CZ20003803A3 - Izolovaný polypeptid, izolovaný analog polypeptidu, izolovaný imunogenní polypeptid, izolovaná nukleová kyselina, vektor, hostitelský vektorový systém, protilátka, farmaceutický prostředek, způsob vyvolání imunitní odpovědi, způsob zabránění infekce, vakcína a způsob léčení - Google Patents

Abstract

Izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů a derivátů. Izolované polypeptidy, které obsahují aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, přičemž si zachovávají svou přirozenou terciální strukturu, a popisuje způsoby jejich přípravy. Izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, přičemž polypeptid má lektinovou aktivitu a neváže cholin. Izolovaný imunogenní polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin. Farmaceutické prostředky, vakcíny a metody pro diagnostické a terapeutické použití při léčení infekcí způsobených pneumokokovou bakterií.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká obecně polypeptidu na N-konci zkráceného proteinu A, který váže cholin. Vynález se také týká vakcín, které poskytují ochranu nebo vyvolávají ochranné protilátky proti bakteriální infekci, zvláště proti infekci pneumokokem, protilátek a antagonistů proti tomuto polypeptidu, pro použití v diagnóze a pro pasivní imunní terapii. Polypeptid a/nebo nukleová kyselina, která polypeptid kóduje, jsou také užitečné jako kompetitivní inhibitory bakteriálního adhezinu pneumokoků. Konečně je tento vynález zaměřen na léčení pomocí polypeptidu.

Dosavadní stav techniky

Streptococcus pneumoniae je gram pozitivní bakterie, která je hlavní příčinou invazivních infekcí, jako jsou sepse, meningitida, zánět středního ucha a lalokového zánětu plic (Tuomanen a kol., NEJM 322:1280-1284, 1995). Pneumokoky se dychtivě vážou na buňky horního a dolního dýchacího systému. Jako u většiny bakterií, navazování pneumokoků k lidským buňkám je podmíněno přítomností bakteriálních povrchových proteinů, které se vážou na cukry eukaryotů stejným způsobem jako lektin (Cundell, D. & Tuomanen E. (1994) Microb. Pathog. 17:361-374). Pneumokoky se vážou na nezanícený epitel, tento proces je možno posuzovat jako bezpříznakové nosičství. Bylo předpokládáno, že přechod k invazivní nemoci zahrnuje místní produkci zánětiivých faktorů, které při aktivaci lidské buňky změní počet a typ receptorů, které jsou na lidských buňkách k dispozici (Cundell, D. a kol., (1995) Nátuře, 377:435-438). V tomto novém uspořádání pneumokoky využijí příležitost a získají výhodu tím, že se naváží na jeden z těchto neregulovaných receptorů, na receptor faktoru aktivujícího destičky (PAF) (Cundell, D. a kol., (1995) Nátuře, 377:435-438). Během několika minut po objevení PAF receptoru pneumokoky prodělají cykly zesílené adherence a invaze • · · · • ·

do buněk. Inhibice vazby bakterií na aktivované buňky, například rozpustnými analogy receptorů, blokuje u zvířecích modelů vývoj směrem k nemoci (Idanpaan-Heikkila, I. a kol., (1997) J. Infect. Dis., 176:704-712). Zvláště účinné v tomto ohledu jsou rozpustné sacharidy obsahující lakto-N-neotetraózu, buď s další siaiovou kyselinou nebo bez ní, které zabraňují navázání pneumokoků na lidské buňky in vitro a in vivo zabraňují kolonizaci v plicích.

Proteiny, které vážou cholin: kandidát strukturálního genu pro adhezin:

Pneumokoky vytvářejí rodinu povrchových proteinů, které mají schopnost se vázat na povrch bakterií pomocí nekovalentního spojení s teichoovou kyselinou nebo lipoteichoovou kyselinou v bakteriální stěně. Povrch Streptococcus pneumoniae je posázen rodinou proteinů CBPs (proteiny, které vážou cholin), které jsou nekovalentně vázány k fosforylcholinu. CbpA (75 kD) je na povrchu exponovaný protein, který váže cholin, který vykazuje chimemí stavbu. Je zde jedinečná N-koncová doména oblasti bohaté na prolin, která je následována C-koncovou doménou, která obsahuje 10křát se opakující oblast, odpovědnou za vazbu k cholinu.

CbpA je adhezin (ligand) pro receptory obsahující glykokonjugáty, které jsou přítomné na povrchu eukaryotíckých buněk. Mutanty s defekty v cbpA vykazovaly na modelu krysích mláďat sníženou virulenci při kolonizaci nosohltanu. Tato vazba směřuje na cholinové determinanty, které nasedají na kyselinou teichoovou a je zprostředkována charakteristickou částí domény, která váže cholin a je přítomna v každém z členů této rodiny proteinů. Doména, která váže cholin, byla objevena a plně charakterizována Lopezem a kol. při jeho studiích autolytického enzymu (Ronda a kol. (1987) Eur. J. Biochem. 164:621-624). Jinými proteiny, které obsahují tuto oblast, jsou autolyzin pneumokokového fága a ochranný antigen, pneumokokový povrchový antigen A (PspA) (Ronda, C. a kol. (1987) Eur. J. Biochem. 164:621-624 a McDaniel, L.

S. a kol., (1992) Microb. Pathog. 13:261-269). CbpB není schopen kolonizovat oblast nosohltanu, která je sdílena s jiným členem jeho rodiny, pokud se týká C-konce), ale jeho aktivita vazby na lidské buňky má původ v jeho jedinečné N-koncové doméně. Protože proces kolonizace a postupu k nemoci závisí primárně na připojení pneumokoka na lidskou buňku, zrušení funkce N-koncové domény, buď křížově reagující protilátkou nebo kompetitivní inhibici pomocí peptidu napodobujícího doménu, může být pro blokování onemocnění kritické. Použití proteinů, které vážou cholin, pro vakcíny proti pneumokokům je diskutováno v mezinárodní PCT přihlášce č.

• · · · · · · · · · · · ·· · ·· · · ···· • · · ····· • * · · ······

3··· ·· ···· ··· ·· ··· ···· ·· ··

PCT/US97/07198 a tato PCT přihláška Je plně zahrnuta jako odkaz. Běžné vakcíny proti S. pneumoniae používají čištěné sacharidy z pouzder 23 nejběžnějších serotypů této bakterie, aie tyto vakcíny chrání pouze v 50 % (Shapiro a kol. NJEM 325:1453, 1991) a nejsou imunogenní u dětí mladších než 2 roky. Léčebný polypeptid by měl dále poskytnout možnost léčby v případech infekce multirezistentními organizmy. Proto předkládaný vynález naplňuje dlouho pociťovanou potřebu ochranných vakcín.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin. Polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedena v SEQ ID NOS: (sekvence číslo) 1, 3 až 7 nebo 9 až 11, včetně jejích fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů. Tento vynález také poskytuje izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin a má aminokyseliny, jak je uvedeno v SEQ ID NO: 24, kde polypeptid vykazuje svou terciální strukturu a způsoby přípravy takového polypeptidu. Izolovaný polypeptid je vhodný pro imunizování zvířat a lidí proti bakteriální infekci, zvláště infekci pneumokoky.

Z dalšího hlediska se předkládaný vynález rozšiřuje na N-konec zkráceného proteinu A, který má však lektinovou aktivitu a nikoli aktivitu, která váže cholin. Dále předkládaný vynález poskytuje imunogenní N-konec zkráceného proteinu A, který váže cholin, nebo fragment takovéhoto proteinu.

Předkládaný vynález se také vztahuje na izolované nukleové kyseliny, jako jsou rekombinantní molekuly DNA nebo klonované geny, nebo jejich degenerované varianty, mutanty, analogy nebo jejich fragmenty, které kódují izolovaný polypeptid nebo které kompetitivně inhibují aktivitu polypeptidu. Je výhodné, když izolovaná nukleová kyselina, která zahrnuje jejich degenerované varianty, varianty, mutanty, analogy nebo fragmenty, má sekvenci jaká je uvedena v SEQ ID NOS: 12,14 až 17,19 až 22 nebo 23. V jiném provedení vynálezu, celková DNA sekvence rekombinantní molekuly DNA nebo tak určeného klonovaného genu může být operativně vázána k sekvenci kontrolující expresi, která může být vnesena do vhodného hostitele. Vynález se proto rozšiřuje na jednobuněčné hostitele transformované klonovaným genem nebo • · · · ·

rekombinantní molekulou DNA, která obsahuje DNA sekvenci, která je předmětem tohoto vynálezu, a zvláště DNA sekvence nebo jejich fragmenty, vybrané ze sekvencí, uvedených výše.

Protilátky proti izolovanému polypeptidu zahrnují přirozeně vzniklé a rekombinantním způsobem připravené protilátky.Tyto mohou zahrnovat jak polyklonální tak monoklonální protilátky, připravené známými genovými technikami, rovněž tak bispecifické (chimerní) protilátky a protilátky mající jinou funkčnost, které jsou použity pro diagnostické účely, spolu s jejich schopností modulovat adherencí bakterií mimo jiné včetně jejich působení jako kompetitivní činidla.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je poskytnout metodu pro léčení savců tím, že bude možno kontrolovat množství nebo aktivitu bakterií nebo jejich subjednotek, a tak léčit nebo odvrátit nepříznivé následky invazivních, spontánních nebo samostatně vzniklých patologických stavů. Tento vynález poskytuje farmaceutické prostředky vhodné pro použití v léčebných metodách, které obsahují nebo jsou založeny na izolovaných polypeptidech, jejich subjednotkách nebo jejich vazebných partnerech.

Tento vynález poskytuje farmaceutické prostředky, vakcíny, a diagnostické a léčebné metody, které je používají.

Podrobný popis

Předkládaný vynález je zaměřen na izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin. Polypeptidy jsou vhodné pro použití při imunizaci zvířat proti pneumokokové infekci. Tyto polypeptidy nebo jejich peptidové fragmenty, když jsou připraveny s vhodným adjuvans, jsou použity ve vakcínách pro ochranu proti pneumokokům a proti jiným bakteriím s křížově reagujícími proteiny.

Tento vynález poskytuje izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin. V jenom provedení má polypeptid aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 1, 3 až 5, 7 nebo 9 až 11, včetně jejich fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů. V jiném provedení má polypeptid aminokyselinu KXXE (SEQ ID NO: 6).

Tento vynález poskytuje izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, která je uvedena na obrázku 2. V jenom provedení má polypeptid aminokyselinovou sekvenci, která je konzervativní oblastí, která je uvedena na obrázku 2. Například

4 4 4 konzervativní oblastí, která je uvedena na obrázku 2. Například konzervativní oblasti zahrnují mimo jiné aminokyselinovou sekvenci 158 až 210; 158 až 172; 300 až 321; 331 až 339; 409 až 427 a 430 až 447. Obrázek 2 uvádí homologie různých serotypů nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence N-koncové oblasti CbpA, který je uvažován v tomto vynálezu.

Dále tento vynález poskytuje izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu, který váže cholin a má aminokyseliny, jak je uvedeno v sekvenci SEQ ID NO: 24, kde polypeptid vykazuje svoji terciální strukturu. V jenom provedení je polypeptid jeho analog, fragment, mutanta nebo varianta. Uvažované varianty jsou uvedeny na obrázku 2. Tento vynález také poskytuje izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu, který váže cholin a má aminokyseliny od pozice 16 do pozice 475 serotypů 4, jak je uvedeno na obrázku 2 nebo odpovídající aminokyseliny serotypů 4, jak je ukázáno na obrázku 2, kde polypeptid vykazuje svoji terciální strukturu. V jenom provedení terciální struktura odpovídá struktuře přítomné v nativním proteinu.

Způsoby přípravy polypeptidu jsou například následující: štěpení celé molekuly proteinu A, který váže cholin, pomocí hydroxylaminu, přičemž hydroxylamin štěpí protein A, který váže cholin, u aminokyseliny asparagin (N) na pozici 475 v serotypů R6x a serotypů 4, nebo u aminokyseliny odpovídající aminokyselině serotypů R6x nebo serotypů 4 v jiném serotypů, jak je ukázáno na obrázku 2, a tak vytvoření zkráceného proteinu A, který váže cholin. Alternativní způsoby, kterými se vytvoří zkrácený protein A, který váže cholin nebo jeho fragment a uchová se jeho nativní terciální struktura (tj. nativní terciální struktura celé molekuly proteinu A, který váže cholin) jsou uvažovány také a jsou známy osobám se zkušeností v tomto oboru. Protože si polypeptid uchová svou terciální strukturu, izolovaný polypeptid je vhodný pro použití jako imunogen pří imunizaci zvířat a lidí proti bakteriální infekci, zvláště pneumokokové.

Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci proteinu A, který váže cholin (CbpA), serotyp typu 4 je následující:

ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESY

AKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAV

SKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKD

QKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAE

AEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGEL • · • · • · · · · · · · • · · · ······ β ········· v ··· ·· ··· ···· ·· ·· ,! ATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKE EDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAE VESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPAPKAE KPAPAPKPEN (SEQ ID NO 24).

„Polypeptid R2“ označuje polypeptid, obsahující aminokyselinové sekvence od pozice 16 do pozice 444 z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin (CbpA) serotypu typu 4 (viz obrázek 1), který má následující sekvenci:

ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESY

AKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAV

SKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKD

QKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAE

AEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGEL

ATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKE

EDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAE

VESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPA (SEQ ID NO 1).

DNA sekvence, která kóduje polypeptid R2 z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin (CbpA) serotyp typu 4:

GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGA

AAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGA

GATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTG

AGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTA

GTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGA

ATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAA

AAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAA

GTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAAC

AAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTG

AAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAA

CTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCG

ATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAA

CGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAG

AGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTG

AAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAG

GTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAAC

ACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTG • · · · τ · · · f 99 9 99 aagaaactcttccaagcccatccctgaaaccagaaaaaaaggtagcaga AGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAA GAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACT TGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAG TAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGC AAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAA ATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAG CAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTG (SEQ ID NO 12).

Aminokyselinová sekvence CbpA serotypu 4:

ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESY AKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAV SKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKD QKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAE AEVESKQAEATRLKKJKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGEL ATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKE EDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAE VESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPAPŘAE KPAPAPKPENPAEQPKAEKPADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPA QPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMATGWLQNNGSWYYLNSNGAMATG WLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQYNGS WYYLNANGSMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWVKDGDTWYYLEAS GAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYGVNANGEWVN. (SEQ ID NO 2)

99

9 9 9

9 9 9

9 9 9 · • 9 9 9

DNA sekvence, která kóduje aminokyselinovou sekvenci CbpA serotypu 4:

GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGA

AAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGA

GATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTG

AGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTA

GTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGA

ATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAA

AAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAA

GTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAAC

AAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTG

AAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAA

CTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCG • ·· · • ·

ATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAA

CGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAG

AGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTG

AAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAG

GTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAAC

ACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTG

AAGAAACTCTTCCAAGCCCATCCCTGAAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGA

AGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAA

GAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACT

TGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGgCTTGAACTA

GTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAG

CAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAA

AATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA

GCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTGAACAACCACAACCAG

CGCCGGCTCCAAAAGCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCAAAACCAGAGAA

TCCAGCTGAACAACCAAAAGCAGAAAAACCAGCTGATCAACAAGCTGAA

GAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGGTTGACTCAACA

GCAACCGCCAAAAACTGAAAAACCAGCACAACCATCTACTCCAAAAACA

GGCTGGAAACAAGAAAACGGTATGTGGTACTTCTACAATACTGATGGTTC

AATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAAtGGCTCAtGGTAcTACcTCAACAG

CAATGGCGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACT

ATCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAATGGT

TCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCGACAGGATGGCTCCA

ATACAATGGCTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCGACAG

GATGGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTGAT

ATGGCGACAGGTTGGGTGAAAGATGGAGATACCTGGTACTATCTTGAAGC

ATCAGGTGCTATGAAAGCAAGCCAATGGTTCAAAGTATCAGATAAATGGT

ACTATGTCAATGGCTCAGGTGCCCTTGCAGTCAACACAACTGTAGATGGC

TATGGAGTCAATGCCAATGGTGAATGGGTAAACTAA (SEQ ID NO 13).

• ·· · • 4 4 44·· 4 4 4 ·

4 4 · 4 4 4 4 · · 4 444444

444 44 4444

444 44 444 4444 44 44 „Polypeptid R1“ označuje polypeptid, obsahující aminokyselinové sekvence od pozice 16 do pozice 321 z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin (CbpA) serotypu typu 4, který má následující sekvenci:

ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESY AKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAV SKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKD QKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAE AEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGEL ATPDKKENDAKSSDSSVGEETL (SEQ ID NO 3).

DNA sekvence, která kóduje polypeptid R1 je:

GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGA

AAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGA

GATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTG

AGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTA

GTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGA

ATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAA

AAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAA

GTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAAC

AAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTG

AAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAA

CTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCG

ATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAA

CGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAG

AGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTG

AAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAG

GTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAAC

ACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTG

AAGAAACTCTTC (SEQ ID NO 14).

„Polypeptid C/R2“ označuje polypeptid, obsahující opakování oblasti C uvnitř R2, kde opakující se oblast C má aminokyselinové sekvence od pozice 327 do pozice 433 z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin (CbpA), serotypu typu 4, který má následující sekvenci:

KPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVK

KAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAK

RKA (SEQ ID NO 4).

4

9 99

DNA sekvence polypeptidu C/R2

AAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTA AGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAAC CAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAG TTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCG AAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGCAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAA GCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAAATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAG AAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA (SEQ ID NO 15) „Polypeptid A/R2“ označuje polypeptid, obsahující opakování oblasti A uvnitř R2, kde opakující se oblast A má aminokyselinové sekvence od pozice 153 do pozice 269 z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin (CbpA), serotypu typu 4, který má následující sekvenci:

TEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELELAESDVEVK

KAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAK rrada (SEQ ID NO 5). j_ak j_e ukázáno na obrázku 1, oblast A polypeptidu R2 je shodná s oblastí A uvnitř polypeptidu R1.

DNA sekvence, která kóduje polypeptid A/R2 je:

ACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAA

GCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACC

CAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTG

GAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAAC

CTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAA

ACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAA

GCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCT (SEQ ID NO 16).

Totožnost nebo umístění jednoho nebo více aminokyselinových zbytků mohou být změněny nebo modifikovány, aby byly zahrnuty varianty jako například delece, obsahující méně než všechny zbytky specifické pro protein, substituce, kde jeden nebo více specifických zbytků jsou zaměněny jinými zbytky a adice, kde jeden nebo více aminokyselinových zbytků jsou přidány ke koncové nebo střední části polypeptidu (viz obrázek 2). Tyto molekuly zahrnují: vnesení kodonů preferovaných při expresi ve vybraných hostitelích, jiných než savci; vnesení míst pro štěpení restrikčními endonukleázami; a vnesení dalších iniciačních, terminačních nebo jiných vnitřních DNA • · ··· • · · • ·

9 9

999 9999 sekvencí, které usnadňují konstrukci snadno exprimujících vektorů. Specifické příklady aminokyselinových substitucí u serotypu 4, zahrnují mimo jiné tyto následující: E na pozici 154 je substituován K; P na pozici 155 je substituován L; G na pozici 156 je substituován E; E na pozici 157 je substituován K; K na pozici 181 je substituován E; D na pozici 182 je substituován A; R na pozici 187 je substituován Y, H nebo L; I na pozici 194 je substituován N; E na pozici 200 je substituován D; E na pozici 202 je substituován D; E na pozici 209 je substituován K; K na pozici 212 je substituován E; V na pozici 218 je substituován L; V na pozici 220 je substituován K nebo E; K na pozici 221 je substituován E; N na pozici 223 je substituován D nebo K; P na pozici 225 je substituován S, T nebo R; D na pozici 227 je substituován N; E na pozici 228 je substituován K; Q na pozici 229 je substituován E, G nebo D; K na pozici 230 je substituován T; K na pozici 232 je substituován N; E na pozici 235 je substituován K; A na pozici 236 je substituován E; E na pozici 237 je substituován K; S na pozici 240 je substituován N; K na pozici 241 je substituován E; Q na pozici 242 je substituován K; K na pozici 249 je substituován E; K na pozici 250 je substituován N; E na pozici 257 je substituován Q nebo K; A na pozici 263 je substituován L; K na pozici 264 je substituován E; R na pozici 265 je substituován N; R na pozici 266 je substituován I; A na pozici 267 je substituován K nebo V; D na pozici 258 je substituován T; A na pozici 269 je substituován D; A na pozici 291 je substituován T, V, P, G nebo X; G na pozici

294 je substituován G, A nebo E; V na pozici 295 je substituován D nebo A; P na pozici

295 je substituován L nebo F; L na pozici 2999 je substituován P nebo Q; P na pozici 328 je substituován S; E na pozici 329 je substituován G; E na pozici 340 je substituován A; K na pozici 343 je substituován E nebo D; E na pozici 347 je substituován K; D na pozici 349 je substituován A; R na pozici 354 je substituován Η; E na pozici 366 je substituován D; E na pozici 375 je substituován K; K na pozici 378 je substituován E; E na pozici 390 je substituován G; P na pozici 391 je substituován S; N na pozici 394 je substituován D; V na pozici 397 je substituován I a K na pozici 408 je substituován Q.

„Polypeptid R2 serotypu - R6x“ označuje polypeptid, obsahující aminokyselinové sekvence od pozice 16 do pozice 444 z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin (CbpA) serotypu typu R6x, který má následující sekvenci:

• ·· 9 ·· ·· 99

9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

9 9 9

ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVAL NIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVA EAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVK EEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLK EANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLK SGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKE AELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKR KAAEEDKVKEKPA (SEQ ID NO 7)

DNA sekvence, která kóduje polypeptid R2 serotypu R6x:

GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGAC AGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAA ATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGC CTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAA ATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCA AAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGG AGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAA GCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTA CAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAG CGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGC ACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTA CAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGAtCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCT AAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTTCAG AtCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTA GCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGT AGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCTCATCCCTGAAATCAGGAAAAAAGGTAG CAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCA AAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTG ACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAA CTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGC AAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGA AAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAA GCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTG (SEQ ID NO 17)

Aminokyselinová sekvence CbpA serotypu R6x:

ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVAL

NIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVA • ·· · • 4 • · · ····· • · · · ······ «· o ··· ·· ····

ΙΟ ··· ·· ··· ···· ·· ··

EAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVK

EEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLK

EANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLK

SGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKE

AELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKR

KAAEEDKVKEKPAEQPQPAPATQPEKPAPKPEKPAEQPKAEKTDDQQAEEDY

ARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPAQPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMAT

GWLQNNGSWYYLNANGAMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNG

SWYYLNANGAMATGWLQYNGSWYYLNSNGAMATGWLQYNGSWYYLNA

NGDMATGWLQNNGSWYYLNANGDMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATG

WVKDGDTWYYLEASGAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYG

VNANGEWVN (SEQ ID NO 8).

DNA sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci CbpA serotypu R6x:

GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGAC

AGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAA

ATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGC

CTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAA

ATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCA

AAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGG

AGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAA

GCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTA

CAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAG

CGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGC

ACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTA

CAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGAtCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCT

AAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTtCAGA tCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAG

CAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTA

GGTGAAGAAACTCTTCCAAGCTCATCCCTGAAATCAGGAAAAAAGGTAGC

AGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAA

AAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGA

CCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAAC

TAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGCA

AGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAA

AACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAG • ♦*·

• e

9 9

9 9

9 9

9 9

4·

CAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTGAACAACCACAACC AGCGCCGGCTACTCAACCAGAAAAACCAGCTCCAAAACCAGAGAAGCCA GCTGAACAACCAAAAGCAGAAAAAACAGATGATCAACAAGCTGAAGAAG ACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACTCAACAGCAA CCGCCAAAAACTGAAAAACCAGCACAACCATCTACTCCAAAAACAGGCT GGAAACAAGAAAACGGTATGTGGTACTTCTACAATACTGATGGTTCAATG GCAACAGGATGGCTCCAAAACAACGGTTCATGGTACTATCTAAACGCTAA TGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTATC TAAACGCTAATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCA TGGTACTACCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAATA CAATGGTTCATGGTACTACCTAAACAGCAATGGCGCTATGGCGACAGGAT GGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTCAACGCTAATGGTGATATG GCGACAGGATGGCTCCAAAACAACGGTTCATGGTACTACCTCAACGCTAA TGGTGATATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAACGGTTCATGGTATTACC TCAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGTTGGGTGAAAGATGGAGATACC TGGTACTATCTTGAAGCATCAGGTGCTATGAAAGCAAGCCAATGGTTCAA AGTATCAGATAAATGGTACTATGTCAATGGCTCAGGTGCCCTTGCAGTCA ACACAACTGTAGATGGCTATGGAGTCAATGCCAATGGTGAATGGGTAAAC TAA(SEQIDNO 18).

„Polypeptid R1 serotypu R6x“ označuje polypeptid, obsahující aminokyselinové sekvence od pozice 16 do pozice 321 zN-konce dvakrát zkráceného proteinu A (CbpA), který váže cholin, serotypu R6x, který má následující sekvenci:

ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVAL NIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVA EAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVK EEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKI.K EANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETL (SEQ ID NO 9).

DNA sekvence, která kóduje polypeptid R1 je:

GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGAC

AGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAA

ATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGC

CTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAA • 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9 · ♦ * « »·· ·· ··

ATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCA

AAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGG

AGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAA

GCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTA

CAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAG

CGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAATCTCGAAACGAGGG

CACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCT

ACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAG

CTAAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTTCA

GATCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGC

TAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGC

GTAGGTGAAGAAACTCTTC (SEQ ID NO 19).

„Polypeptid C/R2 serotypu R6x“ označuje polypeptid, obsahující opakování oblasti C uvnitř R2 (viz obrázek 2), kde opakující se oblast C má aminokyselinové sekvence od pozice 327 do pozice 433 z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin (CbpA), serotypu typu 4, který má následující sekvenci:

KSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVK EAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAK RKA (SEQ ID NO 10)

DNA sekvence polypeptidu C/R2 serotypu R6x:

AAATCAGGAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTG AGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAAC CAATACTTACAAAACGCTTGACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAG TTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCG AGACGAGGAAAAAATTAAGCAAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAA GCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAG AAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA (SEQ ID NO 20).

„Polypeptid A/R2 serotypu R6x“ označuje polypeptid, obsahující opakování oblasti A uvnitř R2 (viz obrázek 2), kde opakující se oblast A má aminokyselinové sekvence od pozice 155 do pozice 265 z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin (CbpA), serotypu typu R6x, který má následující sekvenci:

PGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKE AELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKR KADA(SEQIDNO 11)

DNA sekvence, která kóduje polypeptid A/R2 serotypu R6x je:

CCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGA AAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAA TACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTA AAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAAC GAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTG AGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGA AGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCT (SEQ ID NO 21).

Tento vynález je zaměřen na izolovaný polypeptid, kde izolovaný polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena v SEQ ID NOS: 22 nebo 23, včetně jejích fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.

SPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDV

EVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEE

EAKRKAAEEDKVKEKPA (SEQ ID NO 22; serotype 4; position 323-434); or

PSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESD

VKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAE

EEAKRKAAEEDKVKEKRA (SEQ ID NO 23, serotype R6x; position 322-434).

„Polypeptid B/R2“ označuje polypeptid, obsahující aminokyselinové sekvence od pozice 270 do pozice 326 z N-konce zkráceného proteinu A (CbpA), který váže cholin, serotypu typu 4, jak je uveden na obrázku 2. „Polypeptid B/R2 serotypu - R6x“ označuje polypeptid obsahující aminokyselinové sekvence od pozice 264 do pozice 326 z Nkonce zkráceného proteinu A (CbpA), který váže cholin, serotypu R6x, jak je uveden na obrázku 2. Tento vynález uvažuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci oblastí A, B, C, A+B, B+C, A+C jak je ukázáno na obrázku 1.

Dále tento vynález poskytuje izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, kde polypeptid má aminokyselinu KXXE (SEQ ID NO: 6).

Vynález je zaměřen na polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci z Nkonce zkráceného proteinu A, který váže cholin, kde aminokyselinová sekvence je • · uvedena na obrázku 2. V jenom provedení má polypeptid aminokyselinovou sekvenci, která je konzervativní oblastí, která je uvedena na obrázku 2. Například konzervativní oblasti zahrnují mimo jiné aminokyselinovou sekvenci 158 až 172; 300 až 321; 331 až 339; 355 až 365, 367 až 374, 379 až 389, 409 až 427 a 430 až 447. Obrázek 2 uvádí homologie různých serotypů nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence N-koncové oblasti CbpA, který je uvažován v tomto vynálezu.

Tento vynález poskytuje izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, kde polypeptid má lektinovou aktivitu a neváže se kcholinu. V jenom provedeni má polypeptid aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena v kterékoli z SEQ ID NO: 1, 3 až 5, 7 nebo 9 až 11, včetně jejích fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.

Zde používaný výraz „polypeptid vykazující lektinovou aktivitu“ označuje polypeptid, peptid nebo protein, který se nekovalentně váže na sacharidy. Jak je zde definováno, „adhezin“ znamená nekovalentní vazbu bakterií k lidské buňce nebo sekretu, která je dostatečně stabilní, aby vydržela omývání. Jak je zde definováno, „váže se k LNnT“ znamená, že se váže k substrátům pokrytým lakto-N-neotetraózou více než k albuminové kontrole.

Tento vynález poskytuje izolovaný imunogenní polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin. V tomto vynálezu je zamýšleno, že imunogenní polypeptid má aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena v kterékoli z SEQ ID NO; 1, 3 až 7 nebo 9 až 11, včetně jejích fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů. Tento vynález poskytuje izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci z N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, která je uvedena na obrázku 2. V jenom provedení má polypeptid aminokyselinovou sekvenci, která je konzervativní oblastí, která je uvedena na obrázku 2.

Tento vynález je zaměřen na analogy polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, uvedenou výše. Analog polypeptidu může mít na N-konci methionin nebo N-koncový polyhistidin, případně navázaný na N-konec nebo C-konec polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci.

V jiném provedení tento vynález počítá speptidovými fragmenty polypeptidu, které pocházejí z proteolytického štěpení produktů polypeptidu. V jiném provedení má derivát polypeptidu ksobě připojenu jednu nebo více chemických složek. V jiném provedení je chemickou složkou ve vodě rozpustný polymer. V jiném provedení je chemickou složkou polyethylenglykol. V jiném provedení je chemická složka jednou, dvakrát, třikrát nebo čtyřikrát pegylována. V jiném provedení je chemická složka na Nkonci jednou pegylována.

Připojení polyethylenglykolu (PEG) ke sloučenině je zvláště užitečné, protože PEG má velmi pro savce velmi nízkou toxicitu (Carpenter a kol., 1971). Například adenozindeamináza s připojeným PEG byla ve Spojených státech schválena pro použití u lidí k léčení prudkého kombinovaného syndromu imunodeficience. Druhou výhodou, kterou poskytuje konjugace sPEG je účinné snížení imunogenicity a antigenicity heterologních sloučenin. Například připojení PEG k lidskému proteinu může být užitečné pro léčení nemoci u jiných savčích druhů, bez rizika vzniku prudké imunní odpovědi. Sloučenina, která je předmětem tohoto vynálezu, může být podávána v mikrokapslích tak, aby se snížila nebo zabránilo imunní odpovědi hostitele na sloučeninu nebo proti buňkám, které mohou sloučeninu produkovat. Sloučenina, která je předmětem tohoto vynálezu, může být podávána ve formě mikrokapslí, připravených z membrány, jako jsou lipozómy.

Bylo popsáno množství aktivovaných forem PEG, vhodných pro přímou reakci s proteiny. PEG reagencie, užitečné pro reakci s aminoskupinami proteinů, jsou aktivní estery karboxylových kyselin nebo karbonátové deriváty, zvláště ty, ve kterých zbývají čími skupinami jsou N-hydroxysukcinylimid, p-nitrofenol, imidazol nebo 1-hydroxy-2nitrobenzen-4-sulfonát. Deriváty PEG, které obsahují maleimidové nebo halogenacetylové skupiny, jsou vhodné reagencie pro modifikaci proteinů, které neobsahují sulfhydrylové skupiny. Rovněž PEG reagencie, obsahující hydrazinové nebo hydrazidové skupiny jsou užitečné pro reakci s aldehydy, vytvořenými oxidací sacharidových skupin v proteinech pomocí perjodátu.

V jiném provedení je výhodné, když aminokyselinové zbytky zde popsaného polypeptidu jsou v „L“ izomerické formě. V jiném provedení mohou být zbytky v „D“ izomerické formě substituovány za kterýkoli L-aminokyselinový zbytek, pokud se v polypeptidu zachovají požadované funkční vlastnosti lektinové aktivity. NH₂ označuje volnou aminoskupinu, přítomnou na aminovém konci polypeptidu, COOH označuje volnou karboxyskupinu, přítomnou na karboxylovém konci polypeptidu. Zkratky zde používané jsou ve shodě se standardní nomenklaturou poiypeptidů, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969).

• ·· ·

Je třeba si povšimnout, že všechny sekvence aminokyselinových zbytků jsou zde představené vzorci, jejichž levá a pravá orientace je v běžném směru od aminokonce ke karboxykonci. Dále je třeba si povšimnout, že pomlčka na počátku nebo konci sekvence aminokyselinových zbytků označuje peptidovou vazbu k další sekvenci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků.

Syntetický polypeptid, připravený běžně známými technikami na pevné fázi, tekuté fázi nebo technikami kondenzace peptidů nebo kteroukoli jejich kombinací, může obsahovat přirozené i nepřirozené aminokyseliny. Aminokyseliny použité pro syntézu peptidu může být standardní Boc (na N“-aminoskupině chráněné N“-tbutylkarbonylem) aminokyselinová pryskyřice se standardními protokoly pro odstraňování chránících skupin, neutralizaci, připojování a promývání podle původního postupu syntézy na pevné fázi podle Merrifielda (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:21492154) nebo aminokyseliny na N“-aminoskupině chráněné 9-fiuorenylmethoxy karbonylem (Fmoc), nestálé v zásaditém prostředí, poprvé popsané Carpinem a Hanem (1972, J. Org. Chem. 37:3403-3409). Tedy polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, může obsahovat D-aminokyseliny, kombinaci D a L-aminokyselin a různé „navržené“ aminokyseliny (např. β-methyl aminokyseliny, Ca-methyl aminokyseliny a Να-methyl aminokyseliny atd.), aby se dosáhlo specielních vlastností. Syntetické aminokyseliny zahrnují ornitin za lyzin, fluorofenylalanin za fenylalanin a norleucin za leucin nebo izoleucin. Dále používáním specifických aminokyselin při specifických spojovacích krocích mohou být vytvářeny a-šroubovice, β-ohyby, β-listy, γohyby a cyklické peptidy.

Peptidy mohou obsahovat na C-konci speciální aminokyseliny, které obsahují buď CO₂H nebo CONH₂ postranní řetězec, čímž se napodobuje volný glycin nebo glycinamidová skupina. Jiný způsob použití tohoto speciálního zbytku by bylo třeba D nebo L aminokyselinový analog s postranním řetězcem, který obsahuje linker nebo vazbu na nosič. V jednom provedení může být pseudo-volný C-koncový zbytek v D nebo L optické konfiguraci; v jiném provedení může být použita racemická směs D a L izomerů.

V dalším provedení může být jako N-koncový zbytek peptidu začleněn pyroglutamát. Protože pyroglutamát není přístupný sekvenování pomocí Edmanovy degradace, omezení substituce N-koncovým pyroglutamátem pouze asi na 50 % peptidů na daném nosiči ponechá pro sekvenování na nosiči dostatek peptidu bez • · • · pyroglutamátu. Pracovník se zkušeností v oboru by snadno poznal, že tato technika by mohla být použita pro sekvenování jakéhokoli peptidu, ve kterém je zabudován aminokyselinový zbytek rezistentní k Edmanově degradaci na N-konci. Jiné metody vhodné pro charakterizaci jednotlivých peptidů, které demonstrují požadovanou aktivitu, jsou popsány níže v textu podrobně. Specifická aktivita peptidu, který obsahuje blokovanou N-koncovou skupinu, např. pyroglutamát, když je určitá N-koncová skupina přítomna v 50 % peptidů, by byla snadno demonstrovatelná porovnáním aktivity kompletně (100%) blokovaného peptidu s neblokovaným (0%) peptidem.

Dále předkládaný vynález předvídá přípravu peptidů, které mají dobře definované strukturální vlestnosti a použití peptidomimetik a peptidomimetických vazeb, jako jsou esterové vazby, pro přípravu peptidů s novými vlastnostmi. V jiném provedení může být vytvořen peptid, který obsahuje redukovanou peptidovou vazbu, tj. Rf-CHa-NH-Rz, kde Ri a R₂ jsou aminokyselinové zbytky nebo sekvence. Redukovaná peptidová vazba může být vnesena jako dipeptidová subjednotka. Taková molekula by měla být odolná proti hydrolýze peptidové vazby, např. proteázovou aktivitou. Takové peptidy by poskytly ligandy s jedinečnou funkcí a aktivitou, jako jsou prodloužené poločasy in vivo, způsobené odolností k metabolickému štěpení nebo proteázové aktivitě. Dále je dobře známo, že v určitých systémech vykazují nepřirozené peptidy zvýšenou funkční aktivitu (Hrubý, 1982, Life Sciences 31:189-199; Hrubý a kol., 1990, Biochem. J. 268:249-262); předkládaný vynález poskytuje metodu pro vytváření nepřirozených peptidů, které obsahují náhodné sekvence na všech ostatních pozicích.

Nepřirozený, cyklický nebo zpevněný peptid může být připraven synteticky, za předpokladu že alespoň na dvě pozice v sekvenci peptidu je vložena aminokyselina nebo analog aminokyseliny, který poskytuje chemickou funkční skupinu schopnou křížového spojení, aby došlo ke vzniku nepřirozené struktury, cyklizaci nebo zpevnění peptidu po opracování, které křížové spojení navodí. Pokud je zabudována aminokyselina, která navozuje ohyb řetězce, bude dávána přednost cyklizaci. Příklady aminokyselin, schopných křížového spojení v peptidu jsou cystein, tvořící disulfidické vazby, kyselina asparagová, tvořící lakton a chelátová sloučenina jako je kyselina ykarboxyl-glutamová (Gla) (Bachem), která zachycuje přechodné kovy a vytváří křížovou vazbu. Chráněná kyselina γ-karboxyl-glutamová může být připravena modifikací syntézy, popsané Zee-Cheng a Olson (1980, Biophys. Biochem. Res. Commun. 11281132). Peptid, v němž peptidová sekvence obsahuje alespoň dvě aminokyseliny • *· · schopné křížového spojení, může být opracován např. oxidací cysteinových zbytků, aby došlo k vytvoření disulfidické vazby, nebo přidáním kovových iontů, aby došlo ke vzniku chelátu, tím ke křížovému spojení v peptidu a tedy k vytvoření nepřirozeného, cyklického nebo zpevněného peptidu.

Předkládaný vynález poskytuje strategický přístup pro systematickou přípravu křížových vazeb. Například jestliže jsou do peptidové sekvence zabudovány čtyři cysteiny, mohou být použity různé chránící skupiny (Hiskey, 1981, v The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, sv. 3, vyd. Gross a Meienhofer, Academie Press: New York, str. 137 až 167; Ponsati a kol., 1990, Tetrahedron 46:8255-8266). U prvního páru cysteinů mohou být odstraněny ochranné skupiny a cysteiny oxidovány a poté mohou být odstraněny ochranné skupiny u druhého páru a cysteiny opět oxidovány. Tímto způsobem může být vytvořen definovaný soubor disulfidických vazeb. Jinou možností je zabudovat pár cysteinů a pár ověřených aminokyselinových analogů, takže křížové vazby budou mít odlišnou chemickou podstatu.

Aby byly do peptidu vneseny určité konformační motivy, mohou být do něho zabudovány následující neklasické aminokyseliny: 1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-3karboxylát (Kazmierski a kol., 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)methyl-fenylalanin, (2S,3R)-methyl-fenylalanin, (2R,3S)-methyl-fenylalanin a (2R,3R)methyl-fenylalanin (Kazmierski a Hrubý, 1991, Tetrahedron Lett.); kyselina 2aminotetrahydronaftalen-2-karboxylová (Landis, 1989, Ph.D. Thesis, University of Arizona); hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-3-karboxylát (Miyake a kol., 1989, J. Takeda Res. Labs. 43:53-76); β-karbolin (D a L) (Kazmierski, 1989, Ph.D. Thesis, University of Arizona); HIC (kyselina histidin izochinolin karboxylová) (Zechel a kol., 1991, Int. J. Pep. Protein Res. 43) a HIC (histidin - cyklická močovina) (Dharanipragada).

Aby byly v peptidu indukovány nebo podpořeny určité sekundární struktury, mohou být do něho zabudovány následující aminokyselinové analogy a peptidomimetika: LL-Acp <LL-3-amino-2-propenidon-6-karboxylová), dipeptidový analog indukující β-ohyb (Kemp a kol., 1985, J. Org. Chem. 50:5834-5838); analogy indukující β-list (Kemp a kol., 1988, Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); analogy indukující β-ohyb (Kemp a kol., 1988, Tetrahedron Lett. 29:5057-5060); analogy indukující a-šroubovici (Kemp a kol., 1988, Tetrahedron Lett. 29:4935-4938); analogy indukující a-šroubovici (Kemp a kol., 1989, J. Org. Chem. 54:109-115) a analogy poskytnuté v následujících odkazech; Nagai a Sáto, 1985, Tetrahedron Lett. 26:647-650; DiMaio a kol., 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans. str. 1687; též Gly-Ala analog (Kahn a kol., 1989, Tetrahedron Lett. 30:2317); stereoizomer amidové vazby (Jones a kol., 1988, Tetrahedron Lett. 29:3853-3856); tretrazol (Zabrocki a kol., 1988, J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880); DTC (Samanen a kol., 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35:501-509) a analoga popsaná v Olson a kol., J. Am. Chem. Sci. 112:323-333 a Garvey a kol., 1990, J. Org. Chem. 56:436. Konformačně omezená mimetika beta ohybů a beta výdutí a peptidy, které je obsahují jsou popsány v patentu US č 5 440 013, vydaném Kahnovi 8. srpna 1995.

Předložený vynález poskytuje další možnosti pro modifikaci nebo přípravu derivátů polypeptidu nebo peptidu, který je předmětem tohoto vynálezu. Modifikace peptidů jsou dobře známé osobám se zkušeností v tomto oboru a patří sem fosforylace, karboxymetylace a acylace. Modifikace mohou být provedeny jak chemickým tak enzymatickým způsobem. V jiném ohledu mohou být připraveny glykozylované peptidy nebo peptidy acylované mastnými kyselinami. Příprava glykozylovaných peptidů a peptidů acylovaných mastnými kyselinami je v oboru dobře známa. Mohou být také připraveny deriváty peptidů acylovaných mastnými kyselinami. Například mimo jiné může být volná aminoskupina (N-koncová nebo na lyzinu) acylována, např. acylována zbytkem kyseliny myristilové. V jiném provedení může být zabudována do peptidu aminokyselina, obsahující postranní alifatický řetězec se strukturou (CH₂)nCH₃. Tento a jiné konjugáty peptidů a mastných kyselin, vhodné pro použití v předloženém vynálezu jsou popsány v patentu UK GB-8 809 162.4, mezinárodní patentové přihlášce PCT/AU89/00166 a výše uvedeném odkazu 5.

Mohou být provedeny mutace v nukleových kyselinách, kódujících polypeptid tak, že určitý kodon je změněn na kodon, který kóduje odlišnou aminokyselinu. Taková mutace je obyčejně provedena tak, že je proveden nejmenší možný počet nukleotidových změn. Substituční mutace tohoto druhu mohou být provedeny tak, že je změněna aminokyselina ve výsledném proteinu nekonzervativním způsobem (tj. změněním kodonu z aminokyseliny patřící do skupiny aminokyselin, které mají určitou velikost nebo charakteristiku na aminokyselinu, patřící do skupiny jiné) nebo konzervativním způsobem (tj. změněním kodonu z aminokyseliny patřící do skupiny aminokyselin, které mají určitou velikost nebo charakteristiku na aminokyselinu, patřící do téže skupiny). Takové konzervativní změny všeobecně vedou k menším změnám ve ···· ·· 99

9 9 « • · 9 9

9 9 9

9 9 · ·· 99 struktuře a funkci výsledného proteinu. U nekonzervativních změn je pravděpodobnější, že změní strukturu, aktivitu nebo funkci výsledného proteinu. Mělo by být vzato v úvahu, že předkládaný vynález zahrnuje sekvence obsahující konzervativní změny, které nemění významně aktivitu nebo vazebné charakteristiky výsledného proteinu.

Substituent za aminokyselinu v sekvenci může být vybrán z jiných členů skupiny, k níž aminokyselina patří. Například nepolární (hydrofobní) aminokyseliny zahrnují alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Aminokyseliny obsahující kruhové aromatické struktury jsou fenylalanin, tryptofan a tryptofan. Polární neutrální aminokyseliny zahrnují glycin, serin, threonin, cystein, tyrozin, asparagin a glutamin. Kladně nabité (bazické) aminokyseliny zahrnují arginin, lyzin a histidin.

Negativně nabité (kyselé) aminokyseliny zahrnují kyselinu asparagovou a glutamovou.

U takových změn se neočekává, že by ovlivnily molekulovou hmotnost, určovanou polyakrylamidovou elektroforézou nebo izoelektrický bod.

Zvláště výhodné substituce jsou:

- Lys za Arg a naopak, takže kladný náboj může být zachován;

- Glu za Asp a naopak, takže záporný náboj může být zachován;

- Ser za Thr, takže může být zachována volná skupina -OH; a

- Gin za Asn, takže může být zachována volná skupina NH₂.

Syntetické DNA sekvence dovolují vhodné konstrukce genů, které budou exprimovat analogy nebo „muteiny. Obecná metoda pro místně specifické zabudování nepřirozených aminokyselin do proteinů je popsáno v Nořen a kol., Science, 244:182188 (duben 1989). Tuto metodu je možno použít pro vytvoření analogů s nepřirozenými aminokyselinami.

Ve shodě s předloženým vynálezem mohou být použity běžné molekulárně biologické, mikrobiologické a DNA rekombinantní techniky z tohoto oboru. Takové techniky jsou plně vysvětleny v literatuře. Viz například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); „Current Protocols in Molecular Biology“ sv. I až III [vyd. Ausubel, R. M. (1994)]; “Cell Biology: A Laboratory Handbook“ sv. I až III [vyd.

J. E. Celis (1994)]; „Current Protocols in Immunology“ sv. I až lil [vyd. Coligan, J. E.

(1994)j; „Oligonucleotide Synthesis“ (vyd. M. J. Gait 1984); „Nucleic Acid Hybridisation“ [vyd. B. D. Hames & S. J. Higgins (1984)]; „Animal Cell Culture“ [vyd. R. I. Freshney (19β6)]; „Immobilized Celis And Enzymes“ [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, „A Practical Guide To Molecular Cloning“ (1984).

• ••4

V dalším provedení může být pyroglutamát zabudován jako N-koncový zbytek v peptidu. Třebaže pyroglutamát není přístupný sekvenaci pomocí Edmanovy degradace, omezením substituce N-koncovým pyroglutamátem pouze asi na 50 % peptidů na daném nosiči ponechá na nosiči pro sekvenování dostatek peptidu bez pyroglutamátu. Pracovník se zkušeností v oboru by snadno poznal, že tato technika by mohla být použita pro sekvenování jakéhokoli peptidu, ve kterém je zabudován aminokyselinový zbytek rezistentní k Edmanově degradaci na N-konci. Jiné metody vhodné pro charakterizaci jednotlivých peptidů, které demonstrují požadovanou aktivitu, jsou popsány níže v textu podrobně. Specifická aktivita peptidu, který obsahuje blokovanou N-koncovou skupinu, např. pyroglutamát, když je určitá N-koncová skupina přítomna v 50 % peptidů, by byla snadno demonstrovatelná porovnáním aktivity kompletně (100%) blokovaného peptidu s neblokovaným (0%) peptidem.

Chemické složky vhodné pro derivatizaci.

Chemické složky vhodné pro derivatizaci mohou být vybírány mezi polymery, které jsou ve vodě rozpustné. Zvolený polymer musí být ve vodě tak rozpustný, takže sloučenina ke které je připojen se nesráží ve vodném prostředí, jako je fyziologické prostředí. Pro léčebné použití konečných přípravků je výhodné, když polymer bude farmaceuticky přijatelný. Osoba se zkušeností v oboru bude schopna vybrat požadovaný polymer na základě takových úvah, jako zda konjugát polymeru a sloučeniny bude používán terapeuticky a pokud ano, tak na základě úvah o požadované dávce, době cirkulace, odolnosti k proteolýze a jiných předpokladech. Pro předložené sloučeniny nebo složky musí být tyto předpoklady ověřeny pomocí zde poskytnutých testů.

Ve vodě rozpustný polymer může být vybrán například ze skupiny polyethylenglykol, kopolymer ethylenglykol/propylenglykol, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly-1,3,6-trioxan, kopolymer ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové, polyaminokyseliny (buď homopolymery nebo náhodné kopolymery) a dextran nebo poly(n-vinylpyrolidon) polyethylenglykol, homopolymery propropylenglykolu, kopolymery prolypropylen oxidu/ethylenoxidu, polyoxyethylované polyoly a polyvinylalkohol. Polyethylenglykol propionaldehyd může mít ve výrobě výhody, pro svou stabilitu ve vodě.

Polymer může mít jakoukoli molekulovou hmotnost a může mít větvený nebo nevětvený řetězec. U polyethylenglykolu je kvůli snadnému zacházení a výrobě ···· výhodná molekulová hmotnost mezi asi 2 kDa a 100 kDa (termín „asi“ značí, že v preparátu polyethylenglykolu některé molekuly váží více, některé méně než je stanovená molekulová hmotnost). V závislosti na požadovaném léčebném profilu (např. na požadované době uvolňování, účincích, jsou-li jaké na biologickou aktivitu, na snadnosti manipulace, na stupni nebo ztrátě antigenicity a jiných známých účincích polyethylenglykolu na léčebné proteiny nebo analogy) mohou být použity i jiné velikosti molekul.

Počet takto připojených polymerových molekul může varírovat a osoba se zkušeností v tomto oboru bude schopna ověřit vliv tohoto na účinek. Může být připraven monoderivát, nebo mohou být poskytnuty di-, tri-, tetraderiváty nebo jejich některé kombinace, buď se stejnými nebo odlišnými chemickými složkami (např. polymery, jako jsou polyethylenglykoly o různých molekulových hmotnostech). Poměr molekul polymeru k účinné složce nebo molekulám účinné složky se bude měnit, stejně jako jejich koncentrace v reakčni směsi. Obecně platí, že optimální poměr (v termínech účinnosti reakce v níž není přebytek nezreagovaných složek nebo složek a polymeru) bude určen takovými faktory, jako jsou požadovaný stupeň derivatizace (např. zda se jedná o mono, di-, tri- atd), molekulové hmotnosti vybraného polymeru, zda má polymer větvený nebo nevětvený řetězec a na reakčních podmínkách.

Molekuly polyethylenglykolu (nebo jiné chemické složky) by měly být připojeny k účinné složce nebo složkám tak, že se vezmou v úvahu účinky na funkční nebo antigenní domény proteinu. Existuje množství metod připojení, dostupných osobám se zkušeností v tomto oboru, např. EP 401 384, který je zde zahrnut jako odkaz (připojení PEG kG-CSF), viz též Malik a kol., 1992, Exp. Hematol. 20.Ί028-1035 (popisující pegylaci GM-CSF pomocí tresylchloridu). Například polyethylenglykol může být kovalentně vázán přes aminokyselinové zbytky prostřednictvím reaktivní skupiny, jako je volná aminoskupina nebo karboxylové skupina. Reaktivní skupin jsou ty, ke kterým může být aktivovaná molekula polyethylenglykolu vázána. Aminokyselinové zbytky, které mají volnou aminoskupinu jsou lyzinové zbytky a zbytky N-koncových aminokyselin; ty které mají volnou karboxylovou skupinu jsou zbytky kyseliny asparagové a glutamové a zbytky C-koncových aminokyselin. Sulfhydrylové skupiny mohou být také použity jako reaktivní skupiny pro připojení polyethylenglykolové molekuly (molekul). Pro léčebné účely je výhodné připojení k aminoskupině, jako je připojení k N-konci nebo k lyzinové skupině.

• ·

Vynález poskytuje izolovanou nukleovou kyselinu kódující polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin. Tento vynález poskytuje izolovanou nukleovou kyselinu kódující polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, která je uvedena na obrázku 2. V jednom provedení je nukleová kyselina uvedena v kterékoli z SEQ ID NOS: 12, 14 až 17 nebo 19 až 21, včetně jejich fragmentů, mutant, variant, analog nebo derivátů. Nukleová kyselina je DNA, cDNA, genomová DNA, RNA. Dále může být izolovaná nukleová kyselina operativně vázána k promotoru RNA transkripce. Předpokládá se, že nukleová kyselina je použita ke kompetitivní inhibicí lektinové aktivity.

„Vektor“ je replikon, jako je plazmid, fág nebo kosmid, k němuž může být připojen segment jiné DNA tak, aby došlo k replikaci připojeného segmentu.

„DNA“ označuje polymerní formu deoxyribonukleotidů (adenin, guanin, thymin nebo cytozin) buď v její jednovláknové formě nebo dvouvláknové šroubovici. Tento termín označuje pouze primární a sekundární strukturu molekuly a neomezuje ji na jakoukoli určitou terciální formu. Tento termín tedy zahrnuje dvouvláknovou DNA, nacházející se mimo jiné v lineárních DNA molekulách (např. restrikčních fragmentech), virech, plazmidech a chromozomech. Při diskutování o struktuře určitých dvouvláknových DNA molekul mohou být zde sekvence popsány podle běžné konvence, podle které se uvádí pouze sekvence ve směru od 5' ke 3' netranskribovaného vlákna DNA (tj. vlákna, které je sekvenčně homologické s mRNA).

DNA sekvence je „operativně vázána“ k sekvenci kontrolující expresi, když sekvence kontrolující expresi kontroluje a reguluje transkripci a translaci této DNA sekvence. Termín „operativně vázaný“ znamená to, že je k dispozici vhodný startovní signál (např. ATG) před DNA sekvenci, která má být exprimována a že je udržován správný čtecí rámec, aby byla umožněna exprese DNA sekvence pod kontrolou sekvence kontrolující expresi a produkce požadovaného produktu, kódovaného DNA sekvencí. Pokud gen, který chceme vložit do rekombinantní DNA molekuly neobsahuje vhodný startovní signál, takový startovní signál může být před gen vložen.

Tento vynález dále také poskytuje vektor, který obsahuje výše popsanou molekulu nukleové kyseliny. Promotor může být, nebo je totožný s bakteriálním, kvasinkovým, hmyzím nebo savčím promotorem. Vektor dále může být plazmid, • ·· · • · kosmid, umělý kvasinkový chromozom (YAC), bakteriofág nebo DNA eukaryotického viru.

Mohou být také použity mnohé jiné vektorové kostry, v oboru známé jako užitečné pro exprimování proteinů. Mezi takové vektory patří mimo jiné: adenovirus (AV), virus doprovázející adenovirus (AAV), opičí virus 40 (SV40), cytomegalovirus (CMV), virus nádoru myší mléčné žlázy (MMTV), Moloney murine leukemia virus, systémy dodávající DNA, tj. lipozómy a systémy dodávající expresní plazmidy. Jedna třída vektorů dále obsahuje DNA elementy odvozené z virů, jako jsou hovězí papiloma virus, polyoma virus, bakulovirus, retroviry nebo Semliki Forest virus. Takové vektory mohou být získány komerční cestou nebo mohou být sestaveny ze sekvencí, popsaných v metodách, které jsou v oboru dobře známé.

Tento vynález také poskytuje hostitelský vektorový systém pro produkci polypeptidu, který obsahuje vektor vhodné hostitelské buňky. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou mimo jiné prokaryotické nebo eukaryotické buňky, např. bakteriální buňky (včetně grampozitivních buněk), buňky kvasinek, buňky hub, hmyzí buňky a živočišné buňky. Jako hostitelé mohou být použity mnohé savčí buňky, mimo jiné myší fibroblastické buňky NIH 3T3, buňky CHO, HeLa buňky, buňky Ltk, buňky Cos a další.

Pro expresi DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, může být použito množství kombinací hostitel/expresní vektor. Užitečné expresní vektory mohou například sestávat ze segmentů chromozomálních, nechromozomálních a syntetických DNA sekvencí. Vhodné vektory zahrnují deriváty SV40 a známých bakteriálních plazmidů, např. plazmidy Escherichia coli colE1, pCR1, pB322, pMB8 a jejich deriváty, plazmidy jako je RP4; DNA fágy, např. početné deriváty fága λ, např. NM989 a jiné fágové DNA, např. M13 a DNA vláknitých fágů s jednovláknovou DNA; kvasinkové plazmidy jako je plazmid 2μ a jeho deriváty; vektory výhodné v eukaryotických buňkách, jako jsou vektory výhodné v hmyzích nebo savčích buňkách; vektory odvozené z kombinací plazmidů a fágové DNA, jako jsou plazmidy, které byly modifikované aby využily fágovou DNA nebo jiné expresní kontrolní sekvence a podobně.

Kterákoli z velkého množství expresních kontrolních sekvencí - sekvence, které kontrolují expresi DNA sekvence, která je k ní operativně vázaná - může být v těchto vektorech použita pro expresi DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Takovými výhodnými expresi kontrolujícími sekvencemi jsou například časné nebo • · pozdní promotory SV40, CMV, viru vakcinie, polyomaviru nebo adenoviru, iac systém trp systém, TAC systém, TRC systém, LTR systém, oblasti většího operátoru a promotoru fágu λ, kontrolní oblasti fd obalového proteinu, promotor pro kinázu kyseliny 3-fosfoglycerové nebo jiných glykolytických enzymů, promotory kyselé fosfatázy (např. Pho5), promotory kvasinkových α-kopulačních faktorů a jiné sekvence, o nichž je známo, že kontrolují expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk nebo jejich virů, a různé jejich kombinace.

Při expresi DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je také výhodné použít množství různých jednobuněčných hostitelských buněk. Mezi tyto hostitele mohou patřit dobře známé eukaryotické a prokaryotické hostitelské buňky, jako jsou kmeny E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, houby, jako jsou kvasinky a živočišné buňky, jako jsou CHO, R1.1, B-W a buňky L-M, buňky ledvin kočkodana zeleného (např. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 a BMT10), hmyzí buňky (např. Sf19) a lidské buňky a rostlinné buňky v tkáňové kultuře.

Má se za to, že ne všechny vektory, expresní kontrolní sekvence a hostitelé budou fungovat stejně dobře při expresi DNA sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Všichni hostitelé nefungují stejně dobře s týmž expresním systémem. Avšak osoba se zkušeností v tomto oboru, bude schopna vybrat vhodné vektory, expresní kontrolní sekvence a hostitele, bez přílišného experimentování a dosáhnout požadované exprese, bez toho, že by se odchýlila z hranic tohoto vynálezu. Například při výběru vektoru se musí vzít v úvahu hostitel, protože vektor v něm musí fungovat. Počet kopií vektoru, schopnost kontrolovat tento počet kopií a exprese jakýchkoli jiných proteinů, kódovaných vektorem, jako jsou antibiotikové markéry, bude také vzato v úvahu.

Při výběru sekvence kontrolující expresi bude normálně vzato v úvahu množství faktorů. Mezi tyto faktory patří například relativní síla systému, možnost jeho kontroly a jeho slučitelnost s určitou DNA sekvencí nebo genem, které mají být exprimovány, zvláště pokud se týká potenciálních sekundárních struktur. Výhodní jednobuněční hostitelé budou vybráni po uvážení např. jejich slučitelnosti s vybraným vektorem, jejich sekrečních charakteristik, jejich schopnosti správně vytvořit trojrozměrnou strukturu proteinu a jejich fermentačních požadavků a rovněž toxicity produktu, kódovaného DNA sekvencí, která má být exprimována, pro daného hostitele a snadností purifikace exprimovaného produktu.

• · · · • ·

Tento vynález dále poskytuje metodu pro produkci polypeptidu, která obsahuje pomnožení výše popsaného hostitelského vektorového systému za vhodných podmínek, umožňujících produkci polypeptidu a získání takto produkovaného polypeptidu.

Tento vynález dále poskytuje protilátku, schopnou specifického rozpoznání nebo vazby na izolovaný polypeptid. Protilátkou může být monoklonální nebo polyklonální protilátka. Protilátka může být dále označena detekovatelným markérem, který je buď radioaktivní, kolorimetrický, fluorescenční nebo luminiscenční. Označená protilátka může být monoklonální nebo polyklonální protilátka. V jednom provedení je označenou protilátkou purifikovaná označená protilátka. Způsoby značení protilátek jsou v obory dobře známé.

Termín „protilátka“ zahrnuje například jak přirozeně se vyskytující, tak protilátky, které se za přirozených podmínek nevyskytují. Specificky termín „protilátky“ zahrnuje polyklonální a monoklonální protilátky a jejich fragmenty. Dále termín „protilátka“ zahrnuje chimerní protilátky a zcela synteticky připravené protilátky a jejich fragmenty. Takové protilátky zahrnují mimo jiné polyklonální, monoklonální, chimerní, jednořetězcové, Fab fragmenty a Fab expresní knihovny.

Pro produkci polyklonálních protilátek proti polypeptidu nebo jeho analogům či derivátům se mohou používat různé postupy (viz např. Antibodies - A Laboratory Manual, vyd. Harlow a Lané, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Ne York, 1988). Pro produkci protilátky mohou být imunizováni různí živočišní hostitelé injekcí zkráceného CbpA nebo jeho derivátu (např. fragmentu nebo fúzního proteinu), mimo jiné králíci, myši, krysy, ovce, kozy atd. V jednom provedení může být polypeptid konjugován k imunogennímu nosiči, např. hovězímu sérumalbuminu (BSA) nebo „keyhole limpet hemocyanin“ (KLH). Pro zvýšení imunologické odpovědi se mohou použít různá adjuvans, záleží ovšem na druhu hostitelů.

Pro přípravu monoklonálních protilátek, nebo jejich fragmentů, analogů nebo derivátů může být použita kterákoli technika, vhodná pro produkci protilátkových molekul pomocí kontinuálních buněčných linií v kultuře (viz např. Antibodies - A Laboratory Manual, vyd. Harlow a Lané, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Ne York, 1988). Jedná se mimo jiné o techniku hybridomů, původně vyvinutou Kohlerem a Misteinem (1975, Nátuře 256:495-497), rovněž o trioma techniku, techniku lidských B-buněčných hybridomů (Kobzor a kol., 1983, Immunology • · • β • · • ·

Today 4:72) a EBV hybridomovou techniku pro produkci lidských monoklonálních protilátek (Cole a kol., 1985, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. iss, lne., str. 77-96). V dalším provedení vynálezu mohou být monoklonální protilátky v bezmikrobních živočichách, pomocí nedávno objevené technologie (PCT/US90/ 02545). Podle vynálezu, mohou být použity lidské protilátky a mohou být získány pomocí lidských hybridomů (Cole a kol., 1983, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 80:20262030) nebo pomocí transformace lidských B buněk EBV virem in vitro (Cole a kol., v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str 77-96). Ve skutečnosti podle předloženého vynálezu, mohou být použity techniky vyvinuté pro produkci „chimerních protilátek“ (Morrison a kol., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger a kol., 1984, Nátuře 312:604-608; Takeda a kol., Nátuře 314:452-454) sestřihem genů z myší molekuly protilátky specifické pro polypeptid spolu s geny z lidské molekuly protilátky se vhodnou biologickou aktivitou; takové protilátky jsou v rozsahu tohoto vynálezu. Takovéto lidské nebo zušlechtěné chimerní protilátky jsou výhodné pro použití při léčení lidských nemocí a potíží (popsány níže), protože u lidských nebo zušlechtěných protilátek je mnohem méně pravděpodobné než u xenogenních protilátek, že budou samy indukovat imunní odpověď, zvláště odpověď alergickou. V dalším provedení vynálezu se užívá technika popsaná pro konstrukci Fab expresních knihoven (Huse a kol., 1989, Science 246:1275-1281), aby se umožnila rychlá a snadná identifikace monoklonálních Fab fragmentů s požadovanou specificitou pro polypeptid, nebo jeho deriváty či analogy.

Fragmenty protilátky, které obsahují idiotyp protilátkové molekuly, mohou být vytvořeny známými technikami. Například mezi takové fragmenty patří: fragment F(ab')₂, který je možno vytvořit štěpením molekuly protilátky pomocí pepsinu; fragmenty Fab', které je možno vytvořit redukováním disulfidických můstků fragmentu F(ab')₂ a fragmenty Fab, které je možno vytvořit působením papainu a redukčního činidla na molekulu protilátky.

Při produkci protilátek je možno vyhledání požadované protilátky provést technikami, které jsou v oboru známé, např. radioimunologický test, ELISA, sendvičové radioimunologické testy, imunoradiometrické testy, reakce difuzní precipitace v gelu, imunotesty in šitu (například pomocí koloidního zlata, enzymatických nebo radioizotopových značení), western blots, precipitační reakce, aglutinační reakce (např. gelové aglutinační testy, hemaglutinační testy), komplement fixační testy, • · • · imunofluorescenční testy, testy s proteinem A a imunoelektroforetické testy atd. V jednom provedení je zjišťována vazba protilátky detekcí značky na primární protilátce. V jiném provedení je zjišťována primární protilátka pomocí detekce vazby sekundární protilátky nebo látky, která reaguje s primární protilátkou. V ještě jiném provedení je značena sekundární protilátka. V oboru je známo mnoho způsobů pro detekci vazby v imunologickém testu a tyto jsou v rozsahu předloženého vynálezu.

Protilátky mohou být pro detekci in vitro označeny např. značkami jako jsou enzymy, fluorofory, chromofory, radioizotopy, barvy, koloidní zlato, latexové částice a chemiluminiscenční činidla. Alternativně je možno protilátky označit pro detekci in vivo, např. radioizotopy (přednostně techneciem nebo jódem); reagenciemi, které způsobují posun magnetické rezonance (jako je gadolinium a mangan) nebo radio-opaque reagencie.

Nejčastější používané značky pro tato studia jsou radioaktivní prvky, enzymy, chemikálie které fluoreskují, když jsou vystaveny ultrafialovému světlu a další. Je známo množství fluorescenčních materiálů a mohou být použity jako značky. Patří mezi ně například fluorescein, rhodamin, auramin, texaská červeň, AMCA modř a žluť Lucifer. Zvláštní detekční materiál jsou protikráličí protilátky připravené na kozách a konjugované s fluoresceinem pomocí izothiokyanátu. Polypeptid může být také označen radioaktivním prvkem nebo enzymem. Radioaktivní označení lze detekovat jakýmikoli běžně dostupnými měřícími procedurami. Výhodné izotopy lze vybrat z ³H,

Enzymové značky jsou rovněž výhodné a mohou být detekovány jakýmikoli dnes používanými kolorimetrickými, spektrofotometrickými, fluorospektrofotometrickými, ampérometrickými a plynovými technikami. Enzym je konjugován k vybrané částici reakcí s molekulou vytvářející můstek, jako jsou karbodiimidy, diizokyanáty, glutaraldehyd a podobné. Je známo mnoho enzymů, které mohou být v těchto procedurách použity. Výhodné jsou peroxidázy, β-glukuronidáza, β-D-glukozidáza, βD-galaktozidáza, ureáza, glukózooxidáza spolu speroxidázou a alkalická fosfatáza. Patenty US č. 3 654 090, 3 850 752 a 4 016 043 jsou uvedeny jako příklad pro jejich popis alternativních značících materiálů a metod.

V dalším provedení tohoto vynálezu mohou být připraveny komerční soupravy, vhodné pro použití lékařskými odborníky pro určování přítomnosti nebo nepřítomnosti předem určené vazebné aktivity nebo předem určené schopnosti vazebné aktivity na • · · · • · ' podezřelé buňky. V souhlase s testovacími technikami diskutovanými výše, jedna skupina takových souprav bude obsahovat alespoň označený polypeptid nebo jeho vazebného partnera, například protilátku ktomu specifickou, a návody, které ovšem závisí na vybrané metodě, např. „kompetitivní“, sendvičová“, „DASP“ a podobně.

Souprava může také obsahovat ostatní reagencie, jako jsou pufry, stabilizátory atd.

Mohou tedy být připraveny soupravy pro demonstraci přítomnosti bakteriální vazebné aktivity nebo schopnosti buněk být objektem této předem určené bakteriální vazebné aktivity, které obsahují:

(a) předem určené množství alespoň jedné označené imunochemicky reaktivní složky, získané přímým nebo nepřímým připojením přítomného polypeptidu nebo k němu specifického vazebného partnera k detekovatelné značce;

(b) ostatní reagencie; a (c) návod pro použití uvedené soupravy.

Tento vynález poskytuje antagonisty nebo blokující činidla, která zahrnují mimo jiné: peptidové fragmenty, mimetika, molekula nukleové kyseliny, ribozym, polypeptid, malá molekula, molekula sacheridu, monosacharid, oligosacharid nebo protilátka. V rámci tohoto vynálezu jsou také uvažována činidla, která kompetitivně blokují nebo potlačují pneumokokovou bakterii. Tento vynález poskytuje činidla, která obsahují anorganickou sloučeninu, molekulu nukleové kyseliny, oligonukleotid, organickou sloučeninu, peptid, peptidomimetickou sloučeninu nebo protein, který inhibuje polypeptid.

Tento vynález poskytuje vakcínu obsahující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NOS: 1, 3 až 7, 9 až 11, 22 a 23 a farmaceuticky přijatelné adjuvans nebo nosič. Polypeptid může obsahovat aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, jak je uvedena v obrázku 2. Tento vynález poskytuje vakcínu obsahující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci která obsahuje konzervativní oblast jak je uvedena v obrázku 2 a farmaceuticky přijatelné adjuvans nebo nosič. Například konzervativní oblast může obsahovat aminokyselinové sekvence 158 až 172; 300 až 321; 331 až 339; 355 až 365; 367 až 374, 379 až 389; 409 až 427 a 430 až 447. Tento vynález poskytuje vakcínu, obsahující izolovanou nukleovou kyselinu, která kóduje polypeptid a farmaceuticky přijatelné adjuvans nebo nosič.

• 9

Aktivní imunita proti grampozitivním bakteriím, zvláště pneumokokům, může být indukována imunizací (vakcinací) imunogenním množstvím polypeptidu nebo peptidového derivátu nebo jeho fragment spolu s adjuvans, kde polypeptid nebo antigenní derivát nebo jejich fragment je antigenní složkou vakcíny.

Polypeptid předloženého vynálezu nebo jeho deriváty či fragmenty, mohou být připraveny ve směsi s adjuvans, aby byla připravena vakcína. Výhodné je, když derivát nebo jeho fragment, použitý jako antigenní složka vakcíny, je adhezin. Výhodnější je, když polypeptidový nebo peptidový derivát nebo jejich fragment, použitý jako antigenní složka vakcíny, je antigen společný všem nebo mnoha kmenům druhů grampozitivní bakterie, nebo společný blízce příbuzným druhům bakterií. Nejvýhodnější je, když antigenní složkou vakcíny je adhezin, který je společným antigenem.

Vektory obsahující vakcínu založenou na nukleové kyselině, která je předmětem tohoto vynálezu, může být vnasena do požadovaného hostitele pomocí metod, které jsou v oboru známé, např. transfekce, elektroporace, mikroinjekce, transdukce, buněčná fůze, DEAE dextran, precipitace fosforečnanu vápenatého, lipofekce (fúze lipozomů), použití genového děla nebo DNA vektor transportéru (viz např. Wu a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu a Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut a kol., kanadská patentová přihláška č. 2 012 311, podaná 15. března 1990).

Vakcína může být podávána jakoukoli parenterální cestou, mimo jiné intramuskulárně, intraperitoneálně, intravenozně apod. Výhodné je, protože požadovaným výsledkem vakcinace je vyvolat imunitní odpověď k antigenu a tedy k patogennímu organizmu, je žádoucí podání do lymfatických tkání, např. lymfatických uzlin nebo sleziny, buď přímo, nebo nepřímo pomocí výběru virového vektoru. Protože se imunitní buňky průběžně replikují, jsou ideálním cílem pro takové vakcíny z nukleových kyselin, které jsou založené na retrovirových vektorech, protože retrovirové vektory vyžadují replikující se buňky.

U živočišného jedince, u kterého je podezření, že trpí infekcí grampozitivní bakterií, převážně streptokokovou, může být pasivní imunity dosaženo tak, že se danému pacientu podá antisérum, polyklonální protilátky nebo neutralizační monoklonální protilátky proti polypeptidu, který je předmětem tohoto vynálezu. Třebaže pasivní imunita nepropůjčuje dlouhodobou ochranu, může být hodnotným nástrojem pro léčení bakteriální infekce u jedince, který nebyl vakcinován. Pasivní imunita je zvláště důležitá pro léčení infekcí, způsobených kmeny grampozitivních bakterií, které jsou • * ·· · ·· . · ··«· ; · · «···· rezistentní na antibiotika, protože žádná jiná terapie není dostupná. S výhodou jsou protilátky, podávané při pasivní imunní terapii, autologními protilátkami. Například pokud je léčeným jedincem člověk, je s výhodou, když protilátky jsou lidského původu nebo byly zušlechtěny, aby se minimalizovala možnost imunní odpovědi proti protilátkám. Aktivní nebo pasivní vakcíny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, nebo podávání adhezinu, může být použito k ochraně živočišného jedince před infekcí grampozitivními bakteriemi, převážně streptokoky a ještě výhodněji pneumokoky.

Tento vynález poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje polypeptidu, jak byl výše popsán a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředící roztok.

Například takový farmaceutický prostředek pro zabránění navázání pneumokoků na povrchy sliznic může obsahovat protilátky proti lektinové doméně a/nebo přebytek rozpustných proteinů s lektinovou doménou. Zablokování navázání jakýmkoli mechanizmem blokuje počáteční kroky infekce a tedy snižuje kolonizaci. Tím je ovšem snížen přenos nemocí z osoby na osobu a zabraňuje se vývoji symptomatické nemoci.

Tento vynález poskytuje způsob navození imunitní odpovědi u jedince, který byl vystaven nebo infikován pneumokokovou bakterií, který obsahuje podání určitého množství farmaceutického prostředku, kterým je vyvolána imunitní odpověď.

Tento vynález poskytuje způsob zabránění infekce jedince pneumokokovou bakterií, který obsahuje podání jedinci takového množství farmaceutického prostředku, které je účinné pro zabránění navázání pneumokokové bakterie a tím je zabráněno infekci pneumokokovou bakterií.

Tento vynález poskytuje způsob zabránění infekce pneumokokovou bakterií, který obsahuje podání jedinci takového množství farmaceutického prostředku, který obsahuje protilátku a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředící roztok, a zabraňuje infekci pneumokokovou bakterií.

Tento vynález poskytuje způsob léčení jedince, který byl vystaven nebo infikován pneumokokovou bakterií, který obsahuje podání léčebně účinného množství vakcíny, která je předmětem tohoto vynálezu, čímž dojde k léčení jedince.

Tento vynález poskytuje způsob potlačení kolonizace hostitelských buněk u jedince, který byl vystaven nebo infikován pneumokokovou bakterií, který obsahuje podání určitého množství farmaceutického prostředku, který obsahuje polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence, která je uvedena v kterékoli z SEQ ID NOS: 1, až 5, 7 nebo 9 až 11, a tím je navozena imunitní odpověď. Léčebný peptid, který • · · · • · · ····

9 9

9 9 • 9 9 9 ♦ β · * blokuje kolonizaci, je rozšiřován mukózou respiračního traktu. Farmaceutický prostředek obsahuje polypeptid, sestávající z aminokyselinové sekvence, která je uvedena na obrázku 2.

Zde používaný termín „farmaceutický prostředek“ může znamenat léčebně účinná množství polypeptidových produktů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, společně s vhodnými ředícími roztoky, rozpouštědly, emulgátory, adjuvans a/nebo nosiči, vhodnými pro uplatnění léčebného účinku nebo prospěchu, např. zabránění pneumokokové kolonizaci. Zde používaný termín „léčebně účinné množství“ označuje takové množství, které poskytuje léčebný účinek za daných podmínek a za daného způsobu podávání. Takovýmito prostředky jsou roztoky nebo lyofilizované či jinak vysušené přípravky a zahrnují rozpouštěcí roztoky, obsahující různé pufry (např. trisHCI, octan, fosforečnan), pH a iontovou sílu, přídavné látky, jako jsou albumin nebo gelatin, které zabraňují absorbci na povrchy, detergenty (např. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, žlučové soli), rozpouštěcí činidla (např. glycerol, polyethylenglycerol), antioxidanty (např. kyselina askorbová, dvojsiřičitan sodný), konzervační činidla (např. Thimerosal, benzylalkohol, parabeny), látky zvětšující objem nebo modifikátory povrchového napětí (např. laktóza, manitol), k proteinům kovalentně připojené polymery, jako je polyethylenglykol, komplexy s kovovými ionty nebo zabudování materiálu do nebo na určité přípravky z polymerních sloučenin jako jsou kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová, hydrogely atd., nebo do lipozómů, mikroemulzí, micel, jednolamelových nebo multilamelárních váčků, erytrocytárních obalů nebo sféroplastů. Takové složení bude u léčebných činidel ovlivňovat fyzikální stav, rozpustnost, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost vymizení in vivo. Výběr složení bude záviset na fyzikálních a chemických vlastnostech proteinu, který má léčebnou aktivitu. Například produkt odvozený z na membránu vázané formy aktivní složky, může vyžadovat přípravek, obsahující detergent. Kontrolované nebo trvale uvolňující prostředky obsahují lipofilní depotní formy (např. mastné kyseliny, vosky, oleje). Ve vynálezu jsou také zahrnuty zvláštní prostředky potažené polymery (např. poloxamery nebo poloxaminy) a aktivní sloučeniny spojené s protilátkami, namířenými proti tkáňově specifickým receptorům, ligandům nebo antigenům nebo připojené k ligandům tkáňově specifických receptorů. Jiná provedení prostředků, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují zvláštní formy ochranného potažení, inhibitory • · · · proteáz nebo zesilovače pro různé způsoby podávání, včetně parenterálního, plicního nazálního nebo orálního.

Zde používaný termín „farmaceuticky přijatelné nosiče“ označuje látky dobře známé osobám se zkušeností v tomto oboru, které zahrnují mimo jiné 0,01 až 0,1 M a s výhodou 0,05 M fosfátový pufr nebo 0,8% fyziologický roztok. Dále mohu takové farmaceuticky přijatelné nosiče být jak vodné tak nevodné roztoky, suspenze a emulze. Příklady nevodných rozpustidel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje jako jsou olivový olej, a organické estery, které je možno injekčně podávat, jako je ethyloleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, roztoky alkohol/voda, emulze nebo suspenze, včetně solných a pufrovaných médií. Parenterální přenašeče zahrnují roztoky chloridu sodného, Ringerův roztok dextrózy, dextrózu a chlorid sodný, Ringerův roztok s laktózou nebo fixované oleje. Intravenózní přenašeče zahrnují tekuté a vyživující doplňky, doplňky elektrolytů, jako jsou ty, které jsou založené na Ringerově roztoku dextrózy a podobné. Mohou být také přítomna konzervační činidla a jiné přídavky, jako jsou například protimikrobní činidla, antioxidanty, „collating“ činidla, inertní plyny a podobně.

Zde používaný termín „adjuvans“ označuje látky nebo směsi, které zesilují imunitní odpověď k antigenu. Adjuvans může sloužit jako uložení antigenu v tkáni, ze kterého je antigen pomalu uvolňován a také jako aktivátor lymfatického systému, který nespecificky zesiluje imunitní odpověď (Hood a kol., Immunology, 2. vydání, 1984, Benjanin/Cummings: Menlo Park California, str. 384). Často primární dávka samotného antigenu bez přítomnosti adjuvans, není schopna vyvolat humorální nebo buněčnou imunitní odpověď. Mezi adjuvans patří mimo jiné kompletní Freudovo adjuvans, nekompletní Freudovo adjuvans, saponin, minerální gely, jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky, jako jsou lyzolecitin, „pluronic“ polyalkoholy, polyanionty, peptidy, olej nebo emulze uhlovodíků, „keyhole limpet“ hemokyaniny, dinitrofenol a potenciálně užitečné lidské adjuvans, jako je BCG (Calmette-Guerrinův bacil) a Corynebacterium parvum. Je výhodné, když je adjuvans farmaceuticky přijatelné.

Kontrolované nebo trvale uvolňující prostředky obsahují lipofilní depotní formy (např. mastné kyseliny, vosky, oleje). Ve vynálezu jsou také zahrnuty zvláštní prostředky potažené polymery (např. poloxamery nebo poloxaminy) a aktivní sloučeniny spojené s protilátkami, namířenými proti tkáňově specifickým receptorům, ligandům nebo antigenům nebo připojené k ligandům tkáňově specifických receptorů.

♦ 4

444 4444

Jiná provedení prostředků, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují zvláštní formy ochranného potažení, inhibitory proteáz nebo zesilovače pro různé způsoby podávání, včetně parenterálního, plicního nazálního nebo orálního.

Po podání jsou sloučeniny často rychle odstraněny ze slizničních povrchů nebo oběhu a mohou tedy vyvíjet relativně krátkodobou farmakologickou aktivitu. Následkem toho může být vyžadováno časté podávání relativně vysokých dávek bioaktivních sloučenin, aby se udržela jejich léčebná aktivita. O sloučeninách modifikovaných kovalentním připojením ve vodě rozpustných polymerů jako je polyethylenglykol, kopolymery polyethylenglykolu a polypropylenglykolu, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinyl alkohol, polyvinylpyrolidon nebo polyprolin je známo, že vykazují podstatně delší poločasy přetrvávání v krvi po intravenózní injekci, než vykazují odpovídající nemodifikované sloučeniny (Abuchowski a kol., 1981; Newmark a kol., 1982 a Katre a kol., 1987). Takové modifikace mohou také zvýšit rozpustnost sloučeniny ve vodném roztoku, eliminují agregování, zvyšují fyzikální a chemickou stabilitu sloučeniny a silně potlačují imunogenicitu a reaktivitu sloučeniny. Výsledkem je, že požadované in vivo biologické aktivity může být dosaženo méně častým podáním takovýchto komplexů polymer-antigen, nebo v nižších dávkách, než u nemodifikované sloučeniny.

Dávky. Dostatečné množství může obsahovat mimo jiné od 1 pg/kg do 1000 mg/kg. Množství může být 10 mg/kg. Farmaceuticky přijatelná forma prostředku zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič.

Jak je uvedeno výše, předkládaný vynález poskytuje léčebné prostředky obsahující farmaceutické prostředky, zahrnující vektory, vakcíny, polypeptidy, nukleové kyseliny a protilátky, protilátky proti protilátkám a činidla, které pak soutěží s pneumokokovou bakterií v patogenních aktivitách, jako je navázání k hostitelské buňce.

Příprava léčebných prostředků, které obsahují aktivní složku, je v oboru dobře známa. Typicky jsou takové prostředky připraveny ve formě aerosolu polypeptidu, dodávaného do nosohltanu nebo injekčně, buď jako tekuté roztoky nebo suspenze, mohou však také být připraveny v pevné formě, která je vhodná pro rozpuštění nebo suspendování v roztoku před vlastním injekčním podáním. Přípravek může také být emulgován. Aktivní léčebná složka je často míchána sexcipienty, které jsou farmaceuticky přijatelné a slučitelné s aktivní složkou. Vhodnými excipienty jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol nebo podobně a jejich ···· kombinace. Navíc pokud je to žádoucí, prostředek může obsahovat malá množství pomocných sloučenin, jako jsou zvlhčující nebo emulgační činidla, činidla pufrující pH, která zvyšují účinnost aktivní složky.

Aktivní složka může být v léčebném prostředku v neutralizované, farmaceuticky přijatelné, solné formě. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují kyselé soli (vytvořené s volnými aminoskupinami na polypeptidu nebo na molekule protilátky) a které jsou vytvořeny s anorganickými kyselinami, jako jsou například kyselina chlorovodíková nebo kyselina fosforečná, nebo s organickými kyselinami, jako jsou kyselina octová, kyselina šťavelová, kyselina vinná, kyselina „mandelic“ a podobně. Soli vytvořené z volných karboxylových skupin mohou být také odvozeny od anorganických zásad, jako jsou například sodík, draslík, čpavek, vápník nebo železité hydroxidy, a jako jsou organické zásady, například izopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, prokain a podobně.

Prostředek obsahující „A“ (kde „A“ je jednoduchý protein, molekula DNA, vektor atd.) neobsahuje v podstatě „B“ (kde „B“ obsahuje jeden nebo více kontaminujících proteinů, DNA molekul, vektorů atd.), když alespoň 75 hmotnostních procent proteinů, DNA, vektorů (v závislosti na kategorii druhů, k nimž A a B patří) v prostředku je „A“. Je výhodné, když „A“ tvoří alespoň 90 hmotnostních procent druhů A + B v prostředku, nejvýhodnější je alespoň 99 hmotnostních procent.

Výraz „léčebně účinné množství“ je zde používaný ve smyslu množství, které je postačující pro alespoň 15% snížení, výhodně alespoň 50% snížení, ještě výhodněji alespoň 90% snížení a nejvýhodněji když zabrání, klinicky významně sníží aktivitu, funkci a odpověď hostitele. Na druhé straně léčebně účinné množství je postačující aby způsobilo zlepšení klinicky významného stavu hostitele. V kontextu předkládaného vynálezu je nedostatek vlivu na odpověď hostitele zřejmý při pokračování nebo šíření bakteriální infekce. Zlepšení klinicky významného stavu hostitele zahrnuje snížení množství bakterií, mizení bakterií z kolonizovaných hostitelských buněk, snížení horečky nebo zánětu, spojených s infekcí nebo snížení jakýchkoli jiných symptomů, spojených s bakteriální infekcí.

Podle vynálezu může být složka nebo složky léčebného prostředku, které jsou předmětem tohoto vynálezu, dodávána parenterálně, přes slizniční povrchy, např. orálně, nazálně, pulmonárně nebo rektálně nebo transdermálně. Výhodné je podávání parenterální, např. pomocí intravenózní injekce, a také mimo jiné intraarteriálním.

• ···· 4 ·· • · · 4444 4444 • · · · 4 4 4 4 _ _ * _Α · ♦ · « 4 4 4 4 4

·..·♦..· intramuskulárním, intradermálním, subkutánním, intraperitoneálním, intraventrikulárním a intrakraniálním podáváním. Orálnímu nebo pulmonárnímu podávání může být dávána přednost, protože aktivuje imunitu sliznic; protože pneumokoky všeobecně kolonizují nosohltanové nebo plicní sliznice, imunita sliznic může být zvláště účinné preventivní působení. Když je termín „dávková jednotka“ použit ve vztahu k léčebnému prostředku, který je předmětem tohoto vynálezu, označuje fyzicky odlišenou jednotku, vhodnou jako jednotka dávkování pro lidi, přičemž každá z těchto jednotek obsahuje předem určené množství aktivního materiálu, spočtené tak, aby mělo požadovaný léčebný účinek ve spojení s požadovaným rozpouštědlem; tj. nosičem nebo vehikulem.

V jiném provedení může být aktivní složka podávána ve váčku, zvláště vlipozómu (viz Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat a kol., vLiposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein a Fiedler (vyd.), Liss, new York, str. 353 až 365 (1989); Lopez-Berestein, tamtéž, str. 317 až 327; obecně viz tamtéž).

V ještě jiném provedení může být aktivní složka podávána systémem s kontrolovaným uvolňováním. Například polypeptid může být podáván pomocí intravenózní infuze, implantovanou osmotickou pumpou, dermální náplastí, Jipozómy nebo jinými způsoby podávání. V jednom provedení může být použita pumpa (viz Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald a kol., Surgery 88:507 (1980); Saudek a kol., N. Engl. J. Med.

321:574 (1989)). V jiném provedení mohou být použity polymerní materiály (viz Medical Applications of Controlled Release, Langer a Wise (vyd.) CRC Přes., Boča Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen a Balí (vyd.), Wiley, New York (1984); Ranger a Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); viz též Levý a kol., Science 228:190 (1985); During a kol., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard a kol., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). V ještě jiném provedení může být systém s kontrolovaným uvolňováním umístěn v blízkosti léčebného cíle, tj. mozku, přičemž je vyžadován pouze zlomek systémové dávky (viz např. Goodson, v Medical Applications of Controlled Release, viz výše, sv. 2, str. 115 až 138 (1984)). S výhodou je zařízení pro kontrolované uvolňování umístěno v blízkosti místa s nevhodnou imunologickou aktivací nebo nádoru. Jiné systémy s kontrolovaným uvolňováním jsou diskutovány v přehledu Langerem (Science 249:1527-1533 (1990)).

• ·· · ♦ *· ·· ·· 99 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 • ♦ 9 9 9 9

999 9999 9 9 9 9

Jedinec, pro něhož podávání aktivní složky, jak bylo uvedeno výše, je účinný léčebný postup při bakteriální infekci, je převážně člověk, ale může jím být jakýkoli živočich. Osoba s běžnou zkušeností v tomto oboru si snadno uvědomí, že metody a farmaceutické prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou zvláště vhodné pro podávání jakémukoli živočichu, zvláště savci, včetně mimo jiné domácím živočichům, jako jsou kočky a psi, hospodářským zvířatům, jako jsou mimo jiné hovězí dobytek, koně, kozy, ovce a vepři, divoká zvířata (jak v divoké přírodě, tak i v zoologické zahradě), zvířata používaná pro výzkum, jako jsou myši, krysy, králíci, kozy, ovce, vepři, psi, kočky atd., např. pro veterinární lékařské použití.

Pro léčebné metody a prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je poskytnuta léčebně účinná dávka aktivní složky. Léčebně účinná dávka může být určena zkušeným lékařem v závislosti na charakteristikách pacienta (věk, váha, pohlaví, stav, komplikace, další nemoci atd.), jak je v oboru dobře známo. Dále jak jsou prováděny další studie, objeví se další specifičtější informace, týkající se vhodných dávkových hladin pro léčení různých stavů u různých pacientů a pracovník s běžnou zkušeností, pokud vezme v úvahu kontext léčby, věk a obecný zdravotní stav příjemce, je schopen zjistit vhodné dávkování. Obecně při intravenózní injekci nebo infuzi může být dávka nižší než při intraperitoneálním, intramuskulárním nebo jiných způsobech podávání. Dávkovači plán může varírovat v závislosti na poločase v oběhu a použitém přípravku. Prostředky jsou podávány způsobem, který závisí na terapeuticky účinných dávkových formách. Přesná množství aktivní složky, která je nutno podávat, závisí na posouzení praktického lékaře a jsou zvláštní pro každého jedince. Nicméně vhodné dávky mohou být v rozmezí od 0,1 do 20, výhodně od 0,5 do 10 a ještě výhodněji od jednoho do několika miligramů aktivní složky na kilogram tělesné hmotnosti jedince na den a závisí to na způsobu podávání. Vhodné dávkové režimy pro počáteční podání a zesilovací dávku jsou také různé, ale typické je že počáteční dávka je následována opakovanými dávkami v jednohodinových nebo vícehodinových intervalech, podávanými buď injekčně nebo jiným způsobem. Alternativně je možno uvažovat o kontinuální intravenózní infuzi, která postačuje k udržení koncentrací v krvi v rozmezí deseti nanomolů až deseti mikromolů.

Podávání spolu s jinými sloučeninami.

Při léčení bakteriální infekce může být aktivní složka, která je předmětem tohoto vynálezu, podávána ve spojení s jedním nebo více farmaceutickými prostředky, • ··· ··· ·· ···»*·· používanými pro léčení bakteriální infekce, mimo jiné s (1) antibiotiky; (2) rozpustnými sacharidovými inhibitory bakteriálního adhezinu; (3) jinými nízkomolekulárními inhibitory bakteriálního adhezinu; (4) inhibitory bakteriálního metabolizmu, transportu nebo transformace; (5) stimulátory bakteriální lýzy nebo (6) antibakteriálními protilátkami nebi vakcínami, namířenými na jiné bakteriální antigeny. Mezi jinými potenciálně aktivními složkami jsou zahrnuta protizánětlivé činidla, jako jsou steroidy a protizánětlivé léky nesteroidního typu. Podávání může být současné (například podávání směsi aktivní složky, která je předmětem tohoto vynálezu a antibiotika) nebo může být in seríatim.

Tedy ve specifickém provedení může léčebný prostředek dále obsahovat účinné množství aktivní složky a jednu nebo více z následujících aktivních příměsí: antibiotikum, steroid atd. Příklady složení jsou dány dále:

Intravenózní přípravek I

Složka mg/ml cefotaxime 250,0 polypeptid 10,0 dextróza USP 45,0 dvojsiřičitan sodný USP 3,2 „edetate disodium“ USP 0,1 voda pro injekce do 1,0 ml

Intravenózní přípravek II

Složka mg/ml ampicilin 250,0 polypeptid 10,0 dvojsiřičitan sodný USP 3,2 „disodium edetate“ USP 0,1 voda pro injekce do 1,0 ml

Intravenózní přípravek III

Složka mg/ml gentamycin (ve formě síranu) 40,0 polypeptid 10,0 • ♦·*

dvojsiřičitan sodný USP	3,2
„disodium edetate“ USP	0,1
voda pro injekce do	1,0 ml
Intravenózní přípravek IV
Složka	mg/ml
polypeptid	10,0
dextróza USP	45,0
dvojsiřičitan sodný USP	3,2
„edetate disodium“ USP	0,1
voda pro injekce do	1,0 ml
Intravenózní přípravek V
Složka	mg/ml
antagonista polypeptidu	10,0
dvojsiřičitan sodný USP	3,2
„disodium edetate“ USP	0,1
voda pro injekce do	1,0 ml

Tedy ve specifickém případě, kdy je žádoucí snížit nebo inhibovat infekci, která je způsobena vazbou bakterií na hostitelské buňky, nebo protilátkou nebo jejím ligandem nebo protilátkou k tomuto ligandů, je přidán polypeptid aby blokoval interakci bakterií s hostitelskou buňkou.

Je zde také uvažováno plicní podávání polypeptidu, který je předmětem tohoto vynálezu, a který má lektinovou aktivitu a působí jako inhibiční činidlo pro adhezin (nebo jeho deriváty). Inhibiční činidlo pro adhezin (nebo jeho deriváty) je podáván do plic savců, kde může interferovat s vazbou bakterií, tj. streptokoků a výhodně pneumokoků na hostitelské buňky. V oboru je možno nalézt i jiné zprávy o přípravě proteinů, vhodných pro podávání do plic [Adjei a kol., Pharmaceutical Research, 7:565569 (1990); Adjei a kol., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) („leuprodide acetate“); Braquet a kol., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(dodatek 5):143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard a kol., Annals of Internal

• *···

Medicine, sv. III, str. 206 až 212 (1989) (a1-antitrypsin); Smith a kok, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (a-1-proteináza); Oswein a kol., „Aerosolization of Proteins“, Proceedings of Symposium on Respirátory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (1990) (rekombinantní lidský růstový hormon); Debs a kol., J. Immunol. 140:3482-3488 (1988) (interferon-g a faktor alfa nádorové nekrózy); Platz a kol., patent US č. 5 284 656 (faktor stimulující kolonie granulocytů)]. Metody a prostředky pro podávání léků do plic jsou popsány v patentu US č. 5 451 569, vydaném 19. září 1995 Wongovi a kol.

Všechna taková zařízení vyžadují používání přípravků vhodných pro podávání činidel inhibujících adhezin (nebo jeho deriváty). Je typické, že každý přípravek je specifický pro typ používaného zařízení a může zahrnovat použití vhodného poháněcího materiálu, navíc k běžně používaným rozpouštědlům, adjuvans a/nebo nosiče, vhodné pro léčení. Zamýšleno je také používání lipozomů, mikrokapslí nebo mikrokuliček, inkluzních komplexů nebo jiných typů nosičů. Chemicky pozměněné činidlo inhibující adhezin může být také připraveno podle různých předpisů, v závislosti na typu chemické modifikace nebo typu použitého zařízení.

Přípravky vhodné pro použití spolu s rozprašovačem, buď tryskovým nebo ultrazvukovým, budou typicky obsahovat činidlo inhibující adhezin rozpuštěný ve vodě na koncentraci asi 0,1 až 25 mg biologicky aktivního činidla inhibujícího adhezin na ml roztoku. Přípravky mohou také obsahovat pufr a jednoduchý cukr (např. pro stabilizaci činidla inhibujícího adhezin a regulaci osmotického tlaku). Přípravek pro rozprašovač může také obsahovat povrchově aktivní látku, aby se snížilo nebo zabránilo agregaci činidla inhibujícího adhezin, která je způsobována atomizací roztoku při tvorbě aerosolu.

Přípravky pro používání s inhalačním zařízením, které měří dávku, budou obvykle obsahovat jemně mletý prášek, který obsahuje činidlo inhibující adhezin (nebo jeho derivát), které je suspendováno s pomocí povrchově aktivní látky, obsažené v poháněči látce. Poháněči látkou může být jakýkoli běžný materiál, který je pro tyto účely používán, jako jsou chlorofluorouhlovodíky, hydrochlorofluorouhlovodíky, hydrofluorouhlovodíky nebo uhlovodíky, mimo jiné trichlorfluormethan, dichlordifluormethan, dichlortetrafluorethanol a 1,1,1,2-tetrafluorethan nebo jejich kombinace. Vhodnými povrchově aktivními látkami jsou mimo jiné sorbitan trioleát a sojový lecitin. Olejová kyselina může být také vhodná jako povrchově aktivní látka.

···« ♦ · ·♦ • · · · • · · · 9 · 9 9 • 9 9 9

99

Tekuté aerosolové přípravky obsahují činidlo inhibující adhezin a dispergující činidlo ve fyziologicky přijatelném rozpouštědle. Suché práškové aerosolové přípravky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, obsahují jemně mletou pevnou formu činidla inhibujícího adhezin a dispergující činidlo. Jak tekutý tak i suchý práškový aerosolový přípravek musí být uveden do aerosolového stavu. To jest, musí být rozbit na tekuté nebo pevné částice, aby se zajistilo, že aerosolová dávka skutečně dosáhne membrán sliznic v nosních dutinách nebo v plicích. Zde používaný termín „aerosolová částice“ znamená tekutou nebo pevnou částici vhodnou pro nosní či plicní podání, tj. že dosáhne membrán sliznic. Jsou důležité i ostatní úvahy, jako jsou konstrukce dodávacího zařízení, další složky v přípravku a charakteristiky částic. Tyto aspekty plicního podávání léků jsou v oboru dobře známé a manipulace s přípravky, způsoby přípravy aerosolu a konstrukce dodávacího zařízení vyžadují nanejvýše rutinní experimentování osoby, která má běžné zkušenosti v tomto oboru. V určitém provedení bude střední dynamický průměr 5 mikrometrů nebo méně, aby bylo zajištěno, že částice léku dosáhnou plicních sklípků [Wearley, L. L., Crit. Rev. in Ther. Drug Carrier Systems 8:333 (1991)].

Systémy pro dodávání aerosolu, jako je tlakový inhalátor, měřící podanou dávku a inhalátor pro suchý prášek, jsou popsány v Newman, S. P., Aerosols and the Lung, vyd. Clarke, S. W. a Davia, D., str. 197 až 22 a mohou být použity ve spojení s předkládaným vynálezem.

V jiném provedení, jak je diskutováno podrobně dále, může aerosolový přípravek, který je předmětem tohoto vynálezu, obsahovat vedle činidla inhibujícího adhezin i jiné terapeuticky nebo farmakologicky aktivní složky, jako je mimo jiné antibiotikum, steroid a nesteroidní protizánětlivé léky atd.

Tekuté aerosolové přípravky. Předkládaný vynález poskytuje aerosolové přípravky a dávkové formy pro použití při léčbě jedinců trpících bakteriální, např. streptokokovou a zvláště pneumokokovou infekcí. Obecně takové dávkové formy obsahují činidlo inhibující adhezin ve farmaceuticky přijatelném rozpouštědle. Farmaceuticky přijatelná rozpouštědla zahrnují mimo jiné sterilní vodu, fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, roztok dextrózy a podobně. Ve specifickém provedení může rozpouštědlem, které je použito v předkládaném vynálezu nebo ve farmaceutickém přípravku, který je předmětem tohoto vynálezu, být fosfátem pufrovaný ····

• · · · · • · · * • · · · ·· ·· fyziologický roztok nebo pufrovaný fyziologický roztok s pH obecně v rozmezí 7,0 až 8,0 nebo voda.

Tekutý aerosolový přípravek, který je předmětem tohoto vynálezu, může obsahovat jako své volitelné složky farmaceuticky přijatelné nosiče, ředidla, rozpouštěcí nebo emulgující činidla, povrchově aktivní látky a excipienty. Přípravek může obsahovat nosič. Nosič je makromolekula, která je rozpustná v oběhovém systému a která je fyziologicky přijatelná, přičemž fyziologická přijatelnost znamená, že pro osoby se zkušeností v oboru by přijali jako součást léčebného režimu injekci uvedeného nosiče pacientovi. Je výhodné, když je nosič v oběhovém systému relativně stabilní, s přijatelným poločasem v plazmě. Takovými makromolekulami jsou mimo jiné sojový lecitin, kyselina oleová a sorbitan trioleát, přičemž je sorbitan trioleátu dávána přednost.

Předkládané přípravky mohou také obsahovat jiná činidla, vhodná pro udržování pH, stabilizaci roztoku nebo regulaci osmotického tlaku. Příklady takových činidel jsou mimo jiné soli, jako je chlorid sodný nebo chlorid draselný a sacharidy, jako je glukóza, galaktóza nebo manóza a podobně.

V rámci předkládaného vynálezu jsou dále uvažovány tekuté aerosolové přípravky, obsahující činidlo inhibující adhezin a jiný léčebně účinný lék, jako je antibiotikum, steroid, nesteroidní protizánětlivý lék atd.

Suché práškové aerosolové přípravky. V rámci předkládaného vynálezu je dále uvažováno, že aerosolový přípravek může být připraven jako suchý práškový přípravek, obsahující jemně mletý prášek z činidla inhibujícího adhezin a plnidla.

Přípravky, které budou podávány pomocí zařízení na inhalaci prášků, budou obsahovat jemně mletý suchý prášek, obsahující činidlo inhibující adhezin (nebo derivát) a může také obsahovat plnidla jako je laktóza, sorbitol, sacharóza nebo manitol v množstvích, které usnadňují rozptýlení prášku ze zařízení, např. 50 až 90 % hmotnosti přípravku. Činidlo inhibující adhezin (nebo derivát) by mělo být nejvýhodněji připraveno ve formě částic s průměrnou velikostí částic menší než 10 pm (nebo mikronů), výhodněji 0,5 až 5 mm, pro účinné dosažení koncových částí plic. V jiném provedení může suchý práškový přípravek obsahovat jemně mletý prášek činidla inhibujícího adhezin, dispergující činidlo a plnící činidlo. Plnící činidla vhodná pro použití v souvislosti s předkládaným přípravkem zahrnují taková činidla jako je laktóza, ···*··* ······· sorbitol, sacharóza nebo manitol v množstvích, které usnadňují rozptýlení prášku ze zařízení.

V předkládaném vynálezu je dále uvažováno použití suchých práškových přípravků, obsahujících činidlo inhibující adhezin a další terapeuticky účinný lék, jako je antibiotikum, steroid, nesteroidní protizánětlivý lék atd.

V předkládaném vynálezu je dále uvažováno použití pevných dávkových forem pro orální použití, které jsou obecně popsány v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vyd. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) v kapitole 89, která je zde zahrnuta jako odkaz. Pevné dávkové formy zahrnují tablety, kapsle, pilulky, pastilky, zdravotní bonbóny nebo dražé. Pro přípravu zde předkládaných prostředků také může být použita lipozomální nebo proteinoidní enkapsulace (jako například proteinoidní mikrokapsle, popsané v patentu US č. 4 925 673). Může být použita lipozomální enkapsulace a lipozómy mohou být doplněny různými polymery (např. patent US č. 5 013 556). Popis možných pevných dávkových forem pro léčebné použití je podáno K. Marshallem v: Modern Pharmaceutics, vyd. G. S. Bankerem a C. T. Rhodesem, kap. 10, 1979, která je zde zahrnuta jako odkaz. Obecně budou přípravky obsahovat složku nebo složky (nebo jejich chemicky pozměněné formy) a netečné složky, které slouží k ochraně proti prostředí v žaludku a uvolňují biologicky aktivní materiál ve střevech.

Také se zde uvažují dávkové formy pro orální použití, které obsahují deriváty výše uvedené složky nebo složek. Složka nebo složky mohou být chemicky modifikovány tak, že orální podání derivátu je účinné. Obecně je modifikací zamýšleno připojení alespoň jedné přídatné složky k samotné molekule složky léku, přičemž uvedená přídatná složka umožňuje (a) inhibici proteolýzy a (b) průstup do krevního řečiště ze žaludku nebo ze střeva. Také je žádoucí zvýšení všeobecné stability složky nebo složek a prodloužení doby obíhání v těle. Příklady takových přídatných složek jsou: polyethylenglykol, kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, polyvinylalkohol, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylpyrolidon a polyprolin. Abuchowski a Davis, 1981, „Soluble Polymer-Enzyme Adducts“ v Enzymes as Drugs, vyd. Hocenberg a Roberts, Wiley-lnterscience, New York, NY, str. 367 až 383; Newmark a kol., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Dalšími polymery, které mohou být použity, jsou poly-1,3dioxolan a poly-1,3,6-tioxocan. Pro farmaceutické použití, jak je naznačeno výše, jsou výhodné přídatné složky z polyethylenglykolu.

•· ·· ·· • Β Β · Β · • · Β Β · • · · · · Β • Β Β Β Β

ΒΒΒΒ Β Β Β·

Pro složku (nebo derivát) může být místem uvolňování žaludek, tenké střevo (dvanáctník, lačník nebo kyčelník) nebo tlusté střevo. Osoba se zkušeností v tomto oboru má k dispozici přípravky, které se nerozpouštějí v žaludku a uvolní materiál v dvanáctníku nebo jinde ve střevě. Je výhodné, když se vlastní uvolňování vyhne poškozujícím vlivům žaludečního prostředí, buď tím že chrání protein (nebo derivát) nebo uvolňováním biologicky aktivního materiálu až za prostředím žaludku, tedy ve střevě.

Aby se zajistila plná odolnost proti trávicímu prostředí, je podstatné potažení neprostupné alespoň do pH 5,0. Příklady běžnějších netečných složek, které jsou používané jako potahy proti trávicímu prostředí, jsou acetát celulózy „trimellitate“ (CAT), ftalát hydroxypropylmethylcelulózy (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalát polyvinylacetátu (CAP), Eudragit L, Eudragit S a Shellac. Tyto potahové látky můžou být použity jako smíšené vrstvy.

Na tabletách může být také použit potahový materiál nebo směs potahových materiálů, které však nejsou míněny jako ochrana proti trávicímu prostředí v žaludku. Může se jednat o potahový materiál obsahující cukr nebo potahy, které usnadňují spolknutí tablety. Kapsle mohou obsahovat tvrdou skořápku (jako je želatina) kvůli dopravě suchých léčiv, tj. prášku; pro tekuté formy může být použita měkká želatinová skořápka. Obalovým materiálem pro pastilky by měla být silná vrstva škrobu nebo jiný poživatelný papír.

Peptidová léčiva mohou být obsažena v přípravcích jako jemné částice ve formě granulí nebo pilulek o velikosti částic 1 mm. Materiál podávaný v kapslích může také být ve formě prášku, slabě stlačených kousků nebo dokonce jako tablety. Léčebné přípravky můžou být připravovány lisováním.

Do léčebných přípravků mohou také být zahrnuta barviva a činidla dodávající příchutě. Například může být připraven protein (nebo derivát) (buď uzavřením do lipozómů nebo mikrokuliček) a ty dále obsaženy v poživatelném výrobku, jako je chlazený nápoj, obsahující barviva a činidla dodávající příchutě.

Léčivo je možno zředit nebo zvětšit jeho objem pomocí netečného materiálu. Tato ředidla mohou obsahovat sacharidy, zvláště manitol, a-laktózu, bezvodou laktózu, celulózu, sacharózu, modifikovaný dextran a škrob. Jako plnidla také mohou být použity určité anorganické soli, jako jsou fosforečnan vápenatý, uhličitan hořečnatý a • · · ·>

• · · · · · · • · · · · · · • · · · · · * ······ • · · · · · ······ · · ·· chlorid sodný. Některé komerčně dostupné ředící materiály jsou Fast-Flo, Emdex, STARx 1500, Emcompress a Avicell.

Při úpravě léku do pevné dávkové formy mohou být zahrnuta rozvolňovadla. Materiály použité jako rozvolňovadla zahrnují mimo jiné škrob, včetně komerčních rozvolňovadel založených na škrobu, Explotab. škrobový glykolát sodný, Amberlit, sodná sůl karboxymethylcelulózy, ultramylopektin, alginát sodný, želatina, pomerančová kůra, kyselá karboxymethylcelulóza, mohou být také použity přírodní houby a bentonit. Jinými formami rozvolňovadel jsou nerozpustné iontoměničové pryskyřice, které vyměňují kationty. Práškové gumy mohou být použity jako rozvolňovadla a jako pojívá a zahrnují práškové gumy jako jsou agar, Karaya nebo kozinec. Jako rozvolňovadla jsou také vhodné kyselina alginová a její sodná sůl. Pojivá mohou být použita pro držení léčebného činidla pohromadě při přípravě pevných tablet a zahrnují materiály z přírodních produktů jako je akácie, kozinec, škrob a želatinu. Mezi další patří methylcelulóza (MC), ethylcelulóza (EC) a karboxymethylcelulóza (CMC). Jak polyvinylpyrolidon (PVP) tak i hydroxypropylmethylcelulóza (HPMC)mohou být použity ve formě alkoholových roztoků pro granulování léčiva.

Při přípravě léčiva mohou být zahrnuta činidla pro snižování tření, aby se zabránilo ztuhnutí materiálu v průběhu procesu. Maziva mohou být použita ve formě vrstvy mezi léčivem a stěnou lisovacího nástroje a patří mezi ně mimo jiné kyselina stearová včetně její hořečnaté a vápenaté soli, polytetrafluorethylen (PTFE), tekutý parafín, rostlinné oleje a vosky. Mohou také být použita rozpustná maziva jako je laurylsíran sodný, laurylsíran hořečnatý, polyethylenglykol o různé molekulární hmotnosti, Carbowax 4000 a 6000.

Mohou být také použity látky, které zlepšují průtokové vlastnosti léku během přípravy a mohou být přidány aby napomohly při tvarových úpravách v průběhu lisování. Patří mezi ně škrob, talek, pyrogenní silika a hydratovaný křemičitan hlinitý.

Aby se podpořilo rozpouštění léčiva ve vodném prostředí, mohou být jako zvlhčující činidla přidány povrchově aktivní látky. Povrchově aktivní látky mohou zahrnovat aniontové detergenty, jako je laurylsíran sodný, dioktylsulfosukcinát sodný a dioktylsulfonát sodný. Lze použít i kationtové detergenty, jako je chlorid benzalkonia nebo chlorid benzethomia. Na seznamu potenciálních neiontových detergentů, které mohou být zahrnuty při přípravě jako vhodné povrchově aktivní látky jsou lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearát, polyoxyethylen hydrogenovaný ricinový olej 10, • ···· · ·· tt 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 · · · · · ·

V · · · 4 · · · · ·

999 99 9999

4y ··· ·· ······· 4 4 4 4 a 60, monostearan glycerolu, polysorbate 40, 60, 65 a 80, ester sacharózy a mastné kyseliny, methylcelulóza a karboxymethylcelulóza. Tyto povrchově aktivní látky mohou být přítomny v přípravcích proteinů nebo jejich derivátů, buď samotné nebo jako směsi v různých poměrech.

Přísady, které potenciálně zvyšují příjem polypeptidu (nebo derivátu), jsou například mastné kyseliny jako kyselina olejová, kyselina linolová a kyselina linolenová. Podávání do plic. Je zde také uvažováno plicní podávání předloženého polypeptidu (nebo jeho derivátu), který je předmětem tohoto vynálezu. Polypeptid (nebo jeho derivát) je podáván do plic savců pomocí inhalování a pokrývá povrch sliznice plicních sklípků. Další zprávy o podávání léčiv do plic jsou Adjei a kol., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569 (1990); Adjei a kol., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) („leuprodide acetate“); Braquet a kol., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(dodatek 5):143-146 (endothelin-1); Hubbard a kol.,

198, Annals of Internal Medicine, sv. III, str. 206 až 212 (1989) (a1-antitrypsin); Smith a kol., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (a-1-proteináza); Oswein a kol., 1990, „Aerosolization of Proteins“, Proceedings of Symposium on Respirátory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (rekombinantní lidský růstový hormon); Debs a kol.,

1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (1988) (interferon-g a faktor alfa nádorové nekrózy) a Platz a kol., patent US č. 5 284 656 (faktor stimulující kolonie granulocytů). Metoda a prostředek pro podávání léků do plic kvůli systémovému účinku jsou popsány v patentu US č. 5 451 569, vydaném 19. září 1995 Wongovi a kol.

V rámci tohoto vynálezu je zamýšleno používat v praxi široký výběr mechanických zařízení, určených pro podávání léčebných produktů do plic, jedná se mimo jiné o rozprašovače, inhalátory měřící podanou dávku a inhalátory pro inhalování prášků, všechna tato zařízení jsou dobře známa osobám se zkušenostmi v tomto oboru.

Přípravky vhodné pro aplikaci pomocí rozprašovače, buď tryskového nebo ultrazvukového, budou typicky obsahovat polypeptid (nebo derivát) rozpuštěný ve vodě na koncentraci 0,1 až 25 mg biologicky aktivního proteinu na 1 ml roztoku. Přípravek také může obsahovat pufr a jednoduchý cukr (např. pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku). Přípravek pro rozprašovač může také obsahovat povrchově aktivní látku pro snížení povrchově indukované agregace proteinu, způsobené atomizací roztoku při tvorbě aerosolu.

• ·

Přípravky vhodné pro aplikaci pomocí inhalátoru měřícího podanou dávku, budou obecně obsahovat jemně rozemletý prášek, obsahující polypeptid (nebo derivát), suspendovaný pomocí povrchově aktivní látky v hnacím prostředí. Poháněči látkou může být jakýkoli běžný materiál, který je pro tyto účely používán, jako je chlorofluorouhlovodík, hydrochlorofluorouhlovodík, hydrofluorouhlovodík nebo uhlovodíky, mimo jiné trichlorfluormethan, dichlordifluormethan, dichlortetrafluorethanol a 1,1,1,2-tetrafluorethan nebo jejich kombinace. Vhodnými povrchově aktivními látkami jsou mimo jiné sorbitan trioleát a sojový lecitin. Olejová kyselina může být také vhodná jako povrchově aktivní látka.

Přípravky, které budou podávány pomocí zařízení na inhalaci prášků, budou obsahovat jemně mletý suchý prášek, obsahující polypeptid (nebo derivát) a může také obsahovat plnidla jako je laktóza, sorbitol, sacharóza nebo manitol v množstvích, které usnadňují rozptýlení prášku ze zařízení, např. 50 až 90 % hmotnosti přípravku. Protein (nebo derivát) by měl být nejvýhodněji připraven ve formě částic s průměrnou velikostí částic menší než 10 mm (nebo mikronů), výhodněji 0,5 až 5 mm, pro účinné dosažení koncových částí plic.

Nazální podávání. Také je zde uvažováno podávání polypeptidu (nebo derivátu) do nosu nebo nosohltanu. Nazální podávání umožňuje po podání léčiva do nosu průchod polypeptidu přímo přes sliznici horního dýchacího traktu, bez nutnosti ukládání produktu v plicích. Přípravky pro nazální podávání jsou ty, které obsahují dextran nebo cyklodextran.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Schéma proteinu A (CbpA), který váže cholin a zkrácených rekombinant R1 (od aminokyseliny 16 k aminokyselině 321 od N-konce CbpA, jak je uvedeno na obrázku 2) a R2 (od aminokyseliny 16 k aminokyselině 444 od N-konce CbpA, jak je uvedeno na obrázku 2). Doména A sahá od aminokyseliny 153 k aminokyselině 321 od N-konce aminokyselinové sekvence CbpA, jak je uvedeno na obrázku 2; doména B sahá od aminokyseliny 270 k aminokyselině 326 od N-konce aminokyselinové sekvence CbpA, jak je uvedeno na obrázku 2); a C je od aminokyseliny

327 k aminokyselině 433 od N-konce aminokyselinové sekvence CbpA, jak je uvedeno na obrázku 2.

Obrázky 1A až B:

Porovnání homologií různých serotypů nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence N-koncové oblasti CbpA.

Obrázek 3: Exprese a purifikace rekombinant R1 a R2.

Obrázek 4: Výsledky pasivní ochrany u myší. Imunní séra proti rekombinantě R2 ochránily myši před letální reakcí na S. pneumoniae.

Obrázek 5: Titrace protilátek proti R2 na R6x absorbujícím na plotnách potažených LNnT-HSA.

Obrázek 6: Titrace protilátek proti Cbp-A a absorbovaných protilátek proti Cbp-A na aktivitu blokující navázání pneumokoků na plotny potažené LNnT-HSA.

Obrázek 7: Výsledky aktivní ochrany u myší. Imunní séra proti rekombinantě R1 ochránily myši před letální reakcí na S. pneumoniae (reakce vyvolána 560 cfu serotypů 6B).

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou uvedeny aby se plně ilustrovaly výhodná provedení vynálezu. Neměly by však být žádným způsobem chápány jako omezení širokého rozsahu použití vynálezu.

Příklad 1: Zkrácený peptid proteinu A, který váže cholin (CbpA)

Byl vytvořen polypeptid, obsahující zkrácený N-koncový fragment CbpA (serotyp 4). CbpA o plné délce byl amplifikován pomocí PCR primerů SJ533 a SJ537, primery byly navrženy na základě odvozené N-koncové aminokyselinové sekvence CbpA polypeptidu. Přímý 5' primer SJ533 = 5' GGC GGA TCC ATG GA(A,G) AA(C,T) GA(A,G) GG 3'. Tento degenerovaný primer, navržený podle aminokyselinové sekvence XENEG, obsahuje jak BamHI, tak Ncol restrikční místa a startovní kodon ATG. Zpětný 3' primer SJ537 = 5' GCC GTC GAC TTA GTT TAC CCA TTC ACC ATT GGC 3'. Tento primer obsahuje Sall restrikční míst pro klonovací účely a přirozený stop kodon z CbpA a je založen na sekvenci jak typu 4, tak typu R6x.

PCR produkt byl vytvořen pomocí primerů SJ533 a SJ537 za použití genomové DNA jako templátu, ampíifikováno bylo 30 cyklů s teplotou hybridizace primerů 50 °C a s High Fidelity enzymem (Boehringer Mannheim). Výsledné produkty PCR byly čištěny pomocí soupravy QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, lne.) a potom štěpeny pomocí restrikčních enzymů BamHl a Sall a klonovány do expresního vektoru pQE30 (Qiagen, lne.), štěpeného pomocí restrikčních enzymů BamHl, Xbal a Smál.

Polypeptid R2:

Přirozeně se vyskytující Pvull místo u konce druhé opakující se oblasti, jmenovitě C oblasti, jak je ukázáno na obr. 1 (nukleová kyselina 1228 sekvence typu 4), bylo použito pro vytvoření zkrácené verze genu cbpA, obsahující pouze 5' část genu. Pro vytvoření zkráceného klonu byl klon PMI580 o plné délce (typ 4) nebo PMI581 (R6x) štěpen Pvull a Xbal, výsledný fragment byl ligován do expresního vektoru pQE30 a transformován do vhodného hostitele. Protein byl exprimován a čištěn. V tomto případě byl vektorem použit stop kodon, který je od inzertu po směru přepisu, takže exprimovaný protein byl větší než předpověděná velikost inzertu, kvůli další nukleové kyselině na 5' konci klonovacího místa. Aminokyselinová sekvence polypeptidu R2 je uvedena v SEQ ID NO: 1.

Polypeptid R1:

Podobná strategie byla použita pro expresi pouze první opakující se oblasti uvnitř N-koncové oblasti CbpA, jmenovitě oblasti A polypeptidu R1. Zde bylo použito přirozeně se vyskytující Xmal místo mezi dvěma aminokyselinovými opakováními (nukleová kyselina 856 sekvence typu 4). Klon PMI580 o plné délce byl štěpen Xmnl a Aatll. Vektor pQE30 byl štěpen Aatll a Smál. Znovu byly dva fragmenty ligovány, transformovány do E. coli a klony hromadně prohledávány na přítomnost inzertů. Byl vybrán jeden pozitivní klon a z tohoto kmene byl purifikován rekombinantní protein.

Všechny polypeptidy byly exprimovány a purifikovány pomocí Qia Expression Systém (Qiagen) pomocí pQE30 vektoru E. coli. Amino-konce histidinem označených proteinů jsou detekovány pomocí analýzy typu Western, za pomoci jak antihistidinových protilátek, tak protilátek specifických k proteinu.

Čištění R1 a R2:

Pro započetí produkce a čištění rekombiriantních proteinů z E. coli byla z vysetých bakterií vybrána jedna kolonie, obsahující rekombinantní plazmid a pěstována přes noc při 37 °C v 6 ml pufru LB s 50 //g/ml kanamycinu a 100 //g/ml

4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 o 4 4 4 4 4 4 • 4 4 · 4 4 4 4 4 4 co · 4 · 4 4 4 4 4 4 □ 0 44 4 4 4 4444444 4 4 «4 ampicilinu. Tato 6,0 ml kultura byla přidána k 1 I LB s antibiotiky ve výše uvedených koncentracích. Kultura byla třepána při 37 °C do dosažení Aeoo= ~ 0,400. K 1 I kultuře byl přidán 1 M IPTG do konečné koncentrace 1 mM. Kultura byla potom třepána při 37 °C po dobu 3 až 4 hodin. 1 I kultura byla stočena po dobu 15 minut při 4000 ot/min v centrifuze model J-6B. Supernatant byl odstraněn a sediment uložen při -20 °C.

Sediment z 1 I kultury byl znovu resuspendován v 25 ml 50 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris, 6 M GuCI, 300 mM NaCl, pH 8,0 (pufr A). Tato směs byla točena při teplotě místnosti po dobu 30 minut a sonikována na sonikátoru VibraCell (Sonics and Materials, lne., Danbury, CT) za použití mikrošpičky, 2krát po dobu 30 vteřin, při 50%

Cuty Cycle při nastavené výstupní hodnotě 7. Směs byla potom centrifugována 5 minut při 10 000 ot/min v rotoru JA20 a supernatant byl odstraněn a zlikvidován. Supernatant byl navrstven na 10 ml sloupec Talon (Clontech, Palo Alto, CA), připojený k systému GradiFrac ((Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden). Sloupec byl ekvilibrován 100 ml pufru A a promyt dalšími 200 ml tohoto pufru. Byl spuštěn pH gradient za pomoci 100% cílového pufru B - 50 mM NaH₂PO₄, 8 M močovina, 20 mM MES, pH 6,0, celkový objem 100 ml. Protein byl eluován při ~ 30% pufru B. Eluované píky byly sbírány a spojeny.

Pro opětné uspořádání proteinu byla provedena dialýza proti 2 I PBS při teplotě místnosti po dobu 3 hodin za použití dialyzační trubice, která má mez molekulové hmotnosti 14 000. Vzorek byl potom dialyzován přes noc proti 2 I PBS při teplotě 4 °C.

Další výměna pufru byla provedena v průběhu koncentrace proteinu pomocí centrifugačních sloupců Centriprep-30 tím, že k zadrženém zbytku po centrifugaci byl přidán PBS a bylo centrifugováno znovu. Koncentrace proteinu byla určena pomocí proteinového testu BCA a čistota byla znázorněna obarvením 4 až 20% SDS-PAGE gelu pomocí modři Coomassie.

Příklad 2: Lektinová aktivita polypeptidů R1 a R2.

LNtn je sacharidový analog receptorů pro pneumokoky, které jsou přítomné na eukaryotických buňkách. Bylo ukázáno, že mutant pneumokoka, defektní v CbpA, se nedokázal navázat ani na eukaryotickou buňku ani na imobilizovaný cukr, což ukazuje že CbpA je adhezivní ligand. CbpA je modulární protein, který může být rozdělen na dvě oblasti: N-koncová funkční doména a C-koncová doména, která váže Cholin (obr.

1). U polypeptidů R1 a R2 byla analyzována jejich biologická aktivita, aby bylo určeno, zda aktivity celého CbpA byly lokalizované pouze v N-konci (modelem byl R2) nebo v jeho fragmentu (modelem byl R1). Bylo určováno, zda samotná N-koncová doména (R2) obsahuje vazebnou lektinovou aktivitu v nepřítomnosti domény, která váže cholin (CBD), či neobsahuje. Bylo to testováno za pomoci CbpA o plné délce a polypeptidu R2 (zkrácená verze s chybějící oblastí CBD za Pvull místem v oblasti bohaté na prolin).

Při testu byly misky pro pěstování tkáňových kultur potaženy glykokonjugáty, o kterých je známo že jsou rozpoznávány CbpA: LNnT-albumin, 3'-sialyllaktózoalbumin a jako negativní kontrola byl použit albumin. Destičky byly potom blokovány albuminem, promyty a poté přidány na 15 minut buď CbpA o plné délce, polypeptid R2 nebo polypeptid R1 (0,8 pg/ml), potom byly bez promývání přidány na 30 minut fluoresceinem značené R6 pneumokoky, promyto a navázané bakterie byly vizuálně spočítány.

Pozitivní kontrolou byla vazba R6 k sacharidu bez přidání jakéhokoli peptidu a to bylo kalibrováno jako 100 % (tabulka 1). Ve třech oddělených pokusech jak CbpA o plné délce, tak polypeptid R2 kompetitivně inhibovaly vazbu pneumokoků na povrchy potažené LNnT. CbpA o plné délce inhiboval vzhledem ke kontrole 71 %, 64 % a 63 %; polypeptid R2 inhiboval vzhledem ke kontrole 65 %, 53 % a 74 %. Odpovídající si aktivita CbpA a R2 znamená, že doména která váže cholin, není nutná pro LNnT lektinovou aktivitu CbpA a že R2 je kandidát na LNnT lektin.

Na rozdíl od vazby LNnT, vazba pneumokoků na 3'-sialyllaktózu nebyla inhibována pomocí R2 (79 a 101 %) ve srovnání s CbpA o plné délce (74 a 66 %). To naznačuje, že aktivita rozpoznávající kyselinu sialovou je ztracena, pokud chybí CBD. Naopak se zdá, že R1 je aktivní, pokud se týká rozpoznávání kyseliny sialové, což je vlastnost společná s CbpA, která je však v R2 očividně maskována. To naznačuje, že prostorové uspořádání polypeptidu do funkčních domén je ovlivněno složením a délkou polypeptidu. Slabá sekvenční variace se nachází u jiných kmenů (viz obrázek 2). Vzhledem k vysokému stupni sekvenční homologie mezi R1 a R2, je dále možné, že pro lektinovou aktivitu jsou potřebné oba R1 a R2 nebo že oba jsou lektin se slabě odlišnými specifitami (± kyselina sialová).

•·· ···* « · · · * · · · • · · « φ · φ · • · · «

9 99

Tabulka 1

Inhibice vazby pneumokoků R6 na čištěný glykokonjugát rozpustnými formami CbpA

	LNnT	3' sialyllaktóza
forma Cbp	# pneumokoků na jednu vrstvu (SD)	% kontroly	# pneumokoků na jednu vrstvu	% kontroly na kultivační jamku
bez peptidu	3282 2421 (489) 2210 (350)	100%	2611 2115(125)	100%
CbpA o plné délce	2075 1740(167) 1415(50)	63, 71,64	1933 1405 (240)	74 66
Polypeptid R2	2461 1288 (672) 1440 (530)	74, 53, 65	2639 1670(420)	101 79
Polypeptid R1	3002 2245(182) 2500 (310)	91,92, 112	1052 1445 (526)	40 68

N=3 pokusy LNnT, každý ve 3 kultivačních jamkách

N=2 pokusy SiL, každý ve 3 kultivačních jamkách

Lektinová aktivita koreluje s aktivitou navazování na buňky

Lidské buňky na svém povrchu nesou molekuly, které obsahují sacharidy (glykoprotein a glykolipid) a bakterie se na tyto glykokonjugáty navazují pomocí sacharidů, přestože mají velmi odlišné proteinové nebo lipidové kostry. Tak třeba bakterie, které nesou polypeptid s lektinovou aktivitou, se mohou in vitro navazovat na povrchy lidských buněk. Tato přímá korelace mezi in vitro lektinovou aktivitou a vazbou na buňky je známa u pneumokoků. Například LNnT kompetitivně inhibuje vazbu pneumokoků na lidské plicní buňky A549 aktivované TNF a blokuje in vivo rozvoj zápalu plic. Pro stanovení že lektinová aktivita zkráceného CbpA odráží aktivitu vazby na buňky, CbpA a zkrácený CbpA byly testovány na inhibici vazby pneumokoků na • · · · 9 999 4 9 9

9999999 ·· ··· · · • · 9 9 9 9 ··· • 99 9 99 99 99 999 plicní buňky (tabulka 2). CbpA o plné délce a polypeptid R2 kompetitivně inhibovaly navázání pneumokoků na plicní buňky vzhledem ke kontrolám na 58 % a 63 %. Polypeptid R1 nebyl účinný, což značí že vazebná aktivita LNnt, kterou má R2, je k tomu potřebná a vysvětluje to vazbu pneumokoků na plicní buňky.

Tabulka 2

Vazba pneumokoků R6 na lidské plicní buňky aktivované TNF rozpustnými formami CbpA

	Plicní buňky A549
forma Cbp	# pneumokoků na jednu vrstvu (průměr)	% kontroly
bez peptidu	697, 704, 674 702, 722 (700)	100 %
CbpA o plné délce	376, 431 (403)	58 %
Polypeptid R2	517, 693 314, 342, 350 (433)	63 %
Polypeptid R1	696, 642, 552 (630)	90 %

N=2 pokusy, každý ve 2 nebo 3 kultivačních jamkách

Lektinová aktivita LNnT závisí na R2

N-koncová oblast CbpA obsahuje 2 opakování, každé dlouhé ~110 aminokyselin (viz obrázek 1, oblasti A a C uvnitř polypeptidu R2). Pro zjištění relativního příspěvku dvou domén k biologické aktivitě, byl porovnán R1, který obsahuje pouze doménu A, s R2 a CbpA o plné délce. Při testování v adherenčním testu polypeptid R1 neinhiboval navazování k LNnT vůbec (91, 92 a 112 % vzhledem k standardnímu typu). Avšak polypeptid R1 vykazoval nějakou inhibici vazby k sialyllaktóze (68 a 40 % vzhledem ke kontrole). To demonstruje, že polypeptid R2 je vyžadován pro LNnT lektinovou aktivitu a R2 je kandidát na LNnT lektinovou doménu. Naopak R1 se zdá být aktivní při rozpoznávání kyseliny sialové.

*· ·· • · 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

99

Protilátky proti N-koncové doméně CbpA blokují vazbu na buňky:

Vzhledem k tomu, že N-koncová doména CbpA se váže na buňky, interference s aktivitou N-koncové domény bude bránit nebo zvrátí vazbu bakterií na buňky nebo purifikované glykokonjugáty. Jedním z mechanizmů interference je protilátka.

Tabulka 3

Inhibice vazby pneumokoků R6 na povrchy potažené LNnT pomocí protilátek proti CbpA R2

	# pneumokoků na jednu vrstvu (SD)	% kontroly (průměr)
protilátka před imunizací	198 (64; 88 (4)	100 %
protilátka proti zkrácenému R2	56 (11):9(2)	28%; 10%

μΙ neředěné králičí protilátky + 5 μΙ 2x10 R6x preinkubováno při teplotě místnosti 30 minut, potom přidáno do jamek potažených LNnT a proveden adherenční test. Jsou ukázány výsledky dvou nezávislých pokusů.

Antisérum vzniklé proti rekombinantní N-koncové doméně CbpA (R2) bylo testováno na schopnost blokovat navazování pneumokoků na LNnT. Králičí polyklonální antiséra proti CbpA (5 μΙ) a 5 μΙ 2x10⁷ označených bakterií bylo inkubováno při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Tato směs byla převrstvena na zakotvený LNnT po dobu 30 minut a potom 3x opláchnuta PBS, aby byly odstraněny nenavázané bakterie. Bakterie navázané na destičky byly spočítány pomocí mikroskopu a výsledky jsou uvedeny jako průměrné hodnoty spolu se standardní odchylkou z šesti jamek. Výsledky uvedené v tabulce 3 ukazuji, že antiséra vzniklá proti polypeptidu R2 blokovala vazbu pneumokoků na LNnT. Obrázek 5 srovnává titrační křivku protilátky před imunizací s titrační křivkou protilátky proti CbpA R2, pokud se týká inhibice vazby pneumokoků R6x na modelový receptor LNnT. Více než ze 70 % bylo navázání bakterií blokováno protilátkou proti R2 v ředěních 1:100 a 1:200. Při dalším ředění na 1:400 byla tato aktivita odstraněna, což ukazuje na specificitu tohoto působení.

CbpA použitý pro přípravu antisér ukázaných v tabulce 3 a na obrázku 5 byl vyvolán proti CbpA ze serotypu 4. Kmen pneumokoků R6x použitý v testech inhibice navazování byl odvozen ze serotypu 2. Schopnost protilátky blokovat navázání • · · 9 • · · · 9 9 • 9 · · · 9··· • · 9 9·· ·· · · 9 9 · · · • · 9 9 9 9 ·

9······ 99 9 · bakterie heterologního serotypu naznačuje zkříženou ochrannou aktivitu v rámci serotypů. Taková aktivita je u účinného vakcínového imunogenu vysoce žádaná. Aktivita protilátek proti přirozené konformaci N-konce CbpA:

CbpA může být purifikován ze svého přirozeného hostitele, pneumokoka, přes sloupec s cholinovou afinitou, jak je popsáno v Rosenow a kol. Jinou možností je zabudovat polyhistidinovou značku na konec genu tak, že přepisovaný protein bude prodloužen několika histidiny. Tyto zbytky usnadňují čištění na niklové afinitní matrici. Oproti zkráceným formám si udržují polypeptidy o plné délce přednostně udržují svou přirozenou terciální strukturu. CbpA purifikovaný zvláště z pneumokoka, ale také z E. coli nebo jiných hostitelských bakterií pomocí těchto biochemických způsobů, si podržuje svoji přirozenou terciální strukturu. Přirozeně prostorově uspořádaný CbpA, když je použitý jako imunogen, vyvolává protilátky, které se potenciálně odlišují od těch, které jsou navozeny imunizací zkrácenou formou, u níž může být prostorové uspořádání odlišné. Podobně CbpA použitý jako léčivo, může mít terciální strukturu odlišnou od zkrácené formy, která může mít svojí schopnost blokovat navazování vylepšenou. Za těchto předpokladů může být výhodné produkovat CbpA jako protein o plné délce, aby se umožnilo jeho uspořádání do přirozené terciální struktury a potom biochemickým způsobem odštěpit jeho C-konec (CBD). Například působení hydroxylaminu štěpí na aminokyselinové pozici 475 serotypu R6x a serotypu 4 proteinu A, který váže cholin, čímž se oddělí N- a C-konce. N-koncový fragment je potom vhodný jako léčivo nebo imunogen.

Jiná možnost je použít přirozenou formu CbpA jako imunogen a antiséra proti přirozené struktuře. Biologicky aktivní protilátky proti N-konci v této směsi mohou být obohaceny odstraněním protilátek k BD pomocí absorbce. Taková protilátka byla připravena pomocí inkubace 200 pl séra s 1x10⁸ bakterií bez CbpA, po dobu 1 hodiny při R1. Ostatní proteiny na této mutantě, které vážou cholin, na sebe absorbují protilátky proti CBD, které jsou potom z antiséra odstraněny centrifugací a následným odstraněním bakterií.

Aby byla demonstrována biologická aktivita absorbovaných protilátek proti CbpA, byla určena schopnost absorbovaného antiséra blokovat navazování pneumokoka k modelovému receptorů LNnT. Pneumokoky R6x byly inkubovány s ředěním antiséra 1 : 6 000 a potom přidány do jamek potažených LNnT albuminem.

• 444 • 4444

99

9 9 9

4 4 9

9 4 4 4

4 4 4

Tabulka 4

Absorbované antisérum proti CbpA blokuje navázání

Antisérum 1 : 6 000	Počet pneumokoků na jamku ± SD (% kontroly)
bez protilátky	563 ± 11 (100%)
preimunní antisérum	479 ± 11 (85 %)
antisérum proti CbpA	294 ± 72 (52 %)
antisérum proti CbpA absorbované kvůli odstranění CBD protilátek	175 ±38 (31 %)

Tyto výsledky naznačují, že protilátky proti N-koncové doméně Cbp/A v její přirozené konformaci, silně blokují navázání. Tato aktivita je větší než aktivita proti zkrácené formě z obrázku 5, kdy byla inaktivní při ředění 1 : 600. Další ukázka této aktivity absorbovaného antiséra proti CbpA je uvedena v titrační studii na obrázku 5. Základní úroveň navázání pneumokoků typu 4 na jamky pokryté LNnT je ukázána jako trojúhelníky. Preinkubace pneumokoků s neabsorbovaným antisérem (čtverečky) nebo absorbovaným antisérem (kosočtverečky) při různých uvedených ředěních, mělo za následek snížené navazování. Skutečnost, že obě antiséra vykazovala podobné snížení navazování ukazuje, že většina blokující aktivity protilátky kCbpA spočívá v aktivitě proti N-konci (tj. odstranění protilátek k doméně, která váže cholin, pomocí absorbce, nesnižuje biologickou aktivitu.

Příklad 3: Pasivní ochrana pomocí antiséra proti R2

Příprava králičího imunního séra:

Králičí imunní sérum proti polypeptidu R2 (krácený CbpA) a CbpA bylo připraveno v Covance (Denver, PA). Poté, co byla odebráno preimunizační sérum, byl novozélandský bílý králík imunizován 250 pg R2, který obsahoval obě koncová opakování aminokyselin (příprava 483:58 výše), v kompletním Freudově adjuvans. Králík obdržel 21. den posilovači dávku v nekompletním Freudově adjuvans a byl vykrvácen 31. den. Druhý králík byl podobným způsobem imunizován puntíkovaným CbpA.

··♦· * ·· 44 44 • 44 4 4 4444 • 4 · 4 4 4 4

4 444 44 4

44 4444

44 444 4444 44 44

Pasivní ochrana u myši:

Myši C3H/HeJ (5 kusů ve skupině) byly pasivně imunizovány intraperitoneálně 100 μΙ králičího séra proti R2 nebo preimunizačního séra v ředění 1:2 ve sterilním PBS (preimunizační sérum a imunizační sérum z 31. dne). Jednu hodinu po podání séra byla u myši vyvolána odezva podáním 1600 CFU Streptococcus pneumoniae serotypů 6B (kmen SP317). Osmdesát procent myší imunizovaných králičím imunním sérem, vzniklým proti polypeptidu R2, přežilo vyvolání odezvy (obrázek 4). Všechny myši imunizované preimunizačního králičím sérem byly sedmého dne mrtvé.

Tyto údaje ukazují, že protilátky specifické k CbpA působí ochranně proti systémové pneumokokové infekci. Údaje dále naznačují, že oblast, která váže cholin, není pro ochranu nezbytná, protože protilátka specifická proti zkrácenému proteinu polypeptidu R2, kterému chybí konzervativní opakování, která vážou cholin, byla pro ochranu postačující. Navíc sérum, zaměřené proti CbpA serotypů 4 působilo ochranně proti vyvolání odezvy serotypem 6B.

Příklad 4: Aktivní ochrana pomocí antiséra proti R1

Myši C3H/HeJ (10 kusů ve skupině) byly imunizovány intraperitoneálně pomocí zkráceného proteinu CbpA R1 (15 pg v 50 μΙ PBS, s 50 μΙ kompletního Freudova adjuvans). Skupina 10 simulované imunizovaných myší obdržela PBS a adjuvans. Druhá imunizace byla provedena po čtyřech týdnech, 15 pg proteinu intraperitoneálně s nekompletním Freudovým adjuvans (simulované imunizované obdržely PBS a IFA). Krev pro analýzu imunitní odpovědi byla odebírána ve 3, 6 a 9 týdnu. Koncové ředění titru ELISA proti zkrácenému CbpA u sér z 9. týdne spojených od 10 myší imunizovaných CbpA bylo 4 096 000. V sérech simulované imunizovaných myší nebyl detekována žádná protilátka. U myší byla 10 týden vyvolána odezva podáním 560 CFU Streptococcus pneumoniae serotypů 6B (kmen SPSJ2p, který byl poskytnut od P. Flynn, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN). U myši bylo 14 dní sledováno jejich přežívání. Osmdesát procent myší imunizovaných zkráceným CbpA proteinem R1 přežilo vyvolání odezvy. Všechny simulované imunizované myši byly osmého dne mrtvé (obrázek 7).

Příklad 5: Prevence proti kolonizaci nosohltanu u nedospělých krys

4 444 * · 4 4 4 Μ • 4 4 4444 444»

4 4 4>·44 • *4 4 *4444*

444 44 4444

Ο | *44 44 444 4444 44 44

N-koncová doména CbpA in vitro kompetitivně inhibuje navázání pneumokoků.

Pro předvedení léčebné účinnosti peptidů s touto aktivitou, byly nedospělým krysám podány zkrácené peptidy, potom byla vyvolána odezva pomocí pneumokoků a byla hodnocena kolonizace nosohltanu.

Krysám bylo intranazálně podáno 10 pl PBS, obsahujících 0,8 pg polypeptidu R2 nebo R1 nebo neobsahujících žádný protein. O 15 minut později byly intranazálně vneseny pneumokoky typu 3 (kmen Slil) (10 pl obsahujících 1x10⁵ cfer). Aby byla zjištěna schopnost polypeptidu kompetitivně inhibovat navazování pneumokoků a jejich kolonizaci, byl po 72 hodinách proveden nosní výplach a byl kvantifikován počet získaných pneumokoků vždy u 4 zvířat z každé skupiny. Krysy kterým byly podány samotné Slil vykazovaly 2200, 6500, 6900 a 8700 (průměr 6075) kolonií na 10 pl.

Zvířata léčená zkráceným R2 vykazovala největší pokles (3600, 3500, 2500 a 2100), což je průměrně 2095 bakterií na 10 pl (48 % kontroly). Zvířata léčená zkráceným R1 také vykazovala snížený stupeň kolonizace (5000, 4800, 3500 a 1600), což je průměrně 3725 bakterií (61 % kontroly).

Tento pokus ukazuje, že podávání peptidů, který je předmětem tohoto vynálezu, zvířatům v léčebné studii pro ně navržené, může tato zvířata chránit proti následné pneumokokové infekci.

Diskuse:

Jak bylo v pokusech ukázáno, když polypeptid R2: 1) je podán jako vakcinační antigen, vyvolává obranné protilátky a je výhodným prostředkem pro vakcinační přípravek; a 2) je-li podán jako peptid do respiračního systému a/nebo k nosohltanovému receptoru, kompetitivně zabraňuje navazování pneumokoků a je výhodným prostředkem pro preventivní a léčebné činidlo proti kolonizaci nebo invazivní nemoci. Také zkrácené formy CbpA fungují jako lektiny bez CBD. Jsou rozpoznávány dva druhy sacharidů: LNnT je rozpoznáván peptidem, obsahujícím obě N-koncová opakování (A a C) na obrázku 1 a kyselina sialová je rozpoznávána peptidem, obsahujícím pouze jediné koncové opakování (A), které se nachází na samotném Nkonci. Zkrácená forma, obsahující N-koncové opakování polypeptidu R1 a R2 rovněž vykazuje lektinovou aktivitu v testech s buněčnými kulturami.

Důležitými rysy aktivity polypeptidu R2 jsou: 1) naprostá korelace biologické aktivity polypeptidu R2 a formy CbpA o plné délce při rozpoznávání čištěných analogů glykokonjugátového receptoru, buněk plic a zvířecích modelů. Korelace je také

4 · Λ

4444

44

4 9

4 4

4 4

4 4 4

44 ukázána u protilátek proti nim; a 2) zkřížená ochrana mezi činidly odvozenými z typu 4 a bakterií v in vitro testech při použití jiného serotypu (např. 6B a 2), která je důležitá pro vhodnou vakcínu, preventivní a léčebné přípravky.

Ačkoli byl vynález zde popsán a ilustrován pomocí odkazů na různé specifické materiály, procedury a příklady, má se za samozřejmé, že vynález není omezen na určité kombinace materiálů a procedur, vybraných pro tento účel. Početné variace v takových podrobnostech mohou být předpokládány osobami se zkušenostmi v oboru. Rovněž jakékoli zde citované odkazy jsou v rozsahu, který odpovídá popisu vynálezu, považovány za zahrnuté odkazem v tomto dokumentu.

• ·

- 1 Seznam sekvencí <110> Tuomanen, Elaine I.

Wizemann, Theresa

Masure, H. R.

Johnson, Leslie S.

Koenig, Scott <i2o> Polypeptid obsahující aminokyseliny N-konce zkráceného proteinu Ά, který váže cholin, vakciny z něho připravené a jejich použití <130> 1340-1-017 msc <140> 09/056,019 <141> 1998-04-07 <160> 39 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1

Glu Asn Glu Gly Ala Thr Gin Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn • · · ····· • * * · ······ • · · ·· · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

Glu Ser Gin Ala Glu Gin Gly Glu Gin Pro

25

Arg Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu

40

Gly Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys

55

Ala Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn lle Lys

70 lle Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gin Leu

90

Ser Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser

100 105

Ser Ser Ser Ser Ser Seř Asp Ser Ser Thr

115 120

Thr Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro

130 135

Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys

145 150

Lys Lys Leu Asp Ser Glu

Tyr Val Lys Lys lle Val

Arg His Thr Xle Thr Val

Asn Glu Tyr Leu Asn Lys

80

Gin lle Leu Met Met Glu

Lys Phe Glu Lys Asp Ser

110

Lys Pro Glu Ala Ser Asp

125

Gly Glu Lys Val Ala Glu

140

Lys Ala Lys Asp Gin Lys

155 160

Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr lle Thr Tyr Lys Thr Leu Glu • · · · • · · ····< • · · · *····· • · · ·· · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

- 3 165 '170 175

Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu

180 185 190

Leu Val Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Glu Gin Lys Ile Lys

195 200 205

Gin Ala Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu

210 215 220

Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg

225 230 235 240

Arg Ala Asp Ala Lys Glu Gin Gly Lys Pro Lys Gly Arg Ala Lys Arg

245 250 255

Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala

260 265 270

Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser

275 280 285

Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu

290 295 300

Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr

305

310

315

320 • · · · ·· · ···· ···· • · · ····· • · · · ······ ··· ·· ···· ··· ·· ··· ···· Φ· ··

- 4 Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp

325 330 335

Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys 340 345 350

Glu Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala Glu Val Glu 355 360 365

Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg

370 375 380

Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys

385 390 395 400

Val Lys Glu Lys Pro Ala

405 <210> 2 <211> 655 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 2

Glu Asn Glu Gly Ala Thr Gin Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn

10 15

Glu Ser Gin Ala Glu Gin Gly Glu Gin Pro Lys Lys Leu Asp Ser Glu • · · · • · · ···· ···· • · · · · · · · * ·· · ···«·» • « · · · · · · · «·· «1 ··· ···· ·· ··

- 5 20 25

Arg Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Tyr

40

Gly Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys Arg

55

Ala Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile Lys Asn

70 75

Ile Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gin Leu Gin

90

Ser Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser Lys

100 105

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys

115 120

Thr Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly

130 135

Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys

145 150 155

Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr

Val Lys Lys Ile Val

His Thr Ile Thr Val

Glu Tyr Leu Asn Lys

Ile Leu Met Met Glu

Phe Glu Lys Asp Ser

110

Pro Glu Ala Ser Asp

125

Glu Lys Val Ala Glu

140

Ala Lys Asp Gin Lys

160

Tyr Lys Thr Leu Glu

165

170

175 • ·

Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val

180

Leu Val Lys Val Lys Ala Asn Glu

195 200

Gin Ala Glu Ala Glu Val Glu Ser

210 215

Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu

225 230

Arg Ala Asp Ala Lys Glu Gin Gly

245

Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr

260

Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly

275 280

Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala

290 295

Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin

305 310

Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu

- 6 Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu

185 190

Pro Arg Asp Glu Gin Lys Ile Lys

205

Lys Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu

220

Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg

235 240

Lys Pro Lys Gly Arg Ala Lys Arg

250 255

Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala

265 270

Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser

285

Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu

300

Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr

315 320

Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp

325

330

335 • · · ·

Val Glu Val Lys Lys

340

Glu Pro Arg Asn Glu

355

Ser Lys Lys Ala Glu

370

Lys Lys Ala Glu Glu

385

Val Lys Glu Lys Pro

405

Ala Glu Lys Pro Ala

420

Pro Lys Ala Glu Lys

435

Arg Arg Ser Glu Glu

450

Lys Thr Glu Lys Pro

465

Lys Glu Glu Ala Lys

350

Lys Ala Glu Val Glu

365

Ile Lys Thr Asp Arg

380

Ala Glu Glu Asp Lys

400

Ala Pro Ala Pro Lys

415

Glu Asn Pro Ala Glu Gin

430

Ala Glu Glu Asp Tyr Ala

445

Thr Gin Gin Gin Pro Pro

460

Pro Lys Thr Gly Trp Lys

475 480

Ala Glu Leu Glu Leu Val

345

Glu Lys Val Lys Gin Ala

360

Ala Thr Arg Leu Glu Lys

375

Glu Ala Lys Arg Lys Ala

390 395

Ala Glu Gin Pro Gin Pro

410

Pro Ala Pro Lys Pro

425

Pro Ala Asp Gin Gin

440

Glu Tyr Asn Arg Leu

455

Ala Gin Pro Ser Thr

470

Gin Glu Asn Gly Met Trp Tyr Phe Tyr Asn Thr Asp Gly Ser Met Ala • · ·

- 8 485 490 495

Thr Gly Trp Leu Gin Asn Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ser Asn

500 505 510

Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu Gin Asn Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr

515 520 525

Leu Asn Ala Asn Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Leu Gin Asn Asn Gly

530 535 540

Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Leu

545 550 555 560

Gin Tyr Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ser Met Ala

565 570 575

Thr Gly Trp Leu Gin Tyr Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn

580 585 590

Gly Asp Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Gly Asp Thr Trp Tyr Tyr

595 600 605

Leu Glu Ala Ser Gly Ala Met Lys Ala Ser Gin Trp Phe Lys Val Ser

610 615 620

Asp Lys Trp Tyr Tyr Val Asn Gly Ser Gly Ala Leu Ala Val Asn Thr

625

630

635

640 ♦ ···· · 9 9 9 9 9 9

9 · 99 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 9999 99 99

- 9 - ·

Thr Val Asp Gly Tyr Gly Val Asn Ala Asn Gly Glu Trp Val Asn

645 650 655 <210> 3 <2U> 284 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3

Glu Asn Glu Gly Ala Thr Gin Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn

5 10 15

Glu Ser Gin Ala Glu Gin Gly Glu Gin Pro bys Lys Leu Asp Ser Glu

25 30

Arg Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Tyr Val Lys Lys Ile Val

40 45

Gly Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys Arg His Thr Ile Thr Val

55 60

Ala Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile Lys Asn Glu Tyr Leu Asn Lys

70 75 80

Ile Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gin Leu Gin Ile Leu Met Met Glu

90 95

Ser Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser Lys Phe Glu Lys Asp Ser • ·· ·

- 10 100 105 110

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys Pro Glu Ala Ser Asp

115 120 125

Thr Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu

130 135 140

Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gin Lys

145 150 155 160

Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Xle Thr Tyr Lys Thr Leu Glu

165 170 175

Leu Glu lle Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu

180 185 190

Leu Val Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Glu Gin Lys lle Lys

195 200 205

Gin Ala Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu

210 215 220

Lys Lys Xle Lys Thr Asp Arg Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg

225 230 235 240

Arg Ala Asp Ala Lys Glu Gin Gly Lys Pro Lys Gly Arg Ala Lys Arg

245

250

255 • ·«·· 4 ·· 4· 44 • 4 · · · · · 444· · 4 4444· • 44 · 444444 • 44 44 ····

444 4· 444 4444 44 44

- Π Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala

260 265 270

Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu

275 280 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4

Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala

10 15

Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro

25 30

Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val

40 45

Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lep Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu

55 60

Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser

70 75 80

Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys • ·.· ·· ··

·· * ·

Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala

100 105 <210> 5 <211> 109 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 5

Thr Glu Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu

10 15

Ala Glu Lys Lys Ala Lys_ Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr

25 30

Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp

40 45

Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Val Lys Ala Asn

55 60

Glu Pro Arg Asp Glu Gin Lys Ile Lys Gin Ala Glu Ala Glu Val Glu

70 75 80

Ser Lys Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg

90 95 ····· · 9 · 9 9 * · • · 9 9 · · · * · · 9

9 · · · · · · • · · 9 ····«· • 9 · ·· · · · t

999 99 999 9999 99 99

- 13 Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Asp Ala

100 105 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 6

Lys Xaa Xaa Glu <210> 7 <211> 376 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 7

Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gin Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala Lys 15 10 15

Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gin Val Val Asp Glu Tyr Ile Glu 20 25 30

Lys Met Leu Arg Glu Ile Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn • ·♦·

- 14 ·· ·· ·· · · · · · ···· • · · ····· • · · · ······ • · · · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

Lys Leu Ser Ala Ile Lys

Glu Glu Lys Ser Lys Asp

75

Asp Ala Ala Phe Glu Lys

Val Ala Glu Ala Lys

105

Asp Gin Lys Glu Glu

120

Thr Leu Glu Leu Glu

135

Glu Leu Glu Leu Val

155

Thr Ile Lys Gin Ala

170

Ala Thr Arg Leu Glu Asn

185

Glu Ala Lys Arg Lys Ala

Val Ala Leu Asn Ile

Glu Leu Asn Val Leu

Ile Lys Ala Lys Leu

Leu Lys Pro Gly Glu Lys

100

Ala Lys Lys Lys Ala Glu

115

Pro Thr Asn Thr Tyr Lys

130

Val Lys Val Lys Glu Ala

145 150

Glu Ser Arg Asn Glu Gly

165

Ser Lys Lys Ala Glu

180

Lys Lys Ala Glu Glu

Thr Lys Tyr Leu Arg

Glu Leu Pro Ser Glu

Phe Lys Lys Asp Thr

Lys Lys Val Glu Glu

110

Asp Arg Arg Asn Tyr

125

Ile Ala Glu Phe Asp

140

Lys Glu Glu Ala Lys

160

Lys Glu Lys Val Glu

175

Ile Lys Thr Asp Arg

190

Asp Ala Lys Leu Lys

- 15 195

Glu Ala Asn Val Ala

210

Lys Arg Gly Val Pro

225

Asp Ala Lys Ser Ser

245

Ser Ser Leu Lys Ser

260

Glu Glu Ala Glu Lys

275

Asn Tyr Pro Thr Asn

290

Ser Asp Val Lys Val

305

Ala Lys Glu Pro Arg

325

Val Glu Ser Lys Lys

200

Thr Ser Asp Gin Gly Lys

215

Gly Glu Leu Ala Thr Pro

230 235

Asp Ser Ser Val Gly Glu

250

Gly Lys Lys' Val Ala Glu

265

Lys Ala Lys Asp Gin Lys

280

Thr Tyr Lys Thr Leu Asp

295

Lys Glu Ala Glu Leu Glu

310 315

Asp Glu Glu Lys Ile Lys

330

Ala Glu Ala Thr Arg Leu

205

Pro Lys Gly Arg Ala

220

Asp Lys Lys Glu Asn

240

Glu Thr Leu Pro Ser

255

Ala Glu Lys Lys Val

270

Glu Glu Asp Arg Arg

285

Leu Glu Ile Ala Glu

300

Leu Val Lys Glu Glu

320

Gin Ala Lys Ala Lys

335

Glu Asn Ile Lys Thr

340

345

350 • · • 4 4 4 44444·

444 44 4444

444 44 444 4444 44 44

- 16 Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu

355 360 365

Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala

370 375 <210> 8 <211> 663 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 8

Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gin Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala Lys

10 15

Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gin Val Val Asp Glu Tyr Ile Glu

25 30

Lys Met Leu Arg Glu Ile Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn

40 45

Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu Arg

55 60

Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ser Glu

70 75 80

Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys Asp Thr ·»·· ·· 44 44

4 ·4 · 4 4 4 4 4 • 4 · 4 4 4 4 4 • 4 4 4 444444

4 4 44 4 4 4 4

444 44 444 4444 44 44

- 17 85 90 95

Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu

100 105 110

Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr

115 120 125

Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Phe Asp

130 135 140

Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu- Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys

145 150 155 160

Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Lys Gin Ala Lys Glu Lys Val Glu

165 170 175

Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg

180 185 190

Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Asp Ala Lys Leu Lys

195 200 205

Glu Ala Asn Val Ala Thr Ser Asp Gin Gly Lys Pro Lys Gly Arg Ala

210 215 220

Lys Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn

225

230

235

240 ··«·

• ·· ·· ·· • · · · ·· · • · · · · · « ······ • « · · « · ·«···· ·· ··

Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser

245

Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys

260

Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys

275 280

Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys

290 295

Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala

305 310

Ala Lys Glu Pro Arg Asp._ Glu Glu

325

Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala

340

Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu

355 360

Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala

370 375

Thr Gin Pro Glu Lys Pro Ala Pro

- 18 Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser

250 255

Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val

265 270

Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg

285

Thr Leu Asp Leu Glu Ile Ala Glu

300

Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu

315 320

Lys Ile Lys Gin Ala Lys Ala Lys

330 335

Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr

345 350

Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu

365

Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro Ala

380

Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gin

385

390

395

400 ·· · • · • · · • · · ··· ·· ·· ·· • · ♦ · · · • · · · ·

Φ · · · » · • · · · · • ···· ·· ··

- 19 Pro Lys Ala Glu Lys Thr Asp Asp Gin Gin Ala Glu Glu Asp Tyr Ala

405 410 415

Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gin Gin Gin Pro Pro

420 425 430

Lys Thr Glu Lys Pro Ala Gin Pro Ser Thr Pro Lys Thr Gly Trp Lys

435 440 445

Gin Glu Asn Gly Met Trp Tyr Phe Tyr Asn Thr Asp Gly Ser Met Ala

450 455 460

Thr Gly Trp Leu Gin Asn Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn

465 470 475 480

Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu Gin Asn Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr

485 490 495

Leu Asn Ala Asn Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Leu Gin Asn Asn Gly 500 505 510

Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Leu 515 520 525

Gin Tyr Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ser Asn Gly Ala Met Ala

530 535 540

Thr Gly Trp Leu Gin Tyr Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn • · · · • · • ·· · ······ • · · ·· · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

- 20 545 550 555 560

Gly Asp Met Ala Thr Gly Trp Leu Gin Asn Asn Gly Ser Trp Tyr Tyr

565 570 575

Leu Asn Ala Asn Gly Asp Met Ala Thr Gly Trp Leu Gin Tyr Asn Gly

580 585 590

Ser Trp Tyr Tyr Leu Asn Ala Asn Gly Asp Met Ala Thr Gly Trp Val

595 600 605

Lys Asp Gly Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Glu Ala Ser Gly Ala Met Lys

610 615 620

Ala Ser Gin Trp Phe Lys Val Ser Asp Lys Trp Tyr Tyr Val Asn Gly

625 630 635 640

Ser Gly Ala Leu Ala Val Asn Thr Thr Val Asp Gly Tyr Gly Val Asn

645 650 655

Ala Asn Gly Glu Trp Val Asn

660 <210> 9 <211> 254 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae

- 21 <400> 9

Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gin Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala Lys

10 15

Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gin Val Val Asp Glu Tyr Ile Glu

25 30

Lys Met Leu Arg Glu Ile Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn

40 45

Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu Arg 50 55 60

Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ser Glu

70 75 80

Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys Asp Thr

90 95

Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu

100 105 110

Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr 115 120 125

Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Phe Asp

130

135

140

Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys • ·

4 4 4 4 · 4 4 toto • · 4 · · · · toto·· • · 4 44444 • 44 4 444444

444 44 4444

444 44 444 4444 44 44

- 22 145 150 155 160

Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Lys Gin Ala Lys Glu Lys Val Glu

165 170 175

Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg

180 185 190

Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Asp Ala Lys Leu Lys

195 200 205

Glu Ala Asn Val Ala Thr Ser Asp Gin Gly Lys Pro Lys Gly Arg Ala

210 215 220

Lys Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn

225 230_ 235 240

Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu.Thr Leu

245 250 <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 10

Lys Ser Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala

10 15 • ·

- 23 Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro

25 30

Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Asp Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val

40 45

Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu

55 60

Pro Arg Asp Glu Glu Lys Ile Lys Gin Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser 65 70 75 80

Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg Lys 85 90 95

Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala

100 105 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 11

Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys • · · ·

• · · · · • · « · · • · · · · · • · · · · • · · · · · ·

- 24 Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr 20 25 30

Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Phe Asp Val Lys

40 45

Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser

55 60

Arg Asn Glu Gly Thr Ile Lys Gin Ala Lys Glu Lys Val Glu Ser Lys

70 75 80

Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys

90 95

Ala Glu Glu Glu Ala Lys.Arg Lys Ala Asp Ala

100 105 <210> 12 <211> 1219 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 12 gagaacgagg gagctaccca agtacccact tcttctaata gggcaaatga aagtcaggca 60 gaacaaggag aacaacctaa aaaactcgat tcagaacgag ataaggcaag gaaagaggtc 120 gaggaatatg taaaaaaaat agtgggtgag agctatgcaa aatcaactaa aaagcgacat 180 acaattactg tagctctagt taacgagttg aacaacatta agaacgagta tttgaataaa 240 • · · ·

atagttgaat	caacctcaga	aagccaacta	cagatactga	tgatggagag	tcgatcaaaa	300
gtagatgaag	ctgtgtctaa	gtttgaaaag	gactcatctt	cttcgtcaag	ttcagactct	360
tccactaaac	cggaagcttc	agatacagcg	aagccaaaca	agccgacaga	accaggagaa	420
aaggtagcag	aagctaagaa	gaaggttgaa	gaagctgaga	aaaaagccaa	ggatcaaaaa	480
gaagaagatc	gtcgtaacta	cccaaccatt	acttacaaaa	cgcttgaact	tgaaattgct	540
gagtccgatg	tggaagttaa	aaaagcggag	cttgaactag	taaaagtgaa	agctaacgaa	600
cctcgagacg	agcaaaaaat	taagcaagca	gaagcggaag	ttgagagtaa	acaagctgag	660
gctacaaggt	taaaaaaaat	caagacagat	cgtgaagaag	cagaagaaga	agctaaacga	720
agagcagatg	ctaaagagca	aggtaaacca	aaggggcggg	caaaacgagg	agttcctgga	780
gagctagcaa	cacctgataa	aaaagaaaat	gatgcgaagt	cttcagattc	tagcgtaggt	840
gaagaaactc	ttccaagccc	atccctgaaa	ccagaaaaaa	aggtagcaga	agctgagaag	900
aaggttgaag	aagctaagaa	aaaagccgág	gatcaaaaag	aagaagatcg	ccgtaactac	960
ccaaccaata	cttacaaaac	gcttgaactt	gaaattgctg	agtccgatgt	ggaagttaaa	1020
aaagcggagc	ttgaactagt	aaaagaggaa	gctaaggaac	ctcgaaacga	ggaaaaagtt	1080
aagcaagcaa	aagcggaagt	tgagagtaaa	aaagctgagg	ctacaaggtt	agaaaaaatc	1140
aagacagatc	gtaaaaaagc	agaagaagaa	gctaaacgaa	aagcagcaga	agaagataaa	1200
gttaaagaaa	aaccagctg					1219

<210> 13 <211> 1969 <212> DNA <213> Streptococcus pneurooniae <400> 13

gagaacgagg	gagctaccca	agtacccact	tcttctaata	gggcaaatga	aagtcaggca	60
gaacaaggag	aacaacctaa	aaaactcgat	tcagaacgag	ataaggcaag	gaaagaggtc	120
gaggaatatg	taaaaaaaat	agtgggtgag	agctatgcaa	aatcaactaa	aaagcgacat	180
acaattactg	tagctctagt	taacgagttg	aacaacatta	agaacgagta	tttgaataaa	240
atagttgaat	caacctcaga	aagccaacta	cagatactga	tgatggagag	tcgatcaaaa	300

gtagatgaag	ctgtgtctaa	gtttgaaaag	gactcatctt	cttcgtcaag	ttcagactct	360
tccactaaac	cggaagcttc	agatacagcg	aagccaaaca	agccgacaga	accaggagaa	420
aaggtagcag	aagctaagaa	gaaggttgaa	gaagctgaga	aaaaagccaa	ggatcaaaaa	480
gaagaagatc	gtcgtaacta	cccaaccatt	acttacaaaa	cgcttgaact	tgaaattgct	540
gagtccgatg	tggaagttaa	aaaagcggag	cttgaactag	taaaagtgaa	agctaacgaa	600
cctcgagacg	agcaaaaaat	taagcaagca	gaagcggaag	ttgagagtaa	acaagctgag	660
gctacaaggt	taaaaaaaat	caagacagat	cgtgaagaag	cagaagaaga	agctaaacga	720
agagcagatg	ctaaagagca	aggtaaacca	aaggggcggg	caaaacgagg	agttcctgga	780
gagctagcaa	cacctgataa	aaaagaaaat	gatgcgaagt	cttcagattc	tagcgtaggt	840
gaagaaactc	ttccaagccc	atccctgaaa	ccagaaaaaa	aggtagcaga	agctgagaag	900
aaggttgaag	aagctaagaa	aaaagccgag	gatcaaaaag	aagaagatcg	ccgtaactac	960
ccaaccaata	cttacaaaac	gcttgaactt	gaaattgctg	agtccgatgt	ggaagttaaa	1020
aaagcggagg	cttgaactag	taaaagagga	agctaaggaa	cctcgaaacg	aggaaaaagt	1080
taagcaagca	aaagcggaag	ttgagagtaa	aaaagctgag	gctacaaggt	tagaaaaaat	1140
caagacagat	cgtaaaaaag	cagaagaaga	agctaaacga	aaagcagcag	aagaagataa	1200
agttaaagaa	aaaccagctg	aacaaccaca	accagcgccg	gctccaaaag	cagaaaaacc	1260
agctccagct	ccaaaaccag	agaatccagc	tgaacaacca	aaagcagaaa	aaccagctga	1320
tcaacaagct	gaagaagact	atgctcgtag	atcagaagaa	gaatataatc	gcttgactca	1380
acagcaaccg	ccaaaaactg	aaaaaccagc	acaaccatct	actccaaaaa	caggctggaa	1440
acaagaaaac	ggtatgtggt	acttctacaa	tactgatggt	tcaatggcga	caggatggct	1500
ccaaaacaat	ggctcatggt	actacctcaa	cagcaatggc	gctatggcga	caggatggct	1560
ccaaaacaat	ggttcatggt	actatctaaa	cgctaatggt	tcaatggcaa	caggatggct	1620
ccaaaacaat	ggttcatggt	actacctaaa	cgctaatggt	tcaatggcga	caggatggct	1680
ccaatacaat	ggctcatggt	actacctaaa	cgctaatggt	tcaatggcga	caggatggct	1740
ccaatacaat	ggctcatggt	actacctaaa	cgctaatggt	gatatggcga	caggttgggt	1800
gaaagatgga	gatacctggt	actatcttga	agcatcaggt	gctatgaaag	caagccaatg	1860
gttcaaagta	tcagataaat	ggtactatgt	caatggctca	ggtgcccttg	cagtcaacac	1920

aactgtagat ggctatggag tcaatgccaa tggtgaatgg gtaaactaa

1969 • · · ·

··

- 27 <210> 14 <211> 853 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 14 gagaacgagg gagctaccca agtacccact tcttctaata gggcaaatga aagtcaggca 60 gaacaaggag aacaacctaa aaaactcgat tcagaacgag ataaggcaag gaaagaggtc 120 gaggaatatg taaaaaaaat agtgggtgag agctatgcaa aatcaactaa aaagcgacat 180 acaattactg tagctctagt taacgagttg aacaacatta agaacgagta tttgaataaa 240 atagttgaat caacctcaga aagccaacta cagatactga tgatggagag tcgatcaaaa 300 gtagatgaag ctgtgtctaa gtttgaaaág gactcatctt cttcgtcaag ttcagactct 360 tccactaaac cggaagcttc agatacagcg aagccaaaca agccgacaga accaggagaa 420 aaggtagcag aagctaagaa gaaggttgaa gaagctgaga aaaaagccaa ggatcaaaaa 480 gaagaagatc gtcgtaacta cccaaccatt acttacaaaa cgcttgaact tgaaattgct 540 gagtccgatg tggaagttaa aaaagcggag cttgaactag taaaagtgaa agctaacgaa 600 cctcgagacg agcaaaaaat taagcaagca gaagcggaag ttgagagtaa acaagctgag 660 gctacaaggt taaaaaaaat caagacagat cgtgaagaag cagaagaaga agctaaacga 720 agagcagatg ctaaagagca aggtaaacca aaggggcggg caaaacgagg agttcctgga 780 gagctagcaa cacctgataa aaaagaaaat gatgcgaagt cttcagattc tagcgtaggt 840 gaagaaactc ttc 853 <210> 15 <211> 318 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 15 aaaccagaaa aaaaggtagc agaagctgag aagaaggttg aagaagctaa gaaaaaagcc 60 • ·· · • · · · ·· ··

- 28 -
gaggatcaaa	aagaagaaga	tcgccgtaac	tacccaacca	atacttacaa	aacgcttgaa	120
cttgaaattg	ctgagtccga	tgtggaagtt	aaaaaagcgg	agcttgaact	agtaaaagag	180
gaagctaagg	aacctcgaaa	cgaggaaaaa	gttaagcaag	caaaagcgga	agttgagagt	240
aaaaaagctg	aggctacaag	gttagaaaaa	atcaagacag	atčgtaaaaa	agcagaagaa	300
gaagctaaac	gaaaagca					318

<210> 16 <211> 327 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae

<400> 16
acagaaccag	gagaaaaggt	agcagaagct	aagaagaagg	ttgaagaagc	tgagaaaaaa	60
gccaaggatc	aaaaagaaga	agatcgtcgt	aactacccaa	ccattactta	caaaacgctt	120
gaacttgaaa	ttgctgagtc	cgatgtggaa	gttaaaaaag	cggagcttga	actagtaaaa	180
gtgaaagcta	acgaacctcg	a.gacgagcaa	aaaattaagc	aagcagaagc	ggaagttgag	240
agtaaacaag	ctgaggctac	aaggttaaaa	aaaatcaaga	cagatcgtga	agaagcagaa	300
gaagaagcta	aacgaagagc	agatgct				327

<210> 17 <211> 1129 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae

<400> 17
gaaaacgaag	gaagtaccca	agcagccact	tcttctaata	tggcaaagac	agaacatagg	60
aaagctgcta	aacaagtcgt	cgatgaatat	atagaaaaaa	tgttgaggga	gattcaacta	120
gatagaagaa	aacataccca	aaatgtcgcc	ttaaacataa	agttgagcgc	aattaaaacg	180
aagtatttgc	gtgaattaaa	tgttttagaa	gagaagtcga	aagatgagtt	gccgtcagaa	240

- 29 ataaaagcaa agttagacgc agcttttgag aagtttaaaa aagatacatt gaaaccagga 300 gaaaaggtag cagaagctaa gaagaaggtt gaagaagcta agaaaaaagc cgaggatcaa 360 aaagaagaag atcgtcgtaa ctacccaacc aatacttaca aaacgcttga acttgaaatt 420 gctgagttcg atgtgaaagt taaagaagcg gagcttgaac tagtaaaaga ggaagctaaa 480 gaatctcgaa acgagggcac aattaagcaa gcaaaagaga aagttgagag taaaaaagct 540 gaggctacaa ggttagaaaa catcaagaca gatcgtaaaa aagcagaaga agaagctaaa 600 cgaaaagcag atgctaagtt gaaggaagct aatgtagcga cttcagatca aggtaaacca 660 aaggggcggg caaaacgagg agttcctgga gagctagcaa cacctgataa aaaagaaaat 720 gatgcgaagt cttcagattc tagcgtaggt gaagaaactc ttccaagctc atccctgaaa 780 tcaggaaaaa aggtagcaga agctgagaag aaggttgaag aagctgagaa aaaagccaag 840 gatcaaaaag aagaagatcg ccgtaactac ccaaccaata cttacaaaac gcttgacctt 900 gaaattgctg agtccgatgt gaaagttaáa gaagcggagc ttgaactagt aaaagaggaa 960 gctaaggaac ctcgagacga ggaaaaaatt aagcaagcaa aagcgaaagt tgagagtaaa 1020 aaagctgagg ctacaaggtt agaaaacatc aagacagatc gtaaaaaagc agaagaagaa 1080 gctaaacgaa aagcagcaga agaagataaa gttaaagaaa aaccagctg 1129 <210> 18 <211> 1992 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae

<400> 18
gaaaacgaag	gaagtaccca	agcagccact	tcttctaata	tggcaaagac	agaacatagg	60
aaagctgcta	aacaagtcgt	cgatgaatat	atagaaaaaa	tgttgaggga	gattcaacta	120
gatagaagaa	aacataccca	aaatgtcgcc	ttaaacataa	agttgagcgc	aattaaaacg	180
aagtatttgc	gtgaattaaa	tgttttagaa	gagaagtcga	aagatgagtt	gccgtcagaa	240
ataaaagcaa	agttagacgc	agcttttgag	aagtttaaaa	aagatacatt	gaaaccagga	300
gaaaaggtag	cagaagctaa	gaagaaggtt	gaagaagcta	agaaaaaagc	cgaggatcaa	360

aaagaagaag atcgtcgtaa ctacccaacc aatacttaca aaacgcttga acttgaaatt 420 • ·· ·

gctgagttcg	atgtgaaagt	taaagaagcg	gagcttgaac	tagtaaaaga	ggaagctaaa	480
gaatctcgaa	acgagggcac	aattaagcaa	gcaaaagaga	aagttgagag	taaaaaagct	540
gaggctacaa	ggttagaaaa	catcaagaca	gatcgtaaaa	aagcagaaga	agaagctaaa	600
cgaaaagcag	atgctaagtt	gaaggaagct	aatgtagcga	cttcagatca	aggtaaacca	660
aaggggcggg	caaaacgagg	agttcctgga	gagctagcaa	cacctgataa	aaaagaaaat	720
gatgcgaagt	cttcagattc	tagcgtaggt	gaagaaactc	ttccaagctc	atccctgaaa	780
tcaggaaaaa	aggtagcaga	agctgagaag	aaggttgaag	aagctgagaa	aaaagccaag	840
gatcaaaaag	aagaagatcg	ccgtaactac	ccaaccaata	cttacaaaac	gcttgacctt	900
gaaattgctg	agtccgatgt	gaaagttaaa	gaagcggagc	ttgaactagt	aaaagaggaa	960
gctaaggaac	ctcgagacga	ggaaaaaatt	aagcaagcaa	aagcgaaagt	tgagagtaaa	1020
aaagctgagg	ctacaaggtt	agaaaacatc	aagacagatc	gtaaaaaagc	agaagaagaa	1080
gctaaacgaa	aagcagcaga	agaagataaa	gttaaagaaa	aaccagctga	acaaccacaa	1140
ccagcgccgg	ctactcaacc	agaaaaacca	gctccaaaac	cagagaagcc	agctgaacaa	1200
ccaaaagcag	aaaaaacaga	tgatcaacaa	gctgaagaag	actatgctcg	tagatcagaa	1260
gaagaatata	atcgcttgac	tcaacagcaa	ccgccaaaaa	ctgaaaaacc	agcacaacca	1320
tctactccaa	aaacaggctg	gaaacaagaa	aacggtatgt	ggtacttcta	caatactgat	1380
ggttcaatgg	caacaggatg	gctccaaaac	aacggttcat	ggtactatct	aaacgctaat	1440
ggtgctatgg	cgacaggatg	gctccaaaac	aatggttcat	ggtactatct	aaacgctaat	1500
ggttcaatgg	caacaggatg	gctccaaaac	aatggttcat	ggtactacct	aaacgctaat	1560
ggtgctatgg	cgacaggatg	gctccaatac	aatggttcat	ggtactacct	aaacagcaat	1620
ggcgctatgg	cgacaggatg	gctccaatac	aatggctcat	ggtactacct	caacgctaat	1680
ggtgatatgg	cgacaggatg	gctccaaaac	aacggttcat	ggtactacct	caacgctaat	1740
ggtgatatgg	cgacaggatg	gctccaatac	aacggttcat	ggtattacct	caacgctaat	1800
ggtgatatgg	cgacaggttg	ggtgaaagat	ggagatacct	ggtactatct	tgaagcatca	1860
ggtgctatga	aagcaagcca	atggttcaaa	gtatcagata	aatggtacta	tgtcaatggc	1920
tcaggtgccc	ttgcagtcaa	cacaactgta	gatggctatg	gagtcaatgc	caatggtgaa	1980
tgggtaaact	aa					1992

<210> 19

- 31 <211> 763 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 19

gaaaacgaag	gaagtaccca	agcagccact	tcttctaata	tggcaaagac	agaacatagg	60
aaagctgcta	aacaagtcgt	cgatgaatat	atagaaaaaa	tgttgaggga	gattcaacta	120
gatagaagaa	aacataccca	aaatgtcgcc	ttaaacataa	agttgagcgc	aattaaaacg	180
aagtatttgc	gtgaattaaa	tgttttagaa	gagaagtcga	aagatgagtt	gccgtcagaa	240
ataaaagcaa	agttagacgc	agcttttgag	aagtttaaaa	aagatacatt	gaaaccagga	300
gaaaaggtag	cagaagctaa	gaagaaggtt	gaagaagcta	agaaaaaagc	cgaggatcaa	360
aaagaagaag	atcgtcgtaa	ctacccaacc	aatacttaca	aaacgcttga	acttgaaatt	420
gctgagttcg	atgtgaaagt	taaagaagcg	gagcttgaac	tagtaaaaga	ggaagctaaa	480
gaatctcgaa	acgagggcac	aattaagcaa	gcaaaagaga	aagttgagag	taaaaaagct	540
gaggctacaa	ggttagaaaa	catcaagaca	gatcgtaaaa	aagcagaaga	agaagctaaa	600
cgaaaagcag	atgctaagtt	gaaggaagct	aatgtagcga	cttcagatca	aggtaaacca	660
aaggggcggg	caaaacgagg	agttcctgga	gagctagcaa	cacctgataa	aaaagaaaat	720
gatgcgaagt	cttcagattc	tagcgtaggt	gaagaaactc	ttc		763

<210> 20 <211> 318 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 20 aaatcaggaa aaaaggtagc agaagctgag aagaaggttg aagaagctga gaaaaaagcc 60 aaggatcaaa aagaagaaga tcgccgtaac tacccaacca atacttacaa aacgcttgac 120 cttgaaattg ctgagtccga tgtgaaagtt aaagaagcgg agcttgaact agtaaaagag 180 gaagctaagg aacctcgaga cgaggaaaaa attaagcaag caaaagcgaa agttgagagt 240

- 32 aaaaaagctg aggctacaag gttagaaaac atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa 300 gaagctaaac gaaaagca 318 <210> 21 <211> 321 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae

<400> 21
ccaggagaaa	aggtagcaga	agctaagaag	aaggttgaag	aagctaagaa	aaaagccgag	60
gatcaaaaag	aagaagatcg	tcgtaactac	ccaaccaata	cttacaaaac	gcttgaactt	120
gaaattgctg	agttcgatgt	gaaagttaaa	gaagcggagc	ttgaactagt	aaaagaggaa	180
gctaaagaat	ctcgaaacga	gggcacaatt	aagcaagcaa	aagagaaagt	tgagagtaaa	240
aaagctgagg	ctacaaggtt	agaaaacatc	aagacagatc	gtaaaaaagc	agaagaagaa	300
gctaaacgaa	aagcagatgc	t				321

<210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 22

Ser Pro Ser Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys

10 15

Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg

25 30

Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala ·«»♦ • · · I • · · « * * 9 9 « • « · · ·* ··

- 33 35 40 45

Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu 50 55 60

Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala

70 75 80

Glu Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys

90 95

Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu 100 105 110

Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala 115 120 <210> 23 <211> 122 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 23

Pro Ser Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys 15 10 15

Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gin Lys Glu Glu Asp • 4» ···· •· ♦ ·· · • 9 « • · · · • · · ··* ·« ** • · · » « • · · · · . _ · · · ♦ · • · · · · · ·<····· _φ<

Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lýs Thr Leu Asp Leu Glu Ile

Ala Glu Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys

Glu Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asp Glu Glu Lys Ile Lys Gin Ala Lys

Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile 85 90 95

Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala

100 105 110

Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Arg Ala

115 120 <210> 24 <211> 428 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 24

Glu Asn Glu Gly Ala Thr Gin Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn • ·

- 35 Glu Ser Gin Ala Glu Gin Gly Glu Gin Pro Lys Lys Leu Asp Ser Glu 20 25 30

Arg Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Tyr Val Lys Lys Ile Val 35 40 45

Gly Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys Arg His Thr Ile Thr Val 50 55 60

Ala Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile Lys Asn Glu Tyr Leu Asn Lys

70 75 80

Ile Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gin Leu Gin Ile Leu Met Met Glu

90 95

Ser Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser Lys Phe Glu Lys Asp Ser

100 105 110

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys Pro Glu Ala Ser Asp

115 120 125

Thr Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu

130 135 140

Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gin Lys

145 150 155 160

Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu

165

170

175

I · · • · • · · · 4 » · · · · • · · · « · · · · • · · · » · · · C · 4

Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu

180 185 190

Leu Val Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Glu Gin Lys Ile Lys 195 200 205

Gin Ala Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu

210 215 220

Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg

225 230 235 240

Arg Ala Asp Ala Lys Glu Gin Gly Lys Pro Lys Gly Arg Ala Lys Arg

245 250 255

Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala 260 265 270

Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser

275 280 285

Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu

290 295 300

Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr

305 310 315 320

Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp • · · ·

- 37 325 330 335

Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys 340 345 350

Glu Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala Glu Val Glu 355 360 365

Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg 370 375 380

Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lyš Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys

385 390 395 400

Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro Ala Pro Lys

405 410 415

Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn 420 425 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 25 ggcggatcca tggaraayga rgg • · · · · • · · · • * · '·

- 38 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 26 gccgtcgact tagtttaccc attcaccatt ggc 33 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae' <400> 27

Xaa Glu Asn Glu Gly

5 <210> 28 <211> 439 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 28

Ala Val Ala Ser Leu Phe Met Gly Ser Val Val His Ala Thr Glu Lys

10 15

Glu Val Thr Thr Gin Val Ala Thr Ser Ser Asn Lys Ala Asn Lys Ser • ·

- 39 Gin Thr Glu His Met Lys Ala Ala Lys Gin Val Asp Glu Tyr Ile Lys

40 45

Lys Lys Leu Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn Val Gly Leu 50 55 60

Leu Thr Lys Leu Gly Val Ile Lys Thr Glu Tyr Leu His Gly Leu Ser

70 75 80

Val Ser Lys Lys Lys Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Glu Ile Lys Ala

90 95

Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gin Phe Lys Lys Asp Thr Leu Pro Thr

100 105 110

Glu Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala

115 120 125

Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Lys Asp Leu Arg Asn Tyr Pro

130 135 140

Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Asp Ile Ala Glu Ser Asp Val

145 150 155 160

Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu

165 170 175

Ser Arg Asp Glu Lys Lys Ile Asn Gin Ala Lys Ala Lys Val Glu Asn ·· «4 ··· · · · · · · ··· · · ······· « < · ·

- 40 180 185 190

Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Asn Ile Lys Thr Asp Arg Glu 195 200 205

Lys Ala Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Asp Ala Lys Leu Gin Glu Ala 210 215 220

Asn Val Ala Thr Ser Glu Gin Asp Lys Ser Lys Arg Arg Ala Lys Arg

225 230 235 240

Glu Val Xaa Gly Glu Leu Ala Thř Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala

245 250 255

Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Thr Ser Pro Ser

260 265 270

Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu

275 280 285

Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr

290 295 300

Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp

305 310 315 320

Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys

325

330

335 • · • · · * · • · 9 · Β···· • · Β β Β Β Β Β «·· ·· ··· ··· ·· ·Β

- 41 Glu Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gin Val Lys Ala Lys Val Glu 340 345 350

Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ilé Lys Thr Asp Arg 355 360 365

Lys Lys Ala Glu Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Ala Glu Glu Asp 370 375 380

Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro Ala Pro

385 390 395 400

Gin Pro Glu Lys Pro Thr Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Pro Ala Pro

405 410 415

Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Lys Pro Lys Ala Glu Lys Pro

420 425 430

Ala Asp Gin Gin Ala Glu Glu

435 <210> 29 <211> 437 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 29

Ala Val Ala Ser Leu Phe Met Gly Ser Val Val His Ala Thr Glu Lys • · • · · · · * · · · · · • « * ♦ · · · · 4 9 9 · ······ • · · ·· · · · · *·· «· ··· ···· ·· ··

- 42 15 10 15

Glu Val Thr Thr Gin Val Ala Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn Lys Ser

25 30

Gin Thr Glu His Met Lys Ala Ala Lys Gin Val Asp Glu Tyr Ile Lys

40 45

Lys Lys Leu Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn Val Gly Leu

55 60

Leu Thr Lys Leu Gly Val Ile Lyš Thr Glu Tyr Leu His Gly Leu Ser

70 75 80

Val Ser Lys Lys Lys Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Glu Ile Lys Ala

90 95

Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gin Phe Lys Lys Asp Thr Leu Pro Thr

100 105 110

Glu Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala

115 120 125

Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Lys Asp Leu Arg Asn Tyr Pro

130 135 140

Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Asp Ile Ala Glu Ser Asp Val

145

150

155

160 • · ·· ·♦ • · · · · · · 9 9 9 9

9 · 9 ··· ·

9 9 · ♦ ···«·

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 9999 ·· ··

- 43 Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu

165 170 175

Ser Arg Asp Glu Lys Lys Ile Asn Gin Ala Lys Ala Lys Val Glu Asn

180 185 190

Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Asn Ile Lys Thr Asp Arg Glu

195 200 205

Lys Ala Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Asp Ala Lys Leu Gin Glu Ala

210 215 220

Asn Val Ala Thr Ser Glu Gin Asp Lys Ser Lys Arg Arg Ala Lys Arg

225 230 235 240

Glu Val Leu Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala

245 250 255

Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Thr Ser Pro Ser

260 265 270

Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu

275 280 285

Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr

290 295 300

Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp

305

310

315

320 • ·

- 44 Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys

325 330 335

Glu Ser Arg Asn Glu Glu Lys Xle Lys Gin Val Lys Ala Lys Val Glu

340 345 350

Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg

355 360 365

Lys Lys Ala Glu Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Ala Glu Glu Asp

370 375 380

Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro Ala Pro

385 390 395 400

Gin Pro Glu Lys Pro Thr Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Pro Ala Pro

405 410 415

Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Lys Pro Lys Ala Glu Lys Pro

420 425 430

Ala Asp Gin Gin Ala

435 <210> 30 <211> 439 <212> PRT • « · »···· « * · · ·♦···♦ • · · ·· »··· ··« ·· «·· ··»· ·· ··

- 45 <213> Streptococcus pneumoniae <400> 30

Val Ala Val Ala Ser Leu Val Met Gly Ser Val Val His Ala Thr Glu

10 15

Lys Glu Val Thr Thr Gin Val Ala Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn Glu

25 30

Ser Gin Ala Gly His Arg Lys Ala Ala Glu Gin Phe Asp Glu Tyr Ile

40 45

Lys Thr Met Ile Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn Phe Ala

55 60

Leu Asn Ile Lys Leu Ser Arg Ile Lys Thr Glu Tyr Leu Arg Lys Leu

70 75 80

Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ala Glu Leu Pro Ser Glu Thr Lys

90 95

Lys Glu Ile Asp Ala Ala Phe Glu Gin Phe Lys Lys Asp Thr Asn Arg

100 105 110

Thr Lys Lys Thr Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys

115 120 125

Lys Lys Ala Lys Ala Gin Lys Glu Glu Asp His Arg Asn Tyr Pro Thr

130

135

140

- 46 ·· ·· «Φ • · · · · » • · · · · • · 9 9 9 · • 9 9 9 9

99 9 99 99

Asn Thr Tyr Lys Thr Leu

145 150

Val Lys Lys Ala Glu Leu

165

Arg Asp Asp Glu Lys Ile

180

Lys Ala Glu Ala Thr Arg

195

Ala Glu Glu Glu Ala Lys

210

Val Glu Lys Asn Val Ala

225 230

Arg Lys Arg Gly Val Pro

245

Asn Asp Ala Lys Ser Ser

260

Ser Pro Ser Leu Lys Pro

275

Glu Leu Glu Ile Ala

155

Glu Leu Val Lys Glu

170

Lys Gin Ala Glu Ala

185

Leu Glu Asn Ile Lys

200

Arg Arg Ala Glu Ala

215

Thr Ser Glu Gin Asp

235

Gly Glu Gin Ala Thr

250

Asp Ser Ser Val Gly

265

Glu Lys Lys Val Ala

280

Glu Ser Asp Val Glu

160

Glu Ala Lys Glu Ser

175

Lys Val Glu Ser Lys

190

Thr Asp Arg Glu Lys

205

Lys Leu Lys Glu Ala

220

Lys Pro Lys Gly Arg

240

Pro Asp Lys Lys Glu

255

Glu Glu Ala Leu Pro

270

Glu Ala Glu Lys Lys

285

Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Ala Gin Lys Glu Glu Asp Arg

- 47 ♦ · ··

444 44

44 44

4 4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4

444« 44 44

290

Arg Asn Tyr Pro Thr Asn

305 310

Glu Ser Asp Val Lys Val

325

Glu Ala Lys Glu Ser Arg

340

Lys Val Glu Ser Lys Lys

355

Thr Asp Arg Lys Lys Ala

370

Glu Asp Lys Val Lys Glu

385 390

Ala Pro Gin Pro Glu Lys

405

Ala Pro Lys Pro Glu Lys

420

Asp Asp Gin Gin Ala Glu

295

Thr Tyr Lys Thr Leu

315

Lys Glu Ala Glu Leu

330

Asn Glu Glu Lys Val

345

Ala Glu Ala Thr Arg

360

Glu Glu Glu Ala Lys

375

Lys Pro Ala Glu Gin

395

Pro Thr Glu Glu Pro

410

Pro Ala Glu Gin Pro

425

Glu

300

Glu Leu Glu Ile Ala

320

Glu Leu Val Lys Glu

335

Asn Gin Ala Lys Ala

350

Leu Glu Lys Ile Lys

365

Arg Lys Ala Ala Glu

380

Pro Gin Pro Ala Pro

400

Glu Asn Pro Ala Pro

415

Lys Ala Glu Lys Thr

430

435 ♦ ΒΒΒ

ΒΒ * ΒΒΒΒ ΒΒΒΒ • Β Β Β Β β Β Β

Β ΒΒ · Β Β Β Β Β Β

Β Β Β Β Β ΒΒΒΒ

ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒΒ ·· ΒΒ

- 48 <210> 31 <211> 419 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 31

Ala Val Ala Ser Leu Val Met Gly Ser Val Val His Ala Thr Glu Asn

S 10 15

Glu Gly Thr Thr Gin Ala Pro Thr Ser Ser Asn Arg Gly Asn Glu Ser

25 30

Gin Ala Glu His Met Lys Ala Ala Lys Gin Val Asp Glu Tyr Ile Glu

40 45

Lys Met Leu Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn Val Gly Leu 50 55 60

Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ile Lys Thr Glu Tyr Leu Arg Gly Leu Ser

70 75 80

Val Ser Lys Glu Lys Ser Thr Ala Glu Leu Pro Ser Glu Ile Lys Glu

90 95

Lys Leu Thr Ala Ala Phe Lys Gin Phe Lys Lys Asp Thr Leu Lys Pro

100 105 110

Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys

- 49 44

4

115 120 125

Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile

130 135 140

Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val

145 150 155 160

Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg

165 170 175

Asp Glu Glu Lys Ile Lys Gin Ala Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Lys

180 185 190

Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Lys Ala

195 200 205

Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Val Asp Ala Lys Glu Gin Asp Glu Ser

210 215 220

Ser Lys Arg Arg Lys Ser Arg Val Lys Arg Gly Asp Val Gly Glu Gin

225 230 235 240

Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser

245 250 255

Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu Lys Pro Gly Lys Lys

260

265

270 • «· ·· · ·· ·· ·· ·· · ·· · · · · · · • · · · · · · · • · · · »····· • · · · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ·»

- 50 Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Asp Lys Lys Ala Lys

275 280 285

Ala Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys

290 295 300

Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala

305 310 315 320

Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asn Glu Glu

325 330 335

Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala

340 345 350

Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu

355 360 365

Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala

370 375 380

Glu Gin Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gin Pro Glu Lys Pro Ala Pro

385 390 395 400

Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gin Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp

405 410 415

Gin Gin Ala

- 51 ····

9

9 • · 9

9 9

9 9 9· ·4

9 4 4

9 9 9

9 4 4

4 9 9

44 <210> 32 <211> 437 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 32

Val Ala Ser Leu Phe Met Gly Ser

5

Val Thr Thr Gin Val Ala Thr Ser

Thr Glu His Met Lys Ala Ala Lys

40

Lys Leu Gin Leu Asp Arg Arg Lys

55

Thr Lys Leu Gly Val Ile Lys Thr

70

Ser Lys Lys Lys Ser Glu Ala Glu

Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gin Phe

Val Val His Ala Thr Glu Lys Glu

15

Ser Asn Lys Ala Asn Lys Ser Gin

30

Gin Val Asp Glu Tyr Ile Lys Lys

His Thr Gin Asn Val Gly Leu Leu

Glu Tyr Leu His Gly Leu Ser Val

80

Leu Pro Ser Glu Ile Lys Ala Lys

95

Lys Lys Asp Thr Leu Pro Thr Glu

100

105

110 ·*«· · ·· ·· ·· • ··*· ···· • · · · · · · • · · ··»···

Pro Gly Lys Lys Val

115

Lys Lys Ala Glu Asp

130

Asn Thr Tyr Lys Thr

145

Val Lys Lys Ala Glu

165

Arg Asp Glu Lys Lys

180

Lys Ala Glu Ala Thr

195

Ala Glu Glu Ala Lys

210

Val Ala Thr Ser Glu

225

Val Phe Gly Glu Leu

245

Ser Ser Asp Ser Ser

- 52 Ala Glu Ala Glu Lys Lys

120

Gin Lys Glu Lys Asp Leu

135

Leu Glu Leu Asp Ile Ala

150 155

Leu Glu Leu Val Lys Glu

170

Ile Asn Gin Ala Lys Ala

185

Arg Leu Lys Asn Ile Lys

200

Arg Arg Ala Asp Ala Lys

215

Gin Asp Lys Ser Lys Arg

230 235

Ala Thr Pro Asp Lys Lys

250

Val Gly Glu Glu Thr Leu

Val Glu Glu Ala Lys

125

Arg Asn Tyr Pro Thr

140

Glu Ser Asp Val Glu

160

Glu Ala Lys Glu Ser

175

Lys Val Glu Asn Lys

190

Thr Asp Arg Glu Lys

205

Leu Gin Glu Ala Asn

220

Arg Ala Lys Arg Glu

240

Glu Asn Asp Ala Lys

255

Thr Ser Pro Ser Leu

260

265

270 • 4 * ·· 44 • · 4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4

4444 44 44

Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala 275 280 285

Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro

290 295 300

Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val

305 310 315 320

Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu

325 330 335

Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gin Val Lys Ala Lys Val Glu Ser

340 345 350

Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg Lys

355 360 365

Lys Ala Glu Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Ala Glu Glu Asp Lys

370 375 380

Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gin Prp Gin Pro Ala Pro Ala Pro Gin

385 390 395 400

Pro Glu Lys Pro Thr Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Pro Ala Pro Ala

405 410 415

Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Lys Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala

4*44 • · · • 4

4 ·

4 4 • 44 44

4444 • 4

4

4

4

4 • 4

- 54 420 425 430

Asp Gin Gin Ala Glu

435 <210> 33 <211> 433 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 33

Cys Thr Val Ala Ser Leu Val Met Gly Ser Val Val His Ala Thr Glu 15 10 15

Asn Glu Arg Thr Thr Gin- Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Gly Lys Pro

25 30

Glu Arg Arg Lys Ala Ala Glu Gin Phe Asp Glu Tyr Ile Asn Lys Met

40 45

Ile Gin Leu Asp Lys Arg Lys His Thr Gin Asn Leu Ala phe Asn Ile

55 60

Gin Leu Ser Arg Ile Lys Thr Glu Tyr Leu Asn Gly Leu Lys Glu Lys

70 75 80

Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Lys Ile Lys Ala Glu Leu Asp Ala Ala

- 55 ···· • · » • ♦ • · · • · · ··· ·· • ·· ·· · · • · • · • · ··· (J··· ·· ·« • · · · • · · · <· · · · · • · · · ·· ··

Phe Lys Gin Phe Lys Lys Asp Thr Leu Pro Thr Glu Pro Glu Lys Lys 100 105 110

Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Val Ala

115 120 125

Glu Ala Lys Lys Lys Ala Lys Ala Gin Lys Glu Glu Asp His Arg Asn

130 135 140

Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Asp Leu Glu Ile Ala Glu Phe

145 150 155 160

Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys Glu Ala

165 170 175

Asp Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Asn Gin Ala Lys Ala Lys Val

180 185 190

Glu Ser Glu Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp

195 200 205

Arg Glu Lys Ala Glu Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Asp Ala Lys

210 215 220

Glu Gin Asp Glu Ser Lys Arg Arg Lys Ser Arg Gly Lys Arg Gly Ala

225 230 235 240

Leu Gly Glu Gin Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser • · · ·

- 56 245 250 2S5

Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu Lys

260 265 270

Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Asp

275 280 285

Lys Lys Ala Lys Ala Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr

290 295 300

Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Lys

305 310 315 320

Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser

325 330 335

Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gin Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys

340 345 350

Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys

355 360 365

Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys

370 375 380

Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro Ala Pro Gin Pro Glu

385

390

395

400 • · · · • · · · · · · · • ·· · ······ ··· · · ···· ··· ·· ··· ···· ·· ··

- 57 Lys Pro Ala Glu Glu Pro Glu Asn Pro Val Pro Ala Pro Lys Pro Glu 405 410 415

Asn Pro Ala Glu Gin Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gin Gin Ala

420 425 430

Glu <210> 34 <211> 427 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 34

Val Ala Val Ala Ser Leu Val Met Gly Ser Val Val His Ala Thr Glu

10 15

Lys Glu Val Thr Thr Gin Val Pro Thr Tyr Ser Asn Met Ala Lys Thr

25 30

Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gin Val Val Asp Glu Tyr Xle Glu Lys

40 45

Met Leu Arg Glu Ile Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn Phe

55 60

Ala Phe Asn Met Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Glu Tyr Leu Tyr Gly • · · ·

- 58 65 70 75 80

Leu Lys Glu Lys Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Glu Val Lys Ala Lys

90 95

Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gin Phe Lys Lys Asp Thr Leu Lys Leu Gly

100 105 110

Glu Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys 115 120 125

Ala Lys Ala Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr

130 135 140

Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys

145 150 155 160

Lys Ala Glu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Glu Ala Lys Thr Arg Asn Glu

165 .170 175

Asp Thr Ile Asn Gin Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu

180 185 190

Ala Thr Lys Leu Glu Glu Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu

195 200 205

Glu Ala Lys Arg Lys Ala Glu Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Asp Lys

210

215

220 ,ξ., • ·

Leu Lys Arg Arg Thr Lys Arg Ala 225 230

Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys

245

Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu

260

Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala

275 280

Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro

290 295

Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val

305 310

Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Gly

325

Gin Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser

340

Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys

355 360

Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val

- 59 Val Pro Gly Glu Pro Ala Thr Pro

235 240

Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu

250 255

Lys Ser Gly Lys Lys Val Ala Glu

265 270

Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gin Lys

285

Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Asp

300

Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu

315 320

Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Asn

330 335

Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu

345 350

Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg

365

Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro

370

375

380 • ♦ · · • · · · · · · · · · · • · · · · · · · • · · · ······ • · · ·· · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

- 60 Gin Pro Ala Pro Ala Pro Gin Pro Glu Lys Pro Thr Glu Glu Pro Glu

385 390 395 400

Asn Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro Lys

405 410 415

Ala Glu Lys Thr Asp Asp Gin Gin Ala Glu Glu

420 425 <210> 35 <211> 413 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 35

Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gin Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala Lys

10 15

Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gin Val Val Asp Glu Tyr Ile Glu

25 30

Lys Met Leu Arg Glu Ile Gin Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gin Asn

40 45

Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ilě Lys Thr Lys Tyr Leu Arg »4 44 44

4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4 4

- 61 Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ser Glu

70 75 80

Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys Asp Thr

90 95

Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu

100 105 110

Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr

115

120

125

Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Phe Asp

130 135 140

Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys

145 150 155 160

Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Lys Gin Ala Lys Glu Lys Val Glu

165 170 175

Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg

180 18.5 190

Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Asp Ala Lys Leu Lys

195 200 205

Glu Ala Asn Val Ala Thr Ser Asp Gin Gly Lys Pro Lys Gly Arg Ala

210

215

220 • 4« ·

4 4444 4444

4 4 44444 • 4 4 4 4 4 4 4 4 ·

444 ·4 4444

444 44 444 4444 44 44

- 62 Lys Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn

225 230 235 240

• ·· · ·· ·· ·· • · · · · ♦ • · · · · • · · · · · • · · · · ···· ·· · ·

- 63 370 375 380

Thr Gin Pro Glu Lys Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gin 385 390 395 400

Pro Lys Ala Glu Lys Thr Asp Asp Gin Gin Ala Glu Glu 405 410 <210> 36 <211> 425 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 36

Tyr Ile Ala Ser Leu Phe- Leu Gly Gly Val Val His Ala Glu Gly Val 15 10 15

Arg Ser Glu Asn Asn Pro Thr Val Thr Ser Ser Gly Gin Asp Ile Ser

25 30

Lys Lys Tyr Ala Asp Glu Val Lys Ser His Leu Glu Lys Ile Leu Ser

40 45

Glu Ile Gin Thr Asn Leu Asp Arg Ser Lys His Ile Lys Thr Val Asn

55 60

Leu Ile Asn Lys Leu Gin Asp Ile Lys Arg Thr Tyr Leu Tyr Glu Leu • ···· • · · · • · • · · • · · • · · ♦· · ·· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · • ··· ·· ··

- 64 Asn Val Leu Glu Asp Lys

Ala Glu Leu Asp Ala Ala

100

Thr Glu Pro Gly Lys Lys

115

Ala Glu Lys Lys Ala Lys

130

Pro Thr Ile Thr Tyr Lys

145 150

Val Lys Val Lys Glu Ala

165

Glu Ser Arg Asn Glu Gly

180

Ser Glu Gin Ala Glu Ala

195

Glu Lys Ala Glu Glu Glu

210

Ser Lys Ala Glu Leu

Phe Glu Gin Phe Lys

105

Val Ala Glu Ala Lys

120

Ala Gin Lys Glu Glu

135

Thr Leu Glu Leu Glu

155

Glu Leu Glu Leu Val

170

Thr Ile Asn Gin Ala

185

Thr Arg Leu Lys Lys

200

Ala Lys Arg Arg Ala

215

Pro Ser Lys Ile Lys

Lys Asp Thr Leu Pro

110

Lys Lys Val Glu Glu

125

Asp Tyr Arg Asn Tyr

140

Ile Ala Glu Ser Asp

160

Lys Lys Glu Ala Asp

175

Lys Ala Lys Val Glu

190

Ile Lys Thr Asp Arg

205

Asp Ala Lys Glu Gin

220

Asp Glu Ser Lys Arg Arg Lys Ser Arg Val Lys Arg Gly Asp Phe Gly • 4444 • 4 4 • 4

4 4 • 4 4 • 44 44

44 «4 • · 4 4 4 « • 4 4 4 4

4 4 · 4 >

• · f 4 ·

4444 44 *4

- 65 225 230 235 240

Glu Pro Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp

245 250 255

Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu Lys Pro Gly

260 265 270

Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys 275 280 285

Ala Lys Asp Gin Lys Glu Glu Asp His Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr 290 295 300

Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys

305 310 315 320

Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Gly Ser Arg Asn

325 330 335

Glu Glu Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Lys Lys Ala

340 345 350

Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu

355 360 365

Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys

370

375

380

• ·

- 66 Pro Ala Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro Ala Pro Gin Pro Glu Lys Pro

385 390 395 400

Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gin Pro Lys Ala Glu

405 410 415

Lys Pro Ala Asp Gin Gin Ala Glu Glu

420 425 <210> 37 <211> 439 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 37

Ala Ser Leu Phe Leu Gly Gly Val Val His Ala Glu Gly Val Arg Ser

10 15

Gly Asn Asn Ser Thr Val Thr Ser Ser Gly Gin Asp Ile Ser Lys Lys

25 30

Tyr Ala Asp Glu Val Glu Ser His Leu Gin Ser Ile Leu Lys Asp Val

40 45

Asn Lys Asn Leu Lys Lys Val Gin His Thr Gin Asn Ala Asp Phe Asn

55 60

Lys Lys Leu Ser Lys Ile Lys Thr Lys Tyr Leu Tyr Glu Leu Asn Val « · · 99 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 • * · · ······ . · · · · 9 · 9 9

999 99 999 9999 99 99

- 67 65 70 75 80

Leu Glu Glu Lys Ser Glu Ala Glu Leu Thr Ser Lys Thr Lys Glu Thr

90 95

Lys Glu Glu Leu Thr Ala Ala Phe Glu Gin Phe Lys Lys Asp Thr Leu

100 105 110

Ser Thr Glu Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu

115 120 125

Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Lys Asp Arg Arg Asn

130 135 140

Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser

145 150 155 160

Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Val Lys Ala

165 170 175

Asn Glu Pro Arg Asp Glu Glu Lys Ile Lys Gin Ala Glu Ala Lys Val

180 185 190

Glu Ser Lys Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp

195 200 205

Arg Glu Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg

210

215

220 • ΦΦΦ • · · · · φφφφ φ · φφφφ • · φ φφφφφφ • φ φ ©φφφ

- 68 Glu Gin Ala Glu Glu Glu Ala Lys Val Lys Asp Glu Pro Lys Lys Arg

225 230 235 240

Thr Lys Arg Gly Val Leu Gly Glu Pro Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu

245 250 255

Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro 260 265 270

Ser Pro Ser Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys

275 280 285

Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg

290 295 300

Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala

305 310 315 320

Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu

325 330 335

Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala

340 34.5 350

Glu Val Glu Ser Lys Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys

355 360 365

Thr Asp

Arg Lys Lys

Ala Glu Glu

Glu Ala Lys

Arg Lys

Ala Ala Glu

370

375

380 β · •· · ···· .··· · · » · · · » • «« · «««··· • · · ·· ···· ··· ·· «.····· ·· ··

- 69 Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro

385 390 395 400

Ala Pro Gin Pro Glu Lys Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Pro

405 410 415

Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gin Pro Lys Ala Glu Lys Pro

420 425 430

Ala Asp Gin Gin Ala Glu Glu

435 <210> 38 <211> 460 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 38

Cys Ile Val Ala Ser Leu Val Met Gly Ser Val Val His Ala Thr Glu 15 10 15

Asn Glu Gly Ala Thr Gin Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn Glu

25 30

Ser Gin Ala Glu Gin Gly Glu Gin Pro Lys Lys Leu Asp Ser Glu Arg »· · · · · • · · · · • · · · · » · · · · · » · · · · t · · · · · ·

Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu 50 55

Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys

70

Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile

Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gin

100

Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val

115 120

Ser Ser Ser Ser Ser Asp. Ser Ser

130 135

Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu

145 150

Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu

165

Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr

180

Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu

- 70 Glu Tyr Val Lys Lys Ile Val Gly

Lys Arg His Thr Ile Thr Val Ala

80

Lys Asn Glu Tyr Leu Asn Lys Ile

95

Leu Gin Ile Leu Met Met Glu Ser

105 110

Ser Lys Phe Glu Lys Asp Ser Ser

125

Thr Lys Pro Glu Ala Ser Asp Thr

140

Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala

155 160

Lys Lys Ala Lys Asp Gin Lys Glu

170 175

Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu

185 190

Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu

195

200

205

- 71 Val Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Glu Gin Lys Ile Lys Gin

210 215 220

Ala Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Gin Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

225 230 235 240

Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg

245 250 255

Ala Asp Ala Lys Glu Gin Gly Lys Pro Lys Gly Arg Ala Lys Arg Gly

260 265 270

Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys

275 280 285

Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu

290 295 300

Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala

305 310 315 320

Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro

325 330 335

Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val

340 345 350

Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu • «·♦· · ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · · • · · ····· • * « · ······ • · · · · · · · · ·«· ·· ··· ···· ·· ··

- 72 35S 360 365

Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser

370 375 380

Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys

385 390 395 400

Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val

405 410 415

Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro Ala Pro Lys Ala

420 425 430

Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gin Pro

435 440 445

Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gin Gin Ala Glu Glu

450 455 460 <210> 39 <211> 459 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 39

Ile Val Ala Ser Leu Val Met Gly Ser Val Val His Ala Thr Glu Asn • ·

- 73 Glu Gly Ala Thr Gin Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala Asn Glu Ser

25 30

Gin Ala Glu Gin Gly Glu Gin Pro Lys Lys Leu Asp Ser Glu Arg Asp

40 45

Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Tyr Val Lys Lys Ile Val Gly Glu

55 60

Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys Arg His Thr Ile Thr Val Ala Leu

70 75 80

Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile Lys Asn Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Val

90 95

Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gin Leu Gin Ile Leu Met Met Glu Ser Arg

100 105 110

Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser Lys Phe Glu Lys Asp Ser Ser Ser

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys Pro Glu Ala Ser Asp Thr Ala

130 135 140

Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys 145 150 155 160

Lys Lys Val Glu Glu Val Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gin Lys Glu Glu • 4 • ··· • 4 · · 4 4 • 4 4 4 ·

4 4 4 4 4 • · 4 4 ·

- 74 165 170 175

Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu

180 185 190

Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val

195 200 205

Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Lys Gin Lys Ile Lys Gin Ala

210 215 220

Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Glň Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys

225 230 235 240

Ile Lys Thr Asp Arg Glu Glu Ala Glu Glu Glu Alá Lys Arg Arg Ala

245 250 255

Asp Ala Lys Glu Gin Gly Lys Pro Lys Gly Arg Pro Lys Arg Gly Val

260 265 270

Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser

275 280 285

Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu Lys 290 295 300

Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys

305

310

315

320 • ··· ·

• · • · • ·

- 75 Lys Lys Ala Glu Asp Gin Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr 325 330 335

Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu

340 345 350

Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Pro

355 360 365

Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gin Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Lys

370 375 380

Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys

385 390 395 400

Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys

405 410 415

Glu Lys Pro Ala Glu Gin Pro Gin Pro Ala Pro Ala Pro Lys Thr Glu

420 425 430

Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gin Pro Lys

435 440 445

Ala Glu Lys

Pro Ala Asp Gin

Gin Ala

Glu Glu

Claims (53)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Ή/

   1. Izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin.
2. 2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 1, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
3. 3. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 3, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
4. 4. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 6.
5. 5. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 7, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
6. 6. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 9, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
7. 7. Izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, která je uvedena v SEQ ID NO. 24, přičemž polypeptid vykazuje svou terciální strukturu.
8. 8. Izolovaný polypeptid podle nároku 7, jehož terciální struktura odpovídá struktuře nacházející se v přirozeném proteinu.
9. 9. Izolovaný polypeptid podle nároku 7, který je vytvořen štěpením celého proteinu A, který váže cholin, pomocí hydroxylaminu, přičemž hydroxylamin štěpí protein A, který váže cholin, u aminokyseliny 475, čímž vytvoří N-koncový zkrácený protein A, který váže cholin.
10. 10. Izolovaný analog polypeptidu podle nároku 1.

    • · ··

    44 44 44

    4 444# 4444

    4 4 4 4 4 4 4

    44 4 4 4 4 4 4 4

    4 4 4 4 4 4 4

    44 444 4444 44 4«
11. 11. Izolovaný polypeptid podle nároku 10, přičemž analog obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má N-koncový methionin nebo N-koncový polyhistidin.
12. 12. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, přičemž uvedené fragmenty jsou produkty proteolytického štěpení polypeptidu.
13. 13. Izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, kdy polypeptid má lektinovou aktivitu a neváže cholin.
14. 14. Izolovaný imunogenní polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin.
15. 15. Izolovaný imunogenní polypeptid podle nároku 14, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 1, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
16. 16. Izolovaný imunogenní polypeptid podle nároku 14, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 3, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
17. 17. Izolovaný imunogenní polypeptid podle nároku 14, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 7, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
18. 18. Izolovaný imunogenní polypeptid podle nároku 14, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 9, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
19. 19. Izolovaná nukleová kyselina, kódující polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin.

    • »44 ·· 9 4 4 · 4 4 4 4 · • 4 · 44944 • 4 4 · 494999

    444 44 4499

    00 444 94 994 9494 49 49
20. 20. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, jejíž sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 12, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
21. 21. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, jejíž sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 14, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
22. 22. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, jejíž sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 17, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
23. 23. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, jejíž sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 19, včetně jeho fragmentů, mutant, variant, analogů nebo derivátů.
24. 24. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, přičemž nukleová kyselina je DNA.
25. 25. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, přičemž nukleová kyselina je cDNA.
26. 26. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, přičemž nukleová kyselina je genomová DNA.
27. 27. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, přičemž nukleová kyselina je RNA.
28. 28. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 19, která je operativně vázána k promotoru RNA transkripce.
29. 29. Vektor, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 19.
30. 30. Vektor podle nároku 28, přičemž promotor obsahuje bakteriální, kvasinkový, hmyzí nebo savčí promotor.
31. 31. Vektor podle nároku 28, přičemž vektor je plazmid, kosmid, umělý kvasinkový chromozom (YAC), bakteriofág nebo eukaryotická virová DNA.

    *··· «φ • φ • φφ φ • φ φ φ φ φ φ φφ φφ
32. 32. Hostitelský vektorový systém pro produkci polypeptidu, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 30 ve vhodné hostitelské buňce.
33. 33. Hostitelský vektorový systém podle nároku 32, v y z n a č u j í c í se t í m, že vhodná hostitelská buňka je prokaryotická nebo eukaryotická buňka.
34. 34. Buněčná linie, obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 19.
35. 35. Způsob získání polypeptidu v purifikované formě, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

    (a) vnesení vektoru podle nároku 19 do vhodné hostitelské buňky;

    (b) kultivace výsledných hostitelských buněk tak, že produkují polypeptid;

    (c) získání polypeptidu, produkovaného v kroku (b); a (d) purifikace polypeptidu, takto získaného v kroku (c).
36. 36. Protilátka schopná se specificky vázat k polypeptidu podle nároku 1 nebo 7.
37. 37. Protilátka podle nároku 36, přičemž se jedná o monoklonální protilátku.
38. 38. Protilátka podle nároku 36, přičemž se jedná o polyklonální protilátku.
39. 39. Protilátka podle nároku 36, přičemž se jedná o chimerní (bispecifickou) protilátku.
40. 40. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje množství polypeptidu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
41. 41. Způsob vyvolání imunitní odpovědi u jedince, který byl vystaven působení nebo infikován pneumokokovou bakterií, vyznačující se tím, že je jedinci podáno množství farmaceutického prostředku podle nároku 40, čímž je indukována imunitní odpověď.
42. 42. Způsob zabránění infekce pneumokokovou bakterií u jedince, vyznačující se t í m, že je jedinci podáno takové množství farmaceutického prostředku podle

    999* ·« 99 *9 • · · » 9 · · · • « · 9 9 9 9 · • · · 9 9*9999

    Λ-y 999 *· 9 9*·

    Ό/ 999 ·· ··· «'·· ·* ·· nároku 40, které je účinné pro zabránění navázání pneumokokové bakterie, čímž je zabráněno infekci pneumokokovou bakterií.
43. 43. Způsob podle nároku 40, v y z n a č u j í c í se t í m, že farmaceutický prostředek je dopraven do respiračního traktu nebo nosohltanu.
44. 44. Způsob zabránění infekce pneumokokovou bakterií u jedince, vyznačující se t í m, že je jedinci podáno takové množství farmaceutického prostředku obsahujícího protilátku podle nároku 36 a a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo, čímž je zabráněno infekci pneumokokovou bakterií.
45. 45. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelné adjuvans nebo nosič.
46. 46. Vakcína podle nároku 45, v y z n a č u j i c i se t i m, že polypeptid má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v kterékoli z SEQ ID NOS: 1, 3 až 7, 9 až 11, 22 a 23.
47. 47. Vakcína podle nároku 45, v y z n a č u j i c i se t i m, že polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci N-konce zkráceného proteinu A, který váže cholin, která je uvedena na obrázku 2.
48. 48. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci obsahující konzervativní oblast, která je uvedena na obrázku 2 a farmaceuticky přijatelné adjuvans nebo nosič.
49. 49. Vakcína podle nároku 48, v y z n a č u j i c i se t i m, že konzervativní oblast je vybrána z aminokyselinové sekvence 158 až 172; 300 až 321; 331 až 339; 355 až 365; 379 až 389; 409 až 427 a 430 až 447.
50. 50. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu, která kóduje polypeptid podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelné adjuvans nebo nosič.

    ΒΒΒΒ « β* 99 ΒΒ • ΒΒ · * 9 Β Β • Β ΒΒΒΒ • ΒΒΒ···

    Β Β ΒΒΒΒ

    ΒΒΒΒΒΒΒ 99 ΒΒ
51. 51. Vakcína vyznačující se t ί m, že obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu podle nároku 19 a farmaceuticky přijatelné adjuvans nebo nosič.
52. 52. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 29 a farmaceuticky přijatelné adjuvans nebo nosič.
53. 53. Způsob léčení jedince infikovaného nebo vystaveného pneumokokové bakterii, vyznačující se tím, že je jedinci podáno léčebně účinné množství vakciny podle kteréhokoli z nároků 45 až 52.