CZ20002640A3 - Způsob výroby absorbovatelných mikročástic - Google Patents

Způsob výroby absorbovatelných mikročástic Download PDF

Info

Publication number
CZ20002640A3
CZ20002640A3 CZ20002640A CZ20002640A CZ20002640A3 CZ 20002640 A3 CZ20002640 A3 CZ 20002640A3 CZ 20002640 A CZ20002640 A CZ 20002640A CZ 20002640 A CZ20002640 A CZ 20002640A CZ 20002640 A3 CZ20002640 A3 CZ 20002640A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
peptide
microparticles
bound
units
coated
Prior art date
Application number
CZ20002640A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Ciarán Loughman
Original Assignee
Kinerton Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kinerton Limited filed Critical Kinerton Limited
Priority to CZ20002640A priority Critical patent/CZ20002640A3/cs
Publication of CZ20002640A3 publication Critical patent/CZ20002640A3/cs

Links

Landscapes

  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby souboru obalených vázaných mikročástic s dlouhodobým uvolňováním, který obsahuje jeden nebo více peptidů, jeden nebo více proteinů nebo jejich kombinaci, imobilizované na absorpčních polymemích mikročásticích, které mají absorpční polymerní povlak, přičemž uvedený způsob zahrnuje rozprašování a disperzi vázaných mikročástic.

Description

Způsob výroby absorpčních mikročástic
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby obalené vázané mikročástice, která je dlouhodobě uvolňujícím komplexem jednoho nebo více peptidů, jednoho nebo více proteinů nebo jejich kombinace, imobilizovaných na absorpční polymerní mikročástici, která má absorpční obalující polymer. Komplexní mikročástice, vyrobená způsobem podle vynálezu obsahuje peptid(y) a/nebo protein(y), jenž mají alespoň jednu aminoskupinu a/nebo alespoň jednu karboxylovou skupinu v molekule, pevnou absorpční polyesterovou mikročástici, která má povrchové a podpovrchové karboxylové skupiny nebo aminoskupiny v dostatečném množství k navázání peptidu(ů) a/nebo proteinu(ů) tak, aby imobilizovaný(é) peptid(y) nebo protein(y) tvořily 0,1 % až 30% celkové hmotnosti komplexní mikročástice, která ie zabalena jednotlivě nebo po skupinách absorpčním obalujícím polymerem, ovlivňujícím uvolňování imobilizovaný(é) peptid(y) a/nebo protein(y).
Dosavadní stav techniky
Pro kontrolované uvolňování farmaceutických kompozic v organismech již bylo vyvinuto, testováno a použito mnoho systémů pro podávání účinných látek. Tak například byly pro uvolňování biologicky účinných molekul, jako je progesteron, použity polyestery, jako je poly(DL-kyselina mléčná), poly(kyselina glykoiová), poly(ekaprolakton) a různé kopolymery ve formě mikrokapsulí, filmů nebo tyčinek (viz M. Chasin a R. Langer, editors, Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Dekker, NY 1990). Při implantaci kompozice polymer/terapeutický prostředek, například, subkutánně nebo intramuskulárně, se terapeuticky účinná látka uvolňuje po • ·
určitou dobu. Takové biokompatibilní biodegradabilní polymerní systémy jsou uspořádány tak, aby mohla zachycená terapeuticky účinná látky difundovat z polymerní matrice. Při uvolňování terapeuticky účinné látky se polymer degraduje in vivo a tudíž se implantát nemusí chirurgicky odstraňovat. Třebaže faktory, které zabezpečují u polléru degradaci nejsou do všech detailů zcela jasně známy, lze předpokládat, že degradace polyesterů se dá ovlivnit náchylností esterových vazeb polymerních složek k neenzymatické autokatalytické hydrolýze.
Tak například, Deluca (EP-0 467 389 A2) popisuje fyzikální interakci mezi hydrofobním biodegradabilním polymerem a proteinem nebo polypeptidem.
Vznikající kompozice je směsí terapeuticky účinné látky a hydrofobního polymeru, který zajišťuje její rovnoměrné difusní uvolňování z matrice po introdukci do subjektu.
Hutchinson (U.S. Pat. No. 4,767,628) řídí uvolňování terapeuticky účinné látky rovnoměrným rozptýlením v polymerním zařízení. Je uvedeno, že tato formulace řeší kontrolované kontinuální uvolňování ve dvou fázích: první, kterou je difusně závislé vyluhování účinné látky z povrchu formulace; a druhou, která uvolňuje vodními kanálky, které vznikají v důsledku degradace polymeru.
Další biodegradabilní implantáty, vytvářené in-situ, a způsoby jejich výroby, jsou popsané v patentech US 5 278 201 (dále též Patent '201) a US 5 077 049 (dále též Patent Ό49), Dunn et al. Uvedené patenty Dunna et al. popisují metody napomáhající regeneraci periodontální tkáně v a periodontální oblasti a pro zpomalení retardace a migrace epithelových buněk podél povrchu zubního kořenu. Patent '049 popisuje metody, které se zabývají • * • · • · · · · · ·· ·· ·· ·» • ·· · · ·· · • ·· · · · · · • ······ ·· · • · · · · · · umístěním in-situ vytvářené biodegradabilní bariery, přiléhající k povrchu zubu. Tato bariéra je mikroporézní a zahrnuje póry definované velikosti a může obsahovat biologicky aktivní látky. Vytvoření bariery se dosahuje umístěním kapalného roztoku vodoukoagulovatelného termoplastického biodegradabilního polymeru, jako je poly(d,I-laktid-co-gIykoIid) v netoxickém organickém rozpouštědle, které je s vodou mísitelné, jako je N-methyl pyrrolidon (obvykle se dosáhne koncentrace polymeru asi 50%) do peridontální oblasti. Organické rozpouštědlo se rozptyluje do peridontálních tekutin a biodegradabilní, vodou koagulovatelný polymer tvoří in-situ pevný, biodegradabilní implantát. Rozptýlení rozpouštědla tvoří póry uvnitř pevného biodegradabilního implantátu, aby se podpořilo vrůstání buněk. Podobně patent '859 popisuje metody pro stejné indikace týkající se vytváření biodegradabilní bariery z kapalné směsi biodegradabilního, vytvrditelného termosetového prepolymeru, vytvrzovacího činidla a vodorozpustného materiálu jako je sůl či cukr a vodorozpustného polymeru. Vytvrditelný termosetový prepolymer je popsán jako absorpční polymer zakončený akrylovým esterem.
Dále, mnoho systémů pro kontrolované dodávání biologicky aktivních sloučenin do různých míst a řada míst jsou popsány v literatuře. Tak například, US Patent 5 011 692, Fujioka et al., uvádí farmaceutický přípravek s dlouhodobým pulsujícím uvolňováním, který obsahuje vrstvy z polymerního materiálu s obsahem účinné látky. Vrstvy z polymerního materiálu obsahují účinnou látku pouze v malém množství nebo jí neobsahují vůbec. Celý pcvrch je v kolmém směru nastaven a je pokryt polymerním materiálem, který je nerozpustný ve vodě. Tyto typy pulsujícího podávání farmaceutických dávek jsou vhodné pro implantaci pod kůži.
U.S. Pat. No. 5,366,756, Chesterfield et al., popisuje způsob přípravy porézních bioabsorpčních implantátových materiálů.
• ·
- 4 Způsob zahrnuje přípravu velkého množství částic bioabsorpčního implantátového materiálu a povlečení částic bioabsorpčního implantátového materiálu alespoň jedním růstovým faktorem. Implantát může také obsahovat antimikrobiálně účinné látky.
US Patent 5 385 738, Yamhira et aL, uvádí dlouhodobě uvolňující injekční systém, zahrnující suspenzi prášku, který obsahuje aktivní ingredient a farmaceuticky přijatelný biodegradovatelný nosič (např. protein, polysacharidy a syntetické sloučeniny s vysokou molekulovou hmotností, výhodně kolagen, atelo kolagen, želatina a jejich směs) ve viskosním rozpouštědle (např. rostlinné oleje, polyethylenglykol, propylenglykol, silikonový olej a triglyceridy mastných kyselin se střední délkou řetězce) pro injekce. Aktivní složka je ve farmaceutické formulaci inkorporována do biodegradovatelného nosiče v následujícím stavu:
(i) aktivní složka je chemicky vázána k nosné matrici;
(ii) aktivní složka je vázána k nosné matrici intermolekulární silou; nebo (iii) aktivní složka je fyzikálně uložena uvnitř komůrky matrice.
Dále, takovéto systémy, jak byly až dosud popsány v literatuře, například v publikaci Dunn, et al. (US 4 938 763), mohou tvořit in-situ biodegradovatelné, mikroporézní, pevné implantáty v živém těle organismu koagulací roztoku polymeru v organickém rozpouštědle jako je N-methyl-2-pyrrolidin. Nicméně, použití těchto rozpouštědel, včetně těch, které mají malé molekuly a jsou organické, je doprovázeno migrací roztoku z místa aplikace, což způsobuje poškození živé tkáně, zahrnující například dehydrataci buněk a nekrosu. Ztráta většího množství rozpouštědla může vést ke srážení koagulační složky a oddělování implantátu od okolní tkáně.
• · • · • · • · ?· ·· • · · · · · · · • fc · · · · · · · · · ·· ·
5··· · · · · · · ·
- ····«· · · · · · · »·
US patent 5 612 052 popisuje kationtoměničové mikročástice vyrobené obvykle z polyesterových řetězců nesoucích karboxylové skupiny, na kterých jsou iimobilizovány zásadité biologicky aktivní látky, aby se dosáhlo systému s kontrolovaným uvolňováním absorpčního gelujícího kapalného polyesteru. Obsah US patentu 5 612 052 je formou odkazu tímto vložen do popisu vynálezu. Iontová konjugace karboxylových entit s basickými polypeptidy je zmíněna v popisu známého stavu techniky v patentech US 5 672 659 a US 5 665 702. Nicméně, tyto komplexy jsou rozpustnými chemickými sloučeninami, vznikajícími molekulárně reakcí individuální zásadité komponenty s karboxylovou komponentou ve vhodném rozpouštědle za vzniku dobře definovaného iontového konjugátu jako nové chemické entity s určitými fysiochemickými vlastnostmi.
Podstata vynálezu
Vynález je zaměřen na způsob (způsob A) výroby obalené vázané mikročástice nebo více vázaných mikročástic, přičemž tato obalená vázaná mikročástice nebo více vázaných mikročástic zahrnují vázanou mikročástici nebo více vázaných mikročástic a absorpční obalující polymer, dále vázaná mikročástice nebo více vázaných mikročástic obsahuje absorpční jádro z polymeru s heterořetězcem a jeden nebo více peptidů, jeden nebo více proteinů nebo jejich kombinaci, imobilizovaný(é,ou) na uvedeném absorpčním polymerním jádru s heterořetězcem, kde peptid je nezávisle zvolen ze souboru, do kterého patří růstový hormon uvolňující peptid (GHRP), luteinizační hormon-uvolňující hormon (LHRH), somatostatin, bombesin, gastrin uvolňující peptid (GRP), kalcitonin, bradykinin, galanin, melanocyt stimulující hormon (MSH), růstový hormon uvolňující faktor (GRF), amylin, tachykininy, sekretin, parathyroidní hormon (PTH), enkafelin, endothelin, kalcitoninový gen uvolňující peptid (CGRP), neuromediny, protein spojený s parathyroidním hormonem (PTHrP), glukagon, ·· • · • · • ·· · · » · · · » · · • · · · ·· · · · · · neurotensin, adrenokortikotropní hormon (ACTH), peptid YY (PYY), glukagon uvolňující peptid (GLP), vasoaktivní intestinální peptid (VIP), peptid aktivující adenylátcyklázu podvěsku mozkového (PACAP), motilin, substance P, neuropeptid Y (NPY), TSH a jeho analogy a fragmenty nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z jmenovaných látek; a kde protein je nezávisle vybrán ze souboru, do něhož patří růstový hormon, erytropoietin, stimulační faktor granulocytu tračníku, stimulační faktor granulocytového makrofágu tračníku a interferony; přičemž způsob zahrnuje následující tyto kroky:
získání disperze s obsahem pevných vázaných mikročástic v roztoku absorpčního obalujícího polymeru, homogenizací a současnou dispergací uvedených pevných vázaných mikročástic do roztoku absorpčního obalujícího polymeru; a rozprašování uvedené disperze nebulizační sondou, která pracuje při ultrazvukové frekvenci v rozmezí 12 kHz až 36 kHz, do media, které není rozpouštědlem pro uvedený absorpční obalující polymer, při průtoku asi 1ml/min až 15 ml/min.
Výhodný způsob provedení způsobu A, označovaný jako způsob B, je takový, při kterém medium obsahuje isopropanol nebo ethanol.
Výhodný způsob provedení způsobu B, označovaný jako způsob C, je ten, při kterém roztok absorpčního polymeru sestává z asi 5% až 30% absorpčního polymeru a teplota media je od pokojové teploty do asi -80°C.
- 7 Φ·
Výhodný způsob provedení způsobu A, označovaný jako způsob D, je takový, kdy obsah peptidu, peptidů, proteinu nebo proteinů nebo jejich kombinace ve vázané mikročástici je 0,1 % to 30% celkové hmotnosti této vázané mikročástice.
Výhodný způsob provedení způsobu D, označovaný jako způsob E, je takový, kdy absorpční polymerní jádro obsahuje glykolátové jednotky a citrátové zbytky kde poměr glykolátových jednotek ku citrátovým zbytkům je asi 7-1 až asi 20-1 nebo glykolátové jednotky a vinanové zbytky, kde poměr glykolátových jednotek ku vinanovým zbytkům je asi 7-1 až asi 20-1 nebo glykolátové jednotky a jablečnanové zbytky, kde poměr glykolátových jednotek ku jablečnanovým zbytkům je asi 7-1 až asi 20-1.
Výhodný způsob provedení způsobu E, označovaný jako způsob F, je takový, kdy absorpční obalující polymer obsahuje (a) jednotky na bázi l-laktidu a jednotky na bázi glykolidu, kde poměr jednotek na bázi l-laktidu ku jednotkám na bázi glykolidu je asi 60-40 až asi 90-10, (b) jednotky na bázi dj-laktidu a jednotky na bázi glykolidu, kde poměr jednotek na bázi d,l-laktidu ku jednotkám na bázi glykolidu je asi 60-40 až asi 90-10, (c) jednotky na bázi d,l-laktidu a (d) jednotky na bázi l-laktidu a jednotky na bázi d,l-laktidu, kde poměr jednotek na bázi l-laktidu ku jednotkám na bázi d,l-laktidu je asi 80-20.
- 8 ♦ ft
Výhodný způsob provedení způsobu F, označovaný jako způsob G, je takový, kdy absorpční obalující polymer tvoří 5 až 70% celkové hmotnosti obalené vázáné mikročástice nebo obalených vázaných mikročástic.
Výhodný způsob provedení způsobu G, označovaný jako způsob H, je takový, ve kterém absorpční obalující polymer tvoří 20-60% celkové hmotnosti obalené vázané mikročástice nebo obalených vázaných mikročástic.
Výhodný způsob provedení způsobu H, označovaný jako způsob I, je takový, ve kterém absorpční obalující polymer tvoří 30-50% celkové hmotnosti obalené vázáné mikročástice nebo obalených vázaných mikročástic.
Výhodný způsob provedení způsobu I, označovaný jako způsob J, je takový, ve kterém peptidem jen analog LHRH.
Výhodný způsob provedení způsobu J, označovaný jako způsob K, je takový, ve kterém analogem LHRH je p-Glu-His-Trp-SerTyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.
Výhodný způsob provedení způsobu I, označovaný jako způsob L je takový, ve kterém peptidem je analog somatostatinu.
Výhodný způsob provedení způsobu L, označovaný jako způsob M, je takový, ve kterém analogem somatostatinu je Η-β-D-NalCys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou spojeny disulfidickou vazbou.
Jiný výhodný způsob provedení způsobu L je takový, ve kterém je takový, kde analogem somatostatinu je N-hydroxy•» »t • · · • · • · • · · • 9 9
- 9 ·» * · · · 9 · · • · ♦· · · · · ethyl pi perazinyi-acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NFk, kde dva Cys zbytky jsou spojeny disulfidickou vazbou.
Ještě další výhodný způsob provedení způsobu L je takový, ve kterém analogem somatostatinu je N-hydroxyethylpiperazinyl-ethylsulfonyl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys zbytky jsou spojeny disulfidickou vazbou.
Termín absorpční, jak je zde užíván, znamená ve vodě nerozpustný materiál jako je polymer, který podléhá v biologickém prostředí disasociaci řetězce na vodorozpustné vedlejší produkty.
Termín mikročástice, jak je zde užíván, znamená částice absorpčního polyesteru, které jsou výhodně ve v podstatě kuličkovité formě.
Termín vázaná mikročástice, jak je zde užíván, znamená mikročástici, která obsahuje jeden nebo více peptidů a/nebo jeden nebo více proteinů iontově imobilizovaných na mikročástici.
Termín obalená mikročástice, jak je zde užíván, znamená vázanou mikročástici, která má polymerní povlak, přičemž polymerní povlak nemusí být vždy obalovat úplně celou částici.
Termín polymerní jádro, jak je zde užíván, je jiná cesta jak říci více mikročástic.
Termín obalující polymer, jak je zde užíván, znamená polymer, který se používá pro obalení vázané mikročástice.
Termín gelotvorný kapalný polyester, jak je zde užíván, znamená materiály, které absorbují rozpouštědla jako je voda, • · * · • ♦ · · • · · · • · · * * · • 9 ·
- 10 9 9 9
9 99 99 ♦ ♦ · • · · • * · « · · · · · 9
9 99 9 9 9 9 podléhají fázové přeměně a při tom si udržují trojrozměrné mřížky schopné reversibilní deformace.
Aminokyseliny se charakterizují zavedenými třípísmennými kódy, které jsou odborníkovi v oboru známé, například Ala = aianin.
Mikročástice, která se používá ve způsobu podle vynálezu je krystalická a je vyrobena z absorpčního polyesteru, jako je polyglykolid, který má jednu nebo více karboxylových skupin na jednotlivých řetězcích, což má za důsledek dostatečnou koncentraci karboxylových skupin na povrchu mikročástice, která zprostředkuje kontakt pod povrchem mikročástice s komplexem a iontově imobilizuje peptid(y) a/nebo protein(y), které mají jednu nebo více zásaditých skupin. Nebo mohou být karboxylové skupiny polyglykolidu amidovány, například diaminem, výhodně primárním nebo sekundárním aminem nebo jejich směsí, kde amin tvoří komplex který iontově imobilizuje peptid(y) a/nebo protein(y), mající jednu nebo více kyselých skupin. Jelikož povrch více mikročástic nemusí být nutně homogenní, termín podpovrchový znamená štěrbiny a podobně, které se nalézají na povrchu mikročástic. Vázané mikročástice představují prostředky pro kontrolované uvolňování peptidu(ů) a/nebo proteinu(ů) v těle pacienta. Další kontrola uvolňování imobilizovaného(ných) peptidu(ů) a/nebo proteinu(ů) se při způsobu podle vynálezu provádí obalením vázáním mikročástic individuálně nebo ve skupinách absorpčním obalujícím polymerem. Vázané mikročástice uvolňují peptid(y) a/nebo protein(y) v průběhu intervalu od asi dvou dnů do asi tří měsíců v těle pacienta, výhodně asi jeden měsíc až asi tři měsíce. Obalené mikročástice uvolňují peptid(y) a/nebo protein(y) v průběhu asi tří dnů až šesti měsíců v těle pacienta, výhodně asi tří týdnů až pěti měsíců.
·· 0· ·· ·· • · 0 · ♦ · 9 • · · 0 · · · • 0 0··· · · · • · · « · · 0 • 0 ·0 0 9 0 0
Typické příklady peptidů, které se dají imobilizovat nebo vázat na mikročástice používané v tomto vynálezu jsou, mimo jiné, růstový hormon uvolňující peptid (GHRP), luteinizační hormonuvolňující hormon (LHRH), somatostatin, bombesin, gastrin uvolňující peptid (GRP), kalcitonin, bradykinin, galanin, melanocyt stimulující hormon (MSH), růstový hormon uvolňující faktor (GRF), amylin, tachykininy, sekretin, parathyroidní hormon (PTH), enkafelin, erdothelin, kalcitoninový gen uvolňující peptid (CGRP), neuromediny, protein spojený s parathyroidním hormonem (PTHrP), glukagon, neurotensin, adrenokortikotropní hormon (ACTH), peptid YY (PYY), glukagon uvolňující peptid (GLP), vasoaktivní intestinální peptid (VIP), peptid aktivující adenylátcyklázu podvěsku mozkového (PACAP), motilin, substance P, neuropeptid Y (NPY), TSH a jeho analogy a fragmenty nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z jmenovaných látek; a kde protein je nezávisle vybrán ze souboru, do něhož patří růstový hormon, erytropoietin, stimulační faktor granulocytu tračníku, stimulační faktor granulocytového makrofágů tračníku a interferony
Mikročástice může být vyrobena z polymeru na bázi laxtidu nebo pevného semikrystalického polylaktonu jako je polyglykolid, který se dá připravit polymerací otevřením kruhu nesoucího kyselou skupinu působením hydroxylových iniciátorů jako je kyselina glykolová, kyselina mléčná, jablečná, vinná a citrónová. Mikročástice používané podle vynálezu se dají syntetizovat Následujícím postupem. V reakční nádobě se smísí monomer založený na laktidu a/nebo a lakton jako je glykolid a kyselý iniciátor jako je kyselina vinná, kyselina jablečná nebo kyselina citrónová. Reakční nádoba se zahřeje na asi 35-45°C, výhodně 40°C a umístí se pod vákuem po dobu asi 20-60 minut, výhodně 30 minut. Teplota reakční směsi v nádobě se zvýší na asi 105-115°C, výhodně 110°C. Po zvýšení teploty se nádoba
- 12 to· ·· • ·· • · • · • to a · to· « · • to ·· ·« *· • toto · * · to to ·· · · toto to · ····· ·· ·· · · · · «· ·· ·· umístí pod atmosféru bezkyslíkatého dusíku, a směs se míchá. Poté co se směs roztaví, přidá se katalytické množství organokovového katalyzátoru, vhodného pro polymeraci otevřením kruhu, jako je roztok 2-ethyl-hexanoátu cínatého v aprotickém rozpouštědle, jako je toluen. Opět se aplikuje vakuum po dobu asi 30-90 sekund pro odstranění toluenu aniž by znatelně ubylo monomeru. Teplota směsi se zvýší na asi 115-125’C, výhodně 120°C po dobu asi 5-10 minut před dalším zvýšením na asi 145150°C. Tato teplota byla udržována po dobu asi 3-5 hodin, výhodně 4 hodiny, za stálého mechanického míchání.
Výsledný polymer se nejprve mikronizuje mletím pomocí mlecích nožů a pak v Aljetově mikronizéru pomocí stlačeného proudu suchého dusíku. Střední průměr částic se stanovoval zařízením pomocí distribuce objemu Malvern Mastersizer/E a se silikonovým olejem 200/5 cS dispergantem.
Polymer se pak vyčistí a se převede na sodnou sůl dispergaci mikronizovaného polymeru v acetonu a umístěním v ultrazvukovém zařízení, výhodně po dobu asi 30 minut. V průběhu této doby se disperze také homogenizuje při asi 8 000-24 000 ot/min, výhodně 9 500 ot/min, pomocí homogenizéru. Po této ultrazvukové homogenizaci asi 3,000-7,000 ot/min, výhodně 5,000 ot/min výhodně po dobu asi 30 minut na odstředivce. Supernatant se odstraní a odstředěná sedlina se resuspenduje v čerstvém acetonu a opakuje se ultrazvukový/homogenizační krok. Po ukončení druhého odstřeďování se supernatant odstraní a koláče se opět resuspendují v deionizované vodě. Pak se provede ještě jeden závěrečný ultrazvukový/homogenizační stupeň, aby se odstranil veškerý zbývající aceton a disperze se ještě jednou odstředí při asi 5,000 ot/min po dobu asi 30 minut.
titi ti· ti titi • ti • ti tititi • · ti ti titi
- 13 • ti ti* titi • titi ti • ti ti ti ti ti tititi • ti ti • ti ·· ti ti « ti • ti ti · ti ti ti ti ti titi ti • ti titi
Odstředěné sedliny se resuspendují v čerstvé deionizované vodě a pH disperze se monitoruje. Za použití míchání se pak přidají dostatečné objemy slabé zásady jako je například 0,2M roztoku uhličitanu sodného, aby se pH zvýšilo na hodnotu mezi asi pH 8 a asi pH 9. Disperze se nechají míchat po dobu asi 30 minut a pak se vakuově zfíltrují přes filtrační papír. Filtrační koláče se dále promývají deionizovanou vodou, zmrazí se a lyofilizují.
Čištění se monitoruje diferenciální skenovací kalorimetrií (DSC) s teplotním růstem asi 5°C/min až 15°C/min, výhodně 10°C/min.
Aniontový iontoměnič ve formě mikročástice se získá tak, že se vezme více mikročástic kationtového iontoměniče a inkubuje se v horkém roztoku (~80°C) diaminu, přičemž je výhodné, když aminy mohou být buď oba primární aminy nebo oba sekundární aminy nebo směs primárních a sekundárních aminů, známé koncentrace v dioxanu nebo THF, přičemž se pracuje pod inertním plynem jako je argon. Koncentrace diaminu v dioxanu nebo THF se stanoví acidimetrií. Pak se reakční směs prakticky ustaví, amidované mikročástice se oddělí filtrací, promyje dioxanem nebo THF, a suší se pod sníženým tlakem.
Peptid(y) a/nebo protein(y) se dají imobilizovat na mikročástici následující metodou. Sodná sůl mikročástice se disperguje v roztocích obsahujících peptid(y) ve formě volných bází a/nebo protein(y) rozpuštěné ve vodě. Disperze se inkubují při teplotě místnosti za míchání po dobu asi 2 hodin před odfiltrováním vázaných mikročástic. Filtrační koláče se zvlhčí deionizovanou vodou, zmrazí a lyofilizují. Vzorky se pak analyzují na dusík elementární analýzou, aby se stanovilo množství imobilizovaného(ných) peptidu(ů) a/nebo proteinu(ů).
0 0
0
0
0 000« ··
0
- 14 00 00 00 0· · 0 0 «*«· 000 0 0000 0 000000 00 0 0 0 0 0 0 0 0 ♦ · ·· ·«
Velikost mikročástice má vliv na množství peptidů a/nebo proteinu, které je mikročástice podle vynálezu schopna imobilizovat. Menší velikost mikročástice znamená více vystaveného povrch na jednotku hmotnosti mikročástice a, tudíž, více peptidů a/nebo proteinu, který se může imobilizovat na jednotku hmotnosti mikročástic. Tento popsaný efekt se může dosáhnout zmenšením mikročástic na mikrony nebo pod 1 mikron. Průměr mikročástic může být v rozmezí od asi 0,5 pm do 100 Nm, výhodně 1 pm až 15 pm a ještě výhodněji 3 pm až 10 pm
Absorpční obalovací polymer může být krystalický nebo nekrystalický laktid/glykolidový kopolymer, amorfní l-laktid/d,l-laktidový kopolymer, kaprolakton/glykolidový kopolymer nebo trimethylen karbonát/glykolidový kopolymer, který je rozpustný v běžných organických rozpouštědlech, jako je chloroform, methylen chlorid, aceton, acetonitril, ethylacetát a ethylformiát nebo jejich kombinace. Nerozpouštědla pro tento absorpční obalovací polymer jsou, mimo jiné, voda, nízkovroucí alkoholy a uhlovodíky nebo jejich kombinace. Absorpční obalovací polymery se mohou syntetizovat katalyzovanou pclymerací otevřením laktonového kruhu nebo polymeraci cyklických monomerů jako je e-kaprolakton, p-dioxanon, trimethylen karbonát, 1,5-dioxepan-2-on nebo 1,4-dioxepan-2-on v přítomnosti iniciátoru jako je hydroxypolykarboxylová kyselina. Ještě další způsob zahrnuje reakci organické polykarboxylové kyseliny s předem vytvořeným polyesterem, který je popsán v US Patentu 5 612 052, jehož obsah je tímto zde vložen do popisu formou odkazu.
Obalení vázaných mikročástic se dá dosáhnout způsobem, podle vynálezu, který zahrnuje použití ultrazvukového atomizéru, při kterém se disperze vázaných mikročástic v roztoku absorpčního obalovacího polymeru zavádí ve formě mikrokapiček do chlazeného nerozpouštědlového prostředí (chlazené nerozpouštědlové prostředí «9 99
9 9 9
9 9 9
9 999
9 9
99 • 9 99
9 9
9
9
9 9
9999 99 • 9
9
- 15 9 9 9 9 9 9
9 je nerozpouštědlem pro absorpční obalovací polymer). Vázané mikročástice se obalí absorpčním obalovacím kopolymerem laktidu a glykolidu pomocí koagulace pevných mikročástic obalených v polymerním roztoku a pomocí ultrazvukového atomizéru (nebulizéru) se přivádějí do kapalného prostředí, které je nerozpouštědlem pro obalovací polymer, ale je schopno extrahovat rozpouštědlo z roztoku obalovacího polymeru kolem obalených mikročástic. Uvedený nebulizér je vybaven sondou, která rozprašuje při frekvenci 12 až 36 kHz. Je výhodné, když sonda, která má být používána, je schopna dosahovat frekvence asi 34 kHz až 36 kHz. Vztah mezi frekvencí, kterou sonda může generovat a jejím vlivem na způsob podle vynálezu je takový, že vyšší frekvence umožňuje, aby se při způsobu podle vynálezu manipulovalo s viskóznějšími roztoky a také umožňuje dosažení vyšší koncentrace disperze vázaných mikročástic v roztoku absorpčního obalovacího polymeru. V závislosti na koncentraci roztoku polymeru, určeného pro obalování více mikročástic, se může počet výchozích mikročástic v obalených mikročásticích měnit od 1 do několika stovek přičemž střední průměr obalené mikročástice se pohybuje od 0,5 pm do 100 pm.
Následující způsoby se týkají přípravy obalených peptidem-nasycených a/nebo proteinem-nasycených (dále jen peptidem-nasycených) kationtoměničů (CE) nebulizací. Obalovací kopolymer, který byl zvolen, se rozpustí v rozpouštědle, jako je buď acetonitril, ethylacetát nebo ethylformiát. Pro dispergaci peptidemnasyceného CE se používá dostatečná hmotnost tohoto roztoku, tak aby hmotnostní poměr peptidem-nasyceného CE ku obalovacímu kopolymeru byla v rozmezí asi 30:70 až asi 80:20. Disperze se dosáhne vysokorychlostní homogenizací. Peptidem-nasycený kationtoměnič se disperguje v roztoku obalovacích kopolymerů v acetonitrilu nebo ethylacetátu. Koncentrace obalovacího kopolymeru v uvedeném roztoku může být od 10% do 25% (W/W) pro ethylacetát φφ φφ φ φ φ · φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ • Φ φφ
- 16 φφ • · · φ φ * φ φ · • ΦΦΦ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ ΦΦΦ φ φ φ φ φ · φ a od 12,5% do 30% (W/W) pro acetonitril, v závislosti na vlastnostech částic, které se požadují (morfologie, velikost, měrný vnitřní povrch). Roztok se homogenizuje pomocí homogenizéru, jako je Ultra-turrax T25 (IKA, Staufen, Germany) s připojenými dispergačními noži. Disperzní nože pro 10-gauge se používají pro vsázku velikosti 1 ml až 50 ml, zatímco nože 25-gauge se používají pro vsázku o velikosti 50 ml to 2,5 L. Rotační rychlost těchto dispergačních nožů se může měnit od 8 000 ot/min do 24 000 ot/min. Homogenizační/dispergační stupeň zajišťuje rovnoměrnou homogenní dispergaci polypeptidemnasyceného kationtoměniče v roztoku obalovacího polymeru bez nutnosti použít ultrazvuku nebo víření. Disperze se přivádí rychlostí mezi 1 ml/min a 10 ml/min do ultrazvukové atomizační trysky s proměnnou frekvencí - tato frekvence se může měnit od 12 kHz do 36 kHz - přičemž vyšší frekvence umožňuje vyšší průtok při dodržení stejných charakteristik částic. Disperze se takto rozprašuje do sběrného kanálu, kde se upraví alespoň 1 až 10 násobným přebytkem kapaliny jako je isopropanol nebo ethanol (vztaženo na objem rozpouštědla obalovacího kopolymerů, který byl použit) při teplotě místnosti nebo se obalí dostatečným množstvím pelet suchého ledu (obvykle 0,5 - 1 kg hmotnosti na litr IPA) tak, aby teplota kaše v průběhu nebulizace zůstala mezi -50°C a -80°C. Tato kaše se míchá při 300 až 700 ot/min, v závislosti na objemu. V případě acetonitrilu nebo ethylacetátu jako rozpouštědla rozprašované kapičky ihned poté, co se dotknou kaše, zmrznou. Když je nebulizace kompletně hotova, nechá se celý objem disperze pozvolna roztát na teplotu mezi 10°C a pokojovou teplotou a pak se vakuově zfiltruje. Filtrační koláče se zvlhčí deionizovanou vodou, aby se odstranil přebytek nerozpouštědla. Částice, získané tímto postupem, mají vzhled hladkých mikrokuliček, pokud byl však použit ve velké míře jako obalovací kopolymer dj-laktid, jsou mírně vrásčité než když jako obalovací kopolymer slouží převážně l-laktid.
φφ φφ • φ φ · φ · · φ φ φ φφφ φ φ φ φφ φφ • Φ
- 17 ΦΦ • φ φ φ • φ φ • φ φ φ φφφ φφφφ φ* φφ φφ φ * φ φ φφφφ φ φ φ φ φ ♦ φ φ φ φ φ φ ·
Vazebná kapacita mikročástice iontoměniče se dá stanovit následovně: například, pro kationtoměničovou mikročástici, kdy jde o množství dostupných karboxylových skupin v dohodnutém hmotnostním množství mikročástic, se tyto skupiny neutralizují pomocí studeného, ve vodě rozpuštěného uhličitanu sodného, přičemž se použije zředěného roztoku o známé normalitě (valární koncentraci). Neutralizované mikročástice jsou izolovány filtrací a opatrně zvlhčeny studenou deionizovanou vodou, načež se vysuší na vzduchu. V pevném stavu se pak mikročástice inkubují ve zředěném roztoku Pilokarpin hydrochloridu o známé koncentraci tak, aby byl zajištěn mírný stechiometrický přebytek zásadité účinné látky oproti předpokládané vazebné kapacitě. Koncentrace zbylého Pilokarpinu HCI ve vodném mediu se pak monitoruje tak dlouho, dokud se dají zaznamenat signfikantní změny v množství báze, zachyceném mikročásticemi. Pokud se již nedají takové změny zaznamenat, stanoví se z naměřeného úbytku procento imobilizované báze na mikročásticích a pak se toto číslo ověří elementární analýzou na dusík.
Vazná kapacita aniontoměniče (amidované částice) se stanovuje (1) elementární analýzou na dusík a (2) množstvím navázaného naproxenu měřením množství naproxenu, který částice odebraly ze zředěného roztoku pomocí HPLC. Druhá z uvedených metod se ověřuje uvolněním imobilizovaného naproxenu působením zředěného roztoku hydroxidu sodného o známé koncentraci.
Obalené mikročástice vyrobené způsobem podle vynálezu se dají podávat pacientovi známými cestami, který je odborník schopen použít, jako je parenterální podávání nebo orální podávání. Výhodně se podává jako prášek nebo suspenze cestou intranasální nebo jako inhalační prostředek přes dýchací soustavu. Pokud se podává parenterálně, je výhodné, když se použije forma disperze v
- 18 isotonickém vodném mediu nebo gelotvorném kapalném polyesteru.
• 0 «0 00 ·· 00 0« • 00 0 0 «0 0 0 00 0
000 0000 0000 • 0 000 0 000 00 ·0 ·
00 00 0 0000 0000 00 00 00 00 00 v nevodném, absorpčním
Účinné dávkování obalených mikročástic, vyrobených způsobem podle vynálezu pacientovi se dá stanovit podle uvážení lékaře nebo veterináře a je závislé na doporučeném dávkování použitého(tých) peptidu(ů) a/nebo proteinu(ů) a množství peptidu(ů) a/nebo proteinu(ů), imobilizovaném na mikročásticích. Toto dávkování je buď známé nebo se stanoví metodami, které jsou v oboru známé.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava, mikronizace a čištění polymerů glykolové kyseliny iniciace kyselinou citrónovou (PGCA), použití jako kationtoměnič (CE)
Příklad 1(a): 7/1 PGCA- Do 500 ml skleněného reaktoru bylo předloženo 242,63 g glykolidu (Purac Biochem, Arkelsedijk, The Netherlands) a 57,37 g kyseliny citrónové (Aldrich, Gillingham, Dorset, U.K.). Kyselina citrónová byla dále sušena silikagelem (Fisher Scientific, Loughborough, Leics., U.K.) v Abderhaldenově přístroji (Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Reaktor byl ponořen v olejové lázni o teplotě asi 40°C a uložen pod vákuem (0,04 mbar) po dobu asi 30 minut. Pak byla lázeň snížena a její teplota byla zvýšena na asi 110°C. Poté co byla tato teplota dosažena, byl reaktor umístěn v atmosféře bezkyslíkatého dusíku a opět ponořen do olejové lázně. Obsah byl míchán při asi 100 ot/min pomocí Heidolphova míchadla (Heidolph Elektro GmbH, Kelheim, Germany). Poté se obsah reaktoru roztavil, bylo přidáno 1,09 ml 0,1 M roztoku 2-ethylhexanoátu cinatého (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) v toluenu (Riedel de- 19 • Φ 00 00 »0 ·· 00
00 0 0 «0 · 0 ·0 »
0 0 00 0 0 00 0 0 0 000 0 00000 00 fr
00 00 0 0000 0000 <« 00 00 00 00
Haen, Seelze, Germany) (stechiometrický poměr na 50 ppm). Opět bylo přes vymrazovací past z tekutého dusíku připojeno vakuum po dobu asi 30 sekund, aby se odstranil toluen bez signfikantního úbytku monomeru. Teplota olejové lázně pak byla zvýšena na asi 120°C po dobu asi 5 minut a dále na asi 150°C. Tato teplota byla ponechána po dobu asi 4 hodin při stálém míchání při asi 100 ot/min. Tak byl získán titulní polymer.
Příklad l(b): 10/1 PGCA- Titulní polymer byl získán postupem poďe příkladu la, ale s použitím 257,40 g glykolidu, 42,60 g kyseliny citrónové a 1,10 ml 0,1 M roztoku 2-ethyl hexanoátu v toluenu (stechiometrický poměr na 50 ppm).
Příklad l(c): 15/1 PGCA- 15/1 PGCA- Do plastové nádoby, vysušené plamenem, vybavené mechanickým míchadlem a přívodem argonu, byl předložen glykolid (2,586 mol, 300 g), dále byla přidána bezvodá kyselina citrónová (0,172 mol, 33 g), a oktoát cínatý (0,2 M v toluenu, 862 ml, 0,172 mmol). Polymerační reaktor a jeho obsah byly několikrát syceny suchým argonem. Po roztavení polymerační vsázky byly reakční složky zahřátý a míchány při asi 160°C dokud se nezačal polymer z taveniny vylučovat. Krátce po částečném vyloučení polymeru bylo míchání ukončeno a v reakci se pokračovalo při asi 160°C po dobu asi 2 hodin. Na závěr polymerace byla teplota snížena na hodnotu pod 120°C a přebytek monomeru byl odstraněn za sníženého tlaku. Kompozice izolovaného polymeru byla ověřena pomocí infračervené a NMR spektroskopie.
Mikronizace - Každý z polymerů z příkladů l(a), l(b) a l(c) byl nejprve rozdrcen pomocí nožového drtiče (IKA, Staufen, Germany) a poté byly mikronizovány v mikronizeru Aljet (Fluid Energy Aljet, Pennsylvania, USA) pomocí proudu stlačeného Příklad l(a) měl střední průměr 24,84 pm podle
Plumsteadsville, suchého dusíku
- 20 ·· ·· ftft ftft ft* ftft • ftft · · ftft · · 9 · · ftft · · ftft · « ftft ft • ft ftftft ftftftft·· ftft ft ··· ft· · ft··· ·«>·# ftft ftft ftft ftft ftft analýzy pomocí zařízení Malvern Master sizer/E (Malvern, Worcs., U.K.) pomocí objemového distribučního modelu a silikonového oleje 200/5 cS (Dow Corning, Seneffe, Belgium) jako dispergačního prostředku. Příklady l(b) a l(c) měly po mikronizaci střední průměr částic 4,69 pm a 6,31 pm.
Čištění a příprava soli- Padesát gramů produktů z příkladů 1(a), l(b) a l(c) bylo dispergováno v 2 I acetonu (Riedel de-Haen, Seelze, Germany) a umístěno v ultrazvukovém zařízení (Branson Uftrasonics BV, Soest, The Netherlands) po dobu asi 30 minut. V průběhu této doby byla disperze také homogenizována při asi 9 500 ot/min pomocí homogenizeru Ultra-turrax T25 (IKA, Staufen, Germany). Po tomto ultrazvukovém homogenizačním stupni byla disperze odstředěna při asi 5 000 ot/min po dobu asi 30 minut v odstředivce Sorvall (Sorvall, Wilmington, Delaware, USA). Supernatant byl odstraněn, odstředěné podíly byly resuspendovány v čerstvém acetonu a ultrazvuková homogenizace byla opakována. Když bylo druhé odstředění ukončeno, supernatant byl odstraněn a odstředěná sraženina byla resuspendována v deionizované vodě. Poté byl proveden ještě jeden finální ultrazvukový homogenizační stupeň, aby se odstranily veškeré zbytky acetonu a disperze byla ještě jednou odstředěna při asi 5 000 ot/min po dobu asi 30 minut.
Odstředěné sraženiny byly resuspendovány v čerstvé deionizované vodě a pH disperze bylo monitorováno, načež byl přidán dostatečný objem 0,2 M roztoku uhličitanu sodného (se současným mícháním), aby se zvýšilo pH na hodnotu mezi asi pH 8 a asi pH 9. Disperze pak byly ponechány pod mícháním po dobu asi 30 minut a pak byly vakuově zfiltrovány přes filtrační papír Whatman č. 1 (průměr 24 cm) (Whatman Intl. Ltd., Maidstone, Kent, U.K.). Filtrační koláče byly zvlhčeny další deionizovanou vodou, zmrazený a lyofilizovány
99 44 44
4 » · 4 4 4
9 4 9 4 4 4
499499 9 4 4
9 4 4 4 9
94 44 ·» ··
9 9 »4 44 • fcfc v lyofilizačním zařízení Edwards SuperModulyo Lyophilizer (Edwards, Crawley, West Sussex, U.K.).
Čistota byla monitorována diferenciální kalorimetrií (DSC) pomocí zařízení TA DSC912S (TA Instruments, New Castle, Delaware, USA) s rychlostí zvyšování teploty 10 °C/min. Získané DSC thermogramy ani v jednom případě nevykazovaly endotermní pík pro monomerní glykolid, ale vykazovaly endotermy při 176°C, 178°C, a 180°C (uvedeno v pořadí příkladů l(a), l(b) a l(c)).
Příklad II
Příprava mikročásticového kationtoměniče na bázi kopolymerů glykolid/kyselina jablečná PGMA
Titulní mikročástice byly syntetizovány způsobem popsaným v příkladu l(c) avšak s použitím glykolidu (2,586 mol, 300 g), bezvodé kyseliny jablečné (0,172 mol, 23 g), oktoátu cínatého (0,2 M v toluenu, 862ml, 0,172 mmol). Diferenciální kalorimetrií, která byla použita, bylo zjištěno, že polymer má teplotu tání (t.t. = 206°C ) .
Pevný polymer byl rozdrcen, aby se dosáhlo středního průměru částic asi 125 pm. Při tom bylo použito mlýna Wiley. Další zmenšení velikosti částic na průměr asi 5-10 pm bylo dosaženo tryskovým mlýnem pomocí stlačeného suchého. Výsledné mikročástice byly zvlhčeny acetonem, aby se odstranily stopy monomeru a nízkomolekulárních oligomerů. Produkt pak byl až do dalšího zpracování sušen za sníženého tlaku při 40°C. Střední průměr suchých mikročástic byl stanoven pomocí analyzátoru velikosti části.
- 22 • · ·· ·· ·· ·· ···« ΦΦΦΦ φ Φ Φ «
ΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ φ Φ Φ • · Φ * · Φ ··· · Φ Φ φ Φ • ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ φ Φ
Φ··· ΦΦ Φ· ΦΦ ·· ΦΦ
Příklad III
Příprava, mikronizace a čištění polymeru glykolové kyseliny iniciace kyselinou vinnou (PGTA), pro použití jako kationtoměnič (CE)
Příklad lll(a): 10/1 PGTA- Do 500 ml skleněného reaktoru bylo předloženo 264,65 g glykolidu (Purac Biochem, Arkelsedijk, The Netherlands) a 34,22 g L-kyseliny vinné (Riedel de-Haen, Seelze, Germany). Kyselina vinná byla dále sušena silikagelem (Fisher Scientific, Loughborough, Leics., U.K.) v Abderhaldenově přístroji (Aldrich, St. Louis, MO). Reaktor byl ponořen do olejové lázně při asi 40°C a bylo připojeno vakuum (0,04 mbar) po dobu asi 30 minut. Lázeň pak byla odstavena a její teplota byla zvýšena na asi 110°C. Když teplota lázně dosáhla této hodnoty, reaktor byl umístěn do atmosféry bezkyslíkatého dusíku znovu ponořen. Obsahy byly míchány při asi 100 ot/min pomocí Heidolfova míchadla (Heidolph Elektro GmbH, Kelheim, Germany). Když se obsah reaktoru roztavil, bylo přidáno 1,14 ml 0,1 M roztoku 2-ethylhexanoátu cínatého (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) v toluenu (Riedel de-Haen, Seelze, Germany) (stechiometrický poměr 50 ppm). Opět bylo připojeno vakuum přes vymrazovací past z kapalného dusíku po dobu asi 30 sekund, aby se odstranil všechen toluen bez signifikantního úbytku monomeru. Teplota olejové lázně pak byla zvýšena na asi 120°C po dobu asi 5 minut a poté byla zvýšena na asi 150°C. Tato teplota byla udržována po dobu asi 4 hodin při konstantním mechanickém míchání rychlostí asi 100 ot/min. Takto byl získán titulní polymer.
Mikronizace- Produkt z příkladu lll(a) byl nejdříve rozdrcen pomocí nožů (IKA, Staufen, Germany) a pak byl mikronizován v Aljetově
Mikronizeru (Fluid Energy Aljet, Plumsteadsville, Pennsylvania,
USA) pomocí proudu stlačeného suchého dusíku. Tento postup • · ··· · ι» • ·
- 23 poskytl střední průměr částic 12,42 pm podle analysy v zařízení Malvern Mastersizer/E (Malvern, Worcs., U.K.), využívající objemový distribuční model a silikonový olej 200/5 cS (Dow Corning, Seneffe, Belgium) jako dispergant.
Čištění a příprava sodné soli- 50 g produktu z příkladu lll(a) bylo dispergováno ve 2 I acetonu (Riedei de-Haen) a umístěno v ultrazvukovém zařízení (Branson Uftrasonics BV, Soest, The Netherlands) po dobu asi 30 minut. V průběhu této doby byla disperze také homogenizována při asi 9 500 ot/min pomocí homogenizeru Ultra-turrax T25 (IKA, Staufen, Germany). Po tomto ultrazvukovém a homogenizačním byla disperze odstředěna při asi 5,000 ot/min po dobu asi 30 minut na odstředivce Sorvall (Sorvall, Wilmington, Delaware, USA). Supernatant byl odstraněn, odstředěná sraženina resuspendována v čerstvém acetonu a ultrazvukový/homogenizační stupeň byl zopakován. Po ukončení druhého odstředění byl supernatant odstraněn a sraženina byla resuspendována v deionizované vodě. Pak byl proveden ještě jeden finální ultrazvukový/ homogenizační stupeň, aby se odstranil veškerý zbývající aceton a disperze byla ještě jednou odstředěna při asi 5 000 ot/min po dobu asi 30 minut.
Odstředěná sraženina byla resuspendována v čerstvé deionizované vodě a pH disperze bylo monitorováno, načež byl přidán v dostatečném objemu 0,2 M roztok uhličitanu sodného, aby se zvýšilo pH na hodnotu mezi asi pH 8 a asi pH 9. Disperze byla ponechána míchat po dobu asi 30 minut, a poté vakuově zfiltrována přes filtrační papír Whatman č. 1 (průměr 24 cm) (Whatman Intl. Ltd., Maidstone, Kent, U.K.). Filtrační koláč byl zvlhčen další deionizovanou vodou, zmrazen a lyofilizován v zařízení Edwards SuperModulyo Lyophilizer (Edwards, Crawley, West Sussex, U.K.).
• 0
- 24 • · 0 0 ·· 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · ·* 0 0 00 · 0 ·· ·
0 0 0 0 0 000 0 0 0 0 ·
0 0 00 0 0000 0000 00 00 00 00 · ·
Čištění bylo monitorováno pomocí DSC s použitím zařízení TA DSC912S (TA Instruments New Castle, Delaware, USA) s teplotním gradientem 10°C/min. DSC thermogram, který byl takto získán, nevykazoval žádné endotermní píky pro monomerní glykolid, ale vykazoval endoterm při 181 °C .
Příklad IV(b): 15/1 PGTA- Titulní polymer byl syntetizován způsobem popsaným v příkladu l(c), ale s použitím glykolidu (2,586 mol, 300 g), bezvodé kyseliny vinné (0,172 mol, 26,8 g) a oktoátu cínatého (0,2 M v toluenu, 862 ml, .0172 mmol). Diferenciální kalorimetrií, která byla použita pro stanovení teplota tání polymeru, byla naměřena teplota tání (t.t. = 204°C).
Pevný polymer byl rozdrcen aby se dosáhlo středního průměru částic asi 125 pm pomocí mlýnku Wiley. Další zmenšení velikosti částic, a to na velikost průměru asi 5-10 pm byla dosažena pomocí tryskového mlýna, který používá stlačený suchý dusík. Výsledné mikročástice byly zvlhčeny acetonem, aby se odstranily veškeré zbytky monomeru a nízkomolekulárních oligomerů. Tento produkt pak byl sušen za sníženého tlaku při asi 40°C až do dalšího použití. Střední průměr suchých mikročástic byl pak stanoven pomocí analyzátoru velikosti částic.
Příklad IV
Příprava mikročástic na bázi polyglykolidového aniontoměniče (AE-1)
Příprava aniontoměniče se dosáhne ve dvou stupních.
První, nízkomolekuiární polyglykolid se připravuje s použitím postupů podobných, jako jsou popsány v příkladu l(c), ale s použitím následující polymerační vsázky: glykolid (1 mol, 116 g), 1,3• ·
- 25 ·· ·· ·· ·· • · · · · ·»·· • · · · · · · · * • · · · ····· ·· · • · · · · · · ·
I) ·· ·· ·· propandiol jako iniciátor (30 mmol, 2,22 g) a oktoát cínatý (0,03 mmol). Redukce velikosti částic a čištění polymeru se pak provedla, jak je také popsáno v příkladu l(c). Ve druhém kroku se prakticky neiontové mikročástice jsou inkubují v roztoku za horka (~80°C) rozpuštěného diaminu, například diaminohexanu, známé koncentrace v dioxanu pod argonem. Koncentrace diaminu v dioxanu se stanovuje acidimetrií. Když reakce prakticky přestala probíhat, amidované mikročástice byly separovány filtrací, zvlhčeny dioxanem, a sušeny za sníženého tlaku. Vazná kapacita aniontoměniče (amidované částice) se stanovuje: (1) elementární analýzou na dusík a (2) množstvím navázaného naproxenu měřením množství této účinné látky, pohlcené ze zředěného roztoku podle HPLC. Poslední uvedený údaj se potvrdí uvolněním imobilizovaného naproxenu pomocí zředěného roztoku hydroxidu sodného známé koncentrace
Příklad V
Příprava laktid-glykolidových kopolymerů iniciovaná propandioiem (PLGPD) pro použití jako obalovacích materiálů
Příklad V(a): 75/25 P(I)LGPD- Do 500 ml skleněného reaktoru bylo předloženo 235,01 g 1 -laktidu (Purac Biochem, Arkelsedijk, The Netherlands), 63,09 g glykolidu (Purac Biochem, Arkelsedijk, The Netherlands) a 1,90 g propandiolu (Riedel de-haen, Seelze, Germany) a pak 3,96 ml 0,1 M roztoku 2-ethyl-hexanoátu cínatého (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) v toluenu (Riedel de-haen, Seelze, Germany) (stechiometricky na 200 ppm). Po vysušení pod vákuem po dobu asi jedné hodiny pro odstranění toluenu byl reaktor umístěn pod atmosféru bezkyslíkatého dusíku a ponořen do olejové lázně, předehřáté na asi 160°C. Obsah reaktoru byl míchán při asi 100 ot/min pomocí míchadla Heidolphova (Heidolph Elektro GmbH, Kelheim, Germany). Když se obsah roztavil, teplota byla zvýšena na • · · ·
- 26 asi 180°C a udržována na této hodnotě po dobu asi 3 hodin. Tímto způsobem byl získán amorfní kopolymer. U kopolymeru byla zjištěna molekulová hmotnost (MW) asi 12 500 g/mol, přičemž bylo použito gelové permeační chromatografie (GPC), která se prováděla pomocí následujícího zařízení: čerpadlo Waters 510, (Waters 410), diferenciální refraktometr Waters (Waters, Milford, Massachusetts, USA) s detekcí rozptylu světla detektorem Wyatt Mnidawn Light Scattering Detector (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California, USA).
Příklad V(b): 90/10 P(I)LGPD- Titulní produkt byl syntetizován postupem jako v příkladu V(a), ale s použitím 274,31 g l-laktidu, 24,55 g glykolidu, 1,14 g propandiolu a 3,89 ml 0,1 M roztoku 2-ethylhexanoátu v toluenu (stechiometrický poměr na 200 ppm). Byl získán krystalický kopolymer. Získaný kopolymer měl podle analýzy GPC molekulovou asi 20,780 g/mol.
Příklad V(c): 90/10 P(d,l)LGPD- Titulní produkt následujícího příkladu V(a), ale s použitím 274,31 g d,l-laktidu, 24,55 g glykolidu, 1,14 g propandiolu a 3,86 ml a 0,1 M roztoku 2-ethyl-hexanoátu cínatého v toluenu (stechiometrický poměr pro 200 ppm). Byl získán amorfní kopolymer. Získaný kopolymer měl molekulovou hmotnost asi 20,650 g/mol podle analýzy, provedené GPC.
Příklad V(d): Kopolymer l-laktidu a d,l-laktidu, iniciace propandiolem (PLGPD), použití jako povlékací materiál, 80/20 P(l)L(d,l)LPD
Titulní produkt byl získán postupem podle příkladu V(a), ale s použitím 239,09 g l-laktidu, 59,77 g d,l-laktidu (Purac Biochem,
Arkelsedijk, The Netherlands) a 1,14 g propandiolu a bylo přidáno
3,96 ml 0,1 M roztoku 2-ethylhexanoátu cínatého v toluenu
- 27 • · ·· ·· · · · · • · · · ♦··· · * ♦ · • · · · · · ft · ftft · • · ftftft · ftftft · · ftft · ··· ftft · «ftftft ···· ftft ·· ·· « · ftft (stechiometrický poměr, 200 ppm). Byl získán amorfní kopolymer. Kopolymer měl molekulovou hmotnost (Mw) 22,320 g/mol, což bylo stanoveno analýzou pomocí GPC. Vykazoval skelný přechod při 48°C a DSC.
Čištění- Produkty z příkladů V(a), V(b) a V(c) byly nebulizací 30% (hmot/hmot) roztoku v acetonitrilu (Labscan, Dublin, Ireland) uvedeny rychlostí 8 ml/min uvedeny do deionizované vody, ochlazené na asi 2°C v 6 I reaktoru s vyhřívaným pláštěm, napojeným oběhem na lázeň, míchaném asi 350 ot/min míchadlem Heidolph (Heidolph Elektro GmbH, Kelheim, Germany). Roztoky byly uvedeny do atomizační trysky Vibra-Cell VC 50 (Bioblock, lllkirch, France) pomocí čerpadla Masterflex (Cole Parmer Instrument Co., Niles, Illinois, USA) a nebulizace bylo dosaženo při ultrazvukové frekvenci 12 kHz. Získané disperze byly filtrovány přes filtrační papíry Whatman č.1 (průměr 24cm) (Whatman Intl. Ltd., Maidstone, Kent, U.K.) a filtrační koláče byly zvlhčeny deionizovanou vodou, zmrazený a lyofilizovány v zařízení Edwards SuperModulyo Lyophilizer (Edwards, Crawley, West Sussex, U.K.).
Čistota byla potvrzena DSC s použitím TA DSC912 (TA Instruments, New Castle, Delaware, USA) s teplotním gradientem 10°C/min, při kterém byly nalezeny u produktů příkladů V(a), V(b), V(c) a V(d) teploty skelného přechodu (Tg) při 44°C, 49°C, 45°C a 48°C.
Příklad VI
Příprava peptidem syceného kationtoměniče
Příklad Vl(a): Sycení peptidem A (p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-TrpLeu-Arg-Pro-Gly-NH2, LHRH analog)- Čtyři gramy sodné soli
- 28 99 ·· ·· ·· • · · · · · ♦ ft • ftft· ft··· ft ft ftftft·· ·· · • · · ftftftft • ft ftft ·· ·· každého z produktů příkladů l(a), l(b), l(c) a 11(a) byly dispergovány v roztocích, obsahujících 1,33 g peptidu A (Kinerton Ltd., Dublin, Ireland) ve formě volné báze, rozpuštěného v 70 ml deionizované vody. Disperze byly inkubovány při pokojové teplotě za míchání po dobu asi 2 hodin a poté zfiltrovány přes filtrační papír Whatman č.1 o průměru 9 cm (Whatman intl. Ltd., Maidstone, Kent, U.K.). Filtrační koláče byly zvlhčeny další deionizovanou vodou, zmrazený a lyofilizovány v zařízení Edwards SuperModulyo (Edwards, Crawley, West Sussex, U.K.). Vzorky pak byly analyzovány na obsah dusíku elementární analýzou, aby se stanovilo množství peptidu A, která byl navázán. Byly získány následující výsledky:
Příklad CE Příklad-# CE p olymer Navázaný Peptid A hmot. %
Vl(a)(i) l(a) 7/1 PGCA 24,52%
Vl(a)(ii) l(b) 10/1 PGCA 12,60%
Vl(a)(iii) l(c) 15/1 PGCA 19,29%
Vl(a)(iv) lll(a) 10/1 PGTA 17,60%
Příklad Vl(b): Sycení peptidem B (Η-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-LysVal-CysThr-NH2, dva zbytky Cys jsou vázány disulfidickou vazbou, analog somatostatinu)- Postupem podle příkladu Vl(b) a s použitím 4 g sodné soli každého z produktů z příkladů l(a), l(b), l(c) a ll(a) a 1,33 g peptidu B ve formě volné báze (Kinerton Ltd., Dublin, Ireland) byly získány vázané mikročástice z příkladů l(a), l(b) a l(c) s imobilizovaným peptidem B. Vzorky byly analyzovány na obsah dusíku elementární analýzou, aby se zjistilo množství vázaného peptidu B vázán. Získané výsledky jsou uvedeny dále:
• 9
- 29 • » · 9 · «· · · * » · • · · 9 · · · · 9 · · ·· · · · · 9 9 · · · 9 * 9
9 9 · · 9 9 9 · 9
9999 99 ·9 «9 ·· 99
Příklad CE Příklad-# CE polymer navázaný peptid B hmotn. %
Vl(a)(i) l(a) 7/1 PGGA 25,20%
Vl(a)(ii) l(b) 10/1 PGGA 13,10%
Vl(a)(iii) l(c) 15/1 PGCA 19,64%
Vl(a)(iv) lll(a) 10/1 PGTA 14,23%
Příklad VII
Příprava obaleného polypeptidem nasyceného kationtoměniče nebulizací
Polypeptidem nasycené kationtoměniče byly dispergovány v roztocích obalovacích kopolymerů v acetonitrilu (Labscan, Dublin, Ireland), uvedených dále. Tato dispergace byla dosažena homogenizací na zařízení Ultra-turrax T25 (IKA, Staufen, Germany) při asi 9 500 ot/min po dobu asi 5 minut. Koncentrace obalovacího kopolymeru v acetonitrilových roztocích se pohybovala od 12,5% do 25% (hmotn./hmotn.) a poměr obalovacího kopolymeru ku polypeptidem nasycenému kationtoměniči se pohyboval od 1:1 do 1,3:1 hmotnostně.
Po dispergaci byla disperze přiváděna do atomizační trysky Vibra-Cell VC50 (Bioblock, lllkirch, France) s ultrazvukovou frekvencí 16 kHz s použitím čerpadla s keramickým pístem (FMI, Oyster Bay, N.Y., USA) nastaveného na průtok 2 ml/min. Pro dosažení nebulizace byla disperze tryskou zaváděna do isopropyl alkoholu (IPA) (Labscan, Dublin, Ireland) chlazeného na asi -80°C přidáváním pelet suchého ledu (A.LG., Dublin, Ireland). IPA působil jako sběrné nerozpouštědlo a byl míchán při asi 300 ot/min s použitím
- 30 «· «« · · · · φ e ·· • · Φ Φ · 4 · · · ♦ · · • · · · · ♦ Φ · ·· * φ · ΦΦΦ Φ ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ Φ φφφ ΦΦ Φ ΦΦΦΦ
ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ Φ· Φ· míchadla Heidolph (Heidolph Elektro GmbH, Keíheim, Germany). Po ukončení nebulizace byla veškerá disperze ponechána ohřát na teplotu mezi asi 10°C a asi pokojovou teplotou. Obalené mikročástice pak byly odděleny vakuovou filtrací přes filtrační papír Whatman č.1 (Whatman Intl. Ltd., Maidstone, Kent, U.K.). Filtrační koláč byl zvlhčen deionizovanou vodou, zmrazen a lyofilizován lyofilizačním zařízení Edwards SuperModulyo Lyophilizer (Edwards, Crawley, West Sussex, U.K.). Získané obalené mikročástice byly analyzovány na velikost pomocí zařízení Malvern Mastersizer/E (Malvern, Worcs., U.K.) a bylo přidáno 1 % Tweenu 20 ve vodě jako disperzantu. Obalené mikročástice byly také analyzovány na obsah dusíku elementární analýzou, aby se stanovil obsah peptidu. Dále uvedená tabulka uvádí výsledky různých obalovacích experimentů, které byly provedeny.
Příklad - # Peptidem sycený CE Příklad - # Obalující kopolymer Příklad - # Konc. (hm./hm.) obalujícího kopolymerů v acetonitrilu Obalující kopolymer / peptidem sycený CE Střední průměr částic hmot. % nasycení peptidem
VÍI(aT~ “VRW 24,31% 1:1 Ι22,ΐ4μτη 5,38% Peptid A
VlffbT- Vl(a)(ii) 7(5) 22,41% 1:1 120,15μίΤϊ Peptid A
WT Vl(a)(iii) ^(5) 1:1 79,30μτη 7,76% Peptid A
vii(d) Vl(a)(iii) 7(5) 72^5% 1:1 77,85μτη 8 93% Peptid A
Vlffe)“ Vl(a)(ív)' ^č) 14,95% 1:1 136,74μΠΊ 8,75% Peptid A
VllífT ' VIWT 7(č) 14,92% 80,59μίη 10,31% Peptid A
Vll(g) 7(a) 25,37% 1:1 140,58um 2^3% Peptid B
Vll(h) Vl(b)(ii) 7(5) 20% Τ/ΓΈΠ 96,77μτη 5^3% Peptid B
VllW” Vl(b)fiii) 7(5) T2^% 1:1 102,5ΰμτη 7/69% ” Peptid B
—W“ vi(b)(iií) Tjč) T£5% 1:1 83,72μτη 7/90% Peptid B
VI(5)W 7(č) 14,95% 1:1 135.14μη 6.69% Peptid B
Vll(l> VIW V(c) 14,92% Γ25Ί 123.13μτη 10,11% “ Peptid B
• 0 • · • · • · ·
0
Produkty všech příkladů byly před testováním in vivo a/nebo in vitro přesévány přes síto 180 pm (Bioblock, rilkir^h, France).
Vázané mikročástice nebo obalené mikročástice se dají testovat in vitro, aby se stanovila rychlost uvolňování vázaného peptidů nebo vázaného proteinu následující metodou. Alikvotní díl vázaných mikročástic nebo obalených mikročástic o hmotnosti asi 50 mg se umístí v kontinuálním systému s průtočnou kyvetou, kde přes celou hmotu vázaných nebo povlečených mikročástic protéká roztok fosfátového pufru o pH asi 7,2 při asi 37°C rychlostí asi 45 ml/hodinu. Vzorky pufru obsahující uvolňovanou účinnou látku se odebírají při asi 4°C a analyzují se na koncentraci peptidů nebo proteinu asi po 1- nebo 2-denních intervalech. Profil uvolňování každé mikročástice se měří po dobu 2 týdnů.
A vázané mikročástice nebo obalené mikročástice se mohou testovat na rychlost uvolňování vázaného peptidů nebo vázaného proteinu in vivo následující metodou. Vzorky se podávají samcům kryse Wistar (Bioresources, Trinity College, Dublin, Ireland) intramuskulární injekcí do stehna. Suspenzní prostředí je tvořono 3 % karboxymethylcelulozy a 1 % Tweenu 20 ve slaném roztoku. Pro vzorky s navázaným peptidem A je účinná ekvivalentní dávka 40 pc/kg/den. Dávky pro vzorky s navázaným peptidem B je 1 mg/kg/den. Odběr vzorků se provádí punkcí ze srdce a hladiny peptidů v plasmě se monitorují radioimunotestem (RIA) specifickým pro peptid A a peptid Β. V případě vzorků s navázaným peptidem A (peptid A je analog LHRH) se pro sledování snížení hladiny testosteronu používá testosteron RIA. Jako alternativa se může v některých případech použít suspenzní prostředí, založené na gelotvorných látkách. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách A a B, které následují dále.
- 32 • Φ «· φφ ·Φ ·· φφ • φ φ φ φ · · φ 0 » · φ φ φ · φ φφ · · · · φ φ φ « φ φ ♦···«♦ φ φ · φφφ φφ φ φφφφ φφφφ φφ φφφφ φφ φφ
Tabulka Α
Peptid A Příklady Peptid A (>150 pg/ml) Dny Testosteron (<1 ng/ml) Dny
Vll(a) 20' --
WS 10 -
Vll(c) 2 11
WI 2 --
Vll(e) 2 -π-
w 2 16
Vll(a) v gelové formě 25 -Ή-
Tabulka Β
Peptid A Příklady Peptid B (>1000 pg/ml) Dny
W) Nebylo testováno
W) Nebylo testováno
w Nebylo testováno
w 15
- wr 10
w 10
Příklad VIII
Vlll(a): Nebulizace s použitím acetonitrilu jako rozpouštědla při pokojové teplotě, IPA jako nerozpouštědlo
Asi 1,06 g kationtoměniče z příkladu l(c) (nevázán na polypeptid) bylo dispergováno v 25,24% (hmotn./hmotn.) roztoku obalovacího kopolymerů podle příkladu V(a) v acetonitrilu (Labscan, • fc fcfc fcfc fcfc fcfc • fcfc · fc fcfc fc · fcfc fc fcfcfc fcfcfc* fcfcfcfc • fc · · fc · fcfcfcfcfc fcfc · • ·· fcfc · fc··· •••fcfcfc fcfc fcfc fcfc fcfc
- 33 Dublin, Ireland) v hmotnostním poměru iontoměnič ku obalovací kopolymer asi 1,03:1. Dispergace byla v tomto případě dosažena homogenizací Ultra-turraxem T25 (IKA, Staufen, Germany) při asi 9 500 ot/min po dobu asi 5 minut.
Po dispergaci byla disperze zaváděna do atomizační trysky Vibra-Cell VC50 (Bioblock, lllkirch, France) s ultrazvukovou frekvencí 16 kHz pomocí čerpadla s keramickým pístem (FMI, Oyster Bay, N.Y., U.S.A.) nastaveného na průtok 2 ml/min. Před zaváděním do trysky byla disperze nebulizována s IPA (Labscan, Dublin, Ireland) při pokojové teplotě (17 až 22°C). Tento IPA působil jako sběrné nerozpouštědlo a byla 300 ot/min s použitím míchadla Heidolph (Heidolph Elektro GmbH, Kelheim, Germany). Po ukončení nebulizace byla disperze ponechána míchat po dobu dalších cca 60 minut při pokojové teplotě před obalením byly částice odděleny vakuovou filtrací přes filtrační papír Whatman č. 1 (Whatman Intl. Ltd., Maidstone, Kent, U.K.). Filtrační koláč byl zvlhčen deionizovanou vodou, zmrazen a lyofilizován v zařízení Edwards SuperModufyo lyophilizer (Edwards, Crawley, West Sussex, U.K.). Získané částice byly analyzovány na velikost pomocí zeřízení Malvern Mastersizer/E (Malvern, Wora., U.K.) a 1 % Tweenu 20 ve vodě jako dispergantem. Výsledné částice měly střední velikost (d(0,5)) = 84,75 pm
Vlff(b): Nebulizace s použitím ethylacetátu jako rozpouštědla při pokojové teplotě, IPA jako nerozpouštědlo
Nebulizace byla provedena v podstatě podle příkladu Vlll(a), ale s použitím asi 0,99 g kationtoměniče z příkladu 1(c) (nenavázaného na polypeptid) dispergovaného v 24,88% (hmotn./hmotn.) roztoku obalovací kopolymerů z příkladu V(a) v ethylacetátu (Riedel-de Haen, Seelze, Germany) v takovém množství, aby poměr kationtoměniče ku obalovacímu kopolymerů byl asi 0,96:1
0 0
- 34 0 0 0 ••00 00 • 0 00 00 ·· • 0 · · ·· »
0 0 0 0 0 · • 000 < 0 0 0 <
• · 0 0 0 0 0 • 0 00 00 00 hmotnostně. Výsledné částice měly střední velikost (d(0,5)) =
100,56 pm
Vlll(c): Nebulizace s použitím ethylacetátu jako rozpouštědla a vyšší frekvence sondy
Asi 1,02 g kationtoměniče z příkladu 1 (c) (nenavázaného na polypeptid) bylo dispergováno v 15,14% (hmotn./hmotn.) roztoku obalovacího kopolymerů z příkladu V(a) v ethylacetátu (Riedel-de Hnen) v takovém množství, aby hmotnostní poměr kationtoměniče ku obalovacímu kopolymerů byl asi 1,05:1. Tato dispergace byla provedena homogenizací Ultra-turraxem T25 (IKA, Staufen, Germany) při asi 9 500 ot/min po dobu asi 5 minut.
Po dispergaci byla disperze zavedena do nebulizéru Martin Walter 400 GSIP nebulizer (Sodeva, Le Bouget du Lac, France) s ultrazvukovou frekvencí nastavenou na asi 34,6 kHz s použitím čerpadla s keramickým pístem (FMI, Oyster Bay, N.Y., U.S.A.) nastaveným na 5 ml/min. Po průchodu tryskou byla disperze nebulizována do IPA (Labscan, Dublin, Ireland) ochlazeného na asi -77° přidáním suchých ledových pelet (A.I.G., Dublin, Ireland). Tento IPA působil jako sběrné nerozpouštědlo a byl míchán při 300 ot/min s Domoci míchadla Heidolph (Heidolph Elektro GmbH, Kelheim, Germany). Připravené nebulizované povlečené částice byly odděleny vakuovou filtrací přes filtrační papír Whatman č. 1 (Whatman Intl. Ltd., Maidstone, Kent, U.K.). Filtrační koláč byl zvlhčen deionizovanou vodou, zmrazen a lyofílizován v zařízení Edwards SuperModulyo lyophilizer (Edwards, Crawley, West Sussex, U.K.). Výsledné částice byly analyzovány na velikost pomocí zařízení Malvem Masterizer/E (Malvern, Worcs., U.K.) a 1 % Tweenu 20 ve vodě jako dispergantu. Výsledné částice měly střední velikost (d(0,5)) = 95,69 pm.
- 35 • ti • ti • ti ·· ·· ·· titi • •titi titititi • tititi «tititi ti ti tititi titi titi ti • ti ti ti ti · ti • ti ·· · · titi
Příklad IX
Navázání somatostatinových analogů - peptidu C a D na CE a následné obalení
IX(a): Nasycení peptidem C
Asi 1,01g sodné soli produktu příkladu 1(c), dispergovaného v roztoku, obsahujícím 0,25 g volné báze peptidu C, se strukturou: N-hydroxyethylpiperazinyl-acetyl-D-Phe-Cys-Tyr-D-TrpLys-Abu-Cys-Thr-NH2 kde dva Cys zbytky jsou vázány disulfidickou vazbou (Kinerton Ltd., Dublin, Ireland) ve 40 ml deionizované vody. Takto získaná disperze byla inkubována pod mícháním po dobu asi 2 hodin a poté zfiltrována přes filtrační papír Whatman č. 1 o průměru 9 cm (Whatman Intl. Ltd., Maidstone, Kent, U.K.). Filtrační koláč byl zvlhčen další deionizovanou vodou, zmrazen a lyofilizován pomocí Ec'wards SuperModulyo (Edwards, Crawley, West Sussex. U.K.). Pak byl vzorek poslán na analýzu obsahu dusíku, aby se stanovilo množství vázaného peptidu, které bylo 20,21 %.
IX(b): Sycení peptidem D
Pomocí postupu podle příkladu IX(á) ale s použitím asi 2,04 g sodné soli produktu z příkladu l(c), dispergovaného v roztoku obsahujícím 0,51 g peptidu D ve formě volné báze, přičemž tento peptid měl strukturu: N-hydroxyethylpiperazinyl-ethylsulfonyl-PheCys-Tyr-D-TrpLys-Abu-Cys-Thr-NFk kde dva Cys zbytky jsou vázány disulfidickou vazbou (Kinerton Ltd., Dublin, Ireland) rozpuštěný v 80 ml. Vzorek pak byl poslán na analýzu dusíku, aby bylo stanoveno ne vázané množství peptidu, které bylo 19,53%.

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob výroby obalené vázané mikročástice nebo obalených vázaných mikročástic, přičemž obalená vázaná mikročástice nebo obalené vázané mikročástice obsahují vázanou mikročástici nebo vázané mikročástice a absorpční obalující polymer, kde vázaná mikročástice nebo každá z mikročástic obsahuje absorpční polymerní jádro s heterořetězcem a na něm alespoň jeden imobilizovaný peptid a alespoň jeden imobilizovaný protein nebo jejich imobilizovanou kombinaci, přičemž uvedený peptid je nezávisle zvolen ze souboru, do kterého patří růstový hormon-uvolňující peptid (GHRP), luteinizační hormon-uvolňující hormon (LHRH), somatostatin, bombesin, gastrin uvolňující peptid (GRP), kalcitonin, bradykinin, galanin, melanocyt stimulující hormon (MSH), růstový hormon uvolňující faktor (GRF), amylin, tachykininy, sekretin, parathyroidní hormon (PTH), enkafelin, endothelin, kalcitoninový gen uvolňující peptid (CGRP), neuromedíny, protein spojený s parathyroidním hormonem (PTHrP), glukagon, neurotensin, adrenokortikotropní hormon (ACTH), peptid YY (PYY), glukagon uvolňující peptid (GLP), vasoaktivní intestinální peptid (VIP), peptid aktivující adenylátcyklázu podvěsku mozkového (PACAP), motilin, substance P, neuropeptid Y (NPY), TSH a jeho analogy a fragmenty nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z jmenovaných látek; a kde protein je nezávisle vybrán ze souboru, do něhož patří růstový hormon, erytropoietin, stimulační faktor granulocytu tračníku, stimulační faktor granulocytového makrofágu tračníku a interferony;
    • ♦
    - 38 9 9 99
    9 9 9
    9 9 9 9
    9 9 9
    9 999 99
    99 ·· ·· 99
    9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 9
    9 999999 99 9
    9 9 9 9 9 9 9
    99 99 99 99 přičemž uvedený způsob zahrnuje následující kroky:
    získání disperze s obsahem pevných vázaných mikročástic v roztoku absorpčního obalujícího polymeru, homogenizací a současnou dispergaci uvedených pevných vázaných mikročástic do roztoku absorpčního obalujícího polymeru; a nebulizaci uvedené disperze nebulizační sondou, která pracuje při ultrazvukové frekvenci v rozmezí 12 kHz až 36 kHz, do media, které není rozpouštědlem pro uvedený absorpční obalující polymer, při průtoku asi 1ml/min až 15 ml/min.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že medium zahrnuje isopropanol nebo ethanol.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že roztok absorpčního polymeru obsahuje 5% až 30% absorpčního polymeru a teplota media je pokojová teplota až asi -80°C .
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid, peptidy, protein, proteiny nebo jejich kombinace ve vázané mikročástici tvoří 0,1 % až 30 % celkové hmotnosti vázané mikročástice.
  5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že absorpční polymerní jádro obsahuje glykolátové jednotky a citrátové zbytky, přičemž poměr glykolátových jednotek ku citrátovým zbytkům je asi 7-1 až asi 20-1 nebo glykolátové jednotky a vinanové zbytky, přičemž poměr glykolátových jednotek ku vinanovým zbytkům je asi
    - 39 • a «· ·* ♦*
    0 · 0 0 «00« 0
    0« 0' « 00 * · • · 000 «00000 00 0 0 00 00 0 0000 000« 0« «· 0· ·· ··
    7-1 až asi 20-1 nebo glykolátové jednotky a jablečnanové zbytky, přičemž poměr glykolátových jednotek ku jablečnanovým zbytkům je asi 7-1 až asi 20-1.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že absorpční obalující polymer obsahuje (a) jednotky na bázi l-laktidu a jednotky na bázi glykolidu, přičemž poměr jednotek na bázi l-laktidu ku jednotkám na bázi glykolidu je asi 60:40 až asi 90:10, (b) jednotky na bázi d,l-laktidu a jednotky na bázi glykolidu, přičemž poměr jednotek na bázi d,l-laktidu ku jednotkám na bázi glykolidu je asi 60:40 až asi 90:10, (c) jednotky na bázi d,l-laktidu a (d) jednotky na bázi l-laktidu a jednotky na bázi d,l-laktidu, přičemž poměr jednotek na bázi l-laktidu ku jednotkám na bázi d,l-laktidu je asi 80:20.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že absorpční obalující polymer tvoří 5 až 70 % celkové hmotnosti obalenou vázánou mikročásticí nebo více obalenými vázanými mikročásticemi.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že absorpční obalující polymer tvoří 20 až 60% celkové hmotnosti obalené vázané mikročástice nebo obalených vázaných mikročástic.
    - 40 Φ· ·» Φ· φφ φφ φφφφ φφφφ φφφφ φφφ φφφφ φ φ φ φ » φ φφφ · φφφ φ φ · · φ • φφ φφ φ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφ
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že absorpční obalující polymer tvoří 30 až 50 % celkové hmotnosti obalené vázáné mikročástice nebo obalených vázaných mikročástic.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že peptidem jen analog LHRH.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že analogem LHRH je p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.
  12. 12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že peptidem je analog somatostatinu.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že analogem somatostatinu je Η-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-CysTLr-NHž, kde dva Cys jsou spojeny disulfidickou vazbou.
  14. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že analogem somatostatinu je N-hydroxyethylpiperazinyl-acetyl-D-PheCys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou spojeny disulfidickou vazbou.
  15. 15. Způsob podle nároku 12 kde analog somatostatinu je N-hydroxyethyl piperaziny l-ethylsulfony l-Phe-Cys-Ty r-D-Trp-Lys-AbuCys-Thr-NH2, kde dva Cys jsou spojeny disulfidickou vazbou.
  16. 16. Způsob podle nároku 1 pro výrobu povlečených spojených mikročástic nebo mikročástic, v podstatě jak byla zde popsána a uvedena v příkladech.
CZ20002640A 1999-01-25 1999-01-25 Způsob výroby absorbovatelných mikročástic CZ20002640A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20002640A CZ20002640A3 (cs) 1999-01-25 1999-01-25 Způsob výroby absorbovatelných mikročástic

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20002640A CZ20002640A3 (cs) 1999-01-25 1999-01-25 Způsob výroby absorbovatelných mikročástic

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20002640A3 true CZ20002640A3 (cs) 2000-12-13

Family

ID=5471356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002640A CZ20002640A3 (cs) 1999-01-25 1999-01-25 Způsob výroby absorbovatelných mikročástic

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ20002640A3 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2237471C2 (ru) Абсорбируемые микрочастицы
AU740493B2 (en) Process for making absorbable microparticles
JP3476775B2 (ja) 生物分解性ポリエステルおよび生物活性ポリペプチドのイオン分子結合体
EP0904062B1 (en) Sustained release ionic conjugate
RU2202563C2 (ru) Фосфорилированные полимеры и их конъюгаты
CZ20002640A3 (cs) Způsob výroby absorbovatelných mikročástic
EP1212095B1 (en) Process to make a sustained release formulation
CZ20002654A3 (cs) Absorbovatelné mikročástice
KR100369764B1 (ko) 생분해성폴리에스테르및생활성폴리펩티드의이온성분자결합체
KR100405879B1 (ko) 생분해성 폴리에스테르 및 생활성 폴리펩티드의 이온성분자 결합체