CZ2000401A3 - Zkrácené deriváty lidského insulinu - Google Patents
Zkrácené deriváty lidského insulinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2000401A3 CZ2000401A3 CZ2000401A CZ2000401A CZ2000401A3 CZ 2000401 A3 CZ2000401 A3 CZ 2000401A3 CZ 2000401 A CZ2000401 A CZ 2000401A CZ 2000401 A CZ2000401 A CZ 2000401A CZ 2000401 A3 CZ2000401 A3 CZ 2000401A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- phe
- gly
- phenh
- insulin
- phenhi2
- Prior art date
Links
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title abstract 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical group N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 abstract 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 abstract 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
(5 7) Anotace:
Zkrácené deriváty lidského insulinu obecného vzorce I X - G1 - Y , kde X=desoktapeptidinsulin, Y=Phe-Phe-PheNH2 (látka I) nebo Phe-Phe-N(CH3)PheNH2 (látka II) nebo Phe-N(CH3)Phe-PheNH2 (látka III). Způsob výroby těchto derivátů, kde se desoktapeptid isulinu kondenzuje s tetrapeptidy vzorce glyPhe-Phe-Phe-NH2 nebo Gly-Phe-Phe-N(CH3)PheNH2 nebo Gly-Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2 v přítomnosti tosylfenylalaminchlorketon trypsinu v 50 až 65 %ním dimethylformanidu při teplotě 4 až 25 °C po dobu 3 až 24 h., načež se vzniklé produkty isolují, zejména vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi.
• · · · • ·
Zkrácené deriváty lidského inzulínu • · · · * · · ·· ···· ·· ··
PV 2fiOĎ-lfOl
Oblast techniky
Vynález se týká nových semisyntheticky připravených zkrácených derivátů lidského insulinu.
Dosavadní stav techniky
Krácení karboxyterminální sekvence B-řetězce lidského insulinu je možné, ale má ve vztahu k biologickému účinku své limity. Kritická délka B řetězce insulinu je 25 aminokyselin a to ještě za předpokladu, že koncový karboxyl fenylalaninu 25 je amidován
23 24 25 26 27 28 29 30
-----Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr no 7
Jiné řešení je zachování sekvence B - B . U analogu lidského insulinu připravených semisyntheticky z desoktapeptid insulinu a tetrapeptidů je viditelnější dopad následných záměn provedených v dané oblasti molekuly lépe než je tomu u despentapeptid analogů lidského insulinu (CZ Užitný vzor 6381). V CZ užitném vzoru č. 6381 byla pozornost soustředěna na destetrapeptid insuliny, v jejichž karboxyterminální části B-řetězce B23-B26 byla modifikována NH - skupiny peptidová vazba, tj. byl substituován vodík methylovou skupinou. Cílem bylo zajistit vyšší metabolickou stabilitu proti endopeptidasovému štěpení. Zavedením N-methylované aminokyseliny (N(CH3)fenylalaninu) do jednotlivých posic bezpochybně zvýší odolnost vazeb vůči chymotrypsinu, ale odrazí se v prostorovém uspořádání té části řetězce, která je považována za rozhodující pro interakci insulinového analogu s receptorem. Zavedením N-methylované aminokyseliny ztrácí peptidová vazba schopnost tvořit vodíkový můstek. Se změnou konformace peptidové vazby je spojena změna lokální flexibility peptidového řetězce a vzroste hydrofobicita peptidu.
• · • · · · « ·
Postupem peptidové synthesy na pevné fázi byly připraveny tři analogy sekvence b23-B26, které byly pomocí enzymově katalysované semisynthesy připojeny na karboxyl argininu B . Produkty byly isolovány a charakterisovány.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou zkrácené deriváty lidského insulinu obecného vzorce I
X - Gly - Y (I) kde X=desoktapeptidinsulin,
Y=Phe-Phe-PheNH2 (látka I) nebo
Phe-Phe-N(CH3)PheNH2 (látka II) nebo Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2 (látka III)
Tetrapeptidy, které se připraví synthesou na pevné fázi se kondensují s desoktapeptid insulinem v přítomnosti tosylfenylalaninchlorketon trypsinu v 50-65% DMF při teplotě 4-25°C po dobu 3-24 hodin. Vzniklé produkty se isolují, zejména vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi.
Příklady provedení
Vysvětlení zkratek
Boc - t-Butoxycarbonyl,
DIEA - Diisopropylethylamin,
DCM - Dichlormetan,
HOBt ester - Hydroxybenztriazolový ester,
DCC - Dicyklohexylkarbodiimid,
DMF - Dimethylformamid,
DMAP - Dimethylaminopyridin,
TFA - Kyselina trifluoroctová,
RP-HPLC - Vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reversní fázi,
TPCK - Tosylfenylalaninchlorketon • · • · · · • · • · · · · · · •· ·· ·· ····
Příklad 1
Tetrapeptidy byly synthesovány na pevné fázi dle Merrifielda. K synthese byla použita 4-methylbenzhydrylaminová (MBHA) pryskyřice (substituce 0,57 mmol/g). Jako semipermanentní N-koncové chránění byla použita t-butyloxykarbonylová skupina (Boc). Synthesa byla prováděna v 0,3 mmol měřítku. Byl použit následující protokol synthesy. Pryskyřice byla neutralisována opakovaným promytím 10% DIPEA v DCM (2x5 min), potom byla promyta DCM (3x1 min). Poté byl do reaktoru s pryskyřicí přidán trojnásobný molární přebytek HOBt esteru chráněné aminokyseliny. Reakce probíhala 1 hodinu. (Ester byl připraven z Boc-aminokyseliny a HOBt působením DCC ve směsi DCM-DMF (9:1), reakční doba byla 30 minut při 0°C. Od vzniklého esteru byla odfiltrována vysrážená dicklohexylmočovina, tato promyta DCM a filtrát zahuštěn za laboratorní teploty a poté přidán DMF do výsledné koncentrace přibližně 0,1 M. Výjimkou byly kondensace Boc-N(CH3)Phe, kdy kondensace byla prováděna buď činidlem ByBrop/DMAP nebo HBTU/DIEA. Průběh reakce byl sledován kvalitním Kaiserovým testem, pouze však při kondensaci nemethylováných aminokyselin. Pokud byl test negativní, následoval další reakční krok. V případě positivního nálezu byla kondensační reakce opakována. Po ukončení výstavby peptidového řetězce byla odštěpena N-koncová Boc skupina působením 50% TFA v DCM, reakce probíhala 25 min. Poté se pryskyřice promyla DCM, 4x1 min, objem DCM byl vždy 50 ml. Pryskyřice byla vysušena do konstantní váhy. Odštěpení peptidů z nosiče spolu s odštěpením chránících skupin v postranních řetězcích bylo provedeno kapalným fluorovodíkem ve směsi s anisolem (9:1) při 0°C. Flurovodík byl vyfoukán dusíkem při O°C a anisol extrahován vychlazeným diethyletherem (4 x 50 ml). Uvolněné peptidy byly extrahovány 20% kyselinou octovou (5 x 50 ml), pryskyřice odfiltrována a roztok peptidu lyofilisován. Čistota peptidu byla kontrolována stanovením aminokyselinového složení, RP-HPLC a hmotovou spektrometrií.
• · * · • ·
Příklad 2
Příprava [Gly23-Phe24-Phe25-Phe26-NH2] destetrapeptid B27-B30 insulinu. Pro přípravu tohoto kráceného analogu byl použit následující protokol. 23mg tetrapeptidu bylo smícháno s 195 μΐ DMF a 55 μΐ 0,05M a CaCl2. Bylo přidáno 22 mg desoktapeptid insulinu (DOI) a reakční směs jemně protřepána.
mg TPCK-trypsinu byly rozpuštěny v 50 μΐ 0,05 M CaCl2 a přidány do reakční směsi. pH reakční směsi bylo upraveno N-methylmorfolinem na hodnotu 7.0. Reakce probíhala za míchání po dobu 3 až 24 hodin, konverse byla monitorována. Reakce byla zastavena přidáním 1 ml acetonu. Sraženina byla odstředěna a supernatant oddělen, sraženina byla opětovně promyta 1 ml acetonu. Sediment byl rozpuštěn v 1,2 ml 10% kyseliny octové a výsledný roztok byl jímán a lyofilizován. Výsledný produkt byl charakterizován RP-HPLC, hmotovou spektrometrií a kapilární elektroforesou.
Příklad 3
Příprava [Gly23-Phe24-Phe25-N(CH3)Phe26-NH2]destetrapeptid B27-B30 insuiinu. io mg peptidu bylo rozpuštěno v 98 μΐ DMF a přidáno 27 μΐ 0,05M CaCl2. Poté bylo přidáno 9,1 mg DOI, šetrně zamícháno a přidáno 1,5 mg TPCK trypsinu rozpuštěného v 25 μΐ 0,05 M CaCl2. Poté bylo postupováno postupem uvedeným v příkladu 2. Reakční doba byla nejméně 3 hodiny, teplota byla mezi 5-25°C.
Příklad 4
Příprava [Gly23-Phe24-N(CH3)Phe25-Phe26-NH2]destetrapeptid dju insulin, llmg příslušného tetrapeptidu bylo rozpuštěno ve 110 μΐ DMF a přidáno 30μ1 0,05 M CaCl2· Poté bylo postupováno dle příkladu 2. Reakční doba byla nejméně 3 hodiny při teplotě 5-25°C.
·· ··« · • * • · • * · · · · · ···· ·· ·· · * ·»*» · · · ·
Příklad 5
Kapilární zonová elektroforesa (CZE). Analysa čistoty připravených peptidů byla prováděna metodou CZE se zdrojem vysokého napětí 0-15 kV. Separačním prostorem byla křemenná kapilára s vnějším polyimidovým povlakem o vnitřním průměru 0,056 mm, vnějším průměrem 0,200 mm, celkové délce 315 mm a efektivní délce (od startu k detektoru) 200 mm. Peptidy byly analysovány v 0,5M kyseliny octové, nebo v roztoku o složení 0,04 M Tris a 0,04 M Tricinu pH 8,1. Vzorek byl nanášen manuálně a měření bylo prováděno při laboratorní teplotě. Separace probíhala v režimu konstatního napětí 10,0 kV a proud dosahoval hodnot 9,5-10,8 μΑ. Detekce byla prováděna spektrofotometricky při 206 nm.
Příklad 6
Hmotová spektra jednotlivých peptidů. Měření bylo prováděno metodou FAB, která spočívá v ionisaci testovaných vzorků pomocí urychlených atomů xenonu. Vzorek byl umístěn na glycerinovou matrici. Snímání spekter bylo prováděno vícekanálovou analysou při nízké rozlišovací schopnosti. Byl použit třísektorový hmotový spektrometr YAB-EQ s geometrií BEQQ vyrobený firmou VG Analytical Manchester. Iontový zdroj pracoval při urychlovacím napětí 8 kV.
Příklad 7
Aminokyselinové složení peptidů. Peptidy byly hydrolysovány v 6 M HCI při teplotě 110°C po dobu 20 hodin a jednotlivé aminokyseliny separovány na přístroji D-500 (Durrum corp.) Zastoupení prolinu a cystinu nebylo vyhodnocováno ·*·« *· «· ·· ·· ’ * · · · * · »·«· ··· ·· > e»*4 ·· ·· ·· ·*·· *· ··
Průmyslová využitelnost
Zkrácené deriváty lidského insulinu podle vynálezu lze využít pro základní biochemický a farmakologický výzkum a jako látky s hormonálním účinek.
Claims (2)
1. Zkrácené deriváty lidského insulinu obecného vzorce I
X - Gly - Y (I) kde X=desoktapeptidinsulin,
Y=Phe-Phe-PheNH2 (látka I) nebo
Phe-Phe-N(CH3)PheNH2 (látka II) nebo Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2 (látka III)
2. Způsob výroby zkrácených derivátů lidského insulinu podle nároku 1 vyznačující se tím, že se desoktapeptid insulinu kondenzuje s tetrapeptidy vzorce Gly-Phe-Phe-Phe-NH2 nebo Gly-Phe-Phe-N(CH3)PheNH2 nebo Gly-Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2 v přítomnosti tosylfenylalaminchlorketon trypsinu v 50-65%ním dimethylformanidu při teplotě 4-25°C po dobu 3-24 h, načež se vzniklé produkty isolují, zejména vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na revezní fázi.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20000401A CZ296065B6 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského inzulinu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20000401A CZ296065B6 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského inzulinu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000401A3 true CZ2000401A3 (cs) | 2001-09-12 |
| CZ296065B6 CZ296065B6 (cs) | 2006-01-11 |
Family
ID=5469491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20000401A CZ296065B6 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského inzulinu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ296065B6 (cs) |
-
2000
- 2000-02-03 CZ CZ20000401A patent/CZ296065B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ296065B6 (cs) | 2006-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5478810A (en) | Peptide amides, processes for the preparation thereof and agents containing these as fibrin/thrombin clotting inhibitors | |
| Marshall et al. | Synthesis of angiotensins by the solid-phase method | |
| Beyermann et al. | Rapid continuous peptide synthesis via FMOC amino acid chloride coupling and 4-(aminomethyl) piperidine deblocking | |
| McMurray | Solid phase synthesis of a cyclic peptide using Fmoc chemistry | |
| Hojo et al. | Development of a Linker with an Enhanced Stability for the Preparation of Peptide Thioesters and Its Application to the Synthesis of a Stable-Isotope-Labelled HU-Type DNA-Binding Protein. | |
| AU2017286333B2 (en) | Metabolically stable spexin peptide analogs | |
| Aimoto et al. | Development of a facile method for polypeptide synthesis. Synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI). | |
| Moroder et al. | Studies on cytochrome c. Part II. Synthesis of the protected heptapeptide (sequence 17–23) of Baker's yeast iso‐1‐cytochrome c | |
| CN108047323B (zh) | 一种固相片段法合成GpTx-1及其类似物和合成方法 | |
| Vita et al. | Synthesis of charybdotoxin and of two N‐terminal truncated analogues: Structural and functional characterisation | |
| XUE et al. | Synthesis of S‐alkyl and C‐terminal analogs of the Saccharomyces cerevisiae a‐factor: Influence of temperature on the stability of Fmoc and OFm groups toward HF | |
| EP1756141B1 (en) | Process for the preparation of peptides | |
| CZ2000401A3 (cs) | Zkrácené deriváty lidského insulinu | |
| CZ9735U1 (cs) | Zkrácené deriváty lidského insulinu | |
| Cordeau et al. | Selenazolidine: A selenium containing proline surrogate in peptide science | |
| Pawlak et al. | Synthesis of a novel side‐chain to side‐chain cyclized enkephalin analogue containing a carbonyl bridge | |
| Wong et al. | Synthesis of a fully active snake venom cardiotoxin by fragment condensation on solid polymer | |
| Hendrix et al. | Synthesis of a protected peptide corresponding to residues 1-25 of the. beta.-amyloid protein of Alzheimer's disease | |
| CA2113313A1 (en) | Pentapeptide with specific conformaton, its production and use | |
| RU2096415C1 (ru) | Циклические пептиды или их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция | |
| Mezö et al. | Cyclohexyloxycarbonyl based orthogonal solid phase peptide synthesis in Boc chemistry | |
| CZ10670U1 (cs) | Zkrácené deriváty lidského insulinu | |
| US7193039B2 (en) | Synthesis of a potent parmagnetic agonist (epm-3) of the melanocyte stimulating hormone containing amino acid-type stable free radical | |
| Byrnes et al. | SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF DENDROTOXIN: A POTENT POTASSIUM CHANNEL | |
| Szewczuk et al. | New conformationally restricted analog of the immunosuppressory mini-domain of HLA-DQ and its biological properties |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20000203 |