CZ2000730A3

CZ2000730A3 - Sférické mikročástice obsahující lineární '* i ^polysacharidy, způsob jejich výroby a jejich použití

Info

Publication number: CZ2000730A3
Application number: CZ2000730A
Authority: CZ
Inventors: Holger Bengs; JüRGEN GRANDE; Arnold Schneller; Gitte Böhm
Original assignee: Aventis Research & Technologies Gmbh & Co Kg
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1998-08-20
Publication date: 2001-01-17

Abstract

Mikročástice s rovnoměrným sférickým tvarem, které vykazují velmi úzké rozdělení velikosti, sestávají zcela nebo částečně z leneámího ve vodě nerozpustného polysacharidu, výhodně z 1,4-a-D-polyglukanu a mohou obsahovat další, obzvláště biologicky odbouratelné, polymery a/nebo účinné látky. Jsou mimo jiné vhodné pro kontrolované uvolňování účinných látek. Při způsobu výroby se rozpustí 1,4-a-D-polyglukan nebo polysacharid v rozpouštědle, roztok se vnese do srážecího činidla, vzniklá směs se ochladí a oddělí se vytvořené částice.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká sférických mokročástic, které obsahují lineární polysacharidy, způsobu jejich výroby a jejich použití, obzvláště pro kontrolované uvolňování účinných látek.

t*

Dosavadní stav techniky

Způsob výroby částic, obzvláště mikročástic z polymerů, jako jsou například polysacharidy, pro nej různější použití, jsou velmi komplikované postupy, které předpokládají přesné dodržování různých parametrů. Obzvláště vedou mnohé způsoby také pouze k nepatrným výtěžkům a k velmi širokému rozdělení částic. V této souvislosti je možno jmenovat především sprejové sušení, kondensace na fázovém v- , rozhrání a emulsní postupy (například VO-způsob = voda | v olejové emulsi, VOV-způsob = voda v oleji ve vodné emulsi, koacervace, fázová preparace, disperse). Obzvláště emulsní způsoby, ale také sprejové sušení ze dvoufázových systémů, vyžadují velmi exaktní postup a v převážné většině případů použití pomocných činidel (emulgátorů) . Stabilní emulce jsou často vyrobitelné pouze s vysokými náklady a precisní kontrolou velkého počtu parametrů (teplota, rychlost míchání a podobně) a úplné oddělení částic činí problémy. Výtěžky částic jsou často velmi nízké, obzvláště je nedostačující hodnota pojmutí účinných látek. Toto je aspekt, který může v případě drahých farmaceutických účinných látek zamezit e<« · použití dané technologie.

Kulovité mikročástice, které vedle polykondensátů obsahujících kyselinu vinnou, mohou obsahovat talé ethylškrob nebo podobné polysacharidy, se mohou získat podle US-PS 5 391 696 způsobem sprejového sušení, pomocí kterého je však možné pouze velmi těžko regulovat velikos částic a obzvláště rozdělení velikosti částic. Další v tomto patentu popsanou možností je rozpuštění polymeru v rozpouštědle nebo směsi rozpouštědel a nakapání roztoku do studeného zkapalněného plynu, například kapalného dusíku, přičemž se vytvoří kulovité částice. Kuličky se potom mohou dát do vody, která současně polymer vysráží a rozpouštědlo extrahuje. Tento způsob je zdlouhavý, nákladný a neekonomický. Také zůstává rovnoměrnost velikosti částic za požadavky .

EP-B1-0 251 476 popisuje výrobu mikročástic z poly.laktidů, ve kterých je dispergován makromolekulám! polypeptid. Také zde je potřebná intensivní kontrola nej různějších parametrů. Jednotné sférické částice se však nezískají.

Mikročástice, které obsahují účinné látky a plyny, jsou popsané ve VO 95/07 072. Výroba probíhá nákladným emulsním postupem, přičemž rozdělení velikosti částic je velmi nejednotné.

Yu Jiugao a Liu Jie popisují v Starch/stárke 46(7) 252 - 5 (1994) efekty reakčních podmínek suspensního zesítění na· velikost mikrokuliček škrobu. K zesítění dochází ve třech stupních; medium je suspense voda v oleji, jako olejová fáze slouží směs podzemnicový olej/toluen. Předem želá·· «· » 0 0 * ·Λ •'0 *sil β'··0 finišovaný škrob se přidává jako vodný roztok, který obsahuje ještě hydroxid sodný a kyselinu ethylenamintetraoctovou. Dále je potřebná přítomnost povrchově aktivního činidla, piopřípadě stabilisátoru.

Nevýhodou při zde popisovaném způsobu je to, že výsledek je závislý na velkém počtu faktorů, totiž hustotě, viskositě a poměrech koncentrací jak vodné, tak také olejové , fáze, na stabilisátoru a rychlosti míchání a kromě toho je i přítomnost stabilisátoru nevýhodná. K tomu je obtížné kontrolovat velký počet daných parametrů, takže reprodukovatelnost není uspokojivá.

Makromolekulárními účinnými látkami nasycené částice z ve vodě nerozpustných polymerů, jako je kyselina polymléčná nebo ethylcelulosa, se získají podle EP-B1-0 204 476 tak, že se partikulární účinná látka suspenduje v acetonickém roztoku polymeru a rozpouštědlo se při teplotě místnosti odpaří. Při tom vzniklé částečky ještě nevykazují požadované farmakologické efekty, takže je nutné další zpracování na .takzvané pelety.

Ačkoliv jsou již známé mikročástice se sférickým uspořádáním, jakož i způsoby jejich výroby, je stále ještě potřeba takovýchto mikročástic se zlepšenými vlastnostmi, jakož i ještě výhodnějšího, obzvláště ekonomičtějšího a lehce reprodukovatelného způsobu jejich výroby. Úkolem předloženého vynálezu tedy je dát k disposici mikročástice, které by měly rovnoměrný sférický tvar, dále by měly pokud možno úzké rozdělení velikosti, to znamená velkou jednotnost a které by se daly mnohostranně použít. Úkolem předloženého vynálezu je dále dát k disposici způsob výroby takovýchto mikročástic, který by byl jednoduše a hospodárně • · * ·*· ·β proveditelný, který by poskytoval mikročástice s rovnoměrnou strukturou a velkou jednotností, které by měly dobré mechanické vlastnosti, byly by biologicky odbouratelné, mohly by být opatřeny nejrůznějšími účinnými látkami a které by byly obzvláště vhodné pro kontrolované uvolňování účinných látek.

Podstata vynálezu

Výše uvedený úkol byl vyřešen sférickými mikročásticemi se středním průměrem 1 nm až 100 μπι, sestávajícími zcela nebo částečně z alespoň jednoho ve vodě nerozpustného lineárního polysacharidu.

Pod pojmem sférické mikročástice se rozumí mikročástice, které mají přibližně kulovitou formu. Podle popisu koule, vycházeje ze společného původu, v prostoru uspořádanými osami stejné délky, které definují rádius koule ve všech prostorových směrech, je pro sférické mikročástice možná odchylka délek os od ideálního stavu koule 1 % až 40 % . Výhodně se získají sférické mikročástice š odchylkami až 25 % , obzvláště výhodně až 15 % . Povrch sférických mikročástic se může makroskopicky srovnávat s povrchem maliny, přičemž hloubka prohloubenin nebo vrubů má činit maximálně 20 % středního průměru sférické mikročástice.

Lineární ve vodě nerozpustné polysacharidy jsou ve smyslu předloženého vynálezu polysacharidy, které jsou vystavěné z monosacharidů, disacharidů nebo jiných monomerních stavebních jednotek, že monosacharidy, disacharidy nebo jiné monomerní stavební jednotky jsou vždy navzájem spojené • * · • I * « • · • · · · « stejným typem vazby. Každá definovaná základní jednotka nebo stavební jednotka má přesmě dvě vazby, vždy jednu k dalšímu monomeru. Z toho jsou vyjmuty obě stavební jednotky, které tvoří počátek a konec polysacharidů. Tyto základní jednotky mají pouze jednu vazbu k dalšímu monomeru.

U tří vazeb (kovalentní vazby) se mluví o rozvětvení. Lileární ve vodě nerozpustné polysacharidy ve smyslu předloženého vynálezu nemaj í žádná rozvětvení nebo j e maj í pouze v nepodstatné míře, takže při velmi malých podílech rozvětvení nejsou tato prokazatelné pomocí současných analytických metod.

Pod pojmem ve vodě nerozpustné polysacharidy se rozumí v rámci předloženého vynálezu sloučeniny, které spadají podle definice Deutsches Arzneimittelbuch (DAB = Deutsches Arzneimittelbuch, Vissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Govi-Verlag GmbH, Frankfurt, 9. vydání, 1987) ve třídách 4 až 7 pod kategorie málo rozpustné, těžko rozpustné , velmi těžko rozpustné nebo prakticky nerozpustné sloučeniny.

V rámci předloženého vynálezu jsou výhodné lineární ve vodě nerozpustné polysacharidy, které byly vyrobené biotechnologickým procesem, obzvláště biokatalytickým, také biotransformačním nebo fermentačnim procesem.

Pojem lineární polysacharidy, vyrobené biokatalysou (také biotransformací) znamená v rámci předloženého vynálezu, že je lineární polysacharid vyroben katalytickou reakcí monomerních stavebních jednotek, jako jsou oligomerní sacharidy, například monosacharidy a/nebo disacharidy tak, že se za vhodných podmínek použije takzvaný biokatalysátor, obvykle enzym.

Lineární polysacharidy z fermentací jsou v rámci předloženého vynálezu lineární polysacharidy, které byly získané fermentačními procesy za použití v přírodě se vyskytujících organismů, jako jsou houby, řasy nebo bakterie, nebo za použití v přírodě se nevyskytujících organismů, ale za pomoci obecně definovaných genově technických metod modifikovaných organismů, jako jsou houby, řasy nebo bakterie, nebo byly získané za zařazení a pomoci fermentačních proceo su.

Lineární polymery podle předloženého vynálezu mohou být vedle výhodných 1,4-a-polyglukanů také další polyglukany nebo jiné lineární polysacharidy, jako jsou pullany, pektiny, mannany nebo polyfruktany.

Kromě toho se mohou lineární polymery pro výrobu mikročástic podle předloženého vynálezu získat také reakcí z dalších nelineárních polysacharidů tak, že se nelineární polysacharidy, které obsahují rozvětvení, zpracují enzymem tak, že dochází ke štěpení rozvětvení, takže se po oddělení ⁴ získají lineární polysacharidy. U těchto enzymů se může jednat například o amylasy, iso-amylasy, glukonohydrolasy nebo pullanasy.

U obzvláště výhodné formy provedení předloženého vynálezu sestávají sférické mikročástice zcela nebo částečně z 1,4-a-polyglukanu. Výhodně se 1,4-a-polyglukan vyrobí pomocí biokatalytického (biotransformatického) procesu pomocí polysacharidsyntetas, škrobových syntetas, glykosyltransferas, α-1,4-glukantransferas, glykogensyntetas, amylocukras nebo fosforylas.

ft* * * * ♦ 'ft · t, '< ft¹ · ft ft! · • ftftft ·* »»' e«e e

Molekulové hmotnosti M_w podle předloženého vynálezu používaných polysacharidů se mohou pohybovat v širokém rozmezí 10^J g/mol až 10 g/mol. Pro podle předloženého vynálezu používaný polysacharid 1,4-a-D-polyglukan se používají molekulové hmotnosti M_w v rozmezí 10^ g/mol až 10$ g/mol , obzvláště 2 x 10^ g/mol až 5 x 10^ g/mol.

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že se velmi jednoduchým způsobem mohou vyrobit velmi jednotné mikročástice z ve vodě nerozpustných lineárních polysacharidů ve velkých množstvích, jaké se nezískají s podobnými komerčně dostupnými polysacharidy, jako je amylosa nebo škrob.

Předmětem předloženého vynálezu je tedy dále způsob výroby sférických mikročástic, které zcela nebo částečně sestávají z ve vodě nerozpustných lineárních polysacharidů, obzvláště 1,4-a-D-polyglukanu, rozpuštěním ve vodě nerozpustného lineárního polysacharidů nebo 1,4-a-D-polyglukanu v rozpouštědle, vnesením roztoku do srážecího činidla, ochlazením vzniklé směsi a oddělením vytvořených mikročástic.

Obzvláště výhodně se smísí tento roztok a srážecí činidlo při teplotě v rozmezí 20 °C až 50 °C a směs se ochladí na teplotu v rozmezí 10 °C až -10 °C , výhodně 5 °C až -5 °C .

Jako rozpouštědlo se výhodně použije dimethylsulfoxid.

Jako srážecí činidlo se výhodně použije voda nebo vodné medium.

Při tom je výhodné, když se uvedený roztok připraví za přítomnosti jednoho nebo více polymerů, obzvláště biologicky odbouratelných polymerů a/nebo za přítomnosti jedné nebo více účinných látek.

Při další výhodné formě provedení se ve vodě rozpustné polysacharidy vyrobí enzymatickým zpracováním rozvětvených nebo vysoce rozvětvených polysacharidů.

í- Dimethylsulf oxid je výhodné rozpouštědlo pro rozpuštění lineárních polysacharidů; jako další rozpouštědla je mimo jiné možno uvést formamid, acetamid, N,N-dimethylformamid, N,N-dimethylacetamid, N-methylmorfolin-N-oxid za přítomnosti vody, jakož i další N-substituované morfolin-N-oxidy a vodné· roztoky s vysokou nebo nízkou hodnotou pH. .

Jako srážecí činidlo je výhodná voda; proces se může ovlivnit použitím jiných rozpouštědel, která mohou vodu zcela nebo částečně nahradit, jako je například dichlormethan, přičemž se mimo jiné může řídit doba srážecího procesu a struktura povrchu částic.

Také jsou k tomu vhodné směsi vody s alkoholy, jako je například methylalkohol, ethylalkohol a isopropylalkohol,

- které ovlivňují parametry procesu, jakož i vlastnosti získávaných částic.

Teplota během procesu srážení je všeobecně výhodně v rozmezí 0 °C až -10 °C , mohou se však použít také vyšší nebo nižší teploty.

Proces srážení se může provádět relativně pomalu přes noc nebo se může ovlivnit variací srážecího činidla a teploty .

0 • 0

0« •000 βί ··

Spolupoužitím vhodných přísad se dá dosáhnout vlivu na vlastnosti částic, jako je velikost, struktura povrchu a podobně, jakož i na vedení procesu. Vhodnými přísadami jsou například povrchově aktivní látky, jako je dodecylsulfát sodný nebo N-methylglukonamid a cukry, například fruktosa, sacharosa a glukosa.

Povrchově aktivní látky mohou být anionické, kationické nebo neionické povahy.

Základními příklady povrchově aktivních látek jsou polysorbáty (například Tveen^), alkylpolyglykolethery, ethylenoxid-propylenoxi-blokové polymery (například Pluronic^), alkylpolyglykolethersulfáty, alkylsulfáty (například již uvažovaný dodecylsulfát sodný) a glykolestery mastných kyselin. Přísady se výhodně přidávají do srážecího činidla .

Koncentrace lineárního polysacharidů v roztoku se může pohybovat v širokém rozmezí, činí výhodně 0,1 g polysacharidu na 1 ml rozpouštědla.

Možné jsou i jiné rozsahy, jako 0,05 g/ml až 0,2 g/ml nebo 0,02 g/ml až 0,5 g/ml .

Částice podle předloženého vynálezu mohou sestávat z alespoň jednoho lineárního polysacharidů a mohou obsahovat alespoň jednu účinnou látku. Povrch může být hladký nebo drsný.

Mikročástice mohou být vystavěny z jediné polysacharidové látky, obzvláště z 1,4-a-D-polyglukanu. Je ale také • 9 » 9 «

τ9 9

9 β«β« možné přimísit jiný lineární ve vodě nerozpustný polysacharid. Také se mohou použít jiné polymery, obzvláště jiné biokompatibilní polymery. Při tom závisí množství jiného polymeru nebo jiných polymerů, které se mohou přimísit, bez toho, že by se nevýhodně změnil sférický tvar a podobné dobré vlastnosti mikročástic, stále na přidaném polymeru. Množství může činit 10 % a více, v určitých případech také méně. ještě použitelné maximální množství se může lehce určit několika málo pokusy.

Částice mohou mít střední průměr (číselná střední hod nota) 1 nm až 100 pm , výhodně 100 nm až 10 pm, obzvláště výhodně 1 pm až 3 pm .

Částice vykazují charakteristiku průměru d_w ku d_n(dispersita) 1,0 až 10,0 , výhodně 1,5 až 5,0 a obzvláště výhodně 2,0 až 2,6 , přičemž d_n = číselná střední hodnota průměru a d_w = hmotnostní střední hodnota průměru.

Zde použité hodnoty průměru jsou definované následovně :

d_n = Σ n^ x d^ / Σ n^ = číselná střední hodnota

O d = Σ n· x d,· / Σ n„· x d· = hmotnostní střední hodnota, přičemž n^ = počet částic s průměrem d^ , d^ = určený průměr , i = pořadový parametr.

Výraz hmotnost” zde neznamená váhu, ale hmotnostní průměr. Větší průměry získají vyšší směrnou hodnotu; exponenty 2 se silněji zdůrazní průměry větších částic.

Dispersita rozdělení průměrů u částic je definována j ako :

^D = V^dn ·

Nejednotnost rozdělení průměrů je definována jako :

^U = ^dw/^dn - 1 = D - ! .

Čím blíže leží hodnota nejednotnosti nule, tím jednotnější jsou částice se zřetelem na rozdělení svojí velikosti . . ,

Mikročástice se mohou obzvláště také kvůli svému tvaru a velikosti výhodně využít v různých oblastech použití, buď jako takové v čisté formě nebo tak, že jsou v nich obsaženy účinné látky v nej širším slova smyslu, například ·- jako aditiva pro kosmetiku v mastech, pudrech, krémech, pastách a podobně,

- jako nosiče pro účinné látky ve farmaceutických a jiných aplikacích,

- jako kluzné prostředky, například pro uzavření pórů nebo vyhlazení hran,

- jako přísada do potravin, například jako plnící komponenta nebo pro zlepšení rheologických vlastností,

- jako aditivum pro zušlechtění například emulsních polymeo ru,

- jako pomocný prostředek pro oddělování, například při oddělování nečistot,

- jako tabletovací materiál, • · • ·

- jako nosič pro magnetické částice,

- jako plnidlo pro bioodbouratelné polymery nebo technické polymery pro kontrolu vlastností,

- jako aditiva pro kontrolu vlastností, například porosity, hmotnosti, barvy a podobně a

- jako standard částic pro kalibrování nebo určení velikosti částic neznámých materiálů.

Jako jednotlivé účinné látky nebo kombinace účinných látek je možno například uvést :

farmaceutické účinné látky, medikamenty, léčiva, peptidy, proteiny, nukleové kyseliny, vakciny, protilátky, steroidy, oligonukleotidy, aromatické látky, vonné látky, hnojivá, „agrotechnické účinné látky, jako jsou pesticidy, herbicidy, insekticidy a fungicidy, chemikálie se specielními vlastnostmi, jako jsou luminofory, emulgátory, tensidy, pigmenty, oxidační činidla, redukční činidla, fullereny a magnetické komplexy, například paramagnetické sloučeniny.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je také použití výše popsaných mikročástic pro kontrolované, například retardované uvolňování účinných látek.

U způsobu se jedná o velmi jednoduchý postup. Parametry pro výrobu částic se mohou pohybovat v širokém rozmezí, jako je poměr rozpouštědla ke srážecímu činidlu, teplota během procesu srážení, koncentrace roztoku a rychlost přídavku roztoku ke srážecímu činidlu.

Částice se vyznačují vysokou jednotností se zřetelem ria svoji velikost a rozdělení svých průměrů.

Vzhledem k nerozpustnosti ve vodě výchozího polymeru,

00

0«

'0 · například 1,4-a-D-polyglukanu se dají uskutečnit výhodná využití, která nejsou závislá na rychlém rozrušení mikročástic a proto se mohou obzvláště výhodně využít v produktech, ve kterých je obsažena voda jako další komponenta.

Mikročástice se vyznačují schopností, že se mohou vystavovat vysokému mechanickému namáhání.

Obzvláště působí částice na základě své morfologie a jednotnosti při vyhlazování, například pórů.'

Výhodně v úvahu přicházející 1,4-a-D-polyglukan se může vyrobit různými způsoby. Velmi výhodná metoda je popsaná.ve VO 95/31 533 . Na závěry tohoto spisu se zde výslovně poukazuje.

Vynález je blíže objasněn pomocí dále uvedených příkladů provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba mikročástic z 1,4-a-D-polyglukanu

500 mg 1,4-a-D-polyglukanu se při teplotě asi 70 °C rozpustí ve 2,5 ml dimethylsulfoxidu (DMSO, p.a. firmy Riedel-de-Haen). Tento dimethylsulfoxidový roztok se za míchání přikape do 100 ml redestilované vody a roztok se ponechá přes noc při teplotě 5 °C. Jemná mléčná suspense se potom odstřeďuje po dobu 15 minut při 3500 otáčkách za minutu a supernatant se oddekantuje. Usazenina se rozmíchá

•9 99 ·· • · • · • · * eeee v redestilované vodě a znovu se odstředí. Postup se ještě dvakrát opakuje, načež se suspense lyofilisuje. Získá se takto 311 mg bílých částic 1,4-a-D-polyglukanu, což odpovídá výtěžku 62 % bezbarvých mikročástic.

Příklad 2

Výroba mikročástic z amylosy, která byla separovaná z rostlin

500 mg amylosy (z brambor, EGA-Chemie) se při teplotě asi 70 °C rozpustí ve 2,5 ml dimethylsulfoxidu (DMSO, p.a. firmy Riedel-de-Haen). Tento dimethylsulfoxidový roztok se za míchání přikape do 100 ml redestilované vody ,a roztok se ponechá přes noc při teplotě 5 °C. Vytvoří se bílá vločkovitá suspense. Další zpracování probíhá stejně, jako je popsáno v příkladě 1 . Získá se takto 210,3 mg bílé pevné látky (42% výtěžek) , u které se jedná o nepartikulární strukturu.

Příklad3

Výroba mikročástic z amylosy, která byla separovaná z rostlin

Tento pokus se provádí analogicky jako je popsáno v příkladě 2 . Použije se 500 mg amylosy firmy Merck (údaj výrobce : amylosa pro biochemické účely). Po stání přes noc se vytvoří bílá vločkovitá suspense. Další zpracování probíhá stejně jako je uvedeno v příkladě 1 . Získá se takto 60 mg bílé pevné látky (12% výtěžek) , jejíž morfologie a struktura je velmi voluminesní. Partikulární struktura se v tomto srovnávacím příkladě stejně jako v příkladě •99 • 9 • 99 • · * 9 • · 9 • · 9 » • · 9

9999 β 9 9 9 • · 9 9 • · 9 9 • 9 99 nepozoruj e.

Příklad 4 až 8

Výroba mikročástic ze škrobů, které byly separovány z různých rostlin

500 mg škrobu (specifikace viz tabulka 1) se při teplotě asi 70 °C rozpustí ve 2,5 ml dimethylsulfoxidu (DMSO, p.a. firmy Riedel-de-Haen). Nevytvoří se žádný roztok.

Směsi vytvoří vazké gely. Tyto se za míchání přidají do 100 ml redestilované vody, přičemž se gel rozrazí a roztok se ponechá přes noc při teplotě 5 °C. Vytvoří se silně zakalené suspense s velkým počtem bílých vloček. Další zpracování probíhá stejně, jako je popsáno v příkladě 1 . Výsledky jsou shrnuté v následující tabulce 1 . U všech srovnávacích příkladů 2 až 8 je zřejmé, že výsledky s nelineárními polysacharidy nebo podobnými výchozími materiály se výrazně liší od výsledků podle příkladu 1 podle předloženého vynálezu. Tvoří se zde bez vyjímky silné zákaly a/nebo velké vločky.

Partikulárně tvarované struktury se nedají pozorovat. Kromě toho jsou výtěžky pevné látky ve srovnávacích příkladech podstatně nižší ve srovnání s příkladem 1 .

··

Tabulka 1

Výsledky srážení různých DMSO-roztoků škrobu ve vodě

Příklad	typ škorbu	podíl lineárního polysacha- ridu (%)	konsistence DMSO-roztoku	konsistence suspenze po srážení při 5 °C	navážka	výtěžek j
1	1,4-a-D- poly- glukan*¹	100	čirý, nízko- viskosní roztok	j emná mléčná suspenze	311,0	62
2	amylosa*² (EGA- Chemie)	90 - 100	po 2 dnech rozpuštěný, vysoce viskozní	jemná suspenze s vločkami	210,3	42
3	amylosa*² (Merck)	95 - 100	po 2 dnech rozpuštěný, za tepla vysoce viskozní	jemná suspenze s vločkami	60,0	12
4	brambory Toffena™ (Sůd- stárke)	20	pevný gel, čirý	silný zákal	neoddě- litelné odstře- divkou

*1 ve vodě nerozpustný *2 ve vodě rozpustný «· tc« e • « 9 · « * · * • ♦ · a • ♦ · ·

9· «·

Tabulka 1 (pokračování)

Příklad	typ škorbu	podíl lineárního polysacha- ridu (%)	konsistence DMSO-roztoku	konsistence suspenze po srážení při 5°C	navážka	výtěžek
5	kukuřice Stárke (Merck)	20	vazký gel	lehký zákal, velké vločky	83,8	17
6	kukuřice Stárke C (National Starch)	50	vazký gel	silný zákal, žádné vločky	101,7	20
7	kukuřice Stárke HVII* (National Starch)	70	vazký gel	silný zákal, žádné vločky	211,1	42
8	hrách (Amylose KG)	70	vazký gel, zakalený	lehký zákal, velké vločky	115,9	23

Příklad 9a a 9b

Výroba mikročástic z 1,4-a-D-polyglukanu ve velkém měřítku

a) 400 g 1,4-a-polyglukanu se při teplotě 60 °C rozpustí v průběhu 1,5 hodiny ve 2 1 dimethylsulfoxidu (DMSO,

p.a. firmy Riedel-de-Haen) , načež se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Tento roztok se potom po kapkách přidá za míchání do 20 1 redestilované vody pomocí v dělící nálevky v průběhu 2 hodin, načež se vsázka ponechá při teplotě 4 °C po dobu 44 hodin. Vytvoří se jemná suspense. Částice se oddělí tak, že se nejprve supernatant oddekantuje. Usazenina se rozmíchá a po malých částech se odstřeďuje (ultracentrifuga RC5C vždy po .5 minutách při 5000 otáčkách za minutu). Pevný zbytek se celkem třikrát rozmíchá s redestilovanou vodou a znovu se odstředí. Pevné látky se spojí a suspense asi 1000 ml se lyofilisuje (Christ Delta 1_24 KD). Isoluje se takto 283 g bílé pevné látky (výtěžek 71 %) .

b) Spojené supernatanty se ponechají přes noc při teplotě -18 °C , načež se provádí výše uvedené zpracování.

Získá se takto dalších 55 g bílé pevné látky (výtěžek 15 %) .

Celkový výtěžek tohoto procesu činí tedy 85 % bezbarvých mikročástic.

Příklad 10

Odsíření mikročástic

Pro oddělení v částicích zbylého dimethylsulfoxidu se ♦ · ·

postupuje následujícím způsobem. 100 g 1,4-a-D-polyglukanu z příkladu 9 se dá do 1000 ml deionisované vody a vsázka se ponechá za lehkého protřepávání po dobu 24 hodin. Oddělení částic se provede stejně, jako je popsáno v příkladě.

(ultracentrifuga RC5C : vždy 15 minut, 3000 otáček za minutu). Po lyofilisaci se získá 98,3 g produktu (98% výtěžek) . Stanovení síry pomocí elementární analysy dává následující hodnoty (zkušební metoda spalování a IR-detekce) :

<5í< Obsah síry v částicích z příkladu 9 : 6 % ± 0,1 % <· Obsah síry v částicích z příkladu 10 : < 0,01 % .

Příklad 11

Zkoušky pevných látek z příkladů 1 až 9 pomocí elektronové mikroskopie

Pro charakterisaci částic se provádí rastrová elektronová mikroskopie (REM)(Camscan S-4). Výsledky zkoušky jsou shrnuté v tabulce 2 . Při tom je zřetelné, že pouze při použití ve vodě nerozpustných lineárních polysacharidů (1,4-a-D-polyglukan) se získají sférické okrouhlé mikročástice. Naproti tomu vede použití jiných výchozích polymerů i pouze k voluminesním, vatovitým a ne partikulárním morfologiím, u nichž není dokazatelná dispersita. Struktura částic, získaných podle příkladu 1 , je patrná z obrázků 1 a 2 . , • 4 4 4 ββ

Tabulka 2

Charakteristika pevných látek a částic z příkladů 1 až 3 a 7 až 9

Příklad	typ škrobu	podíl lineárního polysacharidu	vzhled částic
1	1,4-a-Dpolyglukan*¹	100	okrouhlé separované částice
2	amylosa*²(EGA-Chemie)	90 - 100	vločkovité voluminesní vatovité částice (tj. neseparované částice)
3	amylosa*² (Merck)	95 - 100	vločkovité voluminesní vatovité částice (tj. neseparované částice) .
7	kukuřice Hylon VII (National Starch Chemistry)	70	vločkovité vatovité částice (tj. neseparované částice)
8	hrách (Amylose KG)	70	vločkovité vatovité částice (tj. neseparované částice)
9a	1,4-a-D- polyglukan*¹	100	okrouhlé separované částice
9b	1,4-a-D- polyglukan*¹	100	okrouhlé separované částice

*1 ve vodě nerozpustný *2 ve vodě rozpustný φ

• · »

Příklad 12

Zkouška rozdělení velikostí částic z příkladů 1 a 9

Pro charakterisaci rozdělení velikostí částic z příkladů 1 a 9 se provádí zkoušky pomocí přístroje mastersizer (firma Malvern Instruments). Zkouška se provádí ve Fraunhoferově modusu (vyhodnocení : multimodální, počet) při hustotě 1,080 g/cm^J a objemové koncentraci v oblasti 0,012 % až 0,014 % . Výsledky této zkoušky jsou shrnuté v tabulce 3 a ukazují vysokou jednotnost mikročástic.

Příklad 13

In-vitro produkce 1,4-a-D-polyglukanu v biokatalytickém procesu za pomoci amylocukrasy

Do patnáctilitrové sterilisované nádoby (sterilisace parou) se dá 10 1 20% roztoku sacharosy, načež se najednou přidá enzymový extrakt, obsahující amylocukrasu. Enzymová aktivita činí při tomto experimentu 16 jednotek. Aparatura se opatří rovněž sterilisovaným míchadlem, nádoba se uzavře a obsah se míchá při teplotě 37 °C . Již po několika hodinách se tvoří bílá sraženina. Reakce se ukončí po 180 hodinách. Sraženina se odfiltruje a pro oddělení nízkomolekulárních cukrů se pětkrát promyje vodou. Sraženina na filtru se suší při teplotě 40 °C v sušárně za vakua membránové vývěvy (firmy Vacuubrand GmbH & Co, CVC 2). Hmotnost produktu činí 685 g (výtěžek 69 %) . Takto získaný 1,4-a-D-polyglukan se může přímo použít pro charakterisaci a pro výrobu mikročástic.

• ·

Přikladl 4

Charakterisace ve vodě nerozpustného 1,4-a-D-polyglukanu z příkladu 13 , syntetisovaného pomocí amylocukrasy mg 1,4-a-D-polyglukanu z příkladu 13 se při teplotě místnosti rozpustí v dimethylsulfoxidu (DMSO, p.a. firmy Riedel-de-Haen) a přefiltruje se (2 gm filtr). Část roztoku • T se injikuje na sloupec pro gelovou permeační chromatografii, přičemž se jako eluční činidlo použije dimethylsulf’ * oxid. Intensita signálu se měří pomocí RI-detektoru a vyhodnocuje se proti pullanovému standardu (firma Polymer Standard Systems). Hodnota toku činí 1,0 ml/min.

Měřením se zjistí číselný střed molekulové hmotnosti (M ) 14 200 g/mol a hmotnostní střed molekulové hmotnosti (M ) 29 500 g/mol. Toto odpovídá dispersitě 2,1 .

Tabulka3

Charakterisace průměru částic z příkladů 1 a 9

Příklad		průměr	rozdělení částic
dn*¹ (gm)	j *² d_w (gm)	d«/<V³	d(io %)*⁴ (gm)	d(50 %)*^s (gm)	d(90 %)’⁶ (gm)
1	1,282	2,692	2,100	0,991	1,263	1,776
9a	1,664	4,184	2,541	0,873	1,504	2,624
9b	0,945	2,345	2,481	0,587	0,871	1,399

4« β β *-*-d_n : hodnota číselného středu průměru *^d : hodnota hmotnostního středu průměru *^d_w/d_n : dispersita průměru částic *⁴d(10%) : 10 % všech částic má menší průměr než je uvedená hodnota *^d(50%) : 50 % všech částic má menší průměr než je uvedená hodnota *^d(90%) : 90 % všech částic má menší průměr než je uvedená hodnota

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Sférické mikročástice se středním průměrem 1 nm až 100 μπι , sestávající zcela nebo částečně z alespoň jednoho ve vodě nerozpustného lineárního polysacharidů.
2. Sférické mikročástice se středním průměrem 1 nm až 100 μιη , sestávající zcela nebo částečně z alespoň jednoho ve vodě nerozpustného lineárního polysacharidů, který byl vyroben biotechnickým procesem.
3. Sférické mikročástice se středním průměrem 1 nm až 100 μπι podle nároku 2 , sestávající zcela nebo částečně z alespoň jednoho ve vodě nerozpustného lineárního polysacharidu, který byl vyroben biokatalytickým procesem.
4. Sférické mikročástice se středním průměrem 1 nm až 100 μπι podle nároku 2 , sestávající zcela nebo částečně z alespoň jednoho ve vodě nerozpustného lineárního polysacharidu, který byl vyroben fermentativním procesem.
5. Sférické mikročástice podle nároku 1 , sestávající zcela nebo částečně z 1,4-a-D-polyglukanu.
6. Mikročástice podle nároku 5 , vyznačující se tím, že 1,4-a-D-polyglukan byl vyroben biokatalytickým procesem za pomoci polysacharidsyntetas.
7. Mikročástice podle nároku 5 , vyznačující se tím, že 1,4-a-D-polyglukan • * • · 0 • ·· • · · · ·' · • 9 byl vyroben biokatalytickým procesem za pomoci škrobových syntetas.
8. Mikročástice podle nároku 5 , vyznačující se tím, že 1,4-a-D-polyglukan byl vyroben biokatalytickým procesem za pomoci glykosyltransferas.
9. Mikročástice podle nároku 5 , vyznačující se tím, že 1,4-a-D-polyglukan byl vyroben biokatalytickým procesem za pomoci a-l,4-glukantransferas.
10. Mikročástice podle nároku 5 vyznačující se t í m , že 1,4-a-D-polyglukan byl vyroben biokatalytickým procesem za pomoci glykogensyntetas.
11. Mikročástice podle nároku 5 , vyznačující se tím, že 1,4-a-D-polyglukan byl vyroben biokatalytickým procesem za pomoci amylocukras.
12. Mikročástice podle nároku 5 , vyzná č.u jící se tím, že 1,4-a-D-polyglukan byl vyroben biokatalytickým procesem za pomoci fosforylas.
13. Mikročástice podle nároku 1 , vyznačující se tím, že lineární polysacharidy byly vyrobeny enzymatickým zpracováním rozvětvených nebo vysoce rozvětvených pólysacharidů.
14. Mikročástice podle alespoň jednoho z nároků 1 až 13 se středním průměrem 100 nm až 10. μπι , výhodně 1 až 3 pm.

• A
15. Mikročástice podle alespoň jednoho z nároků 1 až 14,vyznačující se tím, že mají úzké rozdělení průměru částic.
16. Mikročástice podle nároku 15 , vyznačující se tím, že mají dispersitu průměru částic d_w ku d_n 1,0 až 10,0 , výhodně 1,5 až 5,0

C a obzvláště 2,0 až 2,6 .
17. Mikročástice podle alespoň jednoho z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že dodatečně obsahuj í jeden nebo více polymerů, výhodně biologicky odbouratelných polymerů. - '
18. Mikročástice podle jednoho nebo více nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že dodatečně obsahuj í jednu nebo více účinných látek.
19. Způsob výroby sférických mikročástic, které zcela nebo částečně sestávají z ve vodě nerozpustných lineárních polysacharidů, obzvláště 1,4-a-D-polyglukanu, rozpuštěním ve vodě nerozpustného lineárního polysacharidů nebo 1,4-a-D-polyglukanu v rozpouštědle, vnesením roztoku do srážecího činidla, ochlazením při tom vzniklé směsi a oddělením vytvořených mikročástic.
20. Způsob podle nároku 19 , vyznačující se tím, že se roztok a srážecí činidlo smísí při teplotě v rozmezí 20 °C až 50 °C a směs se ochladí na teplotu v rozmezí 10 °C až -10 °C , výhodně 5 °C až -5 °C .

0' ·

9999

0 0'

I
21. Způsob podle nároku 19 nebo 20 ,

I vyznačující se tím, že se jako rozpouI štědlo použije dimethylsulfoxid.
22. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 19 až 21 , vyznačující se tím, že se jako srážecí činidlo použije voda nebo vodné medium.
23. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 19 až 22 ,

I vyznačující se t i m , že se roztok připraví za přítomnosti jednoho nebo více polymerů, obzvláště biologicky odbouratelných polymerů a/nebo jedné nebo více účinných látek.

C ř

F.....‘ .

)
24. Použití mikročástic podle alespoň jednoho z nároků

1 až 18 , nebo vyrobených způsobem podle alespoň jednoho z nároků 19 až 23 , pro kontrolované uvolňování účinných látek.
25. Použití mikročástic podle alespoň jednoho z nároků 1 až 18 , nebo vyrobených způsobem podle alespoň jednoho í* z nároků 19 až 23 , jako standardu pro určení velikosti fe castic.