CZ20004427A3 - Nové efektory dipeptidylpeptidasy IV - Google Patents

Abstract

Peptidové sloučeniny resp. dipeptidovým sloučeninám analogických sloučenin, které jsou tvořeny aminokyselinou a thiazolidinovou nebo pyrrolidinovou skupinou ajejich solí a použití sloučenin pro ošetřování porušené tolerance glukosy, glukosurie, hyperlipidemie, metabolických azidos, diabetes mellitus, diabetické neuropatie a nefropatic právě tak jako následných onemocnění savců, které diabetes mellitus způsobil

Description

Nové efektory dipeptidylpeptidázy IV

Oblast techniky

Předložený vynález se týká dipeptidových sloučenin resp. dipeptidovým sloučeninám analogických sloučenin, které jsou tvořeny aminokyselinou a thiazolidinovou nebo pyrrolidinovou skupinou a jejich solí, v dalším uváděných jako dipeptidové sloučeniny, a použití těchto sloučenin pro ošetřování porušené tolerance glukosy, glukosurie, hyperlipidemie, metabolických azidos, diabetes mellitus, diabetické neuropatie a nefropatie právě tak jako následných onemocnění savců, které diabetes mellitus způsobil.

Vynález se také týká jednoduchého způsobu pro snížení koncentrace cukru v krvi savců pomocí dipeptidových sloučenin jako účinnost snižujících efektorů (substráty, pseudosubstráty, inhibitory, vazebné proteiny, protilátky a j.) pro enzymy se srovnatelnou nebo identickou aktivitou s enzymatickou aktivitou enzymu dipeptidyl peptidázy IV.

Dosavadní stav techniky

DP IV-aktivita resp. DP IV-analogická aktivita (např. cytosolická DP II má substrátovou specifitu téměř identickou s DP IV) se vyskytuje v krevním oběhu, kde vysoce specificky odštěpuje dipeptidy z N-zakončení biologicky aktivních peptidů, když v jejich sekvenci představují prolin nebo alanin zbytky sousedící s N-koncovou aminokyselinou.

Na glukose závislé insulinotropní polypeptidy: gastrický inhibiční polypeptid 142 (GIP1-42) a glukagonu podobný peptid-amid-1 7-36 (GLP-1₇.₃₆), tedy hormony, které stimulují glukosou indukovanou sekreci insulinu pankreatem (nazývané také inkretiny), jsou substráty DP IV, protože tato může in vitro a in vivo odštěpovat z Nkoncových sekvencí těchto peptidů dipeptidy tyrosinyl-alanin a histidyl-alanin.

Snížení DP IV- resp. DP IV-analogické enzymové aktivity tohoto druhu ke štěpení takových substrátů in vivo může sloužit k účinnému potlačování nežádoucí aktivity enzymu v laboratorních podmínkách a také při patologických stavech organismu savců. Např. diabetes mellitus typu II (také stařecký diabetes) spočívá na ·· ·· » · · ( ► · · ι b 9 9 « • · snížené sekreci insulinu, resp. poruchách funkce receptoru, které jsou mezi jiným založeny na proteolyticky podmíněných anomáliích koncentrace inkretinů.

Hyperglykemie a s tím spojené příčiny resp. následné projevy (také diabetes mellitus) se podle současného stavu techniky léčí podáváním insulinu (např. isolovaného z hovězího pankreatu nebo materiálu získaného genovou technikou) nemocným organismům v různých aplikačních formách. Všechny dosud známé stejně jako moderní postupy se vyznačují vysokým vynaložením materiálu, vysokými náklady a často rozhodujícími poškozeními životní kvality pacienta. Klasická metoda (denní intravenosní injekce insulinu běžná od třicátých let) léčí akutní symptomy nemoci, avšak po delším používání vede mezi jiným k těžkým cévním změnám (arteriosklerose) a nervovým poškozením.

Nověji se navrhuje instalace subkutánních depotních implantátů (podávání insulinu probíhá dávkovaně a odpadají denní injekce) jakož i implantace (transplantace) intaktních Langerhansových buněk do slinivky břišní s porušenou funkcí, nebo jiných orgánů a tkání. Takové transplantace jsou technicky nákladné. Vedle toho dále představují s risikem spojený chirurgický zásah do organismu příjemce a vyžadují i při přesazení buněk metody k potlačení resp. obejití imunitního systému.

Použití alanyl-pyrrolididu a isoleucyl-thiazolididu jako inhibitorů DP IV- resp. DP IV-analogické enzymové aktivity je již známo z PCT/DE 97/00820 a použití isoleucyl-pyrrolididu a hydrochloridu isoleucyl-thiazolididu již z DD 296 075. Za tohoto stavu techniky se u nasazovaného isoleucyl-thiazolididu jedná o přírodní, tedy L-threo-isoleucyl-thiazolidid: k datu priority a také ke dni podání přihlášky obou tiskovin byla k disposici jenom tato přírodní forma isoleucyl-thiazolididu.

Bylo zjištěno, že tyto sloučeniny, zejména L-threo-isoleucyl-thiazolidid, jsou dobrými efektory DP IV- resp. DP IV-analogické enzymové aktivity. Při používání těchto sloučenin mohou u některých pacientů resp. forem nemoci však vzniknout jisté problémy:

podle symptomů a závažnosti např. diabetes mellitus by bylo např. žádoucí mít k disposici efektory, které by vyvíjely jiný účinek než známé sloučeniny: tak je známo, že pacienti s diabetes mellitus musí být individuálně nastaveni, aby se umožnilo optimální léčení jejich nemoci. Tak např. u některých případů musela dostačovat snížená aktivita DP IV efektorů. Příliš vysoká aktivita inhibitoru a permanentní podávání téhož medikamentu mohly také, zejména vzhledem k celoživotní aplikaci, • · · • · 11 mít za následek nežádoucí vedlejší účinky. Dále by mohlo být žádoucí zlepšit určité transportní vlastnosti pro zvýšení rychlosti resorpce efektorů in vivo.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je proto poskytnout nové (zejména účinnost snižující) efektory pro léčení poškozené tolerance glukosy, glukosurie, hyperlipidemie, metabolických azidos, diabetes mellitus, diabetické neuropatie a nefropatie, stejně jako následných onemocnění savců způsobených diabetes mellitus a poskytnout jednoduchý způsob pro léčení těchto nemocí.

Podle vynálezu je tento úkol řešen poskytnutím dipeptidových sloučenin resp. analogů dipeptidů, které jsou tvořeny aminokyselinou a thiazolidinovou nebo pyrrolidinovou skupinou, a jejich solí.

Zejména při orální aplikaci těchto efektorů savcům jsou vlivem DP IV nebo DP IV podobných enzymů méně odbourávány endogenní (nebo dodatečně exogenně podané) insulinotropní peptidy GIP1-42 a GLP-I7.36 (nebo také GLP-17.37 anebo jejich analogy) a tím se zmenšuje resp. zpomaluje úbytek koncentrace těchto peptidových hormonů resp. jejich analogů. Podkladem vynálezu je také zjištění, že snížení DP IV nebo DP IV podobné enzymatické aktivity působící v krevním oběhu, vede k ovlivňování hladiny cukru v krvi. Bylo nalezeno, že:

1. snížení DP IV nebo DP IV analogické enzymatické aktivity vede k relativnímu zvýšení glukosou stimulovaných nebo externě dodaných inkretinů (nebo jejich analogů) tj. aplikací efektorů DP IV nebo DP IV analogických proteinů může být ovládáno odbourávání inkretinů v krvi;

2. zvýšená biologická stabilita k odbourávání inkretinů (nebo jejich analogů) má za následek změnu účinku endogenního insulinu;

3. zvýšení stability inkretinů dosažené snížením DP IV nebo DP IV analogické enzymatické aktivity v krvi, vyúsťuje do následné změny glukosou indukovaného účinku insulinu a takto, s pomocí DP IV- efektorů, vede ke kontrolovatené modulaci hladiny krevního cukru.

Hodí se pro to zejména dipeptidové sloučeniny podle vynálezu, u nichž je aminokyselina volena z přírodní aminokyseliny jako je leucin, valin, glutamin, prolin, isoleucin, asparagin nebo asparagová kyselina.

Co nejmožnější orální aplikace vysoce afinních, nízkomolekulárních enzymových inhibitorů je z hlediska nákladů příznivější alternativou např. invasivních chirurgických technik léčení patologických jevů. Chemickým designem vlastností z hlediska stability, transportu a čistění může být jejich způsob účinku modifikován a přizpůsoben individuálním vlastnostem.

Jak bylo vpředu zmíněno, může být např. při dlouhodobém léčení diabetes mellitus žádoucí poskytnout efektory s definovanou aktivitou, se kterými mohou být vyplněny individuální potřeby pacienta resp. ošetřeny symptomy. Dipeptidové sloučeniny podle vynálezu vykazují proto při koncentraci (dipeptidových sloučenin) 10 μΜ , zejména při podmínkách udávaných v tabulce 1, snížení aktivity dipeptidylpeptidázy IV resp. DP IV analogických enzymových aktivit nejméně o 10 %, preferuje se nejméně o 40 %. Často je žádoucí snížení aktivity nejméně o 60 % resp. nejméně o 70 %. Preferované efektory mohou také vykazovat snížení aktivity maximálně o 20 % resp. 30 %. Dále pak jsou transportní vlastnosti předložených sloučenin zřetelně zlepšovány zejména peptidovým transportérem Pep T1.

Zvláště preferovanými dipeptidovými sloučeninami jsou L-allo-isoleucylthiazolidid a jeho soli. Tyto sloučeniny vykazují v poměru k L-threo-isoleucylthiazolididu při přibližně stejně velkém účinku vzhledem k modulaci glukosy, překvapivě, přibližně pětkrát zlepšený transport peptidovým transportérem Pep T1.

Další preferované sloučeniny jsou uvedeny v tabulce 1.

Solemi dipeptidových sloučenin podle vynálezu mohou být např. organické soli jako acetáty, sukcináty, tartaráty nebo fumaráty nebo anorganické zbytky solí jako fosforečnany nebo sírany. Zvláště preferovány jsou fumaráty, které mají vynikající účinek při překvapivě vysoké stabilitě vůči hydrolýze a jsou podstatně méně rozpustné než hydrochloridy. Tyto vlastnosti jsou výhodou i při galenice.

Dále se dává přednost L-threo-isoleucyl-pyrrolididu a jeho solím, zejména fumarátům a L-allo-isoleucyl-pyrrolididu a jeho solím, zejména fumarátům.

Soli dipeptidových sloučenin mohou být v molárním poměru složka dipeptidu (analogu) ke složce solné 1 :1 nebo 2:1. Solí tohoto typu je např. (Ile-Thia)2.fumarová kyselina.

Zvláště oblíbenými solemi jsou soli kyseliny fumarové s L-threo-isoleucylthiazolididem a s L-allo-isoleucyl-thiazolididem.

Vynález se takto týká efektorů aktivity dipeptidyl peptidáfy IV (DP IV) resp.

enzymové aktivity analogické DP IV a jejich využití k poklesu hladiny krevního cukru

99 pod koncentraci glukosy v séru organismu savce charakteristickou pro hyperglykemii. Zvláště se vynález týká použití efektorů aktivity dipeptidyl peptidásy IV (DP IV) resp. enzymové aktivity analogické DP IV podle vynálezu pro zabraňování nebo zmírňování patologických anomálií látkové výměny u organismů savců jako např. porušené tolerance glukosy, glukosurie, hyperlipidemie, metabolických azidos, diabetes mellitus, diabetické neuropatie a nefropatie právě tak jako následných onemocnění savců, které diabetes mellitus způsobil. V další oblíbené formě provedení se vynález týká způsobu pro snižování hladiny krevního cukru pod koncentraci glukosy v séru organismu savce charakteristickou pro hyperglykemii, které se vyznačuje tím, že se organismu savce aplikuje terapeuticky účinné množství nejméně jednoho efektorů aktivity dipeptidyl peptidásy IV (DP IV) resp. enzymové aktivity analogické DP IV podle vynálezu. V další oblíbené formě provedení se vynález týká farmaceutických komposic, tedy medikamentů, které obsahují nejméně jednu sloučeninu podle vynálezu nebo jejich solí případně v kombinaci s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a/nebo rozpouštědly.

Farmaceutické komposice mohou existovat např. jako parenterální nebo enterální formulace a obsahovat odpovídající nosiče resp. mohou existovat jako orální formulace, které mohou obsahovat vhodné, pro orální aplikaci vhodné nosiče. Komposice existují obzvláště jako orální formulace.

Dodatečně mohou farmaceutické směsi obsahovat jednu nebo více hypoglykemicky působících účinných látek, které samy o sobě mohou být známými účinnými látkami.

Efektory aktivity dipeptidylpeptidásy IV (DP IV), resp. DP IV analogické enzymové aktivity podle vynálezu, mohou být použity pro snížení hladiny krevního cukru pod koncentraci glukosy v séru organismu savce, charakteristickou pro hyperglykemii, resp. ke zhotovení příslušného medikamentu.

Podle vynálezu aplikované efektory dipeptidylpeptidásy IV (DP IV), resp. DP IV analogické enzymy, mohou být nasazovány ve farmaceuticky použitelných formulacích nebo formulačních komplexech jako inhibitory, substráty, pseudosubstráty, inhibitory exprese DP IV, vazebné proteiny nebo protilátky těchto enzymových proteinů nebo kombinace z těchto různých látek, které v organismu savce snižují koncentraci DP IV resp. koncentraci DP IV analogických proteinů. Podle vynálezu jsou efektory např. DP IV inhibitory jako dipeptidové deriváty, resp. dipeptidová mimetika, L-allo-isoleucyl-thiazolidid a v tabulce 1 uvedené efektory a • 444 • 4 · 4 4 4 4 4 • · 4 4 4 4*4444 • · 44 4444

4444 4 ··· ···· ·· ·· jejich fumaráty. Efektory podle vynálezu umožňují individuálně nastavitelné ošetřování pacientů resp. nemocí, při čemž je možné vyhnout se zejména individuálně se vyskytujícím nesnášenlivostem, alergiím a vedlejším účinkům.

Sloučeniny vykazují také rozdílný časový průběh účinnosti. Tím je v rukou ošetřujícího lékaře možnost diferencovaně reagovat na individuální situaci pacienta: na jedné straně může přesně nastavit rychlost nástupu účinku a na druhé straně dobu působení a zejména sílu účinku.

Způsob podle vynálezu představuje nový způsob přístupu ke snižování zvýšené koncentrace krevní glukosy v séru savců. Je jednoduchý, komerčně využitelný a vhodný k použití při terapii, zvláště nemocí, které spočívají na nadprůměrných hodnotách krevní glukosy savců a zejména pak vhodný v humánní medicině.

Efektory se podávají např. ve formě farmaceutických preparátů, které obsahují účinnou látku v kombinaci s obvyklými, podle stavu techniky známými materiály nosičů. Aplikují se na příklad parenterálně (např. i.v. ve fysiologickém roztoku kuchyňské soli) nebo enterálně (např. orálně, formulované s obvyklými materiály nosičů jako např. glukosou).

V závislosti na jejich endogenní stabilitě a jejich biovyužitelnosti se musí podávat jedna nebo více dávek efektorů za den, aby se dosáhlo požadované normalisace hodnot krevní glukosy. Takové rozpětí dávek může být u lidí v rozsahu od 0,1 mg až do 30 mg za den, vhodněji pak v rozsahu 0,01 mg až 10 mg substance efektorů na kilogram tělesné hmotnosti.

Bylo nalezeno, že s podáváním efektorů dipeptidylpeptidázy DP IV nebo DP IV analogických enzymových aktivit v krvi savce a jimi s tím spojené snížení aktivity má za příčinný následek, že vlivem DP IV nebo DP IV podobných enzymů jsou méně odbourávány endogenní (nebo dodatečně exogenně podané) insulinotropní peptidy, gastrický inhibiční polypeptid 1-42 (GIP1-42) a glukagonu podobný peptid-amid-1 736 (GLP-I7-36) (nebo také GLP-I7-37 anebo jejich analogy) a tím se zmenšuje resp. zpomaluje úbytek koncentrace těchto peptidových hormonů resp. jejich analogů. Účinkem DP IV efektorů dosažená zvýšená stabilita (endogenně přítomných nebo exogenně dodaných) inkretinů nebo jejich analogů, které jsou takto ve zvýšené míře k disposici pro insulinotropní stimulaci inkretinových receptorů Langerhansových buněk, mění mezi jiným účinnost tělu vlastního insulinu, což sebou přináší stimulaci metabolismu sacharidů ošetřovaného organismu.

··· ·

Výsledkem je pokles hladiny krevního cukru v séru ošetřovaného organismu pod koncentraci glukosy charakteristickou pro hyperglykemii. Tímto mohou být bráněny resp. zmírňovány anomálie látkové výměny jako porušená tolerance glukosy, glukosurie, hyperlipidemie, stejně jako těžké metabolické azidosy a diabetes mellitus a těch původců nemocí, které jsou následkem po delší čas zvýšené koncentrace glukosy v krvi.

V řadě orálně účinných antidiabetik, známých podle současného stavu techniky, není dosud známa tímto způsobem účinná třída nízkomolekulárních substancí (s výjimkou biguanidu Metforminu, molekulová hmotnost 130). Molekulární hmotnosti aminoacyl-thiazolididů se pohybují mezi 146 (glycyl-thiazolidid), 203 (isoleucyl-thiazolidid) a 275 ( tryptofanoyl-thiazolidid). Ve srovnání s tím se molekulové hmotnosti sulfonylmočovin (Glybenclamid: 494), sacharidů (Acarbose: 630) i thiazolidindionů (Pioglitazon: 586) pohybují v rozmezí 500 až 700 Da. Fysiologicky jsou aminoacyl-thiazolidy aminopeptidázami stejně jako kyselou hydrolýzou hydrolyzovány na tělu vlastní látky, jako aminokyseliny a cysteamin, takže používání sloučenin podle vynálezu jako orálně použitelných antidiabetik představuje obohacení farmacie.

U krys a myší je experimentálně indukovaná hyperglykemie podle vynálezu použitými sloučeninami nadprůměrně dobře ošetřovatelná (tabulky 2 a 3). Podávání pětisetnásobku až tisícinásobku účinné dávky nevedlo k žádné prokazatelné patologické změně během třítýdenních toxikologických experimentů na krysách a myších.

Výhodný účinek sloučenin podle vynálezu na DP IV je příklady doložen v tabulce 1:

• 99 ·

9

9 9 9 9 9 * · 9 9 9

9999 99 99

Tabulka 1

Účinek různých efektorů na dipeptidyl- peptidázou IV katalyzovanou hydrolýzu 0,4 mM substrátu H-Gly-Pro-pNA při 30°C, pH 7,6 a iontové síle 0,125

Efektor	Afinita efektorů k DP IV : Ki [nM]	Zbytková účinnost DP IV v přítomnosti 10 μΜ efektorů
Metformin	» 1,000.000	100
Glibenclamid	» 1,000.000	100
Acarbose	» 1,000.000	100
H-Asn-pyrrolidid	12.000	83,1
H-Asn-thiazolidid	3.500	47,2
H-Asp-pyrrolidid	14.000	81,6
H-Asp-thiazolidid	2.900	45,6
H-Asp(NHOH)-pyrrolidid	13.000	88,2
H-Asp(NHOH)-thiazolidid	8.800	54,5
H-Glu-pyrrolidid	2.200	38,5
H-Glu-thiazolidid	610	25,0
H-Glu(NHOH)-pyrrolidid	2.800	44,9
H-Glu(NHOH)-thiazolidid	1.700	36,5
H-His-pyrrolidid	3.500	49,7
H-His-thiazolidid	1.800	35,2
H-Pro-pyrrolidid	4.100	50,2
H-Pro-thiazolidid	1.200	27,2
H-lle-azididid	3.100	43,8
H-lle-pyrrolidid	210	12,3
H-L-allo-lle-thiazolidid	190	10,0
H-Val-pyrrolidid	480	23,3
H-Val-thiazolidid	270	13,6

Je známo, že aminoacyl-pyrrolididy a aminoacyl-thiazolididy mohou být odbourávány enzymy prolin aminopeptidázou a prolidázou, přítomnými v buňkách sliznice tenkého střeva, v séru a jaterních buňkách, a že thiazolidinový kruh je v přítomnosti kyselin (na příklad v žaludku) náchylný ke štěpení za vzniku adekvátního • φ

ΦΦ φ φφφφφ η · φ φ φφφφφφ • φ φ φφφφ φφ φ φφφφφφφ φφ φφ cysteaminového derivátu (viz US 458407). Proto bylo překvapující, že po podání per os byla zjištěna na dávce závislá účinnost účinných látek. Na dávce závislý účinek

L-allo-lle-thiazolididu na aktivitu DP IV v séru po orální aplikaci L-allo-isoleucylthiazolididu krysám Wistar je doložen následující tabulkou:

Tabulka 2

Zbytková reaktivita DP IV v séru proti 0,4 mM substrátu H-Gty-Pro-pNa při 30°C a iontové síle 0,125 po orální dávce a v závislosti na dávce L-allo-isoleucyl-thizolididu, stanoveno 30 min po aplikaci inhibitoru.

Dávka na pokusné zvíře	Zbytková účinnost DP IV v %
0 mg	100
2,5 mg	52
5,0 mg	40
10 mg	28
20 mg	29

Vysloveně překvapující a žádoucí je u diabetického zvířecího modelu docílený, glukosu redukující účinek účinné látky podle vynálezu, L-allo-isoleucylthizolididu, po její orální aplikaci při časově stejné orální glukosové stimulaci (tabulka 3).

Pro zesílení účinku různých antidiabetik snižujícího krevní cukr, se často nasazují kombinace různých orálně účinných antidiabetik. Protože se antihyperglykemické působení efektorů podle vynálezu rozvíjí nezávisle na jiných známých orálně aplikovatelných antidiabetikách, hodí se účinné látky podle vynálezu analogicky v odpovídající galenické formě k nasazení při kombinovaných terapiích pro docílení žádaného normoglykemického efektu.

Podle vynálezu používané sloučeniny mohou být takto o sobě známým způsobem převedeny do obvyklých formulací jako např. tablet, kapslí, dražé, pilulek, čípků, granulátů, aerosolů, sirupů, kapalných, tuhých a krémovitých emulsí a suspensí a roztoků za použití inertních, netoxických, farmaceuticky vhodných nosičů a přídavných látek nebo rozpouštědel. Při tom příslušně výhodná koncentrace terapeuticky účinných sloučenin leží mezi asi 0,1 až 80, zvláště pak mezi 1 až 50

99

9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 >9 9 hmotnostními procenty celkové směsi, tj, v množstvích, která dostačují, aby se dosáhl udaný rozsah pro dávkování.

9« 999«

9999 9

999 9999

Tabulka 3

Redukce cirkulující krevní glukosy během 60 min po orální aplikaci 20 μΜ L-allo-llethiazolididu u různých krysích zvířecích modelů při časově stejném testu tolerance na glukosu (údaje jsou v % vztažených na normoglykemické hodnoty).

Zvířecí model	Koncentrace glukosy v % kontrola	Koncentrace glukosy v % u ošetřených L-allo-lle- thiazolididem
Krysa Wistar, normální	100	82
Krysa Wistar ( diabetes model 2b, tlustá)	100	73

Dobrá resorpce podle vynálezu používaných sloučenin sliznicemi gastrointestinálního traktu umožňuje používání mnoha galenických přípravků: jako medikament mohou být substance používány ve formě dražé, kapslí, žvýkacích kapslí, tablet, kapek, sirupu, ale také jako čípky nebo jako nosní spreje.

Formulace se zhotovují na příklad nastavováním účinné látky s rozpouštědly a/nebo nosiči, případně za použití emulgátorů a/nebo dispergačních prostředků, při čemž např. při použití vody jako ředidla mohou být případně použita organická rozpouštědla jako pomocné prostředky pro rozpuštění.

Jako pomocné látky mohou být na příklad uvedeny: voda, netoxické organická rozpouštědla jako parafiny (např. ropné frakce), rostlinné oleje (např. řepjDvý olej, podzemnicový olej, sezamový olej), alkoholy (např. ethylalkohol, glycerol), glykoly (např. propylenglykol, polyethylenglykol); tuhé nosiče jako např. přírodní minerální moučky (např. vysocedispersní kyselina křemičitá, silikáty, cukry (např. surový cukr, mléčný cukr a hroznový cukr); emulgační prostředky jako neionogenní a aniontové emulgátory (např. polyoxyethylen estery mastných kyselin, polyoxyethylen ethery mastných alkoholů, alkylsulfonáty a arylsulfonáty), dispergační prostředky (např. lignin, sulfitové louhy, methylcelulosa, škroby a polyvinylpyrrolidon) a antiadhesiva ·« ··«* • · « ·· « · 4 · 4 · • « · ····· 4 * 9 9 9 9 9 9 9 ΐ » « ·4 · * 9 9 ···· · ..........* (např. magnesium stearát, mastek, kyselina stearová a laurylsulfát sodný) a případně aromatisující látky.

Aplikace probíhá obvyklým způsobem, zejména enterálně nebo parenterálně, zvláště pak orálně. V případě enterálního použití mohou tablety vedle vyjmenovaných nosičů obsahovat další dodatky jako citrát sodný, uhličitan vápenatý a fosforečnan vápenatý, spolu s různými přídavnými látkami jako škroby, obzvláště bramborovým škrobem, želatinou a podobnými. Spolu s tím mohou být k tabletování spolupoužívány antiadhesiva jako stearát hořečnatý, laurylsulfát sodný a mastek. V případě vodných suspensí a/nebo tinktur, které jsou určeny pro orální aplikaci, mohou být účinné látky mimo shora vyjmenovaných pomocných látek dodatečně doplněny různými chuť zlepšujícími prostředky a barvivý.

Pro parenterální použití mohou být roztoky účinných látek aplikovány spolu s kapalnými nosiči. Jako výhodné se obecně prokázalo podávat pro dosažení efektivních výsledků při intravenosní aplikaci množství asi 0,01 až 2,0 mg/kg tělesné hmotnosti, zvláště pak asi 0,01 až 1,0 mg/kg tělesné hmotnosti za den a při enterální aplikaci obnáší dávkování asi 0,01 až 2,0 mg/kg tělesné hmotnosti, zvláště pak asi 0,01 až 1,0 mg/kg tělesné hmotnosti za den.

Přesto může být v určitých případech žádoucí odchýlit se od udaných množství a sice v závislosti na tělesné hmotnosti pokusného zvířete nebo pacienta, resp. od aplikační cesty, ale také na základě druhu zvířete a jeho individuálního chování vůči medikamentu, resp. intervalu, v němž podávání probíhá. Tak v některých případech může být dostačující vycházet s menším než shora jmenovaným množstvím, zatímco v jiných případech musí být shora uvedená horní hranice překročena. V případě aplikace větších množství je doporučení hodné rozdělit tato množství do více jednotlivých dávek přes den. Pro aplikaci v humánní medicíně se pro dávkování předpokládá stejný prostor. Při tom logicky platí i zde shora uvedené vývody.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1. Dělení isomerů isoleucyl-thiazolididu kapilární zónovou elektroforesou. Obrázek 2. Dělení fumarátu Ile-Thia kapilární zónovou elektroforesou.

Obrázek 3. Aktivita DP IV po orálním podávání různých stereoisomerů H-lle-Thia krysám.

Obrázek 4. Účinek různých aminoacyl-thiazolididů na toleranci glukosy u krys.

Příklady provedení vynálezu

1. Kapsle se 100 mg L-allo-isoleucyl-thiazolididu na kapsli:

Pro cca 10 000 kapslí byl připraven roztok následujícího složení:

Hydrochlorid L-allo-isoleucyl-thiazolididu Glycerol

Polyethylenglykol

Voda

1,0 kg 0,5 kg 3,0 kg 0.5 kg

5,0 kg

Roztok byl o sobě známým způsobem plněn do měkkých želatinových kapslí. Kapsle jsou vhodné k rozkousání nebo polknutí. .

2. Tablety resp. potahované tablety nebo dražé se 100 mg L-allo-isoleucylthiazolididu:

Následující množství se vztahují na výrobu 100 000 tablet:

Jemně mletý hydrochlorid L-allo-isoleucyl- thiazolididu 10,0 kg

Glukosa 4,35 kg

Mléčný cukr 4,35 kg

Škrob 4,50 kg

Jemně mletá celulosa 4,50 kg

Shora uvedené součásti byly promíseny a potom opatřeny roztokem připraveným z polyvinylpyrrolidonu 2,0 kg polysorbátu 0,1 kg a vody cca 5,0 kg • * • · · · • · · · · · · ···· • * φ Φ···· φ · · · φ · · φ · · • φ φφ ····

..... ...........

a ο sobě známým způsobem granulovány tím, že vlhká masa byla nastrouhána a po přidání 0,2 kg stearátu hořečnatého usušena. Hotová směs pro tabletování (30,0 kg) se zpracuje na vyklenuté tablety o hmotnosti 300 mg. Tablety se mohou o sobě známým způsobem potahovat nebo dražovat.

Technická data preferovaných sloučenin jsou uvedena dále.

Údaje z výzkumu fumarátu Ile-Thia (isomery) a jiných solí

Substance	Ki	B.t. (°C)	CE (min)	MS	[a] H2O
L-threo-IT*F	8.10’8	150uyG	160	203	-10,7(405 nm)
D-threo-IT*F	žádné potlačení	147	158	203	nestanoveno
L-allo-IT*F	2.10'z	145-6	154	203	-4,58 (380 nm)
D-allo-IT*F	žádné potlačení	144-6	150	203	4,5 (380 nm)

IT*F = fumarát isoleucyl-thiazolididu.

NMR a HLPC data potvrzují, že se jednalo o odpovídající substance.

Podmínky měření pro stanovení Kj substancí

Enzym:

DPIVp_ras_ečí ledvina, 0,75 mg/ml, 18 U/ml (GPpNA) v 25 mM Tris pH 7,6, 30 % síranu amonného, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTE.

Zásobní roztok: 1 : 250 zředěno do pufru pro měření.

Pufr:

mM HEPES pH 7,6, I = 0,125 (KCI).

Substrát:

GPpNA. HCI Zásobní roztok: 2,1 mM

Měřící aparatura:

Perkin-Elmer Bio Assay Reader, HTS 7000 Plus

T = 30°C λ = 405 nm

Násada k měření:

100 μΙ pufru

100 μΙ substrátu (3 různé koncentrace 0,8 mM - 0,2 mM) μΙ voda / inhibitor (7 různých koncentrací 2,1 μΜ - 32,8 nM) • ·· · μΙ enzymu

Pufr, voda/inhibitor a enzym byly předtemperovány na 30°C a reakce byla nastartována přidáním rovněž předtemperovaného substrátu. Byla provedena čtyřnásobná stanovení. Doba měření byla 10 min.

Stanovení bodu tání

Body tání byly stanovovány na Koflerově bloku s vyhřívaným stolkem mikroskopu akciové společnosti Leica, hodnoty nejsou korigovány anebo byly stanoveny na DSC-přístroji (u Heumann Pharma).

Optická rotace

Hodnoty otáčivosti při rozdílných vlnových délkách byly odčítány na přístroji Polarimetr 341 nebo vyšším, od fy Perkin Elmer.

Podmínky měření hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektra byla snímána na API 165 resp. API 365 fy PE Sciex pomocí ionisace elektrosprejem (ESI). Pracovalo se přibližnou koncentrací c = 10 pg/ml, substance byla vzata do MeOH / Η₂Ο 50:50 a 0,1 % HCOOH, infuse se prováděla vstřikovací pumpou (20 μΙ/min). Měření probíhala v positivním modu [M+Hf, ESI napětí bylo U = 5600 V.

Soli vykázaly následující data:

IT*sůl	Ki	M (gmol1)	B.t. (°C)
Sukcinát	5,1 e-8	522,73	116
Tartarát	8,3 e-8	352,41	122
Fumarát	8,3 e-8	520,71	156
Hydrochlorid	7,2 e-8	238,77	169
Fosfát	1,3 e-7	300,32	105

Zkoumání rozpustnosti solí lle-thia

Fumarát Ile-Thia (lle-Thia*Fum)

Navážka 10,55 mg, odpovídá 0,02 mmol (520,72 g/mol) přídavek 100 μΙ H2Odest

100 μΙ žádný roztok, opticky žádné povrchové smáčení od 200 μΙ postupný počátek rozpustnosti při 400 μΙ se pozoruje úplné rozpuštění • · · · • · · · ·

2,63 %

U této soli bylo také pozorováno, že je stěží smáčitelná a nerozkládá se. Sukcinát Ile-Thia (lle-Thia*Succ)

Navážka 16,6 mg, odpovídá 0,031 mmol (522,73 g/mol) přídavek 16 μΙ H₂Odest μΙ žádný roztok, opticky nasátí vlhkosti od 66 μΙ -1,5 ml nepozorováno žádné úplné rozpouštění substance

Tartarát Ile-Thia (lle-Thia*Tartarat)

Navážka 17,3 mg, odpovídá 0,049 mmol (352,41 g/mol) přídavek 100 μΙ H₂Odest 100 μΙ úplné rozpuštění 17,3%

Fosfát Ile-Thia (lle-Thia*Phos)

Navážka 15,5 mg, odpovídá 0,051 mmol (300,32 g/mol) přídavek 100 μΙ H₂Odest

100 μΙ pozoruje se nástup rozpouštění postupné přidávání 100 μΙ H₂O při 400 μΙ úplné rozpuštění

3,87 %

Hydrochlorid Ile-Thia (lle-Thia*HCI)

Navážka 16,1 mg, odpovídá 0,067 mmol (238,77 g/mol) přídavek 100 μΙ H₂Odest při 100 μΙ úplné rozpuštění 16,1%

Obecná syntéza solí Ile-Thia

Boc-chráněná aminokyselina Boc-lle-OH se předloží do ethylesteru kyseliny octové a násada se ochladí na cca -5°C. Přikape se N-methylmorfolin a za konstantní teploty se přikape chlorid kyseliny pivalové (Labor) resp. neohexanoylchlorid (Technikum). Pro aktivaci se reakce několik minut míchá. Po sobě se přidají N-methylmorfolin (Labor) a thiazolidin hydrochlorid (Labor) a přidá se • « · · • · thiazolidin (Technikum). Zpracování v laboratoři se provádí klasicky solnými roztoky a v provoze se násada čistí roztoky NaOH a CH3COOH.

Odštěpení chránící Boc-skupiny se dosáhne s HCI / dioxan (v laboratoři) resp. s H2SO4 (v provoze).

V laboratoři se hydrochlorid krystaluje z EtOH / ether.

V provoze se volný amin získá přídavkem NaOH / NH3. Kyselina fumarová se rozpouští v horkém ethanolu, přikape se volný amin a vypadne (lle-Thia)₂-fumarát (M = 520,71 gmol'¹)

Analytika isomerů resp. enantiomerů se provádí elektroforesou.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY (Původní)

   1. Dipeptidová sloučenina, která je tvořena aminokyselinou a thiazolidinovou nebo pyrrolidinovou skupinou a její soli.
2. 2. Dipeptidová sloučenina podle nároku 1, kde aminokyselina je volena z přírodní aminokyseliny.
3. 3. Dipeptidová sloučenina podle některého z předcházejících nároků, která při koncentraci 10 μΜ způsobuje úbytek aktivity dipeptidylpeptidázy IV resp. DP IV analogické enzymové aktivity nejméně 10 %.
4. 4. Dipeptidová sloučenina podle nároku 3, která způsobuje úbytek aktivity nejméně 40%.
5. 5. Dipeptidová sloučenina podle některého z předcházejících nároků, kde aminokyselina je volena z leucinu, valinu, glutaminu, prolinu, isoleucinu, asparaginu a kyseliny asparagové.
6. 6. Dipeptidová sloučenina podle některého z předcházejících nároků, totiž L-threo-isoleucyl-pyrrolidid, L-alIó-isoleucyl-thiazolidiď, L-allo-isoleucyl- pyrrolidid a jejich soli.
7. 7. Dipeptidová sloučenina podle některého z předcházejících nároků, kde solemi jsou organické soli jako acetáty, sukcináty, tartaráty nebo fumaráty anebo soli anorganických kyselin jako fosforečnany nebo sírany.
8. 8. Soli dipeptidových sloučenin podle některého z předchozích nároků, které existují v molárním poměru dipeptidové komponenty ke komponentě soli 1 :1 nebo 2:1.

   původní nároky ·# ··»♦ • · · · « · • · · « 9

   44 4 444 4 • 9 44

   4 9 9

   4 4 4

   4 4 4

   4 4 4 9

   44 44
9. 9. Soli dipeptidových sloučenin podle některého z předchozích nároků, totiž soli s kyselinou fumarovou.
10. 10. Soli dipeptidových sloučenin podle nároku 9, totiž soli kyseliny fumarové a L-threo-isoleucyl-pyrrolididu nebo soli kyseliny fumarové a L-alloisoleucyl-thiazolididu.
11. 11. Farmaceutická komposice vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jednu sloučeninu nebo její soli podle některého z předcházejících nároků, případně v kombinaci s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a/nebo rozpouštědly.
12. 12. Farmaceutická komposice podle nároku 11 vyznačující se tím, ž e se jedná o nosič pro parenterální nebo enterální formulace.
13. 13. Farmaceutická komposice podle nároku 9 vyznačující se tím, že existuje jako formulace pro orální aplikaci.
14. 14. Farmaceutická komposice podle některého z nároků 11 až 13 vyznačující se tím, že dodatečně obsahuje hypoglykemicky působící účinnou látku.
15. 15. Použití nejméně jedné sloučeniny nebo komposice podle některého z předcházejících nároků pro výrobu medikamentu pro snížení aktivity dipeptidylpeptidázy IV resp. dipeptidylpeptidáze IV analogických enzymových aktivit.
16. 16. Použití nejméně jedné sloučeniny nebo komposice podle některého z nároků 1 až 14 pro výrobu medikamentu pro snížení hladiny krevního cukru pod koncentraci glukosy v séru savce, charakteristickou pro hyperglykemii.
17. 17. Použití nejméně jedné sloučeniny nebo komposice podle některého z nároků 1 až 14 pro výrobu medikamentu pro orální ošetřování poruch látkové výměny, které mají souvislost s diabetes mellitus.

    původní nároky ·· ···· • · * · · * · « · · 4 .·· · ·»·*· • · · · *«·*·· dQ ·· ·» ·«··

    I £7 ··«· · *·· »··* «· ·φ
18. 18. Použití nejméně jedné sloučeniny nebo komposice podle některého z nároků 1 až 14 pro výrobu medikamentu pro ošetřování porušené tolerance glukosy, glukosurie, hyperlipidemie, metabolických azidos, diabetes mellitus, diabetické neuropatie a nefropatie, právě tak jako jako následných onemocnění savců, které diabetes mellitus způsobil.