 3 hours at the same temperature. The product was cooled to about 10 ° C and then mixed with 20 mL cold water. The mixture was sonicated for 5 min, washed three times with water and then dried under reduced pressure. The product was analyzed for phosphorus content and T _m was measured using elemental analysis and DSC.

Podobně byl PD-102 převeden na PD 102-Phos-l podle postupu na přípravu PDGLY-1Phos-2.Similarly, PD-102 was converted to PD 102-Phos-1 according to the procedure for preparing PDGLY-1Phos-2.

Příklad 6Example 6

Příprava typického polypetidového konjugátu s využitím fosforylovsaných polyglykolidových mikročásticPreparation of a typical polypeptide conjugate using phosphorylated polyglycolide microparticles

PICP3 byl připraven z PDGLY-1-Phos-2 a Peptidu B (50 mg) rozpuštěného ve 2 ml 50:50 směsi acetonitril:voda. 20 μΐ alikvotní podíl peptidového roztoku byl vzat jako kontrolní vzorek. PDGLY1-Phos2 (502 mg) byl přidán do viálky obsahující zbytek peptidového roztoku a sonifikován 5 minut a poté byl míchán 2 h. Produkt byl izolován centrifugací a poté sušen za sníženého tlaku. Kapalina byla analyzována pomocí HPLC kvůli množství peptidu vázaného k prášku. HPLC ukázalo, že 6,7% hmotnosti peptidu bylo navázáno. Obsah peptidu byl pomocí elementární analýzy dusíku určen jako 7,2%.PICP3 was prepared from PDGLY-1-Phos-2 and Peptide B (50 mg) dissolved in 2 mL 50:50 acetonitrile: water. A 20 μΐ aliquot of the peptide solution was taken as a control. PDGLY1-Phos2 (502 mg) was added to a vial containing the remainder of the peptide solution and sonicated for 5 minutes and then stirred for 2 hours. The product was isolated by centrifugation and then dried under reduced pressure. The liquid was analyzed by HPLC for the amount of peptide bound to the powder. HPLC showed that 6.7% by weight of the peptide was bound. The peptide content was determined to be 7.2% by elemental nitrogen analysis.

Podobným způsobem jako v Příkladu 6 byl PD102-Phosl konjugován s Peptidem B za vzniku PICP-4.In a similar manner to Example 6, PD102-Phos1 was conjugated to Peptide B to form PICP-4.

Příklad 7Example 7

Příprava Endo-karboxylovaného 85/15 Poly(dl-laktid-ko-glykolidu) (TR-100)Preparation of Endo-Carboxylated 85/15 Poly (dl-lactide-co-glycolide) (TR-100)

85/15 (molární) směs dl-laktonu a glykolidu byla polymerizována podobně jako v Příkladu 1 ovšem s využitím L-vinné kyseliny jako iniciátoru (při molárním poměru 50/1 lakton/kyselina vinná) a oktanoátu cínatého jako katalyzátoru (při poměru monomer/katalyzátor 5000/1)The 85/15 (molar) mixture of dl-lactone and glycolide was polymerized similar to Example 1 but using L-tartaric acid as initiator (at a 50/1 lactone / tartaric acid molar ratio) and stannous octanoate as catalyst (monomer / monomer ratio). catalyst 5000/1)

Příklad 8Example 8

Fosforylace TR-100 za vzniku TR101-Phos2:Phosphorylation of TR-100 to form TR101-Phos2:

Fosforylace byla provedena podle popisu v Příkladu 2 s využitím směsi TR-100 (15 g) a pyrofosforečné kyseliny (1,244 g).Phosphorylation was performed as described in Example 2 using a mixture of TR-100 (15 g) and pyrophosphoric acid (1.244 g).

Příklad 9'Example 9 '

Ionická konjugace TRI00-Phosl za vzniku CON-P9, CON-P12 a CON-P15Ionic conjugation of TR100-Phosl to form CON-P9, CON-P12 and CON-P15

Využitím podobné procedury jaká byla popsána v Příkladu 3, byl Peptid B (373 mg) reagován s 1,5 g TRI 00-Phosl za vzniku CON-P9. Podobně, CON-P12 byl připraven s využitím Peptidu A (400 mg) a TRI 00-Phosl (2,5 g). Pn přípravě CON-P15 byl použit studený 2propanol jako srážecí médium produkující konjugát založený na Peptidu B (400 mg) a TRI 00Phosl (2,5 g).Using a procedure similar to that described in Example 3, Peptide B (373 mg) was reacted with 1.5 g of TR10-PhosI to form CON-P9. Similarly, CON-P12 was prepared using Peptide A (400 mg) and TR10-Phos1 (2.5 g). For the preparation of CON-P15, cold 2-propanol was used as a precipitation medium producing a conjugate based on Peptide B (400 mg) and TR10PPhos1 (2.5 g).

Příklad 10Example 10

Příprava fosforylovaného derivátu γ-cyklodextrinuPreparation of phosphorylated γ-cyclodextrin derivative

Alikvot γ-cyklodextrinu (20,0 g) byl smíchán v předsušené bance se 46,23 g anhydridu kyseliny propionové a 16,46 g pyrofosforečné kyseliny v prostředí suchého dusíku. Reaktanty byly zahřívány na 45 °C za míchání po dobu 0,5 h. Směs byla ochlazena a poté vysrážena nalitím do studené destilované vody. Produkt byl izolován a poté sušen za sníženého tlaku. Analýza odhalila, že materiál má obsah fosforu 0,43% hmotnosti a molekulovou hmotnost 1251.An aliquot of γ-cyclodextrin (20.0 g) was mixed in a pre-dried flask with 46.23 g of propionic anhydride and 16.46 g of pyrophosphoric acid in a dry nitrogen atmosphere. The reactants were heated to 45 ° C with stirring for 0.5 h. The mixture was cooled and then precipitated by pouring into cold distilled water. The product was isolated and then dried under reduced pressure. Analysis revealed that the material had a phosphorus content of 0.43% by weight and a molecular weight of 1251.

Příklad 11Example 11

Příprava typického polypeptidového konjugátu fosforylovaného γ-cyklodextrinového derivátu • ·· · · 4 4 4 9Preparation of a typical polypeptide conjugate of a phosphorylated γ-cyclodextrin derivative • ·· · · 4 4 4 9

4 9 4 ♦ · · » » 4 94 9 4 ♦ · · »»

9 4 9 9 4 4 99 4 9 9 4

949 9944 49 9449 44 449949 9944 49 9449 44 449

Typický derivát jako GCD-Phos3 (1,7 g) byl konjugován s peptidem (např. Peptid B, 300 mg) pode popisu přípravy konjugátu z Příkladu 3 za vzniku CONG-PIOO.A typical derivative such as GCD-Phos3 (1.7 g) was conjugated to a peptide (e.g., Peptide B, 300 mg) as described for the preparation of the conjugate of Example 3 to give CONG-PIOO.

Příklad 12Example 12

Příprava přípravku na lepení tkáníPreparation of tissue preparation

Fosforylovaný polyester z Příkladu 2 (0,5 g) byl rozpuštěn v methoxypropylkyanoakrylátu (9,5 g) a vzniklý přípravek byl skladován při laboratorní teplotě ve skleněné vialce (nepromyté kyselinou) po dobu několika dnů a nevykazoval žádné známky polymerizace (jak bylo indikováno pomocí nesledovatelné změny viskozity). Aplikování tohoto prostředku na lepení tkání na vlhkou kozí kůži vedla během jedné minuty ke vzniku poddajného (flexibilního) filmu na kůži.The phosphorylated polyester of Example 2 (0.5 g) was dissolved in methoxypropylcyanoacrylate (9.5 g) and the resulting formulation was stored at room temperature in a glass vial (not washed with acid) for several days and showed no signs of polymerization (as indicated by unobservable viscosity changes). Application of this tissue-bonding agent to wet goat skin resulted in a flexible film on the skin within one minute.

Tabulka 1: Experimentální data pro přípravu typických konjugátůTable 1: Experimental data for the preparation of typical conjugates

Konjugát Conjugate Fosforylovaný polypeptid Phosphorylated polypeptide Peptid Peptide Fosforylovaný polyester/peptid Phosphorylated polyester / peptide PM* PM * CON-P1 CON-P1 CEG1-Phos5 CEG1-Phos5 B (B) 1,5g/373mg 1,5g / 373mg h₂oh ₂ o CON-P7 CON-P7 CEG1-Pbos6 CEG1-Pbos6 B (B) 2,0g/300mg 2,0g / 300mg h₂oh ₂ o CON-P10 CON-P10 CEG1-Phos7 CEG1-Phos7 A AND 3,0g/758mg 3,0g / 758mg h₂oh ₂ o CON-P11 CON-P11 CEG1-Phos7 CEG1-Phos7 A AND 1_ř5g/190mg1 _ø 5g / 190mg IPA IPA CON-P13 CON-P13 CPD2-Phos1 CPD2-Phos1 A AND 3,0g/700mg 3,0g / 700mg H₂OH ₂ O CON-P14 CON-P14 CPD2-Phos1 CPD2-Phos1 A AND 3,0g/500mg 3,0g / 500mg IPA IPA CON-P4 CON-P4 PDLG2-Phos1B PDLG2-Phos1B B (B) 1,5g/373mg 1,5g / 373mg H₂OH ₂ O CON-P5 CON-P5 PDLG2-Phos1B PDLG2-Phos1B C C 2,0g/333mg 2,0g / 333mg h₂oh ₂ o CON-P6 CON-P6 PDLG2-Phos1B PDLG2-Phos1B A AND 1,5g/300mg 1,5g / 300mg h₂oh ₂ o CON-P15 CON-P15 TR100-Phos1 TR100-Phos1 A AND 2,5g/400mg 2,5g / 400mg IPA IPA CON-P8 CON-P8 PD100-Phos1 PD100-Phos1 B (B) 1,5g/373mg 1,5g / 373mg H₂OH ₂ O CON-P16 CON-P16 PD101-Phos1 PD101-Phos1 B (B) 1,5g/373mg 1,5g / 373mg h₂oh ₂ o PIC-P3 PIC-P3 PDGLY1-Phos2 PDGLY1-Phos2 B (B) 0,5g/50mg 0,5g / 50mg N/A ON PIC-P4 PIC-P4 PD102-Phos1 PD102-Phos1 B (B) 0,5g/50mg 0,5g / 50mg N/A ON CONG-P100 CONG-P100 GCD-Phos3 GCD-Phos 3 B (B) 1,7g/300mg 1,7g / 300mg H₂OH ₂ O

*PM= srážecí médium* PM = clotting medium

Tabulka II. Složeni a vlastnosti konjugátů a jejich prekurzorůTable II. Composition and properties of conjugates and their precursors

Analytická data Analytical data Polyester Číslo Polyester Number Výtěžek % Yield % GPC Mn Mw GPC Mn Mw DSC Tm DSC Tm Eq. Wt.* Eq. Wt. * Phos .% Phos .% Peptid %** Peptide % ** TR-100 TR-100 81,2 81.2 8582 8582 22,384 22,384 1333 1333 PD-100 PD-100 86,5 86.5 5205 5205 16,3x10³ 16,3x10 ³ — - — - -- - -- - PD-101 PD-101 88,3 88.3 13,3x10³ 13,3x10 ³ 18,6x10³ 18,6x10 ³ -- - — - — - — - PD-102 PD-102 99,1 99.1 — - — - — - — - — - — - CEG-1 CEG-1 96,0 96.0 2732 2732 3134 3134 47.5 47.5 7395 7395 CPD-1 CPD-1 91,9 91.9 2732 2732 3595 3595 N/A ON 22,440 22,440 CPD-2 CPD-2 96,6 96.6 5788 5788 8527 8527 58,3 58.3 39,324 39,324 PDLG-2 PDLG-2 93,8 93.8 10x10³ 10x10 ³ 17x1O³ 17x1O ³ — - — - -- - — - PDLG4-1 PDLG4-1 95,0 95.0 9388 9388 13614 13614 PDGLY-1 PDGLY-1 77,7 77.7 — - — - — - — - — - — - Použitý fosforylovaný Číslo/prekursor Phosphorylated Number / Precursor used CPD2-Phos1/CPD-2 CPD2-Phos1 / CPD-2 19,2 19.2 5376 5376 24x10³ 24x10 ³ 53,6 53.6 745 745 0,85 0.85 — - TR100-Phos1/TR-100 TR100-Phos1 / TR-100 81,8 81.8 9067 9067 29,656 29,656 — - 988 988 0,68 0.68 PD100-Phos1/PD-100 PD100-Phos1 / PD-100 89,0 89.0 6108 6108 8776 8776 39,3 39.3 1344 1344 0,56 0.56 PDLG2- Phosl B/PDLG-2 PDLG2- Phosl B / PDLG-2 97_z297 _of 2 8833 8833 14 x10³ 14 x10 ³ 46,2 46.2 2624 2624 0,07 0.07 PD101-Phos1/PD-101 PD101-Phos1 / PD-101 70,0 70.0 8535 8535 16,188 16.188 -- - 1110 1110 0,83 0.83 PD102-Phos1/PD-102 PD102-Phos1 / PD-102 76,8 76.8 -- - — - — - — - 0,98 0.98 — - CEG1-Pbos5/CEG-1 CEG1-Pbos5 / CEG-1 60,3 60.3 2926 2926 3734 3734 53.5 53.5 1339 1339 1,11 1.11 CEG1-Phos6/CEG-1 CEG1-Phos6 / CEG-1 69,6 69.6 4217 4217 8825 8825 41,4 41.4 960 960 2,11 2.11 CEG1-Phos7/CEG-1 CEG1-Phos7 / CEG-1 52,0 52.0 4345 4345 8593 8593 — - 1020 1020 1,85 1.85 PDLG1-Phos1/PDLG- 1 PDLG1-Phos1 / PDLG- 1 78,1 78.1 8703 8703 12,767 12,767 2810 2810 0,19 0.19 PDGLY1- Phos2/PDGLY-1 PDGLY1- Phos 2 / PDGLY-1 88,6 88.6 0,60 0.60 GCD-Phos3/GCD GCD-Phos 3 / GCD 21,9 21.9 — - -- - 1251 1251 0,43 0.43

Tabulka II (pokračování)Table II (continued)

Analytická Data Analytical Data Polyester Číslo Polyester Number Výtěžek % Yield % GPC Mn Mw GPC Mn Mw DSC Tm DSC Tm Eq. Wt.* Eq. Wt. * Phos. % Phos. % Peptid <%)** Peptide <%) ** Použitý peptid čislo/prekurzor Number / precursor peptide used CON-P9/TR100- Phosl CON-P9 / TR100- Phosl 43,0 43.0 — - B (10,96) (B) (10,96) CON-P12/TR100- Phosl CON-P12 / TR100- Phosl 11,8 11.8 A (21,4) AND (21.4) CON-P8/PD100- Phosl CON-P8 / PD100- Phosl 73 73 54,4 54.4 B (11,25) (B) (11,25) CON-P4/PDLG2- PhoslB CON-P4 / PDLG2- PhoslB 63,2 63.2 53,8 53.8 B (4,9) (B) (4.9) CON-P5/PDLG2- PhoslB CON-P5 / PDLG2- PhoslB 73,5 73.5 48,0 48.0 C (4,7) C (4.7) CON-P6/PDLG2- PhoslB CON-P6 / PDLG2- PhoslB 78,6 78.6 54,9 54.9 A (4,8) AND (4.8) CON-P1/CEG1-Phos5 CON-P1 / CEG1-Phos 63,4 63.4 B (18,5) (B) (18.5) CON-P3/CEG1-Phos5 CON-P3 / CEG1-Phos 82,3 82.3 A (12,8) AND (12.8) CON-P7/CEG1-Phos6 CON-P7 / CEG1-Phos6 33 33 47,8 47.8 B (12,66) (B) (12,66) CON-P2/PDLG1- Phosl CON-P2 / PDLG1- Phosl 62,4 62.4 B (5,4) (B) (5.4) CON-P11/CEG1- Pbos7 CON-P11 / CEG1- Pbos7 70,7 70.7 A (9,94) AND (9.94) CON-P10/CEG1- Phos7 CON-P10 / CEG1- Phos7 6,8 6.8 A (5,69) AND (5,69) CON-P15/TR100- Phosl CON-P15 / TR100- Phosl 72,4 72.4 — - A (6,2) AND (6.2) CON-P13/CPD2- Phosl CON-P13 / CPD2- Phosl 5,1 5.1 — - — - — - — - A (8,78) AND (8,78) CON-P14/CPD2- PhOSl CON-P14 / CPD2- PhOSl 75,1 75.1 — - 57,0 57.0 ·- · - A (9,5) AND (9.5)

• ·· ·· 4 · ·· · ··« ♦ » · · · » · * · « ♦ · · · · · · • · 9 4 · · « · · ·4 4 4 5 6 9 9 9 4 9 4

4 9 9 9 4 4 44 9 9 9 4 4 5

944 9444 49 4444 44 449944 9444 49 4444 44 449

Tabulka II (pokračování)Table II (continued)

Analytická data Analytical data Polyester Číslo Polyester Number Výtěžek % Yield % GPC GPC DSC Tm DSC Tm Eq. Wt.* Eq. Wt. * Phos. % Phos. % Peptid e (%)** Peptide e (%) ** Mn Mn Mw Mw CON-P8/PD100- Phosl CON-P8 / PD100- Phosl 73 73 — - — - 54,4 54.4 ·· ·· B (11,25) (B) (11,25) CON'P4/PLG2- PhoslB CON'P4 / PLG2- PhoslB 63,2 63.2 ““ "" 53,8 53.8 — - — - B (4,9) (B) (4.9) CON-P5/PIG2- PhoslB CON-P5 / PIG2- PhoslB 73,5 73.5 — - — - 48,0 48.0 — - — - C (4,7) C (4.7) CON-P6/PLG2- PhoslB CON-P6 / PLG2- PhoslB 78,6 78.6 — - — - 54,9 54.9 — - — - A (4,8) AND (4.8) CON-P16/PD101- Phosl CON-P16 / PD101- Phosl 61,6 61.6 — - — - -- - — - B (4,8) (B) (4.8) PIC-P3/PDGLY1- Phos2 PIC-P3 / PDGLY1- Phos2 74 74 — - — - — - — - — - B (7,2) (B) (7.2) PIC-P4/PD102- Phosl PIC-P4 / PD102- Phosl 87,2 87.2 — - — - — - — - B (5,6) (B) (5.6) CONG-P100/GCD- Phos3 CONG-P100 Phos3 70,3 70.3 ·· ·· -- - — - B (4,3) (B) (4.3)

* Ekvivalentní hmotnost byla určena titrací na kyselé skupiny ** Založeno na elementární analýze dusíku* Equivalent weight was determined by titration to acidic groups ** Based on elemental nitrogen analysis

99 99 99 ·99 99 99 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9

9999 99 9999 99 9999900 99 9900 99 999

Tabulka HL Data týkající se uvolňováníTable HL Release data

In vivo studie (ng/ml) na den In vivo study (ng / ml) per day 30 30 I AND 1 1 1 I 1 AND 1 1 t l t l 1 1 1 1 1 1 23 23 : : : : • 1 • 1 m o“ m O" I AND ! ! 0,2 0.2 IO IO OJ o“ OJ O" í and I AND 1 1 0,56 0.56 » i »» and 1 1 1 1 o_ O_ O O co o what O i and 1 1 v o v o 0,23 0.23 » 4 »» 4 1 1 1 1 CO_W CO _W W W Φ· co Φ · what 1 1 1 1 1 1 o v· O in· 00 ď 00 ï 1 1 i and 8,0 8.0 0.25 0.25 to it 1 1 » t »» t 12,8 12.8 2,04 2.04 1 1 s with in r- in r- In vitro studie, kumulativní % uvolněná za určitý interval In vitro study, cumulative% released over time Den 40 Day 40 cn co cn what 55,3 55.3 46,9 46.9 42,8 42.8 4,0 4.0 1 1 1 1 1 1 I AND i and Den 30 Day 30 co oT T“ what oT T ' 51,0 51.0 46,5 46.5 39,1 39.1 3,8 3.8 1 1 1 I 1 AND t t Den 25 Day 25 U> u V· U> at IN· 46,8 46.8 co -M· what -M · i and X co X what 4,6 4.6 1 1 1 1 1 1 Den 20 Day 20 May «Ο Ό· <3) «Ο Ό · <3) 40,1 40.1 39,2 39.2 30,9 30.9 o co“ O what" 9— 9— 1 1 1 » 1 »» Den 15 Day 15 Dec CO CO WHAT WHAT 27,4 27.4 co cř co what cř what 25,4 25.4 •N. CM • N. CM X co X what CM <ď CM <ď xř CM xř CM Den 10 Day 10 ’φ' ’Φ ' co V what IN 29,4 29.4 18,5 18.5 2,3 2.3 co what 4,9 4.9 19,4 19.4 Den 5 Day 5 co cm what cm °L ° L CM θ' CM CM θ ' CM 9— V“ 9— IN" co CM what CM 3,2 3.2 σ> 'ď 1“ σ> 'ď 1 " Analyt Analyt Peptid (%) Peptide (%) * co cď CO X * what CD CO X m S m S CM < x CM <x o> ·«. co X o> · «. co X O X O X co < £ what <£ co co CM~ £0 O what what CM ~ £ 0 O to c>L to Ξ to c> L to Ξ Konjugát Conjugate CON-P1 CON-P1 CON-P2 CON-P2 co 0. 1 Z o o what 0. 1 OF O O CON-P4 CON-P4 CON-P5 CON-P5 CON-P6 CON-P6 CON-P7 CON-P7 CON-P8 CON-P8

«· ·· «· * · · · ♦ · · · • · 9 9 9 9· · * * 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 ·9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 ·9 9 9 9 ·

9999 99 9999999 99 999

In vivo uvolněné (ng/ml)/ za den In vivo released (ng / ml) / day 1 1 1 1 I AND 1 1 1 1 1 1 r* v o r * v o » »» Λ Λ 1 1 <o <o 1 1 9,6 9.6 1 1 In vitro studie, Kumulativní % uvolněná za konkrétní interval In vitro study, Cumulative% released over a specific interval 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 <o of <o of rf v* rf in* 10,8 10.8 Anaiyt Anaiyt co o ffi O what O ffi O < i2. <i2. Konjugát Conjugate CON-P9 CON-P9 CON-P10 CON-P10

‘2 cl α •U ‘2 cl α •AT 30 30 1 1 1 1 1 » 1 »» • • • • l l t ♦ t ♦ 1 1 1 1 23 23 1 1 í and > 1 > 1 i and I AND 1 1 IO IO 1 1 1 1 1 1 ! ! ! ! « t « t • * • * o T O T 1 1 1 1 i and I AND I 1 AND 1 1 1 IO IO 1 1 I AND i < and < • 1 • 1 1 1 1 1 0.25 0.25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 In vitro studie, Kumulativní % uvolněná za konkrétní interval In vitro study, Cumulative% released over a specific interval Den 40 Day 40 1 1 1 1 Den 30 Day 30 1 1 1 1 1 1 Den 25 Day 25 1 1 1 1 Den 20 Day 20 May 62,4 62.4 » »» ! ! α <y β «Ο α <y β «Ο 6*09 6 * 09 1 1 i and ( Den 10 (Day 10 55,4 55.4 38,0 38.0 19,9 19.9 1 1 Den 5 Day 5 37,0 37.0 27,8 27.8 (O CD* (O CD* t t Anaiyt Anaiyt Peptid _ Peptide _ 2» of «w» 2 » of «W» 00 < s 00 <s ío < a ío <a A (5,25) AND (5,25) m S m S Konjugát Conjugate CON-P11 CON-P11 CON-P12 CON-P12 CON-P13 CON-P13 CON-P14 CON-P14 CON-P15 CON-P15 CON-P16 CON-P16

·· ·· • · · · » • · · * • · · · ♦ ·· · · · · · · · · · ·

9 9 99 9 9

99999999

In vivo uvolněné* (ng/ml)/ za den In vivo released * (ng / ml) / per day 1 1 1 1 i and * • * • ! ! 1 1 ! ! 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 in vitro studie, kumulativní % uvolněná za konkrétní interval in vitro study, cumulative% released over a specific interval CO id* WHAT id * 00 cf 00 cf 1 1 co ct what ct 1 1 00 oT 00 oT CM CM T“ oT T ' oT CM* CM * N- irT N- irT Analyt Analyt P CD S P CD S CM CD S CM CD S co co S? what what with? Konjugát Conjugate PIC-P3 PIC-P3 PIC-P4 PIC-P4 1 » O o S o a 1 »O o S o a

*Uvolňovací studie byly prováděny u krys a profil uvolňování byl monitorován určením koncentrace peptidu v séru v různých okamžicích s využitím radioimunostanovení.* Release studies were performed in rats and the release profile was monitored by determining the serum peptide concentration at various points using radioimmunoassay.

**Byla použita pouze polovina běžné dávky podávané krysám.** Only half the normal dose given to rats was used.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Absorbovatelné polyestery jsou vhodné pro výrobu konjugátů s různými peptidy a bioaktivními sloučeninami, které lze využít ve farmaceutických přípravcích.Absorbable polyesters are suitable for the production of conjugates with various peptides and bioactive compounds that can be used in pharmaceutical compositions.

Claims

PATENT CLAIMS

An absorbable polyester comprising at least one monophosphate function per chain of absorbable polyester.

A conjugate comprising an absorbable polyester according to claim 1 and a peptide and / or a bioactive agent, wherein the peptide and bioactive agent have at least one interactive amino group, wherein the monophosphate function forms a linkage with the amino group.

3. The conjugate of claim 3, wherein the peptide is selected from the group consisting of p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. , Β-D-Nal-Cys-Tyr-D-TrpLys-Val-Cys-Thr-NH 2, wherein two Cys are disulfide bonded, Nhydroxyethylpiperazinyl-acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys -Abu-Cys-Thr-NEU wherein two Cys are disulfide bonded and N-hydroxyethylpiperazinyl-ethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-TrpLys-Abu-Cys-Thr-NFU wherein the two Cys are disulfide bonded or their a pharmaceutically acceptable salt.

4. A solid absorbable microparticle comprising the absorbable polyester of claim 1 and having a surface on which more than one percent of the monophosphate functions reside.

A conjugate comprising the absorbable microparticle of claim 4 and a peptide and / or a bioactive agent, wherein the peptide and bioactive agent have at least one interactive amino group, wherein the monophosphate function on the surface of the absorbable microparticle forms an association with the amino group.

6. The conjugate of claim 5 wherein the peptide is selected from the group consisting of p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly. -NEf, β-D-Nal-Cys-Tyr-D-TrpLys-Val-Cys-Thr-Nth, wherein the two Cys are disulfide bonded, Nhydroxyethylpiperazinyl-acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp -Lys-Abu-Cys-Thr-NH2 wherein two Cys are disulfide bonded and N-hydroxyethylpiperazinyl-ethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp20

0 «• * 0» 0 0 «··· 0 0 0 0

0 000 0000

0 0000 0000 1

00 000 000

000 0000 00 0000 00 0 0

Lys-Abu-Cys-Thr-NH 2, wherein the two Cys are bonded by a disulfide bond or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

7. An acylated or alkylated absorbable polysaccharide having one or more terminal monophosphate functions per molecule.

8. The acylated or alkylated absorbable polysaccharide of claim 7 wherein said polysaccharide is acylated γ-cyclodextrin.

Conjugate, characterized in that it comprises an acylated or alkylated absorbable polysaccharide according to claim 7 and a peptide and / or a bioactive agent, wherein the peptide and the bioactive agent have at least one interactive amino group, wherein the mono phosphate function forms an association with the amino group.

10. The conjugate of claim 9, wherein the peptide is selected from the group consisting of p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NfL. , Β-D-Nal-Cys-Tyr-D-TrpLys-Val-Cys-Thr-NH 2, wherein the two Cys are disulfide bonded, Nhydroxyethylpiperazinyl-acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys -Abu-Cys-Thr-NKh wherein two Cys are disulfide bonded and N-hydroxyethylpiperazinyl-ethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-TrpLys-Abu-Cys-Thr-NH2 wherein the two Cys are disulfide bonded or their a pharmaceutically acceptable salt.

11. The absorbable polyester of claim 1, wherein the polyester chain comprises one or more monomers selected from the group consisting of lactic acid, D-lactic acid, DL-lactic acid, malic acid, citric acid, tartaric acid, ε-caprolactone, ε-capronic acid, alkylene oxalate, cycloalkylene oxalate, alkylene succinate, β-hydroxybutyrate, glycolide, glycolic acid, L-lactide, D-lactide, DL-lactide, meso-lactide, trimethylene carbonate, p-dioxanone, , 5-dioxepan-2-one and 1,4-dioxepan-2-one and any optically active isomers or copolymers thereof.

0 0

12. The absorbable polyester of claim 11, further comprising one or more polyethylene glycol segments covalently bonded to said polyester.

13. A conjugate comprising an absorbable polyester according to claim 12 and a peptide and / or bioactive agent, wherein the peptide and bioactive agent have at least one interactive amino group, wherein the monophosphate function forms an association with the amino group.

The conjugate of claim 13, wherein the peptide is selected from the group consisting of p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2, Η-β-D -Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NPL, wherein two Cys are disulfide bonded, Nhydroxyethylpiperazinyl-acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr -NEL, wherein the two Cys are disulfide bonded and N-hydroxyethylpiperazinyl-ethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-TrpLys-Abu-Cys-Thr-NPh, wherein the two Cys are disulfide bonded or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

15. A pharmaceutical composition comprising the conjugate of claim 2 and a pharmaceutically acceptable carrier.

16. A pharmaceutical composition comprising the conjugate of claim 5 and a pharmaceutically acceptable carrier.

17. A pharmaceutical composition comprising the conjugate of claim 9 and a pharmaceutically acceptable carrier.

18. A pharmaceutical composition comprising the conjugate of claim 13 and a pharmaceutically acceptable carrier.

The absorbable polymer of claim 1 for use as an acidic vehicle of cyanoacrylate formulations.

99 9 9 9 9 9 9 9 9999 9999 9999 9999 9999 9999 9999 9999 9999

20. A process for preparing low melting phosphorylated hydroxyl-bearing polyesters having from 1% to 60% crystallinity, characterized in that the hydroxyl-bearing polyester is reacted with an excess of pyrophosphoric acid to form a phosphorylated hydroxyl-bearing polyester.

21. A process for the preparation of a phosphorylated-acylated cyclodextrin, wherein the acylated cyclodextrin is reacted with an excess of pyrophosphoric acid to form a phosphorylated-acylated cyclodextrin.

22. A process for the production of a phosphorylated-alkylated cyclodextrin comprising reacting an alkylated cyclodextrin with an excess of pyrophosphoric acid to form a phosphorylated-alkylated cyclodextrin.

23. A process for the production of phosphorylated microparticles, wherein the hydroxyl-bearing microparticles are reacted with an excess of pyrophosphoric acid to form phosphorylated microparticles.

24. A process for the production of an acylated-phosphorylated polysaccharide, characterized in that the polysaccharide is reacted simultaneously with a heated mixture of pyrophosphoric acid and an acylating agent to form an acylated-phosphorylated polysaccharide.

25. A process for the preparation of an acylated-phosphorylated polysaccharide according to claim 24, wherein the polysaccharide is cyclodextrin and the acylating agent is propionic anhydride or acetic acid.

26. A phosphorylated grafted acylated cyclodextrin, wherein the cyclodextrin has one or more monophosphate functions.

27. A process for the production of a phosphorylated grafted acylated cyclodextrin comprising heating the monomer with an acylated cyclodextrin in the presence of a catalytic amount of stannous octanoate for 2 to 24 hours at a temperature of 100 ° C to 200 ° C to form a reaction mixture containing the graft acylated cyclodextrin, the reaction mixture is then dissolved in acetone to form an acetone solution; the acetone solution is precipitated in ice water, the precipitate precipitates in the ice water. Isolated and dried to form a dry precipitate which is then reacted with an excess of pyrophosphoric acid to form a phosphorylated grafted acylated cyclodextrin.

28. A conjugate comprising a phosphorylated grafted acylated cyclodextrin and a peptide and / or a bioactive agent, wherein the peptide and the bioactive agent have at least one interactive amino group and the monophosphate function forms an association with the amino group.