CZ20001874A3 - Sekvence DNA - Google Patents

Abstract

Řešení se týká sekvence DNA a použití této sekvence v mikrobiologii k analytice a/nebo diagnostice, v lékařství, ve fyziologii výživy nebo v biotechnologiích, zvláště jako vektor pro expresi.

Description

Sekvence DNA

Oblast techniky

Vynález se týká sekvence DNA z genu fimbrií kmene Escherichia coli DSM 6601.

Dosavadní stav techniky

Escherichia coli je gramnegativní bakterie, která se vyskytuje ve střevech u lidí i jiných živočichů i v jiném prostředí. Tento mikroorganismus má velké množství variant, které se od sebe liší antigeny pouzdra, povrchovými antigeny a antigeny bičíků, takže může být rozdělen na celou řadu serologických typů. Zařazení podle serotypů však nevypovídá téměř nic o virulenci jednotlivých kmenů, takže i v případě téhož serotypů je mikroorganismus rozdílně pathogenní pro člověka i pro jiné živočichy, tyto rozdíly se mohou v extrémních případech pohybovat od avirulence až po vysokou pathogenitu. Kmen E. coli DSM 6601 patří do serologické skupiny O6:K5 a je hodnocen jako nepatogenní pro člověka i pro jiné živočichy.

Tento kmen má dva chromosomálně kódované geny pro fimbrie, a to typ I (fim) a typ F1C (foc). Je známo, že fimbrie tohoto kmene nesou adhesin. Adhesiny jsou struktury, které hrají podstatnou úlohu při přilnutí bakteriálních buněk na jiné buňky.

Geny fimbrií mají převážné použití v analytice a diagnostice. Použít je však možno tyto geny také v lékařství a ve fyziologii výživy nebo v biotechnologiích.

• · · · • · • ·

...........

Geny fimbrií nebo jejich hlavní podjednotky je možno využít např. k charakterizaci určitého kmene, takže je možno získat další informace o sekvencích těchto genů.

Podstata vynálezu

Nyní byly prováděny výzkumy kmene E. coli DSM 6601 a byly získány sekvence DNA pro hlavní podjednotku fimbrií fimA, která je znázorněna na obr. 1 a pro podjednotku focA, která je znázorněna na obr. 2. Tyto sekvence DNA, získané z uvedeného kmene byly podrobeny analýze sekvence pomocí programu banky dat a byly srovnávány se sekvencemi DNA známých kmenů. Při analýze podjednotky focA kmene DSM 6601 se sekvencí z kmene AD 110, byly prokázány odchylky v jediném místě, kdežto při srovnání sekvence DNA kmene DSM 6601 (gen fimA) se srovnávacím kmenem HB 101, byly prokázány odchylky na větším počtu míst, jak je zřejmé z obr. 1 a 2.

Pro analýzu obou hlavních podjednotek genů fimbrií fimA a focA kmene DMS 6601 a srovnávacích kmenů AD 110a HB 101, byly odpovídající fragmenty DNA nejprve zpracovány působením PCR z chromosomů uvedených kmenů.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení jeho rozsahu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Získání genu fimA z kmenů DSM 6601 a HB 101

Pro PCR-reakci byly použity následující páry primerů: fimA1: 5’-GTG TAC AGA ACG ACT GCC-3’ fimA2: 5’-GTA ATG ACG TCC CTG AAC-3’ • ·

..........

Podmínky PCR: Stupeň 1: 3 min při 95 °C denaturace Stupeň 2: 45 s při 95 °C Stupeň 3: 45 s při 53 °C Stupeň 4: 45 s při 72 °C Stupeň 5: 5 min při 72 °C

Stupně 2 až 4 se opakují 30krát.

Příklad 2

Získání genu focA z kmenů DSM 6601 a AD 110

Pro PCR-reakci byly použity následující páry primerů:

focA1: 5’-CTC ACA TTG CAT TTA TGA AC-3’ focA2: 5’-GGT ΑΤΑ TAT CCG TTA CAC TG-3’

Podmínky PCR: Stupeň 1: 3 min při 95 °C denaturace Stupeň 2: 45 s při 95 °C Stupeň 3: 45 s při 51 °C Stupeň 4: 45 s při 72 °C Stupeň 5: 5 min při 72 °C

Stupně 2 až 4 se opakují 30krát.

Příklad 3

Klonování a izolace plasmidu

PCR-produkty, získané v příkladu 1 a 2 byly klonovány způsobem podle publikace Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, druhé vydání 1989, Cloning, Transformation, 1.53-18.84, PCR: 14.00 - 14.35 ve vektoru pUC 18 a výsledná DNA plasmidu byla použita k transformaci kmene E. coli K12, DH5alfa.

• A • ·

............

Izolace DNA plasmidu byla prováděna způsobem podle publikace Birnboim A. C., a Doly J., 1979, Nucl. Acids Res. 7: 15131523: A rapid alkaline extraction proceduře for screening recombinant plasmid DNA.

Postup byl prováděn tak, že 3 ml prostředí LB byly naočkovány kolonií bakterií a živný roztok byl přes noc protřepáván při teplotě 37 °C. Pak byla kultura odstředěna v Eppendorfově nádobce a střední část byla odstraněna pipetou. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze ve 100 mikrolitrech roztoku I, který obsahoval 50 mM glukózy, 10 mM EDTA o pH 8, 25 mM Tris-HCI o pH 8. Po 5 minutách inkubace při teplotě místnosti bylo přidáno 200 mikrolitrů roztoku II, obsahujícího 0,2 N hydroxidu sodného s 1 % SDS, směs byla míchána až do vyčeření a nádobka byla uložena na dalších 5 minut do ledu.

Pak bylo přidáno 150 mikrolitrů roztoku III, obsahujícího 3 M octanu sodného o pH 4,8, směs byla krátkou dobu protřepávána až do vysrážení chromosomální DNA ve formě vloček a směs byla na dalších 5 minut uložena do ledu. Vysrážená chromosomální DNA a zbytky buněk byly ještě 5 minut odstředěny a supernatant, obsahující DNA plasmidu, byl přenesen do jiné nádobky. K čištění DNA plasmidu bylo přidáno 50 mikrolitrů fenolu a 150 mikrolitrů směsi chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24:1 a po krátkém protřepání byla směs na 2 minuty odstředěna. Vodná fáze byla pipetou přenesena do jiné nádobky. DNA plasmidu byla vysrážená přidáním dvou objemů ledového ethanolu, načež byla směs odstředěna 10 minut. Usazenina byla promyta 70% ethanolem a vysušena. DNA plasmidu byla znovu uvedena do suspenze ve 20 mikrolitrech bidestilované vody a pak uložena při teplotě -20 °C.

Příklad 4

Analýza sekvence DNA

Analýza sekvence DNA byla provedena způsobem podle publikace Sanger F., Nicklen S., a Coulson, A. R., 1977 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467: DNA sequencing with chain terminating inhibitors.

Analýza sekvence DNA byla prováděna při použití balíčku T7 (Pharmacia LKB) pro analýzu sekvence.

V denaturačním stupni bylo smíseno 8 mikrolitrů (1,5 až 2 mikrogramy) DNA plasmidu a 2 mikrolitrů, 2 N roztoku hydroxidu sodného, po krátkém odstředění byla směs inkubována při teplotě místnosti. Pak byla DNA vysrážena přidáním 3 mikrolitrů 3 M octanu sodného o pH 4,8, 7 mikrolitrů bidestilované vody a 60 mikrolitrů ledového absolutního ethanolu, srážení trvalo 15 minut při teplotě -70 °C. Vysrážená DNA byla odstředěna 10 minut, promyta 70% ethanolem a usušena.

Při vazné reakci byla denaturovaná DNA uvedena do suspenze v 10 mikrolitrech bidestilované vody, bylo přidáno 2 mikrolitry pufru pro vazbu a 2 mikrolitry primeru (40 ng). Směs byla inkubována 20 minut při teplotě 37 °C tak, aby bylo možno uskutečnit vazbu primeru na matrici DNA. Reakční směs byla na 10 minut zchlazena na teplotu místnosti a pak byla okamžitě použita pro značení nebo byla zchlazena na teplotu -20 °C a uložena. Při značení byla vytvořena směs 3 mikrolitry značící směsi, 1 mikrolitr [alfa-³²P]dATP a 2 mikrolitry T7-polymerázy (T7-polymeráza byla zředěna pufrem pro ředění enzymů v poměru 1:5) a po krátkém promíchání byla směs inkubována 5 minut při teplotě místnosti. V průběhu této doby byla předehřátá směs pro analýzu a pro terminační reakci na teplotu 37 °C • · · fc • · (na 1 nádobku 2,5 mikrolitrů směsi ‘G’-, ‘A’-, ‘Τ’- a ‘C’-). Po ukončení značící reakce byly vždy 4 mikrolitry této směsi přidány do 4 směsí pro analýzu sekvence a směsi byly krátce promíchány pipetou. Terminační reakční směsi byly inkubovány 5 minut při teplotě 37 °C. K ukončení reakce bylo přidáno vždy 5 mikrolitrů roztoku pro přerušení reakce. Směsi byly přeneseny do inkubátoru s teplotou 95 °C, 2 minuty denaturovány a pak uloženy do ledu. Vždy 2,5 mikrolitrů reakční směsi bylo naneseno na gel pro analýzu sekvence se složením 25,2 g močoviny, 22 ml bidestilované vody, 6 ml 10x TBE, 10 ml 40% polyakrylamidu, 2 ml persíranu amonného s koncentrací 16 mg/ml a 60 mikrolitrů TEMED v pořadí ‘G’, ‘A’, ‘Τ’, ‘C’. Elektroforéza probíhala při 40 W a napětí 1500 V celkem 4,5 hodin.

Tyto sekvence DNA je také možno známým způsobem připravit synteticky a určité úseky sekvence pak použít jako primery, což umožní identifikaci kmene E. coli DSM 6601. Rovněž je možno uložit odpovídající sekvence DNA tohoto kmene genetickou technologií do jiných kmenů E. coli, a tím např. modifikovat přilnutí buněk nebo vlastnosti kolonií jiných kmenů.

Údaje o sekvenci fimadsm:

Vlastnosti sekvence:
Délka	549 párů baží
Typ	DNA
Druh řetězce	dvojitý
Topologie	lineární
Původ sekvence:
Organismus	Escherichia coli
Kmen	DSM 6601
Typ buněk	jednobuněčný organismus

• » · · « «

Popis sekvence fimadsm:

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sekvence DNA se sledem nukleotidů, znázorněným na obr. 1 nebo část této sekvence.
2. 2. Sekvence DNA se sledem nukleotidů, znázorněným na obr. 2 nebo část této sekvence.
3. 3. Použití sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2 v mikrobiologické analytice a/nebo diagnostice.
4. 4. Použití sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2 v lékařství a/nebo pro účely fyziologie výživy nebo probiotické účely.
5. 5. Použití sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2 v biotechnologii, zejména jako vektoru pro expresi.