CZ20004895A3 - 3ˆ-exonuclease, preparation process and use thereof - Google Patents
3ˆ-exonuclease, preparation process and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20004895A3 CZ20004895A3 CZ20004895A CZ20004895A CZ20004895A3 CZ 20004895 A3 CZ20004895 A3 CZ 20004895A3 CZ 20004895 A CZ20004895 A CZ 20004895A CZ 20004895 A CZ20004895 A CZ 20004895A CZ 20004895 A3 CZ20004895 A3 CZ 20004895A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- chromatography
- eluted
- poly
- fractions
- salt
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Předložené řešení se týká póly (A)-speciftcké 3 exonukleázové aktivity, kterou je možné získat chromatografickým čištěním surového extraktu ze zvířecích nebo lidských buněk, a rovněž jejího použití k deadenylaci 3'- poly-(A)-zbytků nukleových kyselin ajako léčiva. Rovněž se popisuje její použití jako diagnostika nebo k identifikaci funkčních interaktorů.The present invention relates to a poly(A)-specific 3' exonuclease activity, which can be obtained by chromatographic purification of a crude extract from animal or human cells, and its use for deadenylation of 3'-poly-(A)-residues of nucleic acids and as a drug. Its use as a diagnostic or for the identification of functional interactors is also described.
Description
Oblast technikyTechnical area
Předložený vynález se týká póly (A)-specifické 3Z-exonukleázové aktivity, kterou je možné získat chromatografickým čištěním surového extraktu ze zvířecích nebo lidských buněk, a rovněž její použití k deadenylaci 3z-poly(A)-zbytků nukleových kyselin a jako léčiva, diagnostika nebo k identifikaci funkčních interaktorů.The present invention relates to a poly(A)-specific 3 Z -exonuclease activity, which can be obtained by chromatographic purification of a crude extract from animal or human cells, as well as its use for deadenylation of 3 z -poly(A)-residues of nucleic acids and as a drug, diagnostic or for the identification of functional interactors.
Dosavadní stav technikyState of the art
Většina eukaryotických mRNAs nese asi 200 adenosinových zbytků s dlouhým zbytkem póly(A) na zakončeních 3Z . Póly- (A)-zbytky přitom zřejmě ovlivňují nejenom poločas rozpadu nebo intracelulární transport mRNAs, nýbrž také translaci mRNA na odpovídající proteiny. Přesný mechanismus není dosud objasněn, přičemž se však zdá, že výstavba a odbourání póly(A)-zbytků je přímo nebo nepřímo vázána na jejich funkce (viz příkladně Vickens, M. a spol., (1997) Curr.Opin.Genet. Dev., 7, strany 220-232).Most eukaryotic mRNAs carry about 200 adenosine residues with a long poly(A) residue at the 3' - terminus. Poly(A) residues appear to influence not only the half-life or intracellular transport of mRNAs, but also the translation of mRNAs into corresponding proteins. The exact mechanism is not yet clear, but it seems that the construction and degradation of poly(A) residues is directly or indirectly linked to their function (see, for example, Vickens, M. et al., (1997) Curr.Opin.Genet. Dev., 7, pp. 220-232).
Póly(A)-odbourávající nukleásové aktivity již byly zkoumány ve více eukaryotických systémech (viz příkladně Virtanen, A. a Astrom, J. (1997) v Prog.Mol.Subcell.Biol. (Jeanteur, P., ed.) Vol. 16, 199-220, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg). Tak byly příkladně v kvasinkách identifikovány dvě reakční cesty. Jedna reakční cesta, tak zvaná deadenylation dependent decapping passway začíná bhr·.Pol(A)-degrading nuclease activities have already been investigated in several eukaryotic systems (see for example Virtanen, A. and Astrom, J. (1997) in Prog.Mol.Subcell.Biol. (Jeanteur, P., ed.) Vol. 16, 199-220, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg). Thus, for example, two reaction pathways have been identified in yeast. One reaction pathway, the so-called deadenylation dependent decapping pathway, begins with bhr·.
/ / odstraněním póly(A)-zbytku a a týká se 5 -3 -exonukleotického odbourání mRNA pomocí Xmlpé7-exonukleázy. Druhá reakční cesta, tak zvaná 2> -5Z-decay passway startuje deadenylací mRNA a zahrnuje 3 -5'-exoribonukleotické odbourání mRNA. Ve vztahu k 3/-5/-decay passway byl před nedávném identifikován multikomponentní komplex, zvaný exosom (Mitchell, P. a spol. (1997), Cell 91, 457-466). Exosom sestává z několika opakovaných 3Z-5Z-exoribonukleáz a podílí se rovněž na 3Z-procesování 5.8S rRNA a 37 -5Z-odbourání mRNA (Anderson, J.S.J. a Parker, R./ / by removing the poly(A)-residue aa, it involves 5 -3 -exonucleotic degradation of mRNA by Xmlpé 7 -exonuclease. The second reaction pathway, the so-called 2> -5 Z -decay pathway, starts with mRNA deadenylation and involves 3 -5'-exoribonucleotic degradation of mRNA. In relation to the 3 / -5 / -decay pathway, a multicomponent complex called the exosome has recently been identified (Mitchell, P. et al. (1997), Cell 91, 457-466). The exosome consists of several repeated 3 Z -5 Z -exoribonucleases and is also involved in 3 Z -processing of 5.8S rRNA and 3 7 -5 Z -mRNA degradation (Anderson, JSJ and Parker, R.
(1998) EMBO J. 17, 1497-1506). Není však známo, jestli nějaká z exoribonukleáz exosomu odbourává přednostně póly(A). Kromě toho byl identifikován v kvasinkách protein I (ΡΑΒΙ) závislý na póly(A)-specifické nukleáze (PAN), který váže póly(A) (viz příkladně Lowell, J.E. a spol. (1992) Genes.Dev. 6, 2088-2099). PAN je 3/-5/-exoribonukleáza a je složena nejméně ze dvou polypeptidů Pan2p a Pan3p (viz příkladně Brown, C.E.Jr. a spol. (1996) Mol.Cell.Biol., 16, 5744-5753).(1998) EMBO J. 17, 1497-1506). However, it is not known whether any of the exosome exoribonucleases preferentially degrades Pol(A). In addition, a Pol(A)-specific nuclease (PAN)-dependent protein I (PABΙ) has been identified in yeast that binds Pol(A) (see, for example, Lowell, JE et al. (1992) Genes.Dev. 6, 2088-2099). PAN is a 3 / -5 / -exoribonuclease and is composed of at least two polypeptides, Pan2p and Pan3p (see, for example, Brown, CEJr. et al. (1996) Mol.Cell.Biol., 16, 5744-5753).
V buňkách savců byly identifikovány tři rozdílné aktivity odbourávající póly(A). Příkladně má Hela-buněčná aktivita vysokou selektivitu pro odbourávání 3^-lokalizovaných póly(A)-zbytků, prodlužuje 3Z-lokalizované hydroxylové skupiny a tvoří 5Z-AMP jako mononukleotidický reakční produkt (viz příkladně Astrom, J. a spol. (1992)Three distinct activities have been identified in mammalian cells that degrade poly(A). For example, the Hela-cell activity has high selectivity for degrading 3'-localized poly(A) residues, elongates 3' - localized hydroxyl groups, and forms 5' - AMP as a mononucleotide reaction product (see, for example, Astrom, J. et al. (1992)).
J.Biol.Chem. 267 (25) 18154-18159 a J.Astróm, A.Astrom a A. Virtanen, In vitro deadenylation of mammilian mRNA by a HeLa cell 37-exonuclease, EMBO J., (1991), Vol. 10, 3067). Dále byla popsána Mg -závislá póly(A)-specifická 3 -exoribonukleáza z telecího brzlíku s molekulovou hmotností 80 kDa (Schróder a spol., (1980) J.Biol.Chem. 255 (10) 4535-4538), případně 74 kDa (Kórner, C.G. a Vahle, E. J.Biol.Chem. 272 • · · ·J.Biol.Chem. 267 (25) 18154-18159 and J.Astróm, A.Astrom and A. Virtanen, In vitro deadenylation of mammalian mRNA by a HeLa cell 3 7 -exonuclease, EMBO J., (1991), Vol. 10, 3067). Furthermore, a Mg-dependent poly(A)-specific 3 -exoribonuclease from calf thymus with a molecular weight of 80 kDa (Schróder et al., (1980) J.Biol.Chem. 255 (10) 4535-4538), or 74 kDa (Kórner, CG and Vahle, EJBiol.Chem. 272 • · · ·
t · • · • · • · (16), 10448-10456. Dále byla popsána 3Z-exonukleáza asociovaná s polyribosomy s molekulovou hmotností 33 kDa, která však není specifická pro póly(A) (Caruccio, N. a Ross,J. (1994) J.Biol.Chem. 269 (50), 31814-31821). Z telecího brzlíku byla identifikována další póly(A)-specifická 3-exonukleázová aktivita, která má molekulovou hmotnost 60 kDa. Dodatečně se však ukázalo, že tento protein je hnRNP L-protein a tím nemá žádný vztah k měřené poly(A)-specifické 31-exoribonukleázové aktivitě.t · • · • · · (16), 10448-10456. Furthermore, a 3 Z -exonuclease associated with polyribosomes with a molecular weight of 33 kDa has been described, which is not specific for poly(A) (Caruccio, N. and Ross, J. (1994) J.Biol.Chem. 269 (50), 31814-31821). Another poly(A)-specific 3 Z -exonuclease activity has been identified from calf thymus, which has a molecular weight of 60 kDa. However, it was additionally shown that this protein is an hnRNP L-protein and thus has no relation to the measured poly(A)-specific 3 1 -exoribonuclease activity.
Úkolem předloženého vynálezu proto je dát k dispozici 3/-exoribonukleázu, která specificky odbourává 3' -lokalizované póly(A)-zbytky.It is therefore an object of the present invention to provide a 3'-exoribonuclease which specifically degrades 3'-located pol(A) residues.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Předmětem předloženého vynálezu je proto způsob získávání póly(A)-specifické 3Z-exonukleázové aktivity, zahrnující následující kroky :The subject of the present invention is therefore a method for obtaining poly(A)-specific 3 Z -exonuclease activity, comprising the following steps:
a) výroba surového extraktu ze zvířecích nebo lidských buněka) production of crude extract from animal or human cells
b) srážení proteinu ze surového extraktu, který se získá z kroku a)b) precipitating the protein from the crude extract obtained from step a)
c) chromatografie precipitátu získaného z kroku b) na bázickém aniontoměničic) chromatography of the precipitate obtained from step b) on a basic anion exchanger
d) afinitní chromatografie aktivní frakce z kroku c)d) affinity chromatography of the active fraction from step c)
e) chromatografie aktivní frakce z kroku d) na bázickém aniontoměničie) chromatography of the active fraction from step d) on a basic anion exchanger
f) afinitní chromatografie aktivní frakce z kroku e)f) affinity chromatography of the active fraction from step e)
g) póly(A)-afinitní chromatografie aktivní frakce z kroku f)g) poly(A)-affinity chromatography of the active fraction from step f)
h) chromatografie aktivní frakce z kroku g) na bázickém aniontoměniči a případně • ·h) chromatography of the active fraction from step g) on a basic anion exchanger and optionally • ·
i) gelová filtrace aktivní frakce z kroku g) neboi) gel filtration of the active fraction from step g) or
j) dvojnásobná afinitní chromatografie aktivních frakcí z kroku f).j) double affinity chromatography of the active fractions from step f).
Překvapivě je -exonukleázová aktivita získaná popsaným způsobem specifická pro 31 -lokalizované póla(A)-zbytky, přičemž je nutná 3z-lokalizovaná hydroxylová skupina a jako mononukleotidický reakční produkt se tvoří 5^-AMP. V protikladu k dosud známým 3Z-exonukleázovým aktivitám má 3-exonukleázová aktivita podle vynálezu molekulovou hmotnost asi 50 kDa za podmínek denaturace.Surprisingly, the -exonuclease activity obtained in the described manner is specific for 3 1 -located polo(A)-residues, whereby a 3 z -located hydroxyl group is required and 5'-AMP is formed as the mononucleotide reaction product. In contrast to the previously known 3 Z -exonuclease activities, the 3'-exonuclease activity according to the invention has a molecular weight of about 50 kDa under denaturing conditions.
V protikladu k proteinu 74 kDa z telecího brzlíku se 3Z-exonukleázová aktivita podle vynálezu nestimuluje spermidinem při nízkých koncentracích soli, nýbrž se při nízkých ale i při vysokých koncentracích soli inhibuje.In contrast to the 74 kDa protein from calf thymus, the 3 Z -exonuclease activity of the invention is not stimulated by spermidine at low salt concentrations, but is inhibited at low but also at high salt concentrations.
Navíc interaguje 3^-exonukleáza podle vynálezu na rozdíl od 74 kDa proteinu z telecího brzlíku realeivně silně s heparin-sefarozou. Takový 74 kDa protein se v SDS-Page - obrázek 1B a 2B nenalezne. Proto bylo překvapivé, že na rozdíl od exonukleaázové aktivity z buněk Hela je exonukleáza podle vynálezu aktivní i v přítomnosti Mn . Navíc je překvapivé, že exonukleáza podle vynálezu pracuje procesivně - to znamená, že se exonukleáza váže na 3Z-konce póly(A)-zbytku a opbourává nukleotid po nukleotidu, aniž by se rozpadl exonukleázový póly(A)-komplex - zatímco protein 74 kDa pracuje distributivně, kdy se komplex po jednom pracovním kroku rozpadne a musí se regenerovat.In addition, the 3'-exonuclease according to the invention interacts really strongly with heparin-Sepharose, unlike the 74 kDa protein from calf thymus. Such a 74 kDa protein is not found in SDS-Page - Figure 1B and 2B. It was therefore surprising that, in contrast to the exonuclease activity from Hela cells, the exonuclease according to the invention is active even in the presence of Mn. In addition, it is surprising that the exonuclease according to the invention works processively - that is, the exonuclease binds to the 3' - end of the poly(A) residue and degrades nucleotide by nucleotide without breaking down the exonuclease poly(A) complex - while the 74 kDa protein works distributively, where the complex breaks down after one working step and has to be regenerated.
Póly(A)- speciíická 3^-exonukleázová aktivita podle vynálezu se může s výhodou získávat z brzlíkových buněk ze zvířecích nebo lidských buněk, obzlváště z telecího brzlíku. K tomu se obecně vyrobí celobuněčný extrakt, ze kterého se • · · · • · protein přednostně vysráži pomocí síranu amonného. Koncentrace nasycení přitom s výhodou činí asi 45 % síranu amonného. Jako obzvláště výhodné se přitom ukázalo, jestliže před vlastním srážením proteinu bylo možné srážením oddělit cizí proteiny při koncentraci nasycení s výhodou asi 25 % síranu amonného, takže v následujícím kroku se mohla vysrážet ze zbytku 3^-exonukleázová aktivita při asi 45 koncentraci síranu amonného. Touto frakcionací proteinů se již může oddělit podstatná část nežádoucích cizích proteinů.The poly(A)-specific 3'-exonuclease activity according to the invention can be advantageously obtained from thymus cells from animal or human cells, in particular from calf thymus. For this purpose, a whole-cell extract is generally prepared, from which the protein is preferably precipitated using ammonium sulfate. The saturation concentration is preferably about 45% ammonium sulfate. It has been found to be particularly advantageous if, before the actual protein precipitation, it was possible to separate the foreign proteins by precipitation at a saturation concentration of preferably about 25% ammonium sulfate, so that in the following step the 3'-exonuclease activity can be precipitated from the residue at a concentration of about 45% ammonium sulfate. By this fractionation of the proteins, a substantial part of the unwanted foreign proteins can already be separated.
Následně se provádí chromatografie precipitátu na bázickém iontoměniči, s výhodou na slabě bázickém aniontoměniči, obzvláště na DEAE, jako příkladně na DEAE-sefaroze. Obecně se eluuje aktivní frakce při asi 0,17 M soli, s výhodou jednomocné soli, jako je příkladně chlorid draselný. Následně se provádí afinitní chromatografie eluované a obvykle dialyzované aktivní frakce, s výhodou na heparinu, neboř bylo překvapivě objeveno, že se aktivní frakce obzvláště dobře váže na heparin, příkladně heparin-sefarozu. Aktivní frakce se proto obvykle eluují při vysokých koncentracích solí, jako příkladně 1,0 M jednomocné soli, jako je chlorid draselný. Následně se provádí chromatografie aktivních frakcí na bázickém aniontoměniči, s výhodou na silně bázickém aniontoměniči, obzvláště na Mono X, jako příkkladně Mono X HR 16/10.The precipitate is then chromatographed on a basic ion exchanger, preferably a weakly basic anion exchanger, in particular DEAE, such as DEAE-Sepharose. The active fraction is generally eluted at about 0.17 M salt, preferably a monovalent salt, such as potassium chloride. The eluted and usually dialyzed active fraction is then chromatographed, preferably on heparin, because it has surprisingly been found that the active fraction binds particularly well to heparin, such as heparin-Sepharose. The active fractions are therefore usually eluted at high salt concentrations, such as 1.0 M monovalent salt, such as potassium chloride. The active fractions are then chromatographed on a basic anion exchanger, preferably a strongly basic anion exchanger, in particular Mono X, such as Mono X HR 16/10.
S výhodou se proteiny eluují s pomocí lineárního gradientu, přičemž aktivní frakce se mohou eluovat při asi 10 %-ní koncentraci soli asi 1,0 M, obzvláště jednomocné soli, jako je chlorid draselný. Potom se provádí afinitní chromatografie aktivních frakcí, s výhodou na barvivu, obzvláště na modrém barvivu, především na Blue-sefaroze.Preferably, the proteins are eluted using a linear gradient, whereby the active fractions can be eluted at about 10% of a salt concentration of about 1.0 M, in particular a monovalent salt such as potassium chloride. The active fractions are then subjected to affinity chromatography, preferably on a dye, in particular on a blue dye, in particular on Blue-Sepharose.
S výhodou se proteiny eluují s pomocí vícestupňového, obzvláště dvoustupňového gradientu soli, přičemž aktivní • · • · · · frakce dobře eluují s výhodou při vysokých koncentracích solí, obzvláště při vysokých koncentracích jednomocných solí, především při asi 1,0 M, jako příkladně 1,0 M chloridu draselného.Preferably, the proteins are eluted using a multi-step, in particular two-step salt gradient, with the active fractions eluting well preferably at high salt concentrations, in particular at high concentrations of monovalent salts, in particular at about 1.0 M, such as 1.0 M potassium chloride, for example.
Podle předloženého vynálezu se následně provádí afinitní chromatografie póly(A), přičemž aktivní frakce se eluují při asi 0,35 až asi 0,55 M soli, obzvláště jednomocné soli, jako je chlorid draselný. Tak se provádí způsobem podle vynálezu chromatografie aktivních frakcí na dalším bázickém aniontoměniči, s výhodou na silně bázickém aniontoměniči, obzvláště na Mono X, jako Smart Mono X.According to the present invention, affinity chromatography is then carried out with pole(A), the active fractions being eluted at about 0.35 to about 0.55 M salt, in particular a monovalent salt such as potassium chloride. Thus, the process according to the invention carries out chromatography of the active fractions on a further basic anion exchanger, preferably on a strongly basic anion exchanger, in particular on Mono X, such as Smart Mono X.
Přitom se aktivita s výhodou eluuje při asi 0,17 M soli, obzvláště jednomocné soli, jako je chlorid draselný. Jako poslední čistící krok se provádí způsobem podle vynálezu případně gelová filtrace aktivních frakcí, s výhodou gelová filtrace na Superdex 200, obzvláště gelová filtrace na Smart Superdex 200, přičemž obecně jsou aktivní frakce dobře frakcionovatelné v přítomnosti asi 0,1 M soli, obzvláště jednomocné soli, jako je příkladně chlorid draselný.The activity is preferably eluted at about 0.17 M salt, in particular a monovalent salt, such as potassium chloride. As a final purification step, the method according to the invention optionally carries out gel filtration of the active fractions, preferably gel filtration on Superdex 200, in particular gel filtration on Smart Superdex 200, whereby the active fractions are generally easily fractionable in the presence of about 0.1 M salt, in particular a monovalent salt, such as potassium chloride, for example.
Způsobem podle vynálezu je možné vyčistit póly(A)/ specifickou 3 -exonukleázovou aktivitu asi 600-násobně s výtěžkem asi 13 % (viz tabulku 1). Přitom je obzvláště překvapivé, že afinitní chromatografie póly(A) podle kroku (d) poskytuje asi 14-ti násobné čištění aktivity podle vynálezu.The method according to the invention allows the purification of the Pol(A)/specific 3-exonuclease activity by about 600-fold with a yield of about 13% (see Table 1). It is particularly surprising that the affinity chromatography of Pol(A) according to step (d) provides an approximately 14-fold purification of the activity according to the invention.
V dalších formách provedení se proteiny po chromatografii na barvivu podrobí dvojnásobné afinitní chromatografii, s výhodou na ssDNA agarose s následnou 5^AMP sefarozou. Aktivní frakce se obvykle eluují při vysokých koncentracích solí, jako příkladně asi 2,0 • · · ·In other embodiments, the proteins are subjected to double affinity chromatography, preferably on ssDNA agarose followed by 5^AMP sepharose, after dye chromatography. Active fractions are usually eluted at high salt concentrations, such as about 2.0 • · · ·
Μ jednomocné soli, jako je chlorid draselný.Μ monovalent salts, such as potassium chloride.
Na základě způsobu podle vynálezu se nyní získá póly(A)-specifická 3^-exonukleázová aktivita, která za podmínek denaturace, příkladně v gelu SDS-PAGE probíhá při asi 50 kDA a za nativních podmínek, příkladně na Superdexu 200, při asi 180 až 220 kDa.Based on the method according to the invention, a poly(A)-specific 3'-exonuclease activity is now obtained which, under denaturing conditions, for example in an SDS-PAGE gel, occurs at about 50 kDa and under native conditions, for example on Superdex 200, at about 180 to 220 kDa.
Proto se vynález rovněž týká asi 50 kDa proteinu a případně asociáty (tetramer), který má póly(A)-specifickou exonukleázovou aktivitu, které se získají způsobem podle vynálezu.Therefore, the invention also relates to an approximately 50 kDa protein and optionally an associate (tetramer) having poly(A)-specific exonuclease activity, which are obtained by the method of the invention.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je proto přípravek obsahující póly(A)-specifickou 3Z-exonukleázovou aktivitu, která se získá způsobem podle vynálezu. Přípravek případně obsahuje další přísady a pomocné látky.Another object of the present invention is therefore a preparation containing poly(A)-specific 3 Z -exonuclease activity, which is obtained by the method according to the invention. The preparation optionally contains further additives and excipients.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je způsob deadenylace nukleových kyselin, obzlváště deadenylace 3Z-lokalizovaných póly(A)-zbytků s výhodou mRNA v přítomnosti přípravku podle vynálezu. S výhodou se provádí deadenylační reakce v přítomnosti jednomocných kationtů, jako příkladně K+ a/nebo NaT, obzvláště při koncentraci jednomocného kationtu asi 0,1 M. Dále je výhodné, jestliže se deadenylační reakce provádí při pH hodnotě asi 7.Another subject of the present invention is a method for the deadenylation of nucleic acids, in particular the deadenylation of 3 Z -localized poly(A) residues, preferably mRNA, in the presence of a preparation according to the invention. The deadenylation reaction is preferably carried out in the presence of monovalent cations, such as K + and/or Na T , in particular at a monovalent cation concentration of about 0.1 M. It is further preferred that the deadenylation reaction is carried out at a pH of about 7.
Další předmět předloženého vynálezu se týká protilátek, které specificky reagují s přípravky podle vynálezu a/nebo s některou komponentou, přičemž přípravek je buďto sám imunogenní nebo se stane imunogenním vazbou na vhodné nosiče, jako je příkladně bovinní serumalbumin, případně se • · ·»·· · ·· ·· ·· » · ··»· ··· • · · · · · · • · * ····· • · · · · · · • · · · « ···«»·· «· · 9 jeho imunogenita může zvyšovat.Another subject of the present invention relates to antibodies that specifically react with the preparations according to the invention and/or with a component, the preparation being either immunogenic itself or becoming immunogenic by binding to suitable carriers, such as, for example, bovine serum albumin, or its immunogenicity may be increased.
Protilátky jsou buďto polyklonální nebo monoklonální. Jejich výroba, která rovněž představuje předmět předloženého vynálezu se příkladně provádí obecně známými metodami imunisováním zvířecího savce, příkladně králíka přípravkem podle vynálezu, případně v přítomnosti příkladně Freundova adjuvantu a/nebo gelů hydroxidu hlinitého (viz příkladně Diamond, B.A. a spol. (1981) The New England Journal of Nedicine, 1344). Polyklonální protilátky vzniklé ve zvířeti na základě imunologické reakce se mohou následně snadno izolovat z krve obecně známými metodami a vyčistit případně sloupcovou chromatografií. Výhodné je afinitní čištění protilátek, při kterém se případně přípravek podle vynálezu váže na NHS aktivovaném HiTrap-sloupci.The antibodies are either polyclonal or monoclonal. Their production, which also constitutes the subject of the present invention, is carried out, for example, by generally known methods by immunizing an animal mammal, for example a rabbit, with the preparation according to the invention, optionally in the presence of, for example, Freund's adjuvant and/or aluminum hydroxide gels (see, for example, Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Nedicine, 1344). The polyclonal antibodies formed in the animal as a result of the immunological reaction can then be easily isolated from the blood by generally known methods and purified optionally by column chromatography. Affinity purification of the antibodies is preferred, in which the preparation according to the invention is optionally bound to an NHS-activated HiTrap column.
Monoklonální protilátky se mohou příkladně vyrábět známou metodou Vinter a Milstein (Vinter,G., Milstein,C. (1991) Nátuře, 349, 293).Monoclonal antibodies can be produced, for example, by the known method of Vinter and Milstein (Vinter, G., Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293).
Dalším předmětem předloženoho vynálezu je také léčivo, které obsahuje přípravek podle vynálezu a případně vhodné přísady a pomocné látky a způsob výroby léčiva k ošetřování rakoviny, autoimunitních nemocí, obzvláště Multiple Sklerose nebo Rheumatoide Arthritis, Alzheimerovy nemoci, alergií, obzvláště neurodermitis, alergií typu I nebo IV,, arthrosy, atherosklerosy, osteoporesy, akutních a chronických infekčních onemocnění a/nebo diabetes a/nebo k ovlivnění buněčného metabolismu, obzvláště při imunosupresi, především při transplantacích, pro které se formuluje přípravek podle vynálezu s farmaceuticky akceptovatelnými přísadami a/nebo pomocnými látkami.Another subject of the present invention is also a medicament which contains the preparation according to the invention and optionally suitable additives and excipients and a method for producing the medicament for the treatment of cancer, autoimmune diseases, in particular Multiple Sclerosis or Rheumatoid Arthritis, Alzheimer's disease, allergies, in particular neurodermatitis, allergies type I or IV, arthrosis, atherosclerosis, osteoporosis, acute and chronic infectious diseases and/or diabetes and/or for influencing cellular metabolism, in particular in immunosuppression, especially in transplantations, for which the preparation according to the invention is formulated with pharmaceutically acceptable additives and/or excipients.
• · · ·• · · ·
Jako vhodné přísady a/nebo pomocné látky jsou příkladně vhodné roztok chloridu sodného, stabilizátory, inhibitory proteinázy atd.Suitable additives and/or excipients include, for example, sodium chloride solution, stabilizers, proteinase inhibitors, etc.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je také diagnostikům obsahující přípravek podle vynálezu a případně vhodné přísady a pomocné látky a způsob výroby diagnostika k diagnóze rakoviny, autoimunitních nemocí, obzvláště Multiple Sklerose nebo Rheumatoide Arthritis, Alzheimerovy nemoci, alergií, obzvláště neurodermitis, alergií typu I nebo IV,, arthrosy, atherosklerosy, osteoporesy, akutních a chronických infekčních onemocnění a/nebo diabetes a/nebo k analýze buněčného metabolismu, obzvláště při imunostatu, především při transplantacích, pro které se formuluje přípravek podle vynálezu s farmaceuticky akceptovatelnými přísadami a/nebo pomocnými látkami.Another subject of the present invention is also diagnostics containing the preparation according to the invention and optionally suitable additives and auxiliaries and a method of producing diagnostics for the diagnosis of cancer, autoimmune diseases, in particular Multiple Sclerosis or Rheumatoid Arthritis, Alzheimer's disease, allergies, in particular neurodermatitis, allergies type I or IV, arthrosis, atherosclerosis, osteoporosis, acute and chronic infectious diseases and/or diabetes and/or for the analysis of cellular metabolism, in particular in immunostatus, especially in transplantations, for which the preparation according to the invention is formulated with pharmaceutically acceptable additives and/or auxiliaries.
Podle předloženého vynálezu se může příkladně přípravek podle vynálezu vázat na pevnou fázi, příkladně na nitrocelulozu nebo nylon a tak se příkladně uvést v in-vitro kontakt s vyšetřovanou tělesnou kapalinou, příkladně krví, a tak příkladně moci reagovat s autoimunními protilátkami. Komplex protilátka-peptid se může následně prokázat příkladně značkovanými antihumáními IgG- nebo IgM-protilátkami. Při značkování se příkladně jedná o enzym, jako peroxidázu, která katalyzuje barevnou reakci. Přítomnost a množství přítomných autoimunních protilátek se tak může barevnou reakcí sandno a rychle prokázat.According to the present invention, for example, the preparation according to the invention can be bound to a solid phase, for example to nitrocellulose or nylon, and thus, for example, be brought into in-vitro contact with the body fluid to be examined, for example blood, and thus, for example, be able to react with autoimmune antibodies. The antibody-peptide complex can then be detected, for example, by labeled anti-human IgG or IgM antibodies. The labeling is, for example, an enzyme, such as peroxidase, which catalyzes a color reaction. The presence and amount of autoimmune antibodies present can thus be detected easily and quickly by a color reaction.
Další diagnostikům obsahuje samotné protilátky podle vynálezu. S pomocí těchto protilátek se může příkladně snadno a rychle vyšetřovat vzorek lidského tkaniva, jestliže je k dispozici přípravek podle vynálezu a/nebo některá jeho • * • · · 9 · · · « «····«· · « « · komponenta. V tomto případě jsou protilátky podle vynálezu značkovány příkladně enzymem, jak se popisuje výše. Specifický komplex protilátka-peptid se tak může snadno a rychle prokázat enzymatickou barevnou reakcí.Another diagnostic contains the antibodies according to the invention themselves. With the help of these antibodies, a human tissue sample can be examined easily and quickly, for example, if the preparation according to the invention and/or one of its components is available. In this case, the antibodies according to the invention are labeled, for example, with an enzyme, as described above. The specific antibody-peptide complex can thus be easily and quickly detected by an enzymatic color reaction.
Další předmět předloženého vynálezu se týká také testu k identifikaci funkčních interaktorů, jako příkladně inhibitorů nebo stimulátorů, obsahujících přípravek podle vynálezu nebo protilátky podle vynálezu a případně vhodné přísady nebo pomocné látky. K tomu se použijí vybrané substance příkladně z tak zvané Chemical library v již výše popsané deadenylační reakci a měří se aktivita přípravků podle vynálezu v přítomnosti případně nepřítomnosti substancí. Jako substráty jsou příkladně vhodné mRNA nebo póly(A). Test se může příkladně provádět analogicky in-vitro deanedylací, jak se blíže popisuje v příkladech.Another subject of the present invention also relates to a test for the identification of functional interactors, such as inhibitors or stimulators, comprising a preparation according to the invention or antibodies according to the invention and optionally suitable additives or auxiliaries. For this purpose, selected substances are used, for example, from the so-called Chemical library in the deadenylation reaction already described above, and the activity of the preparations according to the invention is measured in the presence or absence of the substances. Suitable substrates are, for example, mRNA or pol(A). The test can be carried out, for example, analogously to in-vitro deadenylation, as described in more detail in the examples.
Další obecnou možností použití přípravků podle vynálezu je proto také póly-(A) specifické odbourání nukleových kyselin, obzvláště mRNA. Póly-(A) specifické odbourání nukleových kyselin se může uplatnit obzvláště ve výzkumných laboratořích.Another general application of the preparations according to the invention is therefore also the poly-(A)-specific degradation of nucleic acids, in particular mRNA. The poly-(A)-specific degradation of nucleic acids can be used in particular in research laboratories.
Dále uvedené tabulky, obrázky a příklady slouží k bližšímu vysvětlení vynálezu, aniž by jej omezovaly.The following tables, figures and examples serve to further explain the invention without limiting it.
Přehled obrázků na výkresechOverview of images in drawings
Obrázek 1 ukazuje přehled čištění bovinní póly(A)specifické 31 -exo-nukleázové aktivity. Aktivita deadenylace se kvantifikuje inkubací chromatografické frakce se substrátem L3(A.jq)RNA, který se během in-vitro transkripce a o značkuje pomocí [α- P] ATP za podmínek pro deadenylaci • · · · in-vitro. Jedna Unit je definována jako uvolnění 1 pmol AMP za minutu.Figure 1 shows an overview of the purification of bovine poly(A)-specific 3 1 -exo-nuclease activity. Deadenylation activity is quantified by incubating the chromatographic fraction with the substrate L3(A.jq)RNA, which is labeled with [α-P] ATP during in-vitro transcription under in-vitro deadenylation conditions. One Unit is defined as the release of 1 pmol AMP per minute.
Tabulka 1Table 1
Tabulka II ukazuje substrátovou specifiku póly(A)specifické 3-exonukleázové aktivity.Table II shows the substrate specificity of the pol(A)-specific 3-exonuclease activity.
Tabulka IITable II
Obrázek 1A ukazuje identifikaci polypeptidů 50 kDa pomocí SMART Mono Q-chromatografie. Přitom se poly(A)• · sefarozová frakce frakcionuje SMART-mono Q-chromatografií a získané frakce se spolu s s jednotně značeným substrátem RNA L3 (A^q) inkubují za podmínek in-vitro deadenylace po dobu 90 minut. Reakční produkty se frakcionují elektrofořežou v gelu 10 %-ního polyakrylamidu : bisakrylamidu 19 : 1 - 7 M močoviny. Výsledný fluorogram je znázorněn na obrázku 1A. Stopa S znamená substrát RNA inkubovaný v nepřítomnosti frakce. Stopa Load MQ znamená RNA substrát inkubovaný s póly(A)-sefarozovou frakcí. Stopy 6 až 18 znamenají RNA substrát inkubovaný v přítomnosti získaných frakcí. Byly značkovány pouze sudé frakce.Figure 1A shows the identification of 50 kDa polypeptides using SMART Mono Q-chromatography. In this, the poly(A)• · sepharose fraction is fractionated by SMART-mono Q-chromatography and the obtained fractions are incubated with the uniformly labeled RNA substrate L3 (A^q) under in-vitro deadenylation conditions for 90 minutes. The reaction products are fractionated by electrophoresis in a 10% polyacrylamide:bisacrylamide 19:1-7 M urea gel. The resulting fluorogram is shown in Figure 1A. Lane S represents the RNA substrate incubated in the absence of the fraction. Lane Load MQ represents the RNA substrate incubated with the poly(A)-sepharose fraction. Lanes 6 to 18 represent the RNA substrate incubated in the presence of the obtained fractions. Only even-numbered fractions were labeled.
Obrázek 1B ukazuje SDS-Page SMART-Mono Q-frakcí.Figure 1B shows SDS-Page of SMART-Mono Q-fractions.
Přitom se separují alikvoty frakcí na SDS-Page. Výsledný gel se vybarví stříbrem. Čísla frakcí jsou uvedena.Aliquots of the fractions are separated on SDS-Page. The resulting gel is stained with silver. The fraction numbers are indicated.
Značkují se pouze sudé frakce. Markéry molekulové hmotnosti se se vydělí do stopy M. Čísla na levé straně udávají molekulové hmotnosti značkovacích proteinů v kDa.Only even fractions are labeled. Molecular weight markers are divided into the M trace. The numbers on the left indicate the molecular weights of the labeling proteins in kDa.
Obrázek 2A ukazuje identifikaci polypeptidu 50 kDa chromatografií SMART Superdex 200. Získané frakce se spolu s jednotně značkovaným RNA-substrátem L3 (Α^θ) za podmínek dedenylace in-vitro inkubují po dobu 120 minut. Reakční produkty se frakcionují na 10 %-ním polyakrylamidu : bisakrylamidu 19 : 1 - 7 močovinovém gelu. Výsledný fluorogram je zobrazen na obrázku 2. Stopa L3 (Α^θ) ukazuje substrát RNA, inkubovaný v nepřítomnosti jedné frakce.Figure 2A shows the identification of the 50 kDa polypeptide by SMART Superdex 200 chromatography. The obtained fractions were incubated with the uniformly labeled RNA substrate L3 (Α^θ) under in vitro deadenylation conditions for 120 minutes. The reaction products were fractionated on a 10% polyacrylamide:bisacrylamide 19:1-7 urea gel. The resulting fluorogram is shown in Figure 2. The L3 (Α^θ) trace shows the RNA substrate incubated in the absence of one fraction.
Stopa Load ukazuje RNA-substrát s mono-Q-koncentrovanou póly(A)-sefarozovou frakcí. Stopy 15 až 25 ukazují RNA-substrát inkubovaný v přítomnosti získaných frakcí.The Load trace shows the RNA substrate with the mono-Q-concentrated poly(A)-Sepharose fraction. Lanes 15 to 25 show the RNA substrate incubated in the presence of the recovered fractions.
S a P ukazují místa doběhu RNA-substrátu (S) a produktu (P). Eluční profily markéru molekulové hmotnosti ke kalibraci sloupce Superdex 200 jsou znázorněny nahoře.S and P indicate the run-off points of RNA substrate (S) and product (P). The elution profiles of the molecular weight marker for calibrating the Superdex 200 column are shown above.
• · · ·• · · ·
Obrázek 2B ukazuje SDS-PAGE frakcí SMART Superdex 200. Výsledný gel se vybarví stříbrem. Jsou uvedena čísla frakcí. Byly značkovány pouze sudé frakce. Markér molekulové hmotnosti se separuje ve stopě M. Čísla na levé straně udávaj í molekulovou hmotnost proteinového markéru v kDa.Figure 2B shows SDS-PAGE of SMART Superdex 200 fractions. The resulting gel is stained with silver. Fraction numbers are indicated. Only even fractions were labeled. The molecular weight marker is separated in the M trace. The numbers on the left indicate the molecular weight of the protein marker in kDa.
Obrázek 2C ukazuje afinitní frakcionaci 5 AMP sefarozy 4B na specifickou póly(A)-exonukleázovou aktivitu. Značkované frakce se inkubují po dobu 5 minut s radioaktivním RNA substrátem L3 (A30). Reakční produkty se frakcionují na 10 %-ním polyakrylamidu : bisakrylamidu 19 : 1 - 7 močovinovém gelu. Výsledný fluorogram je zobrazen na obrázku 2C. Ve stopě A se inkubuje substrát RNA s afinitou 5 AMP sefarozy 4E čištěné exonukleázy. Ve stopě se inkubuje v nepřítomnosti aktivní frakce pouze pufr.Figure 2C shows affinity fractionation of 5 AMP Sepharose 4B for specific poly(A)-exonuclease activity. Labeled fractions are incubated for 5 minutes with radioactive RNA substrate L3 (A30). The reaction products are fractionated on a 10% polyacrylamide:bisacrylamide 19:1-7 urea gel. The resulting fluorogram is shown in Figure 2C. In lane A, RNA substrate with affinity of 5 AMP Sepharose 4E purified exonuclease is incubated. In lane B, only buffer is incubated in the absence of active fraction.
Obrázek 2D ukazuje SDS-Page afinitní chromatografie 5 AMP na sefaroze 4B. Výsledný gel se vybarví stříbrem. Čísla frakcí jsou uvedena. Značkují se pouze sudé frakce. Markéry molekulové hmotnosti se se vydělí do stopy M. Čísla na levé straně udávají molekulové hmotnosti značkovacích proteinů v kDa.Figure 2D shows SDS-Page affinity chromatography of 5 AMP on Sepharose 4B. The resulting gel is stained with silver. Fraction numbers are indicated. Only even fractions are labeled. Molecular weight markers are divided into the M trace. The numbers on the left indicate the molecular weights of the labeling proteins in kDa.
Obrázek 3 ukazuje specifitu exonukleázy pro 3 -konce lokalizovaných póly(A)-zbytků. Póly(A)-sefarozové frakce se inkubují za podmínek in-vitro deadenylace po dobu 0, 5, 10, 20, 30, 60 nebo 90 minut, jak je uvedeno, spolu s RNA substrátem L3 (A^n) , L3 (Aon)X-ií:, L3 (A-jr))X^n a L3Figure 3 shows the specificity of the exonuclease for 3'-end localized poly(A)-residues. Poly(A)-Sepharose fractions are incubated under in vitro deadenylation conditions for 0, 5, 10, 20, 30, 60 or 90 minutes, as indicated, together with the RNA substrates L3(A^n), L3(Aon)X-ií:, L3(A-jr))X^ n and L3
30' ’ ' 30' 15’ ^30^49 jak je uvedeno. Reakční produkty se frakcionují bisakrylamidu 19 : 1 - 7 Výsledný fluorogram je zobrazen (Α3θ)χΐ64 na 10 %-ním polyakrylamidu molárním močovinovém gelu.30'''30'15' ^30^49 as indicated. The reaction products are fractionated with bisacrylamide 19 : 1 - 7 The resulting fluorogram is displayed ( A 3θ) χ ΐ64 on a 10% polyacrylamide molar urea gel.
na obrázku 3. S a P ukazují místa doběhu RNA-substrátu (S) a produktu (P).in Figure 3. S and P indicate the RNA substrate (S) and product (P) run-off sites.
Obrázek 4 ukazuje reakční produkt 51-AMP uvolněný během deadenylace. Póly(A)-sefarozová frakce se inkubuje za podmínek in-vitro deadenylace po dobu 20 minut spolu s RNA substrátem L3 (Ajq), který se během in-vitro transkripce značkuje pomocí [a-^^P]ATP. 3 μΐ reakce se podrobí 2-D TLC.Figure 4 shows the reaction product 5 1 -AMP released during deadenylation. The poly(A)-Sepharose fraction is incubated under in vitro deadenylation conditions for 20 minutes with the RNA substrate L3 (Ajq), which is labeled with [α-^^P]ATP during in vitro transcription. 3 μΐ of the reaction is subjected to 2-D TLC.
Výsledný autoradiogram na vysušené PEI celulozové desce ukazuje obrázek 4. Jsou zobrazena místa doběhu 2Z-AMP,The resulting autoradiogram on a dried PEI cellulose plate is shown in Figure 4. The 2 Z -AMP run-off sites are shown,
-AMP a 5/-AMP markérů, které se oddělí spolu s radioaktivními vzorky.-AMP and 5/-AMP markers, which are separated together with the radioactive samples.
Obrázky 5 A-C ukazují pokračující odbourávání póly(A). Póly(A)-sefarozová frakce se inkubuje s X fmol RNA-substrátu L3 (A^q), který se během in-vitro transkripceFigures 5 A-C show the ongoing degradation of poly(A). The poly(A)-Sepharose fraction is incubated with X fmol of RNA substrate L3 (A^q), which is produced during in-vitro transcription.
Λ značkuje pomocí [a-^PjUTP za podmínek in-vitro dedenylace. Reakční produkty se frakcionují na 10 %-ním polvakrvlamidu : bisakrylamidu 19 : 1 - 7 močovinovém gelu. Výsledný fluorogram je zobrazen na obrázku 5 A-C. S a P ukazují místa doběhu RNA-substrátu (S) a produktu (P). Přitom ukazuje obrázek 5A reakce, které se provádějí v přítomnosti 0,5 μΐ póly(A)-sefarozovýcb frakcí a k uvedeným dobám se terminují. Obrázek 5B ukazuje reakce, které se provádějí v přítomnosti 0,5 μΐ póly(A)-sefarozových frakcí a terminují se po 20 minutách. Uvedená množství póly(A) v ng se přidají k reakcím. Obrázek 5C ukazuje reakce, které se provádějí v přítomnosti uvedeného množství póly(A)-sefarozových frakcí v μΐ a terminují se po 20 minutách.Λ is labeled with [α-^P]UTP under in vitro deadenylation conditions. The reaction products are fractionated on a 10% polyacrylamide:bisacrylamide 19:1-7 urea gel. The resulting fluorogram is shown in Figure 5 A-C. S and P indicate the run-off points of the RNA substrate (S) and product (P). Figure 5A shows reactions that are carried out in the presence of 0.5 μΐ poly(A)-Sepharose fractions and terminated at the indicated times. Figure 5B shows reactions that are carried out in the presence of 0.5 μΐ poly(A)-Sepharose fractions and terminated after 20 minutes. The indicated amounts of poly(A) in ng are added to the reactions. Figure 5C shows reactions that are carried out in the presence of the indicated amount of poly(A)-Sepharose fractions in μΐ and are terminated after 20 minutes.
Obrázek 6A :Figure 6A:
SGS-PAGE pro experiment zpětného procesu podle Dayle A.SGS-PAGE for the reverse process experiment according to Dayle A.
• · · ·• · · ·
Hager, Richard R. Burgess, Anal. Biochem (1980), 109, 76. Výsledný gel se vybarví stříbrem. Čísla na levé straně udávají molekulové hmotnosti značkovacích proteinů v kDa. Výsledné pásy se vyříznou, jak je uvedeno v na obrázku 6A (A, 110, B, C, D a E).Hager, Richard R. Burgess, Anal. Biochem (1980), 109, 76. The resulting gel is stained with silver. The numbers on the left indicate the molecular weights of the tag proteins in kDa. The resulting bands are excised as shown in Figure 6A (A, 110, B, C, D and E).
Obrázek 6B :Figure 6B:
Denaturovaný RNA-polyakrylamidový gel : kousky gelu získané v obrázku 6A se eluují podle Hager a spol. Získané eluované proteiny se inkubují se substrátem L3(A^q) podle příkladu 9 a reakční násady se oddělí na polyakrylamidovém gelu. Aktivita byla prokázána v kousku gelu C (asi 50 kDa).Denatured RNA-polyacrylamide gel: The gel pieces obtained in Figure 6A were eluted according to Hager et al. The eluted proteins obtained were incubated with the substrate L3(A^q) according to Example 9 and the reaction batches were separated on a polyacrylamide gel. Activity was demonstrated in gel piece C (about 50 kDa).
Obrázek 7 ukazuje chromatografické kroky způsobu podle vynálezu.Figure 7 shows the chromatographic steps of the method according to the invention.
Zkratky použité v textu :Abbreviations used in the text:
L3 póly(A)-sítě pozdní oblasti humáního adenoviru 2 (délka : 54 nukleotidů (J.Astróm, A.Astrom a A. Virtanen, In vitro deadenylation of mammilian mRNA by a HeLa cell 3Z-exonuclease, EMBO, (1991), Vol. 10, 3067)L3 poly(A)-networks of the late region of human adenovirus 2 (length: 54 nucleotides (J.Astróm, A.Astrom and A. Virtanen, In vitro deadenylation of mammalian mRNA by a HeLa cell 3 Z -exonuclease, EMBO, (1991), Vol. 10, 3067)
Xn n-nukleotidy (A, G, T, C)X n n-nucleotides (A, G, T, C)
Příklady provedení vynálezuExamples of embodiments of the invention
Příklad 1Example 1
Výroba extraktů neobsahuj ících buňky • · ···· · ·· · · 4 4 ·· 4 4 4*4 · 4 · 4Production of cell-free extracts • · ···· · ·· · · 4 4 ·· 4 4 4*4 · 4 · 4
-1 ζζ ·4 4 4 4 * 4 4 iO 4* 4 4 444444 • 4 44 4444 •444 4 444 4444 4· 44-1 ζζ ·4 4 4 4 * 4 4 iO 4* 4 4 444444 • 4 44 4444 •444 4 444 4444 4· 44
Surový extrakt celých buněk se vyrobí z telecího brzlíku podle Vahle, E. (1991) J.Biol.Chem. 266, 3131-3139.Crude whole cell extract was prepared from calf thymus according to Vahle, E. (1991) J.Biol.Chem. 266, 3131-3139.
K tomu se 3 až 15 kg mraženého telecího brzlíku nataje na ledu, nařeže na kousky a homogenizuje se v přibližně stejném objemovém množství pufru 1 (50 mM Tris-HCl, 10 mM K3PO4, mM EDTA, 10 % glycerinu, 50 mM KC1, 0,1 mM DTT, pH 7,9) ve Varing-Blender po dobu 50 sekund při nízké rychlosti a po dobu 50 sekund při vysoké rychlosti. Pevný materiál se sráží centrifugací v Sorwall GSA-Rotor při 16000 g při teplotě 4 °C po dobu 60 minut. Surový extrakt se následně filtruje sítem s velikostí ok 7 - normál (Pascal Eng.Co. Ltd.), přidá se 0,134 g/ml síranu amonného (25 % sycení), hodiny se míchá na ledu a precipitát se sráží centrifugací v Sorwall GSA-Rotor při 16000 g při teplotě 4 °C po dobu 60 minut. Ke zbytku se přidá dalších 0,115 g/ml síranu amonného (45 % sycení) a zpracuje se stejně, jak se popisuje výše. Pelety získané po centrifugací se rozpustí v 2 až 4 objemech pufru D (20 mM HEPES (KOH), 100 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 20 % glycerinu, pH 8,2) a dialyzuje se po dobu 10 hodin při teplotě 4 °C v dialyzační trubici s vylučovací hranicí molekulové hmotnosti 6000 až 8000. Po dialyze se 45 % frakce ze síranu amonného (A.S. 45) zamrazí v kapalném dusíku a skladuje se při teplotě -70 °C.For this purpose, 3 to 15 kg of frozen calf thymus is thawed on ice, cut into pieces and homogenized in approximately the same volume of buffer 1 (50 mM Tris-HCl, 10 mM K3PO4, mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM KCl, 0.1 mM DTT, pH 7.9) in a Varing-Blender for 50 seconds at low speed and for 50 seconds at high speed. The solid material is precipitated by centrifugation in a Sorwall GSA-Rotor at 16,000 g at 4 °C for 60 minutes. The crude extract is then filtered through a 7-normal mesh sieve (Pascal Eng.Co. Ltd.), 0.134 g/ml ammonium sulfate (25% saturation) is added, stirred on ice for hours and the precipitate is precipitated by centrifugation in a Sorwall GSA-Rotor at 16,000 g at 4°C for 60 minutes. A further 0.115 g/ml ammonium sulfate (45% saturation) is added to the residue and processed as described above. The pellets obtained after centrifugation are dissolved in 2 to 4 volumes of buffer D (20 mM HEPES (KOH), 100 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 20% glycerin, pH 8.2) and dialyzed for 10 hours at 4 °C in a dialysis tube with a molecular weight cut-off of 6000 to 8000. After dialysis, the 45% ammonium sulfate fraction (AS 45) is frozen in liquid nitrogen and stored at -70 °C.
Při výchozí hmotnosti 4,5 kg telecího brzlíku obsahuje A.S. 45 frakce (asi 960 ml) asi 68 mg proteinu na ml, což poskytne celkové množství 65 mg proteinu. Koncentrace proteinu se stanoví pomocí Biorad-Protein-Assay-Kit (č.With a starting weight of 4.5 kg calf thymus, the A.S. 45 fraction (about 960 ml) contains about 68 mg protein per ml, which gives a total amount of 65 mg protein. The protein concentration is determined using the Biorad-Protein-Assay-Kit (No.
500-0001) s boviním gama-globulinem jako referenční substancí .500-0001) with bovine gamma-globulin as reference substance.
• · • · · · ♦ ·• · • · · · ♦ ·
Příklad 2Example 2
Dílčí čištění póly(A)-specifické 3^ -exonukleázové aktivityPartial purification of pol(A)-specific 3^-exonuclease activity
K dílčímu čištění se vychází z 960 ml surové A.S. 45 frakce (65 g proteinu) (viz tabulka 1). Provedou se dvě v podstatě stejné chromatografie s DEAE-sefarozou. Při první se ke 160 ml A.S.45 extraktu k DEAE-sefaroze CL-6B (Pharmacia Nr. 10-0710-01) přidá iontoměnič (240 ml sbalené matrice), který byl ekvilibrován pufrem D. Suspenze se pomalu míchá po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Nevázaný materiál se odstraní trojnásobným promytím pufrem D a následnou centrifugací (Sorwall H 4000-Rotor při 800 otáčkách po dobu 3 minuty). DEAE sefarozová matrice se potom uvede na sloupec (průměr 50 mm) a promyje se pufrem s průtokem 9 cm za hodinu. Provede se dvoustupňový gradient soli (pufr D s 0,17 M případně 1,0 M KC1) a eluovaný protein s shromáždí. Dalších 800 ml frakce A.S. 45 se frakcionuje stejným způsobem. V tomto případě se však použije 240 ml balené DEAE-sefarozy a sloupec o průměru 70 mm. Protein eluovaný při 0,17 M KC1, označený jako frakce II se dialyzuje proti pufru D po dobu 10 hodin, zamrazí se v kapalném dusíku a skladuje se při teplotě -70 °C. Následně se frakce II frakcionuje přes heparin-sefarozu CI-6B (Pharmacia Nr. 17-0467-01)-chromatografie. Sloupec s objemem lože 100 ml a průměrem 50 mm se ekvilibruje pufrem D při průtoku 9 cm za hodinu. Provedou se dvě v podstatě stejné frakcionace na heparin-sefaroze. Frakce II (210 ml) se nanese na sloupec heparin-sefarozy CI-6B s průtokem 9 cm za hodinu. Poté, co se eluuje nevázaný materiál se eluuje vázaný protein promytím sloupce pufrem D s 1,0 M KC1. K oddělení zbytku frakce II (270 ml) se použije další sloupec heparin-sefarozy. Eluované frakce (označené jako IIB) se dialyzují proti pufruThe partial purification is based on 960 ml of crude A.S. 45 fraction (65 g protein) (see Table 1). Two essentially identical DEAE-Sepharose chromatography runs are carried out. In the first, 160 ml of A.S.45 extract on DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia No. 10-0710-01) is added with ion exchanger (240 ml packed matrix) which has been equilibrated with buffer D. The suspension is stirred slowly for 30 minutes at 4°C. Unbound material is removed by washing three times with buffer D and then centrifugation (Sorwall H 4000-Rotor at 800 rpm for 3 minutes). The DEAE-Sepharose matrix is then loaded onto a column (50 mm diameter) and washed with buffer at a flow rate of 9 cm per hour. A two-step salt gradient (buffer D with 0.17 M or 1.0 M KCl) is carried out and the eluted protein is collected. Another 800 ml of the A.S. 45 fraction is fractionated in the same way. In this case, however, 240 ml of packed DEAE-Sepharose and a 70 mm diameter column are used. The protein eluted at 0.17 M KCl, designated fraction II, is dialyzed against buffer D for 10 hours, frozen in liquid nitrogen and stored at -70°C. Fraction II is then fractionated over heparin-Sepharose CI-6B (Pharmacia No. 17-0467-01) chromatography. A column with a bed volume of 100 ml and a diameter of 50 mm is equilibrated with buffer D at a flow rate of 9 cm per hour. Two essentially identical fractionations on heparin-Sepharose are carried out. Fraction II (210 ml) is loaded onto a CI-6B heparin-Sepharose column at a flow rate of 9 cm/hr. After the unbound material has eluted, the bound protein is eluted by washing the column with buffer D containing 1.0 M KCl. Another heparin-Sepharose column is used to separate the remainder of fraction II (270 ml). The eluted fractions (designated IIB) are dialyzed against buffer D.
D po dobu 10 hodin při teplotě 4 °C, zamrazí se v kapalném dusíku a skladují se při teplotě -70 °C. Následně se frakce IIB frakcionují čtyřmi v podstatě stejnými FPLC (Pharmacia) Mono Q HR 16/10 (Pharmacia Nr. 17-0467-01)-chromatografie.D for 10 hours at 4°C, frozen in liquid nitrogen and stored at -70°C. Fractions IIB are then fractionated by four essentially identical FPLC (Pharmacia) Mono Q HR 16/10 (Pharmacia No. 17-0467-01) chromatography.
K tomu se Mono Q-sloupec ekvilibrovaný pufrem D nasytí pomocí 50 ml Superloop (Pharmacia Nr. 19-7850-01) (asi 30 ml frakce IIB na průtok). Protein se eluuje pomocí dvoustupňového lineárního gradientu (0 až 20 % ve 250 ml a 20 až 50 % ve 150 ml pufru D s 1,0 M KC1), shromáždí se 9 ml frakcí a aktivní frakce, které eluují při 10 % 1,0 M KC1 se spojí (označeny jako frakce MQ), dialyzují se proti pufru D po dobu 10 hodin při teplotě 4 °C, zamrazí se v kapalném dusíku a skladují při -70 °C. 21 ml balené Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia Nr. 17-0830-01) se podle návodu výrobce připraví na sloupec s průměrem 26 mm. Sloupec se ekvilibruje pufrem D při průtoku 34 cm za hodinu. Frakce MQ (108 ml) se uvede na sloupec a vázaný protein se eluuje pomocí dvoujstupňového gradientu soli (pufr D s 0,17 M případně 1,0 M KC1).To do this, a Mono Q column equilibrated with buffer D is saturated with 50 ml Superloop (Pharmacia No. 19-7850-01) (approx. 30 ml fraction IIB per flow). The protein is eluted using a two-step linear gradient (0 to 20% in 250 ml and 20 to 50% in 150 ml buffer D with 1.0 M KCl), 9 ml fractions are collected and the active fractions that elute at 10% 1.0 M KCl are pooled (designated as MQ fraction), dialyzed against buffer D for 10 hours at 4 °C, frozen in liquid nitrogen and stored at -70 °C. 21 ml of packaged Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia No. 17-0830-01) are prepared on a 26 mm diameter column according to the manufacturer's instructions. The column is equilibrated with buffer D at a flow rate of 34 cm per hour. Fraction MQ (108 ml) is loaded onto the column and bound protein is eluted using a two-step salt gradient (buffer D with 0.17 M or 1.0 M KCl).
Aktivní frakce, označená jako C, která se získá při eluci 1,0 M KC1 se dialyzuje proti pufru D po dobu 10 hodin při teplotě 4 °C, zamrazí se v kapalném dusíku a skladuje při -70 °C.The active fraction, designated C, obtained by elution with 1.0 M KCl, is dialyzed against buffer D for 10 hours at 4°C, frozen in liquid nitrogen and stored at -70°C.
Příklad 3Example 3
Chromatografie na póly(A)-SepharoseChromatography on poly(A)-Sepharose
Podle návodu výrobce se připraví póly(A)-Sepherose CL-6B. Sloupec HR 10/10 s objemem lože 8 ml se ekvilibruje pufrem D s 25 mM KC1 při pH 7. 12 mg (12 ml) frakce C se dialyzuje proti 2 x 21 pufru D s 25 mM KC1 při pH 7 po dobu 4 hodiny. Dialyzovaná frakce se vloží na sloupec s průtokem ·· ···· · «· ·· Μ • · · ···· ···· ·· · · · · · · • · · · ·«···· • · · · · · · · ··«· · ··· ···· ·· ·· ml za minutu. Sloupec se následně promyje nejdříve 5 objemy lože pufrem D s 25 mM KC1 při pH 7 a potom znovu 5 objemy lože pufrem D s 200 mM KC1 při pH 6 a následně 5 objemy lože pufrem D s 280 mM KC1 při pH 6. Následně se zavede gradient (5 objemů lože) od 280 do 600 mM KC1 při pH 6.Poly(A)-Sepherose CL-6B is prepared according to the manufacturer's instructions. An HR 10/10 column with a bed volume of 8 ml is equilibrated with buffer D with 25 mM KCl at pH 7. 12 mg (12 ml) of fraction C is dialyzed against 2 x 21 buffer D with 25 mM KCl at pH 7 for 4 hours. The dialyzed fraction is loaded onto the column at a flow rate of ·· ···· · «· ·· Μ • · · ···· · ··· · · · · · · ·· The column is then washed first with 5 bed volumes of buffer D with 25 mM KCl at pH 7 and then again with 5 bed volumes of buffer D with 200 mM KCl at pH 6 and then with 5 bed volumes of buffer D with 280 mM KCl at pH 6. A gradient (5 bed volumes) from 280 to 600 mM KCl at pH 6 is then introduced.
Póly(A)-specifická exonukleázová aktivita eluuje mezi 350 a 550 mM. Tím bylo dosaženo 14-ti násobného vyčištění nukleázové aktivity.The poly(A)-specific exonuclease activity eluted between 350 and 550 mM, resulting in a 14-fold purification of the nuclease activity.
Příklad 4Example 4
SMART Mono-Q-chromatografieSMART Mono-Q-chromatography
Sloupec SMART Mono Q PC 1,6/5 se ekvilibruje pufrem D při pH hodnotě 7 pomocí 50 mM KC1 a při průtoku 50 μΐ za minutu. 1 ml póly(A)-sefarozové frakce (60 pg proteinu) se dialyzuje proti pufru D s 50 mM KC1 při pH 7 a se stejným průtokem se nanese na sloupec. Sloupec se promývá 1,5 ml gradientem od 50 do 500 mM KC1. 50 μΐ frakce se shromáždí a pomocí in-vitro deadenylačního testu (viz níže) se identifikuje exonukleázová aktivita. Exonukleázová aktivita se eluuje při asi 170 mM KC1.The SMART Mono Q PC 1.6/5 column is equilibrated with buffer D at pH 7 with 50 mM KCl and a flow rate of 50 μΐ per minute. 1 ml of the poly(A)-Sepharose fraction (60 pg protein) is dialyzed against buffer D with 50 mM KCl at pH 7 and loaded onto the column at the same flow rate. The column is washed with a 1.5 ml gradient from 50 to 500 mM KCl. 50 μΐ fractions are collected and exonuclease activity is identified using an in-vitro deadenylation assay (see below). The exonuclease activity elutes at approximately 170 mM KCl.
Příklad 5Example 5
Gelová filtrace SMART (Pharmacia, Uppsala) Superdex 200SMART Gel Filtration (Pharmacia, Uppsala) Superdex 200
Póly(A)-sefarozová frakce (0,7 ml, 0,06 mg na ml proteinu) se nejprve koncentruje dále popsaným způsobem pomocí chromatografie SMART Mono Q PC 1,6/5 (Pharmacia Nr. 17-0671-01). Sloupec se ekvilibruje pufrem D při pH hodnotě 7 s pomocí 50 mM KC1. Póly(A)-sefarozová frakce se dialyzuje proti pufru D s 50 mM KC1 při pH 7 a nanese se na mono-Q « * · · » · · · • · « · • 9 9 · • * · « ·· ·» sloupec s průtokem 50 μΐ za minutu. Vázaný materiál se eluuje pomocí lineárního gradientu do 500 mM KC1 a sbírají se 25 μΐ frakce. Aktivní frakce se (celkový objem 100 μΐ) se identifikují a čistí. Následně se frakcionuje 50 μΐ koncentrované póly(A)-sefarozové frakce pomocí gelové filtrace na sloupci SMART Superdex 200 PC 3,2/30, který byl ekvilibrován pufrem D při pH 7 se 100 mM KC1. Průtok činí 40 μΐ za minutu. Aktivní frakce se identifikují pomocí in-vitro dedenylačního testu (viz níže). Markéry molekulové hmotnosti se frakcionují stejným způsxobem na sloupci Superdex 200. Markéry molekulové hmotnosti jsou Ferritin, Katalse, Aldolase a BSA s molekulovými hmotnostmi 440, 232, 158 a 67 kDa.The poly(A)-Sepharose fraction (0.7 ml, 0.06 mg per ml protein) is first concentrated as described below using SMART Mono Q PC 1.6/5 chromatography (Pharmacia No. 17-0671-01). The column is equilibrated with buffer D at pH 7 with 50 mM KCl. The poly(A)-Sepharose fraction is dialyzed against buffer D with 50 mM KCl at pH 7 and loaded onto a mono-Q « * · · » · · · · · « · · • 9 9 · • * · « ·· ·» column with a flow rate of 50 μΐ per minute. Bound material is eluted using a linear gradient to 500 mM KCl and 25 μΐ fractions are collected. The active fractions (total volume 100 μΐ) are identified and purified. Subsequently, 50 μΐ of the concentrated poly(A)-Sepharose fraction is fractionated by gel filtration on a SMART Superdex 200 PC 3.2/30 column, which has been equilibrated with buffer D at pH 7 with 100 mM KCl. The flow rate is 40 μΐ per minute. The active fractions are identified by an in-vitro deadenylation assay (see below). The molecular weight markers are fractionated in the same way on a Superdex 200 column. The molecular weight markers are Ferritin, Catalase, Aldolase and BSA with molecular weights of 440, 232, 158 and 67 kDa.
Příklad 6Example 6
Afinitní chromatografie na ssDNA Agarose ssDNA Agarose se připraví podle údajů výrobce (Pharmacia Nr. 27-5575-02). Sloupec 0,6 ml se naplní. Na sloupec se vnese aktivní frakce C (10 ml) z příkladu 3 v pufru D s 50 ml KC1 (pH 7,0). Prošlé frakce se shromažďují.Affinity chromatography on ssDNA Agarose ssDNA Agarose is prepared according to the manufacturer's instructions (Pharmacia No. 27-5575-02). A 0.6 ml column is loaded. Active fraction C (10 ml) from Example 3 in buffer D with 50 ml KCl (pH 7.0) is loaded onto the column. The fractions that pass through are collected.
Příklad 7Example 7
Afinitní chromatografie 5ZAMPAffinity chromatography 5 Z AMP
5Z-AMP Sepharose (Pharmacia 17-0620-01) se připraví podle údajů výrobce a prošlé frakce z příkladu 6 se nanesou na sloupec v pufru D s 50 mM KC1 (pH 7,0). Následně se promývá 5 ml pufru D v 50 mM KC1 (pH 7,0). Nato se promývá 5 ml pufru D v 200 mM KC1 (pH 7,0). Nakonec se aktivita eluuje ze sloupce 2 ml pufru D s 2 M KC1 (pH 7,0).5 Z -AMP Sepharose (Pharmacia 17-0620-01) is prepared according to the manufacturer's instructions and the run-through fractions from Example 6 are loaded onto the column in buffer D with 50 mM KCl (pH 7.0). Subsequently, 5 ml of buffer D in 50 mM KCl (pH 7.0) is washed. Then, 5 ml of buffer D in 200 mM KCl (pH 7.0) is washed. Finally, the activity is eluted from the column with 2 ml of buffer D with 2 M KCl (pH 7.0).
Příklad 8Example 8
SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza (prováděná pro obrázky 1B, 2B a 2D)SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (performed for Figures 1B, 2B, and 2D)
Podle Laemmli, U.K. (1970) Nátuře 227, 680-685 se s pomocí gelového aparátu Mini-Protean II (Bio Rad Nr. 125 BR) vyrobí SDS-polyakrylamidový (akrylamid : bisakrylamid 30 : 0,8) gel (5 % akrylamidu ve spaceru a 7,5 % akrylamidu v dělicím gelu). Vznikající množství proteinu se frakcionuje přímo na gelu nebo se před nanesením na gel vysráží přídavkem 1 objemu 20 % TCA, násedovaným centrifuga cí při 13000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Získaná sraženina se promyje acetonem a rozpustí v 10 μΐ vzorkovací ho pufru (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1 % V/V) SDS, 100 mM DTT, 8 % v/v glycerinu, 0,025 % (w/v) bromfenolové modři) a rozdělí se gelovou elektroforézou. Získaný gel se fixuje a vybarví. Vybarvení stříbrem se provádí podle Oakley, B.R a spol. (1980) Anal.Biochem. 105, 361-363. Vybarvení Commassie Brilliant Blue se provede podle Merryl, C.R. (1990) Meth.Enzymol. 182, 477-488.According to Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685, an SDS-polyacrylamide (acrylamide:bisacrylamide 30:0.8) gel (5% acrylamide in the spacer and 7.5% acrylamide in the separating gel) is prepared using a Mini-Protean II gel apparatus (Bio Rad No. 125 BR). The resulting amount of protein is fractionated directly on the gel or precipitated before loading onto the gel by adding 1 volume of 20% TCA, followed by centrifugation at 13,000 g for 30 minutes at 4°C. The obtained precipitate is washed with acetone and dissolved in 10 μΐ of sample buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1% V/V) SDS, 100 mM DTT, 8% v/v glycerin, 0.025% (w/v) bromophenol blue) and separated by gel electrophoresis. The obtained gel is fixed and stained. Silver staining is carried out according to Oakley, B.R et al. (1980) Anal.Biochem. 105, 361-363. Commassie Brilliant Blue staining is carried out according to Merryl, C.R. (1990) Meth.Enzymol. 182, 477-488.
Příklad 9Example 9
Výroba RNA substrátůProduction of RNA substrates
5^-chráněný RNA substrát L3 (Α^θ) , L3 (A^gjX^, L3 (A3q)^49 a L3 (a3o)X164’ se vyr°bí pomocí in-vitro transkripce s T3 RNA-polymarázou (Promega Nr. P208C) a plasmidem pT3L3 (Αβθ) (Astróm, J. a spol. (1991) EMBO J. 10 (10), 3067-3071) jako DNA-matrice, která byla strávena s Nsil, Hinc II, Eco R I a Pvu II. RNA substráty MLÍG^q) ML (C32) • · ♦ · • · · · · · • · · · a MLÍU^q) se vyrobí stejně jako popisuje Astrom, J. a spol. (1991), supra. RNA-substráty se značkují buďto celé nebo na jejich homopolymerních zbytcích vestavbou radioaktivně značených mononukleotidů v průběhu in-vitro transkripce (viz Astrom, J. a spol. (1991), supra, Astrom, J. a spol.The 5'-protected RNA substrate L3 (Α^θ), L3 (Α^gjX^, L3 ( Α 3q)^49 and L3 ( α 3o) X 164' were produced by in vitro transcription with T3 RNA polymerase (Promega No. P208C) and plasmid pT3L3 (Αβθ) (Astróm, J. et al. (1991) EMBO J. 10 (10), 3067-3071) as DNA template, which was digested with NsiI, Hinc II, Eco RI and Pvu II. The RNA substrates MLÍG^q) ML (C32) • · ♦ · · · · · · · · · · · · · · and MLÍU^q) were produced as described by Astrom, J. et al. (1991), supra. RNA substrates are labeled either entirely or on their homopolymer residues by incorporation of radioactively labeled mononucleotides during in vitro transcription (see Astrom, J. et al. (1991), supra, Astrom, J. et al.
(1992), supra). Specifická radioaktivita vestavěných radioaktivních mononukleotidů činí 40 Ci/mmol v transkripční směsi pro celé značení nebo 4 Ci/mmol v transkripční směsi pro značení zbytků. Transkribovaná RNA se čiští podle Moore, C.L. a Sharp, P.A. (1985) Cell, 41, 845-855.(1992), supra). The specific radioactivity of the incorporated radioactive mononucleotides is 40 Ci/mmol in the transcription mixture for total labeling or 4 Ci/mmol in the transcription mixture for residue labeling. The transcribed RNA is purified according to Moore, C.L. and Sharp, P.A. (1985) Cell, 41, 845-855.
Příklad 10Example 10
In-vitro deadenylaceIn-vitro deadenylation
Testovací podmínky pro in-vitro deadenylaci jsou následující : 1 mM MgC^, 2,5 % (w/v) póly(vinylalkohol) (Sigma P-8136), Mw 10000), 100 mM KC1, 0,15 Unit RNAguard, 5 až 20 fmol RNA substrátu, 20 až 48 % (v/v) pufr (20 mM HEPES (KOH), 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 25 % glycerinu, pH 7) a odpovídající proteinové frakce (Astrom, J. a spol. (1992), supra). Reakční objem činí 15 nebo 25 μΐ a inkubace se provádí při teplotě 30 °C. Reakce se následně terminuje a RNA se vyčistí podle Moore, C.L. a Sharp, P.A. (1985) supra. RNA se analyzuje pomocí elektroforézy v 10 % polyakrylamidu (19 : 1 akrylamid/bisakrylamid) - 7 M močovinovém gelu, následovanou autoradiografií získaných gelů.The assay conditions for in-vitro deadenylation are as follows: 1 mM MgCl^, 2.5% (w/v) poly(vinyl alcohol) (Sigma P-8136), Mw 10000), 100 mM KCl, 0.15 Unit RNAguard, 5 to 20 fmol RNA substrate, 20 to 48% (v/v) buffer (20 mM HEPES (KOH), 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 25% glycerin, pH 7) and the corresponding protein fractions (Astrom, J. et al. (1992), supra). The reaction volume is 15 or 25 μΐ and the incubation is carried out at 30 °C. The reaction is then terminated and the RNA is purified according to Moore, C.L. and Sharp, P.A. (1985) supra. RNA is analyzed by electrophoresis in a 10% polyacrylamide (19:1 acrylamide/bisacrylamide)-7 M urea gel, followed by autoradiography of the resulting gels.
Příklad 11Example 11
2D-chromatografie v tenké vrstvě < * • · · · »·2D-thin layer chromatography < * • · · · »·
Dvourozměrová (2D-chromatografie v tenké vrstvě) se provádí na PEI-celulóze F-deskách (Merck Nr. 5579) podle Konarska, M.M. a spol. (1985) Nátuře 313 (6003), 552-557. Produkty uvolněné deadenylaění reakcí se analyzuj í dvourozměrovou chromatografií v tenké vrstvě (2D-TLC) v komoře. Prvním elučním prostředkem (I) je kyselina isobutanová/koncentrovaný amoniak/voda; 577/38/385 (v/v) a druhým elučním prostředkem (II) je nasycený síran amonný/ΙΜ octan sodný/isopropanol; 80/18/12 (v/v). Po prvním dělení se desky suší po dobu 8 hodin při teplotě místnosti, aby se odpařila kyselina isobutanová. Jako markéry se použijí 5Z-AMP (Sigma A-1752), 2Z-AMP (Sigma A-9396),Two-dimensional (2D-thin layer chromatography) is carried out on PEI-cellulose F-plates (Merck No. 5579) according to Konarska, MM et al. (1985) Nature 313 (6003), 552-557. The products released by the deadenylation reaction are analyzed by two-dimensional thin layer chromatography (2D-TLC) in a chamber. The first eluent (I) is isobutanoic acid/concentrated ammonia/water; 577/38/385 (v/v) and the second eluent (II) is saturated ammonium sulfate/ΙΜ sodium acetate/isopropanol; 80/18/12 (v/v). After the first separation, the plates are dried for 8 hours at room temperature to evaporate the isobutanoic acid. 5 Z -AMP (Sigma A-1752), 2 Z -AMP (Sigma A-9396), are used as markers.
3/-AMP (Sigma A-0386). Poloha markéru se stanoví pomocí UV-světla (lampa s minerálním světlem UVG-54, Ultra-Violet Prod. Inc.). Radioaktivní molekuly se stanoví pomocí autoradiografie výsledné PEI-celulozy F-desky.3/-AMP (Sigma A-0386). The position of the marker is determined using UV light (UVG-54 mineral light lamp, Ultra-Violet Prod. Inc.). The radioactive molecules are determined by autoradiography of the resulting PEI-cellulose F-plate.
Příklad 12Example 12
1-D TLC a kvantifikace nukleázové aktivity1-D TLC and nuclease activity quantification
Deadenylaění aktivita se kvantifikuje následovně : L3 (A30)-RNA-substrát, značkovaný pomocí [a^pjATP se inkubuje in-vitro dedenylační reakcí. Reakční produkty se analyzují 1-D TLC s elučním prostředkem III (0,75 Μ K2HPO4, pH 3,5 (H3PO4)). Výsledná PEI-celulozová F-deska se vysuší a skanuje se ve 400 S fosforimageru (Molecular Dynamics). Stanovují se frakce s uvolněným [aJ P]AMP. Na základě známé specifické aktivity [aJ P]AMP v RNA substrátu se vypočítá množství uvolněné AMP v molech. Jednotka deadenylaění aktivity odpovídá uvolnění 1 pmol AMP/minuta.Deadenylation activity is quantified as follows: L3 (A30)-RNA substrate, labeled with [α^pjATP is incubated in an in-vitro deadenylation reaction. The reaction products are analyzed by 1-D TLC with eluent III (0.75 μ K2HPO4, pH 3.5 (H3PO4)). The resulting PEI-cellulose F-plate is dried and scanned in a 400 S phosphorimager (Molecular Dynamics). The fractions with released [α J P]AMP are determined. Based on the known specific activity of [α J P]AMP in the RNA substrate, the amount of released AMP in moles is calculated. One unit of deadenylation activity corresponds to the release of 1 pmol AMP/minute.
• « · · '·»··· • · · * ···· i· · » * »·····♦ · · · ·• « · · '·»··· • · · * ···· i· · » * »·····♦ · · · ·
Příklad 13Example 13
Podmínky in-vitro deadenylaceIn-vitro deadenylation conditions
Podmínky póly(A)-deadenylační aktivity se stanoví výše popsaným deadenylačním testem za použití póly(A)-sefarozové frakce jako zdroje enzymu a póly(A)-zbytku značkovaného L3(A3q)-RNA jako substrátu. Aktivita se stanoví na základě uvolnění mononukleotidu testem 1 D TLC (viz výše). K tomu byla šetřena nutnost jednomocných (draslík a sodík) iontů a dvojmocných iontů (hořčík, mangan, zinek a vápník).The conditions for poly(A)-deadenylation activity are determined by the above-described deadenylation assay using poly(A)-Sepharose fraction as the enzyme source and poly(A)-residue labeled L3(A3q)-RNA as the substrate. The activity is determined based on the release of mononucleotide by 1D TLC assay (see above). The necessity of monovalent (potassium and sodium) ions and divalent ions (magnesium, manganese, zinc and calcium) was investigated for this.
Bylo zjištěno, že dvojmocné kationty nejsou pro aktivitu nutné a že optimální koncentrace jednomocných kationtů činí asi 100 mM. Rovněž bylo zjištěno, že aktivita v přítomnosti iontů draslíku je vyšší než v přítomnosti iontů sodíku. Rovněž bylo zjištěno, že spermidin nemá žádný vliv na aktivitu.It was found that divalent cations are not required for activity and that the optimal concentration of monovalent cations is about 100 mM. It was also found that the activity in the presence of potassium ions is higher than in the presence of sodium ions. It was also found that spermidine has no effect on the activity.
Dále bylo zjištěno, že ionty hořčíku jsou výhodnými dvojmocnými ionty a že optimální koncentrace činí 1 mM. Dále bylo zjištěno, že ionty manganu, zinku a vápníku mohou do určitého stupně nahradit ionty hořčíku. V přítomnosti 1 mM Mn^+, Zn^+ a Ca+ poklesá aktivita ze 17 % přes 2 % na 0,7 % ve srovnání s Mg+.It was further found that magnesium ions are the preferred divalent ions and that the optimum concentration is 1 mM. It was further found that manganese, zinc and calcium ions can replace magnesium ions to some extent. In the presence of 1 mM Mn^ + , Zn^ + and Ca + , the activity decreases from 17% to 2% to 0.7% compared to Mg + .
Ze šetření závislosti na pH vyplývá, že aktivita je nejvyšší při pH hodnotě asi 7.Investigation of the pH dependence shows that the activity is highest at a pH value of about 7.
Příklad 14Example 14
Substrátová specifita • · ···· » >· · · ·· ·· · · · * · · 4 * » c ·· » ·»··· · 9 « · ······Substrate specificity • · ···· » >· · · ·· ·· · · · * · · 4 * » c ·· » ·»··· · 9 « ······
RNA-substrátová specifita aktivity se šetří ve dvou pokusech. V prvním experimentu se inkubují na jejich homopolymerních zbytcích radioaktivně značené RNA-substráty L3 (Α3θ), ML45 (U3Q), ML40 (C33) a ML43 (G3q) v in-vitro deadenylačním testu (viz výše). Uvolnění radioaktivních mononukleotidů se zjišťuje testem 1-D TLC (viz výše). Na základě zjištěných výsledků se podle Lineweaver-Burke stanoví Km a Vmax hodnoty pro každý RNA-substrát (viz tabulka II). Ve druhém experimentu se stanoví specifita substrátu tak, že se RNA-substráty inkubuji s interními póly(A) řezy, následovanými plasmidem kódovanými RNA-sekvencemi stoupající délky s frakcemi póly(A)-sefarozy v in-vitro deadenylačním testu. Bylo zjištěno, že RNA-substráty L3 (^(pX^, L3 (A3q)X^p a L3 (A3q)X-£64 jsou vůči odbourání zcela rezistentní v protikladu k RNA-substrátu L3 (Α3θ) (viz obrázek 3).The RNA substrate specificity of the activity is investigated in two experiments. In the first experiment, the radiolabeled RNA substrates L3 (Α 3θ ), ML45 (U 3Q ), ML40 (C 33 ) and ML43 (G 3 q ) are incubated on their homopolymer residues in an in vitro deadenylation assay (see above). The release of radioactive mononucleotides is determined by a 1-D TLC assay (see above). Based on the results obtained, the Km and Vmax values for each RNA substrate are determined according to Lineweaver-Burke (see Table II). In the second experiment, the substrate specificity is determined by incubating the RNA substrates with internal Pol(A) cuts, followed by plasmid-encoded RNA sequences of increasing length with Pol(A)-Sepharose fractions in an in vitro deadenylation assay. It was found that the RNA substrates L3 (^(pX^, L3 (A 3 q)X^p and L3 (A 3 q)X-£64 are completely resistant to degradation in contrast to the RNA substrate L3 (Α 3 θ) (see Figure 3).
Z toho vyplývá, že RNA-zbytky z adenosinových zbytků jsou výhodným substrátem a že pouze 3Z-koncové lokalizované póly(A)-zbytky se efektivně odbourávají.This implies that RNA-residues from adenosine residues are the preferred substrate and that only 3 Z -terminally localized pol(A)-residues are efficiently degraded.
Příklad 15Example 15
Stanovení uvolněných mononukleotidůDetermination of released mononucleotides
Uvolněné mononukleotidické reakční produkty se stanoví pomocí 2-D TLC. K tomu se v in-vitro deadenylačním testu inkubuje póly(A)-sefarozová frakce spolu s RNA-substrátem L3 (A30), který byl v průběhu in-vitro transkripce značkován pomocí [aoz,P]AMP. Po 20 minutách se reakční produkty analyzují pomocí 2-D TLC za použití neznačkovaných 2Z-AMP,The released mononucleotide reaction products are determined by 2-D TLC. For this purpose, the poly(A)-Sepharose fraction is incubated in an in vitro deadenylation assay with the RNA substrate L3 (A 30 ), which has been labeled with [a oz, P]AMP during in vitro transcription. After 20 minutes, the reaction products are analyzed by 2-D TLC using unlabeled 2 Z -AMP,
3Z-AMP a 5Z-AMP jako markéry. Z výsledku (viz obrázek 4) vyplývá, že 5Z-AMP v průběhu in-vitro deadenylační reakce uvolňuj e enzym.3 Z -AMP and 5 Z -AMP as markers. The result (see Figure 4) shows that 5 Z -AMP releases the enzyme during the in-vitro deadenylation reaction.
• ·• ·
Příklad 16Example 16
Kinetika nukleázové aktivityKinetics of nuclease activity
Ke zjištění, zda se nukleázová aktivita RNA-substrátů odbourává procesivním nebo distributivním z působem, stanoví se nejprve kinetika deadenylační reakce in-vitro v přítomnosti 0,5 μΐ póly(A)-sefarozové frakce a x fmol L3 (Α^θ) RNA-substrátu, cele značených. Obrázek 5 ukazuje, že se akumuluje zcela odbouraná RNA dříve než než reaguje veškerý RNA-substrát. Důsledkem toho je, že deadenylační reakce je za těchto podmínek po 20 minutách zcela dokončena. V další reakci se po dobu 20 minut inkubuje v přítomnosti stoupajícího množství póly(A). Obrázek 5B ukazuje, že přísada póly(A) reakci inhibuje a že při nejvyšších měřených koncentracích přidané póly(A) byly přítomné jak nedeadenylované tak i plně deadenylované RNA-substráty. Při třetím pokusu se změní množství nukleázové aktivity. Inkubační doba činí 20 minut. Obrázek 5C ukazuje, že jak nedeadenylované tak i deadenylované RNA-substráty jsou přítomny dokonce i při nejmenších množstvích přidané nukleázové aktivity. Z toho vyplývá, že exonukleázová aktivita je vysoce procesivní, to znamená, že enzym nedisociuje ze substrátu, dokud není adenosinový konec zcela odbourán.To determine whether the nuclease activity of RNA substrates is degraded processively or distributively, the kinetics of the in vitro deadenylation reaction are first determined in the presence of 0.5 μΐ poly(A)-Sepharose fraction and x fmol L3 (Α^θ) RNA substrate, fully labeled. Figure 5 shows that completely degraded RNA accumulates before all the RNA substrate reacts. As a result, the deadenylation reaction is completely completed after 20 minutes under these conditions. In a further reaction, the reaction is incubated for 20 minutes in the presence of increasing amounts of poly(A). Figure 5B shows that the addition of poly(A) inhibits the reaction and that at the highest measured concentrations of added poly(A) both non-deadenylated and fully deadenylated RNA substrates were present. In the third experiment, the amount of nuclease activity changes. The incubation time is 20 minutes. Figure 5C shows that both non-deadenylated and deadenylated RNA substrates are present even with the smallest amounts of added nuclease activity. This suggests that the exonuclease activity is highly processive, meaning that the enzyme does not dissociate from the substrate until the adenosine terminus is completely degraded.
Příklad 17Example 17
Experiment zpětného sestavení (Obrázek 6)Reassembly experiment (Figure 6)
Experimenty zpětného sestavení se provedou podle Dayle a spol (supra) s tím rozdílem, že zpětné sestavení se provádí na gelu přes noc při teplotě 4 °C. Pro tyto experimenty se použijí aktivní frakce z chromatografie póly(A)-sefarozy (příklad 3).Reassembly experiments are performed according to Dayle et al. (supra) except that reassembly is performed on the gel overnight at 4° C. Active fractions from poly(A)-Sepharose chromatography (Example 3) are used for these experiments.
Claims (25)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20004895A CZ20004895A3 (en) | 1999-06-17 | 1999-06-17 | 3ˆ-exonuclease, preparation process and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20004895A CZ20004895A3 (en) | 1999-06-17 | 1999-06-17 | 3ˆ-exonuclease, preparation process and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20004895A3 true CZ20004895A3 (en) | 2001-04-11 |
Family
ID=5472918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20004895A CZ20004895A3 (en) | 1999-06-17 | 1999-06-17 | 3ˆ-exonuclease, preparation process and use thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ20004895A3 (en) |
-
1999
- 1999-06-17 CZ CZ20004895A patent/CZ20004895A3/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ferro et al. | Poly (ADP-ribosylation) of DNA topoisomerase I from calf thymus. | |
| Willows et al. | Three separate proteins constitute the magnesium chelatase of Rhodobacter sphaeroides | |
| Williams et al. | Natural occurrence of 2-5A in interferon-treated EMC virus-infected L cells | |
| BAGINSKY et al. | Chloroplast PNPase exists as a homo-multimer enzyme complex that is distinct from the Escherichia coli degradosome | |
| Martınez et al. | A 54-kDa fragment of the poly (A)-specific ribonuclease is an oligomeric, processive, and cap-interacting poly (A)-specific 3′ exonuclease | |
| Schimmel et al. | The ubiquitin-proteasome system is a key component of the SUMO-2/3 cycle | |
| Ossmer et al. | Immunocytochemical localization of component C of the methylreductase system in Methanococcus voltae and Methanobacterium thermoautotrophicum | |
| Ikai et al. | Immunohistochemical demonstration of poly (adenosine diphosphate-ribose) in nuclei of various rat tissues. | |
| Mauck et al. | L-myo-Inositol-1-phosphate synthase from bovine testis: purification to homogeneity and partial characterization | |
| JENKINsoN et al. | Rat mammary arginase: isolation and characterization | |
| WO1991007483A2 (en) | Mammalian pancreatic cholesterol esterase | |
| Tucker et al. | De novo synthesis and glycosylation of the MOPC-46B mouse immunoglobulin light chain in cell-free extracts. | |
| Song et al. | Chromatographic purification of the plasmin‐like enzyme from clamworm (Perinereis aibuhitensis Grub) and its fibrinolytic activity by metal ions | |
| Henderson et al. | Evidence for an inhibitor of protein synthesis in rabbit reticulocytes activated by high pressure | |
| Iqbal et al. | Calmodulin in mammalian nerve | |
| US6451307B1 (en) | 3′-exonuclease, production and use thereof | |
| Gerlach et al. | Interaction of immobilized phosphofructokinase with soluble muscle proteins | |
| JPS6359886A (en) | Fetal purified thymidine kinase and its production | |
| US7338776B2 (en) | Production of UGPPase | |
| JP4346449B2 (en) | Production of UPPase | |
| Preiss et al. | Starch synthesis and its regulation | |
| Caldés et al. | Purification of malic enzyme from bovine heart mitochondria by affinity chromatography | |
| JP2003523716A (en) | Purified porcine kidney L-fucose kinase | |
| JP2015156821A (en) | Human pancreatic specific ribonuclease 1 and isolation method thereof | |
| EP1485473B1 (en) | Production of ugppase |