CZ20004620A3 - Přípravek obsahující karnitin a glutathion, vhodný pro zvýšení absorpce glutathionu a zesílení jeho účinků - Google Patents

Abstract

Je popsán přípravek vhodný ke zvýšení absorpce glutathionu a synergizující jeho účinky, který v závislosti na uživatelově stavu může být ve formě doplňkové výživy, dietetické podpory nebo jako aktuální léčivo spočívající v tom, že obsahuje účinné složky, (a) propionyl-L-kamitin nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli; (b) glutathion nebo kvasinky obsahující glutathion; (c) kvasinky prosté glutathionu, pokud složka (b) obsahuje glutathion

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká přípravku k prevenci a/nebo léčbě změn těch orgánů, které vykonávají nejintenzivnější metabolické funkce jako jsou játra, ledviny, kardiovaskulární systém a mozek.

Většinou to jsou přípravky vhodné k léčbě nebo prevenci hepatosy, nefropatie a kardiovaskulárních nebo cerebrálních poruch jako jsou například poruchy vyvolané stárnutím nebo vlivem změněného metabolizmu těchto orgánů, nebo vyvolané toxickými látkami.

Přípravek může mít formu a uplatňovat své působení jako doplňková výživa nebo může být použit v aktuální medicíně v závislosti na tom, zda jde o podpůrné nebo preventivní působení, nebo přísně terapeutické působení, pro které je přípravek určen, a to na určitého jedince, pro kterého je použit.

Dosavadní stav techniky

Glutathion (GSH), N-(N-L-L-y-glutamylcysteinyl) glycin hraje důležitou roli v organických redoxních a detoxikačních reakcích. Glutathion se syntetizuje v těle; výchozími látkami jsou kyselina glutamové a cystein, které v přítomnosti ATP vytvářejí γ-glutamylcystein, který opět v přítomnosti ATP reaguje s glycinem za vzniku glutathionu. Glutathion je v těle všudypřítomný. Jeho nejvyšší koncentrace se nacházejí v játrech, srdci a mozku, tj. v těch orgánech, kde probíhají důležitější metabolické, energetické a detoxikační reakce. Tyto tkáně obsahují také glutathion peroxidázu a glutathion reduktázu, které regulují redoxní systém týkající se glutathionového cyklu a zajišťují udržování dostatečného množství redukované formy glutathionu při jeho oxidaci.

• * • · · « • · «

- 2 I když biochemické a detoxikační účinky glutathionu byly již dlouho známy, a to zvláště na těžké kovy (které jsou mezi nejdůležitějšími znečištěními prostředí) nebo na léčiva poškozující játra, jako je například paracetamol, pouze nejnovější výzkumy poukazují na rozhodující roli glutathionu v různých redoxních systémech, rovněž tak jako na jeho specifickou farmakologickou úlohu. Ve snaze zjistit ochranný účinek glutathionu proti vytváření atheromativních plaků, bylo pozorováno jeho přímé uvolňování přímým měřením antioxidačních/oxidačních systémů v plakách. Tyto výzkumy odhalily nízké koncentrace glutathionu a velmi chabý účinek redoxních systémů vztahujících se ke glutathionu. Zvláště zřejmý byl pokles koncentrace glutathion peroxidázy se současným vzestupem..koncentrace oxidačních faktorů. Tyto abnormality nejsou proto v normální vaskulární tkáni zřejmé.

Glutathion hraje také velkou ochrannou úlohu při onemocnění jater. Ochranný účinek mnoha léčiv na játra je navíc zprostředkován glutathionem. Bylo také referováno o tom, že vzestup koncentrace glutathionu snižuje odmítnutí jatemích transplantátů.

Také na neurocerebrální úrovni se úloha glutathionu samotného liší od jiných lépe známých redox systémů co se týká ochrany proti poškození tkáně a buněk zjištěných při stárnutí, Parkinsonově chorobě nebo Alzheimerově chorobě. Na cerebrální úrovni je ve skutečnosti glutathion schopný hrát různé role, avšak zvláště působí jako neurotransmiter. Nedostatek glutathionu může zvýšit úroveň cytotoxických látek a spustit apoptosu určitých souborů neuronálních buněk.

Během stárnutí je pozorován vzrůst oxidačních procesů a pokles přirozených antioxidačních látek včetně nejnápadnějšího glutathionu s tím důsledkem, že nedostatek glutathionu může být považován za jednu z příčin stárnutí. Příznivou úlohu glutathionu lze také pozorovat na úrovni vnitřních orgánů, kde jeho přítomnost ovlivňuje tvorbu hydroperoxidů a lipidových peroxidů, majících • « ·· ·* • · ·

- 3 důležitou funkci při detoxikaci vnitřních orgánů a při prevenci s tím spojených jatemích a střevních onemocnění.

L-karnitin a jeho alkanoyl-L-karnitinové deriváty jsou dobře známy pro jejich důležitou úlohu, kterou mohou hrát při metabolizmu, zvláště co se týká oxidace a využívání mastných kyselin β-oxidací.

L-karnitin, a to ať už přijmutý se stravou nebo syntetizovaný tělem, je koncentrován krví v těch orgánech, které jsou metabolicky nejaktivnější při zpracování mastných kyselin jako například kosterním svalstvem á srdcem.

Nedostatek L-karnitinu může být příčinou myopathie, zatímco orální podávání Lkarnitinu zlepšuje klinický stav spojený s takovým onemocněním. L-karnitin také vykonává důležitou funkci při mitochondriální oxidaci glukózy spojenou s produkcí energie a proto pro normální energetický metabolismus na kardiální a svalové úrovni je určitá úroveň L-karnitinu nezbytná.

Jeho podávání zlepšuje odolnost proti stresu u těch jedinců, kteří trpí srdeční nedostatečností, rovněž tak jako zlepšuje koronární průtok, vytvářeje zlepšení klinických účinků na kardiální dekompenzaci.

Dalšími biologickými vlastnostmi L-karnitinu a jeho alkanoyl derivátů, a to zvláště propionyl-L-karnitinu, je jeho schopnost stabilizovat buněčné membrány a chránit je proti lézím způsobeným oxidačními procesy.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká zvláště orálních, parenterálních, rektálních nebo transdermálriích přípravků připravených v kombinaci s:

(a) propionyl- L-karnitinem nebo jeho farmakologicky přijatelnými solemi, volitelně v kombinaci s dalším „karnitinem“, kde se „karnitinem“ míní L-karnitin nebo ·· ·* φφ

- 4 alkanoyl-L-karnitin vybíraný ze skupiny sestávající z acetyl-L-karnitinu, valerylL-kamitinu a isovaleryl-L-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelných solí; a (b) glutathionem nebo kvasinkami obsahujícími glutathion;

(c) kvasinkami prostými glutathionu, pokud složka (b) obsahuje glutathion.

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že kombinovaný přípravek obsahující jako aktivní složky:

(a) propionyl-L-karnitin nebo jednu z jeho farmakologicky přijatelných solí;

(b) glutathion nebo kvasinky obsahující glutathion;

(c) kvasinky prosté glutathionu, pokud složka (b) glutathion obsahuje;

je extrémně účinný při prevenci a/nebo léčbě abnormalit metabolicky nejaktivnějších orgánů jako jsou játra, ledviny, kardiovaskulární systém a mozek, jakožto výsledek silného synergického účinku způsobeného jeho složkami. Díky této kombinací dochází k zvýšenému vstřebávání složek tkáněmi, a to zvláště ke zvýšené absorbci glutathionu. Takový přípravek je zvláště vhodný k prevenci nebo léčbě onemocnění jater, ledvin a kardiovaskulárních nebo cerebrálních poruch, tak jako se to například děje při stárnutí, a to ať už oslabením metabolismu výše uvedených orgánů, nebo způsobených toxickými látkami.

Bylo také zjištěno, že složka (a) případně může dále obsahovat další „karnitin“ vybíraný ze skupiny sestávající z acetyl-L-karnitinu, valeryl-L-karnitinu a isovaleryl-L-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelných solí nebo jejich směsí.

Pokud složka (a) v přípravku obsahuje směs karnitinů, dává se přednost směsi Lkarnitinu, acetyl-L-karnitinu, propionyl-L-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelných solí.

• ·

Pokud složka (b) obsahuje glutathion, bude potom složka (c) obsahovat kvasinky prosté glutathionu vybírané ze skupiny sestávající z Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces fragilis. Další příklady takových kvasinek jsou odborníkům dobře známy.

Pokud složka (b) obsahuje kvasinky s glutathionem, musejí obsahovat přednostně od 7 do 10 % hmotnostních glutathionu. Příkladem kvasinek s glutathionem neomezujícím však rozsah, je extrakt kvasinek YH - Torula (Candida utilis) vyráběné Kohjim, Japonsko.

Hmotnostní poměr (a) : (b) : (c) se pohybuje od 100 : 1 : 100 do 1 : 10 : 10, přednostně však od 10 : 1 : 10 do 1 : 1 : 1.

Bylo také prokázáno, že jak synergický účinek, tak vstřebávání tkání se dále zvyšují, pokud přípravek obsahuje:

(d) alespoň jeden prekurzor biosyntézy glutathionu vybíraný ze skupiny sestávající z kyseliny glutamové, glycinu, cysteinu a hořčíku.

Optimálního výsledku se dosáhne, pokud jsou v přípravku přítomny dříve jmenované prekurzory.

Poměr (a): (d), kterému se dává přednost je mezi 1 : 1 a 1 : 0,5.

Přípravek složený z kombinace podle vynálezu podává neočekávaný a překvapující synergický účinek při ochraně těla proti toxickému poškození jak endogenního původu, jako je metabolická porucha stárnutím, tak exogenního původu, jako je porucha způsobená znečištěným prostředím nebo jinými škodlivými látkami. Nový přípravek může být zvláště vhodný k prevenci a léčbě těch abnormalit, které nastávají v souvislosti se stárnutím, a to ať už neurocerebrálního nebo kardiovaskulárního původu, nebo situacemi parenchymálních poruch orgánů, jako například jater, která jsou jako výsledek • · *♦ « · · · • · · • ··· · • · ···· ·· ··

• ·

- 6 jejich metabolického a detoxikačního působení vystavena lézím vyvolaným vnějšími toxickými látkami nebo toxickými metabolity.

Účinek nového přípravku brání výše zmíněným poruchám jak synergickým účinkem, tak zvýšenou koncentrací aktivních složek v tkáních, zvláště glutathionu jakožto výsledku jeho zvýšeného vstřebávání.

Přípravku podle vynálezu je možno použít jak jako náhradní výživy, tak jako doplňkové výživy převážně s preventivním účinkem i jako léčiva k léčbě stavů při klinicky zjištěných onemocněních. Metabolické účinky působené jak karnitiny, tak glutathionem nebo kvasinkami obsahujícími glutathion a aminokyselinami přítomnými v přípravku jsou dobře známy a nedostatek těchto sloučenin v těle může působit i onemocnění vážnějšího původu. Nebylo však možno předpovědět, že jejich kombinace může silně zlepšit účinek a příznivé procesy jejich vstřebávání, a tak zvýšit jejich koncentraci v tkáních. Používání těchto přípravků může být prospěšné pro různé formy jatémích a mozkových poruch, a to zvláště atherosklerotické abnormality a intoxikace těžkými kovy, chemoterapeutickými látkami nebo jinými léčivy.

Překvapující synergický účinek vytvářený kombinací „kamitinů a glutathionu v přítomnosti kvasinek a prekurzorů glutathionových aminokyselin a jejich zvýšené vstřebávání byly prokázány různými vybranými farmakologickými zkouškami (některé z nich jsou dále popsány), jejich schopnost působit vysoce prediktivní indikace vztahující se na praktické využití tohoto přípravku jak v preventivní či nutriční oblasti, tak v přísně terapeutické oblasti.

• 0 ·

0 0·· ·*

0·· 0 0 0 •00·· · • 0 0 • 0 ··

Toxikologické zkoušky

Ještě před různými farmakologickými zkouškami byly na zvířatech zjišťovány meze toxicity a tolerance na nové přípravky.

Tyto toxikologické zkoušky byly provedeny jak na krysách, tak na myších, a to podáváním různých produktů v kombinaci jednorázových vysokých dávek nebo podáváním těchto látek těmže zvířatům trvale po dobu alespoň šedesáti dnů. Bylo tak zjištěno, že lze orálně podávat kombinace až do 1 g.kg'¹ propionyl-L-karnitinu a aoetyl-L-karnitinu společně s 500 mg kg'¹ glutathionu nebo 2 g.kg’¹ kvasinek obsahujících 10 % glutathionu a také stejný produkt s kyselinou .glutamovou (100 mg.kg'¹), cysteinem (100 mg.kg'¹), a hořčíkem (10 mg.kg'¹) bez náznaků intolerance nebo toxicity. Také je dobře tolerováno prodloužené podávání 0,5 g.kg'¹ propionyl-L-kamitinu nebo acetyl-L-karnitinu společně se 100 mg.kg’¹ glutathionu nebo s 1 g.kg¹ extraktu kvasinek obsahujícího 10 % glutathionu též společně s kyselinou glutamovou (50 mg.kg'¹), glycinem (50 mg.kg'¹) a hořčíkem (5 mg.kg'¹) po dobu šedesáti dnů.

Po těchto zkouškách krevní rozbor nevykázal u zkoumaných zvířat žádné abnormality. Též histologické zkoušky hlavních orgánů v porovnání s kontrolními zvířaty při pitvě nevykázaly žádné změny patologického původu.

Farmakologické zkoušky

K prokazování antitoxických účinků a účinků na ochranu proti poškození jater byly pro nový přípravek vybírány různé zkoušky z těch, které se lépe hodí k vyhodnocování farmakologického účinku, které jsou také spolehlivé pro svou předpovědní hodnotu pro účely praktických aplikací a to jak nutričních tak farmaceutických přípravků v oblasti prevence a léčby jatemích onemocnění toxického nebo metabolického původu a poruch způsobených stárnutím.

·· ·· ·· · ·· · • ΦΦΦ φφφφ φφφφ •ΦΦΦ·· «·· • ··· ··· ···· · • φ φ · » · « · ··«< ·· »« ··· ·Φ *··

Zkouška toxicity vyvolaná acetaminofenem (paracetamol)

Různým skupinám myších samců byly podávány orální dávky 600 mg.kg'¹ acetaminofenu, což je dostatečná dávka k usmrcení během 24 hodin pro 50 % takto zkoušených zvířat.

Současně s podáváním acetaminofenu bylo jedné skupině zvířat (skupina G) podáván glutathion (G) a druhé skupině (skupina YG) byly podávány kvasinky obsahující 10 % glutathionu (YG); třetí skupině (skupina PC) byl podáván propionyl-L-karnitin (PC);, čtvrté skupině (skupina AA) byla podávána kombinace kyseliny glutamové, cysteinu, glycinu a hořčíku (AA); páté skupině (skupina CC) byla podávána první kombinace podle tohoto vynálezu nazvaná „úplná kombinace“ (CC) obsahující PC + G + AA, zatímco šesté skupině (skupina CYC) byla podávána druhá kombinace podle tohoto vynálezu nazvaná „úplná kvasinková kombinace“ (CYC) obsahující PC + YG + AA.

U všech zkoušených skupin byla sledována mortalita 24 hodin po podání. Výsledky zkoušky jsou uvedeny v tabulce 1.

Výsledky těchto zkoušek ukazují, že zatímco částečné ochrany proti mortalitě působené acetaminofenem je dosaženo glutathionem, nebyla žádná ochrana pozorována u kombinace s propionyl-L-karnitinem nebo u kombinace s aminokyselinami. Kvasinky obsahující glutathion vykazují vyšší stupeň ochranného účinku než bylo dosaženo s glutathionem samotným. Pokud se podávala úplná kvasinková kombinace CYC, prokázala se úplná ochrana ukazující na synergické působení mezi glutathionem, propionyl-L-karnitinem a dalšími složkami kombinace.

Tyto synergické účinky se jeví jako zřejmější pokud se myším podala dávka 900 mg.kg'¹ acetaminofenu, která způsobila mortalitu 100 % zvířat. V případě podávání pouze úplné kvasinkové kombinace CYC, bylo proti mortalitě ochráněno více než 50 % zkoušených zvířat (viz tabulka 2).

·· ·· • · · · • · · · • · » · · · · · • · · ·· ···

Ochrana proti acetaminofenu v dávce 900 mg.kg'¹ poskytla ještě významnější výsledek s novým přípravkem, polud byly zvířatům po 7 po sobě jdoucích dní před podáním acetaminofenu podávány různé složky kombinace (viz tabulka 3).

Tento výsledek má pravděpodobně vztah ke zvýšení koncentrace glutathionu a dalších složek větším vstřebáváním tkáněmi vlivem přítomnosti kvasinek, rovněž tak jako ke zvýšení syntézy samotného glutathionu vlivem přítomnosti vyššího množství jeho prekurzorů.

Tabulka 1

Ochrana proti mortalitě vyvolané acetaminofenem (600 mg.kg'¹)

/skupina zvířat	mg.kg'1	mortalita
C	-	6/10
PC	100	6/10
G	50	4/10
YG	500	3/10
AA	130	5/10
CC	280	2/10
CYC	780	0/10

C = kontrolní

PC = propionyl-L-karnitin

G = glutathion

YG = kvasinky obsahující 10 % glutathionu

AA = kombinace aminokyselin a hořčíku (30 mg kyseliny glutamové, 25 mg cysteinu, 50 mg glycinu + 5 mg hořčíku)

CC = úplná kombinace = (PC + G + AA)

CYC = úplná kvasinková kombinace = (PC + YG + AA)

444 4 4 «

····

- 10 Tabulka 2

Ochrana proti mortalitě vyvolané acetaminofenem (900 mg.kg'¹)

Podávání/skupina zvířat	mg. kg'1	mortalita
C	-	10/10
PC	100	10/10
G	50	7/10
YG	500	6/10
AA	130	9/10
CC	280	5/10
CYC	780	3/10

Tabulka 3

Ochrana proti mortalitě vyvolané acetaminofenem (900 mg.kg%'¹) po předchozím dlouhodobém podávání přípravku nebo jeho složek po dobu 7 po sobě jdoucích dní

Podávání	mg.kg'1	mortalita
C	-	10/10
PC	- 100	9/10
G	50	5/10
YG	500	3/10
AA	130	9/10
CC	280	1/10
CYC	780	0/10

Zkouška intoxikace chloridem uhličitým (CCI₄) na izolovaných buňkách krysích jater

Vedle intoxikace acetaminofenem byl také na hepatické úrovni stanoven ochranný a synergický účinek působený různými složkami přípravku podle tohoto vynálezu intoxikací CCI₄. Buňky použité v těchto zkouškách byly izolované buňky krysích jater po promytí kolagenázou metodou popsanou Seglenem (Seglen, F.O., Method Cell. Biol. Chem., 264, 4747, 1989). Bylo odebráno přibližně 4-6.10⁸ • ·

• · · · · ··· · · · •··· ·· ··

- 11 živých jaterních buněk, napočítaných s vyloučením neživých buněk pomocí trypanové modři.

Takto izolované buňky byly suspendovány v 25 cm² plastových nádobkách v přítomnosti antibiotik a 10 % inaktivovaného fetálního telecího séra. K takto získané buněčné suspensi byl přidán CCI4 (10 mmol.l'¹), glutathion (GSH 20 mg.l'¹), propionyl-L-karnitin (100 mg.l'¹) nebo glutathion kombinovaný s propionyl-L-karnitinem. Po 4 hodinové inkubaci byl stanoven počet odumřelých buněk uvolněním laktát dehydrogenázy, jak to popisuje Casini, et al. (Casini, et al., J. Biol. Chem., 257, 6721, 1982). Zkoušení ochranného účinku působeného glutathionem, propionyl-L-karnitinem a jejich kombinací proti intoxikaci CCI4 bylo provedeno zkouškou buněčného supernatantu jak na alanin transferázu (Ala AT), tak aspartát transferázu (Asp AT) (biochemický autoanalyzátor Assay System Beckman 700-Encore 2).

Cytologické zkoušení jaterních buněk bylo provedeno jak světelnou, tak elektronovou mikroskopií, a to po fixaci v 3 % formalínu a parafinu při světelné mikroskopii a 3 % glutaraldehydem a 1 % oxidem osmičelým při elektronové mikroskopii.

Výsledky těchto analýz (viz tabulky 4, 5 a 6) ukazují, že jak glutathion, tak propionyl-L-karnitin jsou schopny snížit toxický účinek chloridu uhličitého.

Větší účinek byl překvapivě získán při kombinaci glutathionu s propionyl-Lkarnitinem.

V tomto případě procento mrtvých buněk bylo prakticky sníženo k nule. Vzestup koncentrací enzymů indikující metabolické funkční poškození (Ala AT - Asp AT) byl také kombinací glutathionu a propionyl-L-karnitinu neočekávaně podstatně snížen. Potvrzení silného synergického účinku glutathionu a propionyl-L-karnitinu bylo také provedeno histologickými zkouškami, které při světelné mikroskopii vykázaly fakticky úplné vymizení nekrotických buněk a při elektronové mikroskopii • · · · • fl

- 12 ukázaly na ochranu vnitrobuněčných struktur a zvláště mitochondriálních struktur a počtu ribozomů.

Tabulka 4

Ochrana jaterních buněčných kultur intoxikovaných CCI₄

Působení % mrtvých buněk

CCI₄ > 85±4 glutathion 55±5 propionyl-L-karnitin ,70±7 glutathion + propionyl-L-karnitin 5+3

Tabulka 5

Ochrana jaterních buněčných kultur intoxikovaných CCI₄. Koncentrace alanin aminotransferázy (Ala AT nmol.min'¹.l·¹) a aspartát aminotransferázy (Asp AT nmol.min'¹.!¹) v supernatantu po 4 hodinách

Působení	Ala AT	Asp AT
CCI4	26,5±3,1	9,08+0,7
glutathion	19,7±2,5	7,5±5,4
propionyl-L-karnitin	22,4±2,8	8,9±0,9
glutathion + propionyl-L-karnitin	7,7±1,9	3,4±2,1

Zkoušky intoxikace jater vyvolané chloridem uhličitým

Dalším indikátorem toxicity CCI₄ na játra je zvýšení koncentrace triglyceridů v játrech. Také při této zkoušce byl prokázán ochranný účinek glutathionu, propionyl-L-karnitinu, aminokyselin a kvasinek, a to jak jednotlivých látek, tak jejich kombinace v přípravku podle tohoto vynálezu.

Intoxikace CCI₄ byla vyvolána intraperitoneální injekcí 1 ml.kg'¹ suspense 20 % CCI4 v olivovém oleji hladovějícím krysám, Před intoxikací CCI₄ byl krysám • · • ··· · · • · · ······ ··

- 13 podáván po dobu tří po sobě jdoucích dní glutathion (G = 50 mg.kg¹) nebo propionyl-L-karnitin (PC = 100 mg.kg'¹) nebo kvasinky obsahující 10 % glutathionu (YG = 500 mg.kg'¹) nebo kombinace aminokyselin (AA = kyselina glutamové 50 mg, cystein 25 mg, glycin 50 mg, hořčík 5 mg), nebo úplná kombinace CC (CC = PC + G + AA) nebo úplná kvasinková kombinace CYC (CYC = PC + YG + AA). Po podání CCI4 byla játra usmrcených zvířat vyjmuta a použita k měření koncentrace triglyceridů metodou popsanou Donabedianem (Donabedian, R.K., Clin. Chem., 20, 632, 1974). Výsledky těchto zkoušek vykazují také podstatný synergismus mezi glutathionem a propionyl-L-karnitinem při ochraně jater proti intoxikací CCI₄.

Ještě významnější byl ochranný účinek při kombinaci propionyl-L-karnitinu s kvasinkami a komplexem aminokyselin. V tomto případě ve skutečnosti nenastala infiltrace triglyceridů do jater, čímž byl prokázán silný synergický účinek dosažený přípravkem podle tohoto vynálezu (viz tabulka 6).

Tabulka 6

Zkoušky zvýšení triglyceridů v játrech vyvolaného CCI₄

CCI4 (ml.kg'1)	Působení	Triglyceridy (mg.g'1)
0	-	5,9±0,4
1	-	26,9±1,1
1	PC	20,2±1,9
1	G	18,7±2,1
1	YG	16,5±1,2
1	AA	20,4±2,1
1	CC	12,5±1,4
1	CYC	9,9±0,6

·· ·· «· · • · · 9 · · · · • · · · 9 · • ····· · · * 9 · · * ···· ·· · · «··

- 14 Ochrana krys proti pokusné hypertriglyceridemii

Pro tuto zkoušku byly použita metoda popsaná Carlsonem (Carlson, L.A.V., J. Atheroscl. Res., 8, 667, 1968) a úprava popsaná v Atherosclerosis, 16, 349, 1972. Podle těchto zkoušek vyvolalo podání 3 g.kg'¹ fruktózy u krys pět hodin po podání podstatný vzrůst triglyceridů jak v játrech, tak v séru.

Záměrem této zkoušky bylo prokázat, zda podání jednotlivých složek přípravku podle tohoto vynálezu nebo jejich kombinace je schopno vést ke snížení této triglyceridové abnormality, která se považuje za původce vážných jaterních dysfunkcí, rovněž tak jako atherosklerozy.

Za tímto účelem obdržely krysy glutathion (G = 50 mg.kg’¹) nebo propionyl-Lkarnitin (PC = 50 mg.kg'¹) nebo kvasinky obsahující 10 % glutathionu (YG = 500 mg.kg'¹) nebo směs aminokyselin (AA = kyselina glutamová 50 mg, cystein 25 mg, glycin 100 mg.kg'¹ + hořčík 5 mg.kg'¹), nebo kombinaci těchto různých složek (ve stejných dávkách) bez kvasinek (CC) nebo s kvasinkami (CYC). Látky byly podávány orálně po dobu tří dnů předcházejících podání fruktózy, která byla po ukončení tohoto podávání aplikována po třech hodinách. Pět hodin po podání fruktózy byla všechna zvířata utracena a vzorky krve použity pro zkoušku na triglyceridy metodou popsanou Donabedianem (Donabedian, R.K., Clin. Chem., 20, 632, 1974). Výsledky těchto zkoušek ukazují, že jak glutathion, tak propionylL-karnitin mají na hladinu triglyceridů v séru vyvolanou podáním fruktózy malou účinnost, avšak významnou, pokud se tyto sloučeniny použijí v kombinaci, zvláště v přítomnosti kvasinek. Podstatné snížení triglyceridů bylo ve skutečnosti pozorováno v krvi krys, kterým byla podávána úplná kombinace společně s kvasinkami a aminokyselinami, čímž byl předveden silný synergismus mezi různými složkami této kombinace (viz tabulka 7).

- 15 Tabulka 7

Zkouška na vyvolanou hypertriglyceridemii (mg.ml¹) u krys

Kontrolní	190±6,7
G	180±5,9
YG	175±6,9
PC	185±7,1
YG + PC	155±8,1
AA	185±6,5
CC	140±4,3
CYC	133±6,3

Pokusné zkoušky na atherosklerozu

Metoda použitá na tuto zkoušku byla popsána Malinowem (Malinow, M.R., Atherosclerosis, 48, 105, 1983). Podle této zkoušky byla po dobu šesti týdnů podávána samcům krys chovu Wistar atherogenická strava obsahující 10 % bavlníkového oleje, 24 % kaseinu, 1 % cholesterolu, 60 % cukru a 200 mj.g'¹ > vitaminu D₂ vyvolávající výrazně vaskulární atherosklerotické léze. Ty byly zjištěny na aortě měřením tloušťky abdominální aorty morfometrickou metodou a intenzitou vybarvení vyvolanou Súdánem IV a vyhodnocena jejich závažnost poměrným vyhodnocovacím systémem od 1 do 5.

Použité morfometrické hodnocení a intenzita vybarvení Súdánem IV také v těchto zkouškách vykázaly podstatný synergismus mezi glutathionem (25 mg.kg'¹) a propionyl-L-karnitinem (100 mg.kg'¹), avšak ochranný účinek byl významnější pouze v případě, že byla použita kombinace s kvasinkami. Ve skupině krys s použitým CYC byly projevené vaskulární atherosklerotické léze ve skutečnosti zcela inhibovány, což v tomto případě rovněž prokázalo synergický účinek různých složek kombinace podle tohoto vynálezu.

• · · · « 4 ·· « ·

- 16 Působení proti glycerinem vyvolané nefropatii

Metoda v této zkoušce použitá byla popsána Youngem (Young, Meth.

Find. Exp. Clin. Pharmacol., 13, 23, 1991). Podle této zkoušky vyvolávají glycerinové injekce u krys poruchy ledvin a nefropatii. Tato metoda byla použita k hodnocení ochranných účinků kombinace podle tohoto vynálezu na ledviny. Použité krysy chovu Sprague-Dawley, kterým nebyla po dobu 24 hodin dávána voda k pití dostaly injekci 10 ml.kg'¹ 50 % (hmotn./obj) roztoku glycerinu a vody. Po vstříknutí bylo takto připrayeným krysám umožněno pít. Po 24 hodinách byly zvířatům odebrány vzorky krve, ve které še po centrifugování stanovila v plazmě koncentrace kreatininu (podle metody popsané Tausskym, H.H., Clin. Chem. Acta, 1, 210, 1956) a v moči reakcí s diacetylmonoximem (Henry, R.Y., Cannon, D.C. Eds., Clinical Chemistry, 2. vyd., Harper a Rowe, London, 1974). Po dobu tří dnů předcházejících zkoušce byly denně podávány propionyl-L-karnitin (100 mg.kg'¹), glutathion (50 mg.kg'¹) nebo kvasinky obsahující glutathion (500 mg.kg'¹), aminokyseliny (25 mg.kg'¹), kvasinky (500 mg.kg'¹) a kombinace těchto látek o stejných dávkách. Výsledky této zkoušky (viz tabulka 8) ukazují, že jak propionyl-L-karnitin, tak glutathion mají proti lézím na ledvinách vyvolaným glycerinem doslova ochranný účinek, avšak většího účinku se dosáhne použitím jejich kombinace, a to zvláště v přítomnosti kvasinek. Přítomností aminokyselin vedle kvasinek se dosáhne prakticky úplné ochrany, čímž je demonstrována účinná potenciace aktivity získané kombinací, tedy nejen synergismem, který už tu je, mezi propionyl-L-karnitinem a glutathionem, ale též příznivým účinkem způsobeným kvasinkami a aminokyselinami při jejich zkombinování.

« · * · · · 9 9 • · · · «

9 99 9 9 9 • · · · ··« · 9 9

- 17 Tabulka 8

Ochranný účinek proti glycerinem vyvolané poruše ledvin krys

Působení	Kreatinin	Moč
kontrolní	56,8+7,7	22,2+1,9
glycerin	360,4+55,2	116,7+19,4
propionyl-L-karnitin	280,5+22,5	88,5+11,5
glutathion	240,8+20,9	79,9+9,9
propionyl-L-karnitin + glutathion	185,5+19,2	60,2+6,5
propionyl-L-karnitin + kvasinky (10 % glutathionu)	160,8+16,8	52,5+6,1
aminokyseliny	320,4+50,6	105,5+14,9
propionyl-Lkarnitin +
+glutathion+aminokyseliny + kvasinky	95,4+9,2	38,4+4,1

Vlivy na koncentraci glutathionu (GSH) u starších krys

Od té doby, co je známo, že se metabolické a enzymatická aktivita glutathionu u starších krys snižuje, a toto snížení je jedním z příčin stárnutí, hodnotí se vliv podávání nových přípravků nebo jejich jednotlivých složek na koncentraci glutathionu v plazmě a játrech mladých a starších krys.

Pro tuto zkoušku byly použity dvě různé skupiny krys: mladé krysy (2-3 měsíční) a starší krysy (8-10 měsíců). Koncentrace glutathionu (GSH) byla vypočítávána pro obě skupiny technikou popsanou Moronem (Moron, M.S., Biochem Biophys. Acta, 582, 67, 1979) a to jak před započetím zkoušky, tak po 15 dnech denního podávání propionyl-L-karnitinu (100 mg.kg'¹), glutathionu (50 mg.kg'¹), propionylL-karnitinu s glutathionem nebo kvasinkami obsahujícími 10 % glutathionu (500 mg.kg'¹), aminokyselinami 500 mg.kg'¹), nebo kombinace podle tohoto vynálezu.

Po 15 dnech podávání vykázalo hodnocení koncentrace glutathionu při obnovování normálních koncentrací glutathionu u starších krys reciproční potenciaci propionyl-L-karnitinu a glutathionu jak v játrech (viz tabulka 9), tak

·· ·♦ ·· • · · · * · « ♦ · ♦ · ♦ • · Φ φ 9 · φ

- 18 plazmě (viz tabulka 10). Přesto byl synergismus významnější v přítomnosti kvasinek a aminokyselin, pokud byly přimíšeny do přípravku podle tohoto vynálezu.

Tabulka 9

Vlivy na koncentraci glutathionu (GSH ng.mg'¹ proteinu) v játrech mladých a starších krys

Působení

Mladé krysy čas

Starší krysy čas ..

	0	15 dní	0	15 dní
kontrolní	11,55±0,88	12,75±0,91	8,70±0,72	8,10±0,63
propionyl-L-karnitin	11,25±0,41	12,90±0,71	7,9±0,51	9,3±0,46
glutathion	12,1 ±0,36	12,85±0,66	8,82±0,69	9,90±0,76
propionyl-L-karnitin +	12,70±0,64	13,05±0,55	8,10±0,71	10,50±0,40
glutathion
propionyl-L-karnitin +	11,73±0,49	13,75±0,62	8,75±0,41	10,80±0,71
kvasinky (10 % glutathionu)
aminokyseliny	11,25±0,68	12,68±0,41	8,90±0,57	9,15±0,68
propionyl-L-karnitin +	11,35±0,77	12,45±0,59	8,25±0,61	11,95±0,85

glutathion + aminokyseliny + kvasinky • · • · • 999 9 9 9

9 9 9

9999 99 99 · 9

9 99 9

- 19 Tabulka 10

Vlivy na koncentraci (GSH mg.dl'¹) glutathionu (GSH) v plazmě mladých a starších krys

Působení Mladé krysy Starší krysy

Čas čas

0	15 dní	0	15 dní
kontrolní 2,12±0,59	2,25±0,39	1,39±0,49	1,35±0,55
propionyl-L-karnitin 2,22±0,29	2,39+0,50	í,40±0,22	1,75±0,20
glutathion 2,09±0,31	2,35±0,35	1,26±0,31	1,80±0,41
propionyl-L-karnitin + 2,14±0,21 glutathion	2,40±0,40	1,22±0,21	1,95±0,35
propionyl-L-karnitin + 2 20+0 19 kvasinky (10 % glutathionu)	2,48±0,33	1,35±0,33	2,05±0,29
aminokyseliny 2,27±0,27	2,42±0,29	1,33±0,21	1,40±0,34
propionyl-L-karnitin + 2,10+0,16	2,36±0,26	1,25+0,16	2,25±0,39

glutathion + aminokyseliny + kvasinky

Vliv vstřebávání glutathionu a jeho koncentrace v krvi zvířat zbavených glutathionu

Požadavkem na tuto zkoušku bylo prokázat, že přípravek podle tohoto vynálezu působí příznivě na vstřebávání glutathionu jakožto důsledku přítomnosti kvasinek.

Za tímto účelem byl obsah glutathionu v krví skupiny krysích samců chovu Sprague-Dawley snížen podáváním diethylmaleátu (DEM), který zbavuje glutathionu, technikou popsanou Plummerem (Plummer, J., Chemical depletion of glutathione „in vivo“, Methods in Enzymology, 77, 50, 1981). DEM byl podáván hladovějícím krysám intraperitoneálně v dávkách 1 ml.kg'¹. Půl hodiny po injikování diethylmaleátu jim byl orálně podán samotný glutathion (50 mg.kg'¹) nebo kvasinky obsahující 10 % glutathionu (500 mg.kg'¹) nebo 50 mg.kg'¹ • φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ · · · · • φφφ φφ φφ φφ· ·Φ φφφ

- 20 glutathionu společně s 500 mg kvasinek neobsahujících glutathion. Jiná skupina krys obdržela prekurzory aminokyselin glutathionu (kyselina glutamová 50 mg.kg'¹, glycin 50 mg.kg'¹, cystein 50 mg.kg'¹, hořčík 10 mg.kg'¹) nebo úplnou kombinaci podle tohoto vynálezu ve stejné dávce jak je to popsáno výše.

Po čtyřech hodinách byly zvířatům takto připraveným odebrány vzorky krve a stanovena koncentrace glutathionu v plazmě. Výsledky těchto zkoušek (viz tabulka 11) ukazují, že vstřebávání glutathionu se v přítomnosti kvasinek podstatně zvyšuje a to ať už kvasinky obsahují glutathion nebo jsou použity v jednoduché kombinaci s glutathionem.

Přítomnost kvasinek způsobilo významný vzrůst koncentrace glutathionu v plazmě krys, u nichž byla také koncentrace snížena injekcí DEM.

Tento účinek byl mnohem významnější, pokud byla zvířatům se sníženým obsahem glutathionu podávána úplná kombinace podle tohoto vynálezu.

Tabulka 11

Vlivy působící na koncentraci glutathionu (GSH) v plazmě (GSH mg.dl'¹) krys zbavených glutathionu injikováním diethyimaleátu (DEM). Hodnoty jsou měřeny 4 hodiny po injikování.

glutathion (GSH mg.dl¹) kontrolní 2,70±0,41

DEM 0,61±0,74 propionyl-L-karnitin 0,70±0,54 glutathion 0,95±0,88 kvasinky (10 % glutathion) 1,65+0,90 glutathion + kvasinky 1,85±0,80 aminokyseliny 0,85±0,70 glutathion + aminokyseliny 1,10±0,66 propionyl-L-karnitin + glutathion + 2,15±1,1 aminokyseliny + kvasinky * φ · φ · ·

4 4 44

44444 φ • φφφ • Φ · · Φ· · ·

ΦΦΦ

- 21 Příklady provedení vynálezu

Některé příklady přípravku podle tohoto vynálezu nikterak však neomezující jeho rozsah jsou uvedeny dále.

1) Karnitinová směs (L-karnitin 50 mg, acetyl-L-karnitin 50 mg, propionyl-L-karnitin 50 mg, isovaleryl-L-karnitin 50 mg) kvasinky (obohacené 7 - 10 % glutathionu) kyselina glutamové

L-cystein glycin citran hořečnatý

2) Karnitinová směs (L-karnitin 50 mg, acetyl-L-karnitin 50 mg, propionyl-L-kamitin 50 mg, isovaleryl-L-karnitin 50 mg) glutathion (GHS) kyselina glutamová

L-cystein glycin citran hořečnatý kvasinky (Saccharomyces cerevisians)

20C	i mg
20C	i mg
50	mg
50	mg
50	mg
10	mg

200 mg

50	mg
50	mg
50	mg
50	mg
10	mg
200	i mg

propionyl-L-karnitin	200 mg
kvasinky (obohacené 7 -10 % glutathionu)	200 mg
kyselina glutamová	50 mg
L-cystein	50 mg
glycin	50 mg
citran hořečnatý	10 mg

propionyl-L-karnitin	200 mg
glutathion (GHS)	50 mg
kyselina glutamová	50 mg
L-cystein	50 mg
Glycin	50 mg
citran hořečnatý	10 mg
kvasinky (Saccharomyces cerevisians)	200 mg

0 0

0

0 0

0

0 0 0 ·· 00 ·· • 0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 00 0 0 0

0 0 0

0000 00 00

propionyl-L-karnitin	200 mg
glutathion	100 mg
kyselina glutamová	50 mg
L-cystein	50 mg
glycin	50 mg
citran hořečnatý	10 mg
kvasinky (Saccharomyces cerevisias)	200 mg
propionyl-L-karnitin	200 mg
kvasinky (obohacené 7 -10 % glutathionu)	300 mg
kyselina glutamová	50 mg
L-cystein	50 mg
glycin	. 50 mg
citran hořečnatý	10 mg
propionyl-L-karnitin	200 mg
glutathion (GSH)	100 mg
kyselina glutamová	50 mg
L-cystein	50 mg
glycin	50 mg
citran hořečnatý	10 mg
β-karoten	5 mg
a-karoten	5 mg
koenzym Q10	10 mg
methionát selenu	20 μρ
kvasinky (Saccharomyces cerevisias)	200 mg

propionyl-L-karnitin	200 mg
kvasinky (obohacené 7 -10 % glutathionu)	300 mg
kyselina glutamová	50 mg
L-cystein	50 mg
glycin	50 mg
citran hořečnatý	10 mg
β-karoten	5 mg
a-karoten	5 mg
koenzym Q10	10 mg
vitamin PP	25 mg
vitamin B6	25 mg
vitamin B12	250 μg
methionát selenu	20 μg

•

-23 Farmakologicky přijatelnou solí L-karnitinu nebo alkanoyl-L-karnitinu se míní jakákoliv sůl těchto účinných složek s kyselinou, která nemá nežádoucí toxické nebo vedlejší účinky. Tyto kyseliny jsou farmaceutickým odborníkům známy.

Neomezujícími příklady vhodných solí jsou tyto: chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselý aspartát, citrát, kyselý citrát, vínan, fosforečnan, kyselý fosforečnan, fumarát, kyselý fumarát, glycerofosfát, glukofosfát, mléčnan, maleinát, kyselý maleinát, orotát, šťavelan, kyselý šťavelan, síran, kyselý síran, trichloracetát, trifluoracetát a methansulfonát.

Seznam přijatelných solí schválených FDA je v Int. J. of Pharm., 33, 201 - 217, (1986); tato poslední publikace je zde uvedena jako odkaz.

Přípravek podle tohoto vynálezu může obsahovat také vitaminy, koenzymy, minerální látky a antioxidanty.

Odpovídající excipienty, které se používají k přípravě přípravku podle specifických způsobů podávání jsou odborníkům ve farmacii a potravinářství známé.

•9 00 ·· • · · 0 0 · • 0 0 0 0 • 000 00 0

0 0 0

0000 00 00

Claims (22)

1. Patentové nároky

   1. Přípravek obsahující karnitin a glutathion, vhodný pro zvýšení absorbce glutathionu a zesílení jeho účinků, vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) propionyl-L-kamitin nebo jeho farmakologicky přijatelnou sůl; a (b) glutathion nebo kvasinky obsahující glutathion;

   (c) kvasinky prosté glutathionu, pokud složka (b) obsahuje glutathion.
2. 2. Přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že složka (a) dále obsahuje „karnitin“ vybíraný ze skupiny sestávající z L-karnitinu, acetyl-L-karnitinu, valeryl-L-karnitinu, isovaleryl-L-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelných solí.
3. 3. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že složka (a) obsahuje směs Lkarnitinu, acetyl-L-karnitinu a propionyl-L-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelné sole.
4. 4. Přípravek podle nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že kvasinky obsahující glutathion mají od 7 do 10 % hmotnostních glutathionu.
5. 5. Přípravek podle nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr (a): (b) : (c) se pohybuje od 100 : 1 : 100 do 1 : 10 : 10 a přednostně od 10 : 1 : 10 do 1 : 1 : 1.
6. 6. Přípravek podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje:

   (d) alespoň jeden z prekurzorů biosyntézy glutathionu vybíraný ze skupiny sestávající z kyseliny glutamové, cysteinu a hořčíku.

   • fl flflfl * flfl ·· • fl

   - 25
7. 7. Přípravek podle nároku 6 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr (a) : (d) se pohybuje od 1 : 1 do 1 : 0,5.
8. 8. Přípravek podle nároků 1 a 6 vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) propionyl-L-karnitin nebo jeho farmakologicky přijatelnou sůl;

   (b) glutathion;

   (c) kvasinky prosté glutathionu vybírané ze skupiny sestávající ze Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces fragilis;

   (d) kyselinu glutamovou, glycin, cystein a hořčík.
9. 9. Přípravek podle nároků 1,4 až 6, vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) propionyl-L-karnitin nebo jeho farmakologicky přijatelnou sůl;

   (b) kvasinky obsahující 7 až 10 % hmotnostních glutathionu;

   (c) kyselinu glutamovou, glycin, cystein a hořčík.
10. 10. Přípravek podle nároků 1, 3 až 6, vyznačující se tím, že obsahuje:

    (a) směs L-karnitinu, acetyl-L-karnitinu, propionyl-L-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelných solí;

    (b) glutathion;

    (c) kvasinky prosté glutathionu vybírané ze skupiny sestávající ze Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces fragilis;

    (d) kyselinu glutamovou, glycin, cystein a hořčík.
11. 11. Přípravek podle nároků 1, 3 až 6, vyznačující se tím, že obsahuje:

    (a) směs L-karnitinu, acetyl-L-karnitinu, propionyl-L-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelné sole;

    (b) kvasinky obsahující 7 až 10 % hmotnostních glutathionu;

    (c) kyselinu glutamovou, glycin, cystein a hořčík.
12. 12. Přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že se farmakologicky přijatelná sůl L-karnitinu nebo alkanoyl-L-karnitinu vybírá ze skupiny obsahující: chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselý aspartát, citrát, kyselý citrát, vínan, fosforečnan, kyselý fosforečnan, fumarát, kyselý fumarát, ·· ·· ·♦ φ φφ • · · φ «φφφ · φ φ φφφ · · φ · φ φ φφφ φφφ φφφφ • φφφφ φ φ • ΦΦΦ φφ φφ φφφ φφ φ

    - 26 glycerofosfát, glukofosfát, mléčnan, maleinát, kyselý maleinát, orotát, šťavelan, kyselý šťavelan, síran, kyselý síran, trichloracetát, trifluoracetát a methansulfonát.
13. 13. Přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje vitaminy, koenzymy, minerální látky a antioxidanty.
14. 14. Přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že jej lze podávat orálně ve fořmě doplňkové výživy.
15. 15. Přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že jej lze podávat orálně, parenterálně, rektálně nebo transdermálně ve formě léčiva.
16. 16. Doplňková výživa podle nároku 14 k prevenci hepatosy, nefropatie a kardiovaskulárních nebo cerebrálních poruch zaviněných změněným metabolismem odpovídajících orgánů nebo vyvolaný toxickými látkami.
17. 17. Léčivo podle nároku 15 k terapeutické léčbě hepatosy, nefropatie a kardiovaskulárních nebo cerebrálních poruch zaviněných změněným metabolismem odpovídajících orgánů nebo vyvolaný toxickými látkami.
18. 18. Doplňková výživa podle nároku 16 vyznačující se tím, že je ve formě tablet, tabulek, pilulek, tobolek, granulí nebo sirupů.
19. 19. Léčivo podle nároku 17 vyznačující se tím, že je ve formě tablet, tabulek, pilulek, tobolek, granulí, sirupů čípků, fiól nebo kapek.
20. 20. Použití kombinovaného přípravku složeného z:

    (a) propionyl-L-karnitinu nebo jeho farmakologicky přijatelné sole;

    (b) glutathionu nebo kvasinek obsahujících glutathion;

    (c) kvasinek prostých glutathionu, pokud složka (b) obsahuje glutathion;

    99 9« • 9 9 9

    9 9 9 • · · · · • · ·«** 99 • 9 • . 9 ·· • * • ·

    9 9 • 9

    9 9 9

    9 9 99 9

    - 27 k přípravě doplňkové výživy nebo léčiva vhodného ke zvýšení absorbce glutathionu a zvýšení jeho koncentrace v tkáních.
21. 21. Použití přípravku podle nároku 20 vyznačujícího se tím, že kombinace obsahuje dále;

    (d) alespoň jeden z prekurzorů biosyntézy, glutathionu vybíraného ze skupiny sestávající z kyseliny glutamové, glyčinu, cysteinu a hořčíku,. ..
22. 22. Použití podle nároků 20 nebo 21 vyznačující se tím, že doplňková výživa nebo léčivo jsou vhodné k prevenci nebo léčbě hepatosy, nefropatií a kardiovaskulárních nebo cerebrálních poruch způsobených změnami metabolismu odpovídajících orgánů nebo vyvolané toxickými látkami.