CZ20001837A3

CZ20001837A3 - Kombinace inhibitoru aldosa reduktasy a inhibitoru glykogen fosforylasy

Info

Publication number: CZ20001837A3
Application number: CZ20001837A
Authority: CZ
Inventors: Banavara Lakshman Mylari; Dennis Jay Hoover; Bernard Hulin; Judith Lee Treadway
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1998-11-02
Publication date: 2001-05-16

Abstract

Farmaceutické kompozice na bázi kombinace inhibitoru aldosa reduktasy a inhibitoru glykogen fosforylasy a způsoby léčení chorob a stavů, jako stavu resistence na insulin, jako je diabetes, a snižování tkáňového poškození vyvolaného ischemií.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutické kombinace inhibitoru aldosa reduktasy a inhibitoru glykogen fosforylasy a kitů, které takovou kombinaci obsahují. Dále se vynález týká použití této kombinace pro léčení diabetes, hyperglykemie, hypercholesterolemie, hypertense, hyperinsulinemie, hyperlipidemie, atherosklerosy a tkáňové ischemie u savců.

Dosavadní stav techniky

Přes časný objev insulinu a jeho následné rozsáhlé používání při léčení diabetes a přes pozdější objev a používání sulfonylmočovin [jako je například Chlorpropamide^^R^ (Pfizer), Tolbutamide(^R) (Upjohn), Acetohexamide^^R^ (E.I. Lilly), Tolazamide(^R) (Upjohn)], biguanidů [jako je například Phenformin(^R) (Ciba Geigy), Metformin^^R^ (G. D. Searle)], inhibitorů alfa-glukosidasy [jako je například Precose(^R) (Bayer)] a látek zvyšujících citlivost na insulin (jako je například Rezulin^^R^ (Parke Davis), jakožto orálních hypoglykemických činidel, není léčení diabetes stále ještě dostatečně úspěšné. Inzulín, kterého je zapotřebí přibližně u asi 10 % pacientů postižených diabetes, u nichž nejsou syntetická hypoglykemická činidla účinná (diabetes typu I, insulin dependentní diabetes mellitus), je třeba podávat několikrát denně, přičemž injekční podávání si obvykle zajišťuje pacient sám. Stanovení správného dávkování insulinu vyžaduje časté určování hladiny cukru v moči nebo krvi. Podání nadměrného množství insulinu vyvolává hypoglykemii, která má za následek široký rozsah abnormalit od • 4 4 ·· · ·· · • · · · · · · · · «· • · · · 4 4 · 9 9 4

9 9999 9 9 · 9 99 4 4

4 · ·44 · · 4 • · 4 «4 «44 9 9 99 9 mírných změn obsahu glukosy v krvi až po koma či dokonce smrt. Léčení diabetes mellitus non-insulin dependentního typu (diabetes typu II, NIDDM) obvykle zahrnuje kombinaci diety, cvičení, podávání orálních činidel, například sulfonylmočovin, a v závažnějších případech, insulinu. Klinicky dostupná hypoglykemika však mohou mít vedlejší účinky, které omezují jejich použití. Vždy platí, že je-li v individuálním případě některé z těchto činidel neúspěšné, jiné může být úspěšné. Zjevně tedy přetrvává potřeba hypoglykemických činidel zatížených menším počtem vedlejších účinků nebo vykazujících účinnost v případech, kdy jiná hypoglykemická činidla selhávají.

Inhibitory aldosa reduktasy tvoří třídu sloučenin, o nichž je dobře známo, že jsou užitečné při prevenci a léčení stavů vyvolaných komplikacemi diabetes, jako je diabetická neuropathie a nefropathie. Takové sloučeniny jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy a je možno je snadno identifikovat za použití standardních biologických zkoušek.

Jako příklad sloučenin, o nichž je známo, že jsou užitečné jako inhibitory aldosa reduktasy, je možno uvést zopolrestat, 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolyl]methyl]-l-ftalazinoctovou kyselinu a řadu jí příbuzných sloučenin, které jsou popsány v US patentu 4 939 140 (Larson et al.). Tento patent zde je citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu. Zopolrestat, který odpovídá strukturnímu vzorci

O

·· · · 4 4 • · · 4 4 4 4 • · · · · · ·

4 4444444 4 4 “ 4 · 4 4 4 4

4.4 « 44 444 je inhibitorem aldosa reduktasy, a sloučeninou užitečnou při léčení výše uvedených komplikací vyvolaných diabetes mellitus.

U určitých inhibitorů aldosa reduktasy se uvádí použití při snižování hladiny lipidů u savců - viz například US patent 4 492 706 (Kallai-sanfacon) a EP 0 310 931 A2 (Ethyl Corporation). Tyto dokumenty jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu.

V US patentu 5 064 830 (Going) je popsáno použití určitých oxoftalazinyloctových kyselin, včetně zopolrestatu, pro snižování hladiny kyseliny močové v krvi.

V US patentové přihlášce č. 08/059 688 jsou popsány určité inhibitory aldosa reduktasy, včetně zopolrestatu, pro snižování hladiny lipidů v krvi u lidí. V této přihlášce se uvádí, že terapeutická užitečnost vyplývá z léčení chorob vyvolaných zvýšenou hladinou triglyceridů v krvi, jako jsou kardiovaskulární poruchy, jako thrombosa, arteriosklerosa, infarkt myokardu a angína pectoris.

Atherosklerosa, což je choroba artérií, je považována za hlavní příčinu úmrtí v USA a Západní Evropě. Patologická sekvence vedoucí k atherosklerose a okluzivní srdeční chorobě, je dobře známa. V nejčasnějším stádiu této sekvence vznikají v karotidové, koronární a cerebrální artérii, jakož i v aortě tukové proužky. Tyto léze mají žlutou barvu díky přítomnosti lipidových úsad, které jsou obsaženy zejména v buňkách hladkého svalstva a v makrofázích vrstvy intima artérií a aorty. Předpokládá se, že z většiny cholesterolu obsaženého v těchto tukových proužcích vznikají fibrosní plaky, které se skládají z akumulovaných intimálních buněk hladkého svalu proložených lipidem a obklopených extracelulárním lipidem, kolagenem, elastinem

Λ ** · · · · · · • · · · · · · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999999 9 9 99 9

9 « ·· ·«· »· ·<· a proteoglykany. Buňky vytvářejí s matricí vláknitý kryt překrývající hlubší úsady buněčných zbytků a dalšího extracelulárního lipidu. Lipidem je převážně volný a esterifikovaný cholesterol. Fibrosní plaky vznikají pomalu a časem u nich dochází ke kalcifikaci a nekrotizaci, což vede ke vzniku komplikovaných lézí majících za následek okluzi artérií a sklon k murální thrombose a arteriálním svalovým spasmům, které jsou charakteristické pro pokročilou atherosklerosu.

Epidemiologické důkazy pevně potvrdily předpoklad, že hyperlipidemie je hlavním rizikovým faktorem pro vznik kardiovaskulární choroby (CVD) v důsledku atherosklerosy. V nedávných letech položili přední lékaři nový důraz na snižování hladiny cholesterolu v plasmě, zejména nízkohustotního lipoproteinového cholesterolu, jakožto důležitý krok při prevenci CVD. Je známo, že horní hranice normálního stavu je v současné době podstatně nižší než dříve. V důsledku toho jsou velké části populace západního světa nyní považovány za zvláště ohrožené. Takové nezávislé rizikové faktory zahrnují glukosovou intoleranci, hypertrofii levého ventrikula, hypertensi a příslušnost k mužskému pohlaví. Kardiovaskulární choroby se vyskytují u pacientů postižených diabetes, přinejmenším u jejich části, poněvadž u této části populace je přítomen větší počet nezávislých rizikových faktorů. Úspěšné léčení hyperlipidemie v celé populaci a zejména u populace postižené diabetes má tedy výjimečnou lékařskou důležitost.

Hypertense (či vysoký krevní tlak) je stav, který se v lidské populaci vyskytuje jako sekundární symptom různých jiných poruch, jako je stenosa renální artérie, pheochromocytom nebo endokrinní poruchy. Hypertense se však vyskytuje také u mnoha pacientů, u nichž je kauzativní činidlo či porucha neznáma. Esenciální hypertense je sice často spojována s poruchami, jako je obezita, diabetes a hypertriglyceridemie, vztah mezi těmito poruchami však dosud nebyl objasněn. Kromě toho, mnoho pacientů vykazuje symptomy vysokého krevního tlaku, přestože se u nich jinak nevyskytují žádné další známky choroby nebo poruchy.

Je známo, že hypertense může přímo vést k srdečnímu selhání, renálnímu selhání a mrtvici (mozkovému krvácení).

Ty mohou u pacienta v krátké době vyvolat smrt. Hypertense může také přispívat k vývoji atherosklerosy a koronární choroby. Takové stavy postupně oslabují pacienta a mohou mít za delší dobu za následek také smrt.

Přesná příčina esenciální hypertense není známa, přestože je známa řada faktorů, o nichž se předpokládá, že iniciují tuto chorobu. Z těchto faktorů je možno uvést stres, nekontrolované emoce, neregulované uvolňování hormonů (reninový, angiotensinový, aldosteronový systém), nadměrné zadržování soli a vody v důsledku špatné funkce ledvin, ztlušiování stěn a hypertrofie vaskulatury vedoucí ke konstrikci cév, a dále též genetické faktory.

K léčení esenciální hypertense se přistupuje s tím, že se všechny tyto faktory berou v úvahu. Jako antihypertensiva byla tedy vyvinuta a na trh uvedena široká škála βblokátorů, vasokonstriktorů, inhibitorů enzymu konvertujícího angiotensin apod. Léčení hypertense za použití těchto sloučenin se ukázalo být prospěšné při prevenci smrti hrozící v krátké době, jako při prevenci srdečního selhání, ledvinového selhání a mozkového krvácení. Stále však přetrává problém postupného dlouhodobého vývinu atherosklerosy nebo srdeční choroby v důsledku hypertense. Přestože se tedy snižuje vysoký krevní tlak, základní příčina esenciální hypertense na takové léčení nereaguje.

• · · «· · ♦ · · · · · · • · · · · · · • ······· · · • 99 999 « · · ·«·

Hypertense se spojuje se zvýšenou hladinou insulinu v krvi, což je stav označovaný názvem hyperinsulinemie. Inzulín je peptidový hormon, jehož hlavním účinkem je zajišťování utilizace glukosy, syntézy proteinů a tvorby a ukládání neutrálních lipidů. Inzulín mj. také podporuje růst vaskulárních buněk a zvyšuje retenci sodíku v ledvinách. Posledně uvedených funkcí je možno dosáhnout bez ovlivnění hladiny glukosy a jedná se o známé příčiny hypertense. Tak například růst periferní vaskulatury může mít za následek konstrikci periferních kapilár a retence sodíku zvyšuje objem krve. Snížení hladiny insulinu může tedy u hyperinsulinemiků zabránit abnormálnímu vaskulárnímu růstu a renální retenci sodíku, jež jsou způsobeny vysokou hladinou insulinu, a tím snížit hypertensi.

Srdeční hypertrofie je významným rizikovým faktorem vedoucím k náhlému úmrtí, infarktu myokardu a městnavému srdečnímu selhání. Tyto srdeční příhody jsou přinejmenším zčásti vyvolány zvýšenou susceptibilitou k poškození myokardu po ischemii a reperfusi a může k nim dojít jak u ambulantních pacientů, tak u perioperativních případů. Snaha zabránit nebo minimalizovat nepříznivé perioperativní účinky na myokard, zejména zabránit perioperativnímu infarktu myokardu nebo minimalizovat jeho rozsah, nebyla dosud v plné míře úspěšná. Jak nesrdeční, tak srdeční chirurgie je spojena s podstatným ohrožením infarktem myokardu nebo smrtí. Předpokládá se, že je ohroženo asi 7 milionů pacientů, kteří se podrobují nesrdečnímu chirurgickému zásahu, přičemž u některých typů operací dosahuje výskyt perioperační smrti a vážných srdečních komplikací až 20 až 25 %. Každý rok se kromě toho podrobí asi 400 tisíc pacientů koronárnímu chirurgickému zákroku by-pass a u této populace se výskyt perioperačního infarktu myokardu odhaduje na 5 % a četnost úmrtí na 1 až 2 %. V současné době není k dispozici žádná farmakoterapie snižující poškození srdeční tkáně perioperač7 *· 9 ··· »» «(· ní ischemií myokardu nebo zvyšující srdeční resistenci vůči ischemickým epizodám. Předpokládá se, že taková terapie by mohla zachránit lidské životy a snížit hospitalizaci, zvýšit kvalitu života a snížit celkové náklady na zdravotní péči u vysoce ohrožených pacientů.

Produkce glukosy v játrech je prvek, který je důležitý pro zaměření terapie NIDDM. Játra jsou hlavním regulátorem hladiny glukosy v plasmě v post-absorptivním stavu (nalačno) a rychlost produkce glukosy v játrech u NIDDM pacientů je podstatně vyšší ve srovnání s normální populací. Podobně v postprandiálním stavu (po jídle), kdy mají játra úměrně menší vliv na celkový obsah glukosy v plasmě, je produkce glukosy v játrech u NIDDM pacientů abnormálně vysoká.

Glykogenolýza je důležitým cílem, na který se zaměřuje snaha přerušit produkci glukosy v játrech. Játra produkují glukosu glykogenolýzou (rozkladem glykogenu, který představuje polymer glukosy) a glukoneogenesí (syntézou glukosy z 2- a 3-uhlíkových prekursorů). Několik sérií důkazů ukazuje, že glykogenolýza může představovat důležitý příspěvek k produkci glukosy v játrech v případě léčení NIDDM. Předně, u normálního postabsorptivního člověka vzniká podle odhadu asi 75 % glukosy v játrech glykogenolýzou.

Kromě toho, pacienti postižení chorobami narušujícími ukládání glykogenu v játrech, jako jsou pacienti postižení Hersovou chorobou (deficiencí glykogen fosforylasy), vykazují epizody hypoglykemie. Tato pozorování podporují předpoklad, že glykogenolýza může představovat významný způsob produkce glukosy v játrech.

Glykogenolýza je katalyzována v játrech, svalstvu a mozku tkáňově specifickými isoformami enzymu glykogen fosforylasy. Tento enzym štěpí glykogenovou makromolekulu tak, «9 9 99 9 99

999 9999 999

9999999 9 9 99 9

9 99 999 9-9 999 že uvolňuje glukosa-l-fosfát a novou zkrácenou glykogenovou makromolekulu. Až dosud byly oznámeny dva typy inhibitorů glykogen fosforylasy: glukosa a analogy glukosy [Martin J. L. et al., Biochemistry, 1991, 30, 10101] a kofein a jiné purinové analogy [Kasvinsky P. J. et al., J. Biol. Chem. 1978, 253, 3343 až 3351 a 9102 až 9106]. Tyto sloučeniny a inhibitory glykogen fosforylasy obecně jsou považovány za látky potenciálně použitelné při léčení NIDDM snižováním produkce glukosy v játrech a snižováním glykemie [Blundell, T. B. et al., Diabetologia 1992, 35, Suppl. 2, 569 až 576 a Martin et al., Biochemistry 1991, 30, 10101].

Mechanismus nebo mechanismy, které jsou zodpovědné za poškození myokardu pozorované při ischemii a reperfusi, nejsou plně objasněny. Bylo oznámeno [M. F. Allard et al.,

Am. J. Physiol. 267, H66-H74, 1994], že preischemická redukce glykogenu ... je spojena se zlepšeným postischemickým funkčním zotavením levého ventrikula u hypertrofizovaného srdce potkana.

Přestože tedy existuje celá řada druhů léčení hyperglykemie, hypercholesterolemie, hypertense, hyperinsulinemie, hyperlipidemie, atherosklerosy a ischemie, trvá snaha vyvinout alternativní druhy léčení.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje inhibitor aldosa reduktasy a inhibitor glykogen fosforylasy. Předmětem vynálezu je dále použití takové kompozice pro léčení stavů resistence na insulin, jako je diabetes u savců (například lidí, žen nebo mužů) a použití pro snížení tkáňových poškození (například podstatné předcházení tkáňovým poškozením, indukci tkáňové ochrany) vyvolaných ischemii.

Μ · ·· · ·· 9 **· · · · A · · · « • · · A ··· · · · • AΑ··Α · A A · A « · *

Α· <* ·· A·· ·» «··

Kombinace obsahuje terapeuticky účinná množství inhibitoru aldosa reduktasy a inhibitoru glykogen fosforylasy.

Přednostním množstvím inhibitoru aldosa reduktasy je asi 0,1 mg/kg až asi 20 mg/kg a přednostním množstvím inhibitoru glykogen fosforylasy je asi 0,1 mg/kg až asi 15 mg/kg.

Jako inhibitoru aldosa reduktasy se zvláštní přednost dává 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolyl]methyl]-l-ftalazinoctové kyselině.

Jako přednostní inhibitory glykogen fosforylasy je možno uvést sloučeniny obecného vzorce I

přerušovaná čára představuje případnou vazbu;

A představuje skupinu obecného vzorce -C(H)=,

-C(alkyl)= s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části nebo -C(halogen)=, když přerušovaná čára představuje vazbu; nebo A představuje methylenskupinu nebo skupinu obecného vzorce -CH(alkyl)- s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, když přerušovaná čára nepředstavuje vazbu;

9 ·* 9 · · * *99 9 9 · « « 9 9 ·

9 9 9 99 9 9 9 9

9999999 9 9 99 9 9

999 999 99« ·« 9 99 «99 99 «99 ^Rl^{z R}10 ^{a R}11 představuje nezávisle vždy atom vodíku, atom halogenu, 4-, 6- nebo 7-nitroskupinu, kyanoskupinu, alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, fluormethylskupinu, difluormethylskupinu nebo trifluormethylskupinu ;

R₂ představuje atom vodíku;

R₃ představuje atom vodíku nebo alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku;

R₄ představuje atom vodíku, methylskupinu, ethylskupinu, n-propylskupinu, hydroxyalkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyalkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až 3 atomy uhlíku v alkylové části, fenylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, fenylhydroxyalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, fenylalkoxyalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, thien-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části nebo fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž kruh obsažený v R₄je popřípadě substituován na uhlíku jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku, atomu halogenu alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny; nebo

R₄ představuje pyrid-2-, -3- nebo -4-ylalkylskupinu s až 4 atomy uhlíku v alkylové části, thiazol-2-,

-4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, imidazol-1-, -2-, -4- nebo -5-yl11

4 4 · · 4

4 · · · · · 4 «444 9 9 9 4

9 9999 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 «

Ο «4 444

alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyrrol-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, oxazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, isoxazol-3-,

-4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, isothiazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyridazin-3- nebo -4-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyrimidin-2-, -4-, -5nebo -6-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazin-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části nebo 1,3,5triazin-2-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž heterocyklický kruh obsažený ve zbytku R₄ je popřípadě substituován na uhlíku jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, trifluormethylskupiny, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny a hydroxyskupiny;

R₅ představuje atom vodíku, hydroxyskupinu, atom fluoru, alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, alkanoylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, mono-N- nebo di-N,N-alkylaminoalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových a 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkoxylových částí, karboxyalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části, alkoxykarbonylalkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v první a 1 až 4 atomy uhlíku ve druhé alkoxylové části, benzyloxykarbonylalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části nebo karbo12

44		e	·»	4		49
•	•	•	4 ·	4 4	4	4	4 4
•	*	• 4	4 4	4	•	•
•	»	999«	9 4 4	4	« «	4
• »		9	4 4	444		4·	««

nyloxyskupinu, přičemž tato karbonyloxyskupina je prostřednictvím vazby uhlík-uhlík připojena k fenylovému, thiazolylovému, imidazolylovému, lH-indolylovému, furylovému, pyrrolylovému, oxazolylovému, pyrazolylovému, isoxazolylovému, isothiazolylovému, pyridazinylovému, pyrimidinylovému, pyrazinylovému nebo 1,3,5-triazinylovému kruhu a přičemž kruh obsažený ve zbytku R₅ je popřípadě substituován na atomu uhlíku jedním substituentem zvoleným ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, aminoskupiny a trifluormethylskupiny;

R₇ představuje atom vodíku, atom fluoru nebo alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku; nebo

R₅ a R₇ dohromady popřípadě představují oxoskupinu;

R₆ představuje karboxyskupinu, alkoxykarbonylskupinu s až 8 atomy uhlíku v alkoxylové části nebo skupinu vzorce C(O)NRgR_g nebo C(O)R₁₂/ kde

R₈ představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, hydroxyskupinu nebo alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku; a

R_g představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 8 atomy uhíku, methylen-perfluorovanou alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, fenylskupinu, pyridylskupinu, thienylskupinu, furylskupinu, pyrrolylskupinu, pyrrolidinylskupinu, oxazolylskupinu, thiazolylskupinu, imidazolylskupinu, pyrazolylskupinu, pyrazolinylsku13

9 99 9 9· • 99 99 99 999

9999 99 9 99

9999999 · 9 · · 9

9» 9 99 999 9· ··· pinu, pyrazolidinylskupinu, isoxazolylskupinu, isothiazolylskupinu, pyranylskupinu, piperidylskupinu, morfolinylskupinu, pyridazinylskupinu, pyrimidinylskupinu, pyrazinylskupinu, piperazinylskupinu nebo 1,3,5-triazinylskupinu, přičemž kruh obsažený v Rg je připojen prostřednictvím vazby uhlík-dusík; nebo

R_g představuje alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku, hydroxyskupiny, aminoskupi ny, mono-N- a di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí; nebo

R_g představuje alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z fenylskupiny, pyridylskupiny, furylskupiny, pyrro lylskupiny, pyrrolidinylskupiny, oxazolylskupiny, thiazolylskupiny, imidazolylskupiny, pyrazolylskupiny, pyrazolinylskupiny, pyrazolidinylskupiny, isoxazolylskupiny, isothiazolylskupiny, pyranylskupiny, pyridylskupiny, piperidylskupiny, morfolinylskupiny, pyridazinylskupiny, pyrimidinylskupiny, pyrazinylskupiny, piperazinylskupiny a 1,3,5-triazinylskupiny, přičemž nearomatický kruh obsahující atom dusíku, který je součástí Rg, je popřípadě na atomu dusíku substituován jednou alkylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, benzylskupinou, benzoylskupinou nebo alkoxykarbonylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části a přičemž dále kruh obsažený v Rg je popřípadě na atomu uhlíku substituován jedním substituentem zvoleným ze souboru sestávájícího z atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, aminoskupiny a mono-N- a di-N,Nalkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, s tou podmínkou, že nezahrnuje kvaternizovaný atom dusíku a žádnou vazbu dusík-kyslík, dusík- dusík nebo dusík-halogen;

R₁₂ představuje piperazin-l-ylskupinu, 4-alkylpiperazin-l-ylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, 4-formylpiperazin-l-ylskupinu, morfolinoskupinu, thiomorfolinoskupinu, 1-oxothiomorfolinoskupinu, 1,1-dioxothiomorfolinoskupinu, thiazolidin-3-ylskupinu, l-oxothiazolidin-3-ylskupinu, 1,l-dioxothiazolidin-3-ylskupinu, 2alkoxykarbonylpyrrolidin-l-ylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, oxazolidin-3-ylskupinu nebo 2(R)-hydroxymethylpyrrolidin-l-ylskupinu; nebo

R₁₂ představuje 3- a/nebo 4-mono- nebo -disubstituovanou oxazetidin-2-ylskupinu, 2-, 4- a/nebo 5-mononebo -disubstituovanou oxazolidin-3-ylskupinu, 2-,

4- a/nebo 5-mono- nebo -disubstituovanou thiazolidin-3-ylskupinu, 2-, 4- a/nebo 5-mono- nebo -disubstituovanou l-oxothiazolidin-3-ylskupinu, 2-, 4a/nebo 5-mono- nebo -disubstituovanou 1,1-dioxothiazolidin-3-ylskupinu, 3- a/nebo 4-mono- nebo -disubstituovanou pyrrolidin-l-ylskupinu, 3-, 4a/nebo 5-mono-, -di- nebo -trisubstituovanou piperidin-l-ylskupinu, 3-, 4- a/nebo 5-mono-, -dinebo -trisubstituovanou piperazin-l-ylskupinu, 3substituovanou azetidin-l-ylskupinu, 4- a/nebo 5mono- nebo -disubstituovanou l,2-oxazinan-2-ylskupinu, 3- a/nebo 4-mono- nebo -disubstituovanou pyrazolidin-l-ylskupinu, 4- a/nebo 5-mono- nebo *· · ·· 9 99

9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9999 999 9 9 9 9

9 9 9 999 9 9 99 9

-disubstituovanou isoxazolidin-2-ylskupinu, 4a/nebo 5-mono- a/nebo -disubstituovanou isothiazolidin-2-ylskupinu, přičemž každý ze substituentů je nezávisle zvolen ze souboru sestávajícího z atomu vodíku, atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, aminoskupiny, mono-N- a di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, formylskupiny, oxoskupiny, hydroxyiminoskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, karboxyskupiny, karbamoylskupiny, mono- N- a di-N,N-alkylkarbamoylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, alkoxyiminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxymethoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, karboxyalkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkylové části a hydroxyalkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku;

přičemž však pokud R₄ představuje atom vodíku, methylskupinu, ethylskupinu nebo n-propylskupinu, potom R₅ představuje hydroxyskupinu;

pokud R₅ a R_? představují atomy vodíku, potom R₄ nepředstavuje atom vodíku, methylskupinu, ethylskupinu, n-propylskupinu, hydroxyalkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo alkoxyalkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až atomy uhlíku v alkylové části a R₆ představuje skupinu C(O)NRgRg nebo C(O)R₁₂ nebo alkoxykarbonylskupinu s 1 až atomy uhlíku v alkoxylové části;

a jejich farmaceuticky vhodné soli a proléčiva.

·· • * • ♦ ♦ ·	• • • ♦ ···♦	99 9	·· 9
9 9 9 9	9 9 9	9 9 9 •	9 9 « · • 9 9	9 9
• ·	9	99		···	9 9	99

První skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny obecného vzorce I, kde

Rjl představuje skupinu 5-H, 5-halogen, 5-methyl nebo

5-kyano;

R₁₀ a R.^ představuje každý nezávisle atom vodíku nebo atom halogenu;

A představuje skupinu vzorce -C(H)=;

R₂ a R₃ představují atomy vodíku;

R₄ představuje fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž uvedená fenylskupina je substituována jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku a atomu halogenu nebo jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku, atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny; nebo

R₄ představuje thien-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až atomy uhlíku v alkylové části, pyrid-2-, -3- nebo -4-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, thiazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, imidazol-1-,

-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrrol-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, oxazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové

9 • 99 9 9999

9

9 9 9 • 9 9 • 9 9 9

9 9 9 • ·· 999 části, pyrazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, isoxazol-3-,

-4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž heterocyklický zbytek obsažený v R₄ je na uhlíku popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, trifluor methylskupiny, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny a hydroxyskupiny;

R₅ představuje hydroxyskupinu;

R₆ představuje skupinu vzorce C(O)NRgR_g nebo C(O)R₁₂;

a

R₇ představuje atom vodíku.

Z výše uvedené první skupiny přednostních sloučenin se zvláštní přednost dává sloučeninám, které spadají do první skupiny zvláště přednostních sloučenin obecného vzorce I, kde atom uhlíku a má (S) stereochemii;

atom uhlíku b má (R) stereochemii;

R₄ představuje fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, thien-2-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, thien-3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur2-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části nebo fur-3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž každý z výše uvedených kruhů je substituován jedním nebo dvěma

4

4 4

4444 substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku a fluoru;

R₆ představuje skupinu C(O)NR_gR_g;

R₈ představuje alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, hydroxyskupinu nebo alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku; a

R_g představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, hydroxyskupinu, hydroxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, pyridylskupinu, morfolinylskupinu, piperazinylskupinu, pyrrolidinylskupinu, piperidylskupinu, imidazolylskupinu nebo thiazolylskupinu nebo alkylskupinu ε 1 až 4 atomy uhlíku, která je substituována jedním substituentem zvoleným ze souboru sestávajícího z pyridylskupiny, morfolinylskupiny, piperazinylskupiny, pyrrolidinylskupiny, piperidylskupiny, imidazolylskupiny a thiazolylskupiny.

Z první skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost konkrétním sloučeninám zvoleným ze souboru sestávajícího z;

[(1S)—((R)-hydroxydimethylkarbamoylmethyl)-2-fenylethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, {(1S)—[(R)-hydroxy(methoxymethylkarbamoyl)methyl]-2-fenylethyljamidu 5,6-dichlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, {(1S)-[(R)-hydroxy(methoxymethylkarbamoy1)methyl]-2-fenylethyl}amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, ·· 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9999 9 9

9 9 9 ·

« · • · ·· · ((1S) — {(R)-hydroxy-[(2-hydroxyethyl)methylkarbamoyl]methyl} 2-fenylethyl)amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, {(1S)-[ (R)-hydroxy(methylpyridin-2-ylkarbamoyl)methyl]-2fenylethyl}amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, a ((1S)-{(R)-hydroxy-[(methyl(2-pyridin-2-ylethyl)karbamoyl]methyl)-2-fenylethyl)amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.

Z první skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost sloučeninám obecného vzorce I, kde

a) R^ představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_gpředstavuje methylskupinu a R_g představuje methylskupinu;

b) R_x představuje 5-chlorskupinu, představuje atom vodíku, R₁₀ představuje 6-chlorskupinu, R₄ představuje benzylskupinu, R_g představuje methylskupinu a R_g představuj e methoxyskupinu;

c) R_x představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R·^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_gpředstavuje methylskupinu a R_g představuje methoxyskupinu;

d) R-l představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R_i;lpředstavují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_gpředstavuje methylskupinu a R_g představuje 2-(hydroxy)ethylskupinu;

e) R^ představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R_i;lpředstavují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_gpředstavuje methylskupinu a R_g představuje pyridin-2-ylskupinu; a ·

9 9

999 999

999999 9 9 99 9 9

9 9 9 9 9 9

99 999 99 9·9

f) R-^ představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R_1]Lpředstavují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R₈představuje methylskupinu a R_g představuje 2-(pyridin-2yl)ethylskupinu.

Z výše uvedené první skupiny přednostních sloučenin se také dává větší přednost sloučeninám, které spadají do druhé skupiny zvláště přednostních sloučenin obecného vzorce I, kde atom uhlíku a má (S) stereochemii;

atom uhlíku b má (R) stereochemii;

R₄ představuje fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, thien-2-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, thien-3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur2- ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části nebo fur-3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž každý z výše uvedených kruhů je substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku a fluoru;

Rg představuje skupinu C(O)R₁₂; ^a

R₁₂ představuje morfolinoskupinu, 4-alkylpiperazin1-ylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části,

3- substituovanou azetidin-l-ylskupinu, 3- a/nebo 4mono- nebo -disubstituovanou pyrrolidin-l-ylskupinu, 4- a/nebo 5-mono- nebo -disubstituovanou isoxazolidin-2-ylskupinu, 4- a/nebo 5-mono- nebo -disubstituovanou 1,2-oxazinan-2-ylskupinu, přičemž každý ze substituentů je nezávisle zvolen ze souboru sestávajícího z atomu vodíku, atomu halogenu,

AA A AA A ·· *

A A · A A AA A A A A • A A · A A A A* ·

A A A A A A AAA A A A · A AAA A A ♦ «ΑΑ

AA A AA AAA AA AAA hydroxyskupiny, aminoskupiny, mono-N- a di-N,Nalkylaminoskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových části, oxoskupiny, hydroxyiminoskupiny a alkoxyskupiny.

Z výše uvedené druhé skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost zejména sloučeninám zvoleným ze souboru sestávajícího z:

hydrochloridu [(1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-(4-methylpiperazin l-yl)-3-oxopropyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [(1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-3-oxopropyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, ((1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-isoxazolidin-2-yl-3-oxopropyl)amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, ((1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-[1,2]oxazinan-2-yl-3-oxopropyl)amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [(1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-((3S)-hydroxypyrrolidin-l-yl)3-oxopropyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [(1S)-benzyl-3-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)hydroxy-3-oxopropyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [1S)-benzyl-3-((3R,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)hydroxy-3-oxopropyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny a ((1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-morfolin-4-yl-3-oxopropyl)amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.

·· ·

• 4 4 • 4 4 4

4 44·· • · 9 • 4 *

· • · ·· «44 • · · 4

4 4

44 444

Z druhé skupiny zvláště přednostních sloučenin se přednost dává sloučeninám obecného vzorce I, kde

a) představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a Rjj představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu a R₁₂představuje 4-methylpiperazin-l-ylskupinu;

b) Rj^ představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R·^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu a R₁₂představuje 3-hydroxyazetidin-l-ylskupinu;

c) R^ představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a Rjj^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu a R₁₂představuje isoxazolidin-2-ylskupinu;

d) R-l představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R_i:lpředstavují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu a R₁₂představuje (1,2)-oxazinan-2-ylskupinu;

e) R-l představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu a R₁₂představuje 3(S)-hydroxypyrrolidin-l-ylskupinu;

f) R-^ představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R_1Xpředstavují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu a R₁₂představuje (3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-ylskupinu;

g) R-j. představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a Rgj představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu a R₁₂představuje (3R,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-ylskupinu; a

h) R_x představuje 5-chlorskupinu, R₁₀ a R·^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu a R₁₂představuje morfolinoskupinu.

• 9 9 ·· • 9 9 9 · • 9 9 9 9 9 • 9···· 99 9 • 9 « 9 9 • 9 9 9 9 • 99 • 9 9 9 9 • 9 9

9 9 9

999 99 999

Druhou skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny obecného vzorce I, kde představuje atom vodíku, atom halogenu, methylskupinu nebo kyanoskupinu;

R₁₀ a Rjj představuje každý nezávisle atom vodíku nebo atom halogenu;

A představuje skupinu vzorce -C(H)=;

R₂ a R₃ představují atomy vodíku;

R₄ představuje fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž uvedená fenylskupina je substituována jedním, dvěma nebo třema substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku a atomu halogenu nebo jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku, atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny nebo kyanoskupiny; nebo

-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrrol-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, oxazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové ·· · • · · • · · · · · • · ···· · · · · · · · · ·· · ·· ·· • · • ·· · ·· 9 · ·· • · · · • · · · · • · · · ··· ·· ··· části, pyrazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, isoxazol-3-,

R₅ představuje hydroxyskupinu;

R₆ představuje karboxyskupinu nebo alkoxykarbonylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku v alkoxylové části; a

R₇ představuje atom vodíku, atom fluoru nebo alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku.

Z výše uvedené druhé skupiny přednostních sloučenin se dává větší přednost sloučeninám obecného vzorce I, kde atom uhlíku a má (S) stereochemii;

atom uhlíku b má (R) stereochemii;

substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku nebo fluoru;

^R10 ^{a R}11 Představují atomy vodíku;

R₆ představuje karboxyskupinu; a

R₇ představuje atom vodíku.

Z bezprostředně předcházející skupiny se dává přednost sloučeninám obecného vzorce I, kde

R-L představuje 5-chlorskupinu;

^R10 ^{a R}11 Představují atomy vodíku; a

R₄ představuje benzylskupinu.

Třetí skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny obecného vzorce I, kde

R-j_ představuje atom vodíku, atom halogenu, methylskupinu nebo kyanoskupinu;

Rjq a R^j představuje každý nezávisle atom vodíku nebo atom halogenu;

A představuje skupinu vzorce -C(H)=;

R₂ a R₃ představují atomy vodíku;

R₄ představuje fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž uvedená fenylskupina je substituována jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu

vodíku a atomu halogenu nebo jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestává jícího atomu vodíku, atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny; nebo

R₄ představuje thien-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až atomy uhlíku v alkylové části, pyrid-2-, -3- nebo -4-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, thiazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, imidazol-1-, -2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrrol-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, oxazol-2-, -4- nebo -5-yl- alkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, isoxazol3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu ε 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž heterocyklický zbytek obsažený v R₄ je na uhlíku popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, trifluormethylskupiny, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny a hydroxyskupiny;

R₅ představuje atom fluoru, alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, aminoalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, mono-Nnebo di-N,N-alkylaminoalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových a 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkoxylových částí, karboxyalkoxyskupinu s

až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části, alkoxykarbonylalkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v první a 1 až 4 atomy uhlíku ve druhé alkoxylové části nebo benzyloxykarbonylalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části;

Rg představuje karboxyskupinu nebo alkoxykarbonylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku v alkoxylové části; a

Čtvrtou skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny obecného vzorce I, kde

Rg představuje atom vodíku, atom halogenu, methylskupinu nebo kyanoskupinu;

R₁₀ a R^j. představuje každý nezávisle atom vodíku nebo atom halogenu;

A představuje skupinu vzorce -C(H)=;

R₂ a Rg představují atomy vodíku;

R₄ představuje fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž uvedená fenylskupina je substituována jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku a atomu halogenu nebo jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku, atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy

9 9 9 9 9 9 uhlíku, trifluormethylskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny; nebo

-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrrol-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, oxazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, isoxazol3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž heterocyklický zbytek obsažený v R₄ je na uhlíku popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, trifluormethylskupiny, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny a hydroxyskupiny;

R₅ představuje atom fluoru, alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, aminoalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, mono-Nnebo di-N,N-alkylaminoalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových a 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkoxylových částí, karboxyalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části, alkoxykarbonylalkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v první a 1 až 4 atomy uhlíku ve druhé alkoxylové části nebo

9 9 9« · · · • · · 9 · 9 9 · · ·

9999 · · · · · <999999 9 9 β · * •9 999 99 ··· benzyloxykarbonylalkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části;

R₆ představuje skupinu vzorce C(O)NR_gR_g nebo C(O)R₁₂;

a

Jako příklad přednostních inhibitorů glykogen fosforylasy je možno uvést sloučeniny obecného vzorce IA

kde přerušovaná čára představuje případnou vazbu;

A představuje skupinu obecného vzorce -C(H)=,

-C(alkyl)= s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části,

-C(halogen)= nebo -N=, když přerušovaná čára představuje vazbu; nebo A představuje methylenskupinu nebo skupinu obecného vzorce -CH(alkyl)- s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, když přerušovaná čára nepředstavuje vazbu;

Rl, R₁₀ a R_l;L představuje nezávisle vždy atom vodíku, atom halogenu, kyanoskupinu, 4-, 6- nebo 7-nitroskupinu, alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, fluormethylskupi30

nu, difluormethylskupinu nebo trifluormethylskupinu;

R₂ představuje atom vodíku;

R₃ představuje atom vodíku nebo alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku;

R₄ představuje atom vodíku, methylskupinu, ethylskupinu, n-propylskupinu, hydroxyalkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyalkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až 3 atomy uhlíku v alkylové části, fenylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, fenylhydroxyalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, fenylalkoxyalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, thien-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části nebo fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž kruh obsažený v R₄je substituován na uhlíku jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestává jícího z atomu vodíku, atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny, kyanoskupiny a 4,5-dihydro-lH-imidazol-2-ylskupiny; nebo

R₄ představuje pyrid-2-, -3- nebo -4-ylalkylskupinu s až 4 atomy uhlíku v alkylové části, thiazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, imidazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyrrol-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, oxazol-2-, -4- nebo

-5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, isoxazol-3-,

-4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, isothiazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyridazin-3- nebo -4-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyrimidin-2-, -4-, -5nebo -6-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazin-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, 1,3,5triazin-2-ylalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části nebo indol-2-alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž heterocyklický kruh obsažený ve zbytku R₄ je popřípadě substituován na uhlíku jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, trifluormethylskupiny, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny, hydroxyskupiny a kyanoskupiny; nebo

R₄ představuje skupinu R₁₅-karbonyloxymethyl, kde R₁₅ představuje fenylskupinu, thiazolylskupinu, imidazolylskupinu, ΙΗ-indolylskupinu, furylskupinu, pyrrolylskupinu, oxazolylskupinu, pyrazolylskupinu, isoxazolylskupinu, isothiazolylskupinu, pyridylskupinu, pyridazinylskupinu, pyrimidinylskupinu, pyrazinylskupinu nebo 1,3,5-triazinylskupinu, přičemž výše uvedené kruhy obsažené ve skupině R₁₅jsou popřípadě substituovány na uhlíku jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, aminoskupiny, hydroxy skupinu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku,

alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a trifluormethylskupiny ;

R₅ představuje atom vodíku;

R₆ představuje karboxyskupinu, alkoxykarbonylskupinu s až 8 atomy uhlíku v alkoxylové části; benzyloxykarbonylskupinu nebo skupinu vzorce C(O)NRgRg nebo C(O)R₁₂, kde

Rg představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, cykloalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku, cykloalkylalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku v cykloalkylové a 1 až 5 atomy uhlíku v alkylové části, hydroxyskupinu nebo alkoxyskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku; a

R_g představuje atom vodíku, cykloalkylskupinu se 3 až atomy uhlíku, cykloalkylalkylskupinu se 3 až 8 atomy uhlíku v cykloalkylové a 1 až 5 atomy uhlíku v alkylové části, cykloalkenylskupinu se 4 až 7 atomy uhlíku, cykloalkylalkoxyskupinu se 3 až 7 v cykloalkylové a 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, cykloalkyloxyskupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, hydroxyskupinu, methylen-perfluorovanou alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, fenylskupinu nebo heterocyklickou skupinu, zvolenou ze souboru sestávajícího z pyridylskupiny, furylsku piny, pyrrolylskupiny, pyrrolidinylskupiny, oxazolylskupiny, thiazolylskupiny, imidazolylskupiny, pyrazolylskupiny, pyrazolinylskupiny, pyrazolidinylskupiny, isoxazolylskupiny, isothiazolylskupiny, pyranylskupiny, pyridinyl, piperidylskupiny, morfolinylskupiny, pyridazinylskupiny, pyrimidinylsku33

piny, pyrazinylskupiny, piperazinylskupiny,

1,3,5-triazinylskupiny, benzothiazolylskupiny, benzoxazolylskupiny, benzimidazolylskupiny, thiochromanylskupiny a tetrahydrobenzothiazolylskupiny, přičemž tato heterocyklická skupina je připojena prostřednictvím vazby uhlík-dusík; nebo

R₉ představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, z nichž každá je popřípadě substituována jedním substituentem zvoleným ze souboru sestávajícího z cykloalken-l-yl skupiny se 4 až 7 atomy uhlíku, fenylskupiny, thienylskupiny, pyridylskupiny, furylskupiny, pyrrolylskupiny, pyrrolidinylskupiny, oxazolylskupiny, thiazolylskupiny, imidazolylskupiny, pyrazolylskupiny, pyrazolinylskupiny, pyrazolidinylskupiny, isoxazolylskupiny, isothiazolylskupiny, pyranylskupiny, piperidylskupiny, morfolinylskupiny, thiomorfolinylskupiny, 1-oxothiomorfolinylskupiny, 1,1-dioxothiomorfolinylskupiny, pyridazinylskupiny, pyrimidinylskupiny, pyrazinylskupiny, piperazinylskupiny, 1,3,5triazinylskupiny a indolylskupiny a každá z výše uvedených alkylskupin s 1 až 6 atomy uhlíku a alkoxyskupin s 1 až 8 atomy uhlíku je popřípadě přídavně substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, aminoskupiny, mono-N- a di-N,Nalkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, kyanoskupiny, karboxyskupiny a alkoxykarbonylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části;

a přičemž každý z kruhů v Rg je na uhlíku popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu ha logenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, hydroxyalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, mono-N- a diΝ,Ν-alkylaminoalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových části, alkoxyalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, aminoskupiny, mono-Na di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, kyanoskupiny, karboxyskupiny, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, karbamoylskupiny, formylskupiny a trifluormethylskupiny a každý z kruhů v Rg je popřípadě přídavně substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z alkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku a atomu halogenu;

s tou podmínkou, že v žádném z heterocyklů v R_gnení obsažen kvaternizovaný atom dusíku;

R₁₂ představuje morfolinoskupinu, thiomorfolinoskupinu,

1-oxothiomorfolinoskupinu, 1,1-dioxothiomorfolinoskupinu, thiazolidin-3-ylskupinu, 1-oxothiazolidin3-ylskupinu, 1,l-dioxothiazolidin-3-ylskupinu, pyrrolidin-l-ylskupinu, piperidin-l-ylskupinu, piperazin-l-ylskupinu, piperazin-4-ylskupinu, azetidin-l-ylskupinu, 1,2-oxazinan-2-ylskupinu, pyrazolidin-l-ylskupinu, isoxazolidin-2-ylskupinu, isothiazolidin-2-ylskupinu, 1,2-oxazetidin-2-ylskupinu, oxazolidin-3-ylskupinu, 3,4-dihydroisochinolin-2-ylskupinu, 1,3-dihydroisoindol-2-yl-

skupinu, 3,4-dihydro-2H-chinol-l-ylskupinu, 2,3dihydrobenzo[1,4]oxazin-4-ylskupinu, 2,3-dihydrobenzo[1,4]thiazin-4-ylskupinu, 3,4-dihydro-2Hchinoxalin-l-ylskupinu, 3,4-dihydrobenzo[c][1.2] oxazin-l-ylskupinu, 1,4-dihydrobenzo[d][1.2] oxazin-3-ylskupinu, 3,4-dihydrobenzo[e][1.2] oxazin-2-ylskupinu, 3H-benzo[d]isoxazol2-ylskupinu, 3H-benzo[c]isoxazol-l-yl nebo azepan-l-ylskupinu;

kde každý kruh v R₁₂ ϊθ popřípadě substituován jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, aminoskupiny, mono-N- a di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, formylskupiny, karboxyskupiny, karbamoylskupiny, mono-Na di-N,N-alkylkarbamoylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, alkoxyalkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v první a 1 až 3 atomy uhlíku ve druhé z alkoxylových částí, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, benzyloxykarbonylskupiny, alkoxykarbonylalkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až 5 atomy uhlíku v alkylové části, alkoxykarbonylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části, karboxyalkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkylové části, karbamoylalkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkylové části, mono-N- a di-N,N-alkylkarbamoylalkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, hydroxyalkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, alkoxyalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, aminoalkylskupiny • · · * · • · ♦ · · · — 26 — ♦ · ···· · · · '•'V·* · a * a a • ·

s 1 až 4 atomy uhlíku, mono-N- a di-N,N-alkylaminoalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, oxoskupiny, hydroxyiminoskupiny a alkoxyiminoskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž ne více než dva substituenty jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z oxoskupiny, hydroxyiminoskupiny a alkoxyiminoskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku a oxoskupina, hydroxyiminoskupina nebo alkoxyiminoskupina s 1 až 6 atomy uhlíku je připojena k nearomatickému atomu uhlíku; a kde každý z kruhů v R₁₂ Ď^epopřípadě přídavně substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z alkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku a atomu halogenu;

s tou podmínkou, že když R_g představuje alkoxykarbonylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části nebo benzyloxykarbonylskupinu, potom R₁ představuje skupinu 5-halogen, 5-alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo 5-kyano a R₄ představuje (fenyl)(hydroxy)alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, (fenyl)(alkoxy)alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové a 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, hydroxymethylskupinu nebo Ar-alkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, kde Ar představuje thien-2- nebo -3-ylskupinu, fur-2- nebo -3-ylskupinu nebo fenylskupinu, přičemž uvedený zbytek Ar je popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomů halogenu; s tím, že když R₄ představuje benzylskupinu a R₅ představuje methylskupinu, potom R₁₂nepředstavuje 4-hydroxypiperidin-l-ylskupinu, nebo když R₄představuje benzylskupinu a R₅ představuje methylskupinu, potom R^ nepředstavuje skupinu vzorce C(O)N(CH₃)₂;

s tou podmínkou, že když R-]_ a R₁₀ a R·^ představují atomy vodíku, potom R₄ nepředstavuje imidazol-4-ylmethylskupinu,

2-fenylethylskupinu nebo 2-hydroxy-2-fenylethylskupinu;

s tou podmínkou, že když oba z Rg a R_g představují n-pentyl skupiny, potom R^ představuje 5-chlor, 5-brom, 5-kyano, 5-alkyl s 1 až 5 atomy uhlíku, 5-alkoxy s 1 až 5 atomy uhlíku nebo trifluormethylskupinu;

s tou podmínkou, že když R₁₂ představuje 3,4-dihydroisochinol-2-ylskupinu, potom tato 3,4-dihydroisochinol-2-ylskupina není substituována karboxyalkylskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části;

s tou podmínkou, že když Rg představuje atom vodíku a R_gpředstavuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, potom R_gnení na atomu uhlíku, který je připojen k atomu dusíku skupiny NHR_g, substiutován karboxyskupinou nebo alkoxykarbonylskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části;

s tou podmínkou, že když Rg představuje karboxyskupinu a každý z Rj, R₁₀, R·^ a R₅ představuje atom vodíku, potom R₄nepředstavuje benzylskupinu, atom vodíku, (fenyl)(hydroxy)methy1skupinu, methylskupinu, ethylskupinu nebo n-propylskupinu;

a jejich farmaceuticky vhodné soli a proléčiva.

První skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny obecného vzorce IA, kde

R^ představuje skupinu 5-H, 5-halogen, 5-methyl,

5-kyano nebo 5-trifluormethyl;

R₁₀ a R·^ představuje každý nezávisle atom vodíku nebo atom halogenu;

A představuje skupinu vzorce -C(H)=;

R₂ a Rg představují atomy vodíku;

R₄ představuje atom vodíku, methylskupinu, fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž uvedená fenylskupina je substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku a atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny a přičemž skupina R₄ je popřípadě přídavně substituována jedním atomem halogenu; nebo

R₄ představuje thien-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až atomy uhlíku v alkylové části, pyrid-2-, -3- nebo -4-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, thiazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, imidazol-2-,

-4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrrol-2nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, oxazol-2-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, isoxazol-3-,

-4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, isothiazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyridazin-3- nebo -4-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrimidin-2-,

-4-, -5- nebo -6-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazin-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části nebo 1,3,5-triazin-2-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž heterocyklický zbytek obsažený v R₄ je na uhlíku popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, trifluormethylskupiny, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny a hydroxyskupiny;

R₅ představuje atom vodíku;

Rg představuje skupinu vzorce C(O)NR_gR_g nebo C(O)R₁₂·

Z výše uvedené první skupiny přednostních sloučenin se dává větší přednost sloučeninám, které spadají do první skupiny zvláště přednostních sloučenin obecného vzorce IA, kde

R₄ představuje atom vodíku, fenylalkylskupinu s 1 až atomy uhlíku v alkylové části, thien-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž každý kruhu v R₄je substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomů vodíku a fluoru;

Rg představuje skupinu C(O)R₁₂;

R₁₂ představuje morfolinoskupinu, thiomorfolinoskupinu, 1-oxothiomorfolinoskupinu, 1,1-dioxothiomorfolinoskupinu, thiazolidin-3-ylskupinu, 1-oxothiazolidin-3-ylskupinu, l,l-dioxothiazolidin-3-ylskupinu, pyrrolidin-l-ylskupinu, piperidin-l-yl40 skupinu, piperazin-l-ylskupinu, piperazin-4-ylskupinu, azetidin-l-ylskupinu, 1,2-oxazinan-2ylskupinu, isoxazolidin-2-ylskupinu, isothiazolidin-2-ylskupinu, 1,2-oxazetidin-2-ylskupinu, oxazolidin-3-ylskupinu, l,3-dihydroisoindol-2ylskupinu nebo azepan-l-ylskupinu;

přičemž každý z kruhů v R₁₂ j^e popřípadě substitován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu alkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, aminoskupiny, mono-N- a di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, formylskupiny, karboxyskupiny, karbamoylskupiny, mono-Na di-N,N-alkylkarbamoylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, hydroxyalkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, aminoalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, mono-N- a di-N,N-alkylaminoalkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, oxoskupiny, hydroxyiminoskupiny a alkoxyiminoskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, s tou podmínkou, že pouze heterocykly v R₁₂zvolené ze souboru sestávájícho z thiazolidin-3-ylskupiny, pyrrolidin-l-ylskupiny, piperidin-l-ylskupiny, piperazin-l-ylskupiny, piperazin-4-ylskupiny, azetidin-l-ylskupiny, 1,2-oxazinan-2ylskupiny, isoxazolidin-2-ylskupiny a oxazolidin3-ylskupiny, jsou popřípadě substituovány jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z oxoskupiny, hydroxyiminosku piny a alkoxyiminoskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku a

V 9 9

9 9 9 « 9 999 • · 9 • 9999 9 • 9

9

přičemž kruhy v R₁₂ jsou popřípadě přídavně substituovány jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z alkylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku.

Z výše uvedené první skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost konkrétním sloučeninám zvoleným ze souboru sestávajícího z:

[(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny,

12-(cis—3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [(1S)-benzyl-2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl] amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [2-(1,l-dioxothiazolidin-3-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lHindol-2-karboxylové kyseliny, (2-oxo-2-thiazolidin-3-ylethyl)amidu 5-chlor-lH-indol-2-kar boxylové kyseliny, [(1S)-(4-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [(1S)-benzyl-2-((3RS)-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [2-oxo-2-((lRS)-oxo-l-thiazolidin-3-yl)ethyl]amidu 5-chlorlH-indol-2-karboxylové kyseliny, [ (1S) — (2-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl) -2-oxoethyl] amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [(lS)-benzyl-2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny, [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminoazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny a [(1S)-benzyl-2-(4-hydroxyiminopiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amidu 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.

Z výše uvedené skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost sloučeninám z první skupiny zcela zvláště přednostních sloučenin, kde

R₄ představuje atom vodíku; a

R₁₂ představuje thiazolidin-3-ylskupinu, 1-oxothiazolidin-3-ylskupinu, 1,l-dioxothiazolidin-3-ylskupinu nebo oxazolidin-3-ylskupinu, přičemž tyto substituenty R₁₂ jsou popřípadě substituovány jedním nebo dvěma zbytky nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z karboxyskupiny, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, hydroxyalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku, aminoalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku, mono-Na di-N,N-alkylaminoalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku v každé z alkylových části; nebo

R₁₂ představuje pyrrolidin-l-ylskupinu, která je substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle • · zvolenými ze souboru sestávajícího z karboxyskupiny, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, hydroxyalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku, aminoskupiny, aminoalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku, mono-N- a di-N,N-alkylaminoalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku v každé z alkylových části a mono-N- a di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových částí; a kruhy v R^₂ jsou popřípadě přídavně substituovány dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z alkylskupin s 1 až 5 atomy uhlíku.

Z bezprostředně předcházející skupiny zcela zvláště přednostních sloučenin se dává přednost sloučeninám, kde

a) R^ představuje 5-chlor, R_lo a R₃₁ představují atomy vodíku a R₁₂ představuje cis-3,4-dihydroxypyrrolidin1-ylskupinu;

b) Rj představuje 5-chlor, R₁₀ a R^i představují atomy vodíku a R₁₂ představuje (3S,4SJ-dihydroxypyrrolidinl-ylskupinu;

c) R-l představuje 5-chlor, R₁₀ a R·^ představují atomy vodíku a R₁₂ představuje 1,l-dioxothiazolidin-3-ylskupinu;

d) R_x představuje 5-chlor, R₁₀ a R_i:l představují atomy vodíku a R₁₂ představuje thiazolidin-3-ylskupinu; a

e) R-j_ představuje 5-chlor, R₁₀ a R_i;l představují atomy vodíku a R₁₂ představuje l-oxothiazolidin-3-ylskupinu.

• 9 ·

• 9 9 99

Z výše uvedené skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost sloučeninám ze druhé skupiny zcela zvláště přednostních sloučenin, kde

R₄ představuje fenylmethylskupinu, thien-2- nebo

-3-ylmethylskupinu, kde kruhy v R₄ jsou popřípadě substituovány jedním nebo dvěma atomy fluoru; a

R₁₂ představuje thiazolidin-3-ylskupinu, 1-oxothiazolidin-3-ylskupinu, 1,l-dioxothiazolidin-3-ylskupinu nebo oxazolidin-3-ylskupinu, přičemž tyto substituenty R₁₂ jsou popřípadě substituovány jedním nebo dvěma zbytky nezávisle zvolenými z karboxy nebo alkoxykarbonyl s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, hydroxyalkyl s 1 až 3 atomy uhlíku, aminoalkyl s 1 až 3 atomy uhlíku, mono-Na di-N,N-alkylaminoalkyl s 1 až 3 atomy uhlíku v každé z alkylových části; nebo

R₁₂ představuje azetidin-l-ylskupinu, pyrrolidin-l-ylskupinu nebo piperidin-l-ylskupinu, z nichž každá je substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z karboxyskupiny, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, hydroxyalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku, aminoalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku, mono-N- a di-N,N-alkylaminoalkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku v každé z alkylových části, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, aminoskupiny, mono-Na di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, oxoskupiny, hydroxyiminoskupiny a alkoxyiminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku; a • · kruhy v R₁₂ jsou popřípadě přídavně substituovány jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z alkylskupin s 1 až 5 atomy uhlíku.

a) R^ představuje 5-chlor, R₁₀ a Rjj představují atomy vodíku, R₄ představuje 4-fluorbenzylskupinu, R₁₂představuje 4-hydroxypiperidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S);

b) R-^ představuje 5-chlor, R₁₀ a R·^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R₁₂ představuje 3-hydroxypiperidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S);

c) R^ představuje 5-chlor, R₁₀ a Rjj představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R₁₂ představuje cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S);

d) R_x představuje 5-chlor, R₁₀ a R_1]L představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R₁₂ představuje 3-hydroxyiminopyrrolidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S);

e) Rj představuje 5-chlor, R₁₀ a R-q představují atomy vodíku, R₄ představuje 2-fluorbenzylskupinu, R₁₂představuje 4-hydroxypiperidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S);

f) R^^ představuje 5-chlor, R₁₀ a R_i;l představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R₁₂ představuje

(3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S);

g) Rj představuje 5-chlor, R₁₀ a R_X1 představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R₁₂ představuje 3-hydroxyazetidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S);

h) Rj představuje 5-chlor, R₁₀ a R·^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R₁₂ představuje

3- hydroxyiminoazetidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S); a

i) Rj představuje 5-chlor, R₁₀ a R_i;l představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R₁₂ představuje

4- hydroxyiminopiperidin-l-ylskupinu a stereochemie uhlíkového atomu (a) je (S);

Z výše uvedené první skupiny přednostních sloučenin se dává větší přednost sloučeninám, které spadají do druhé skupiny zvláště přednostních sloučenin obecného vzorce IA, kde

R₄ představuje atom vodíku, fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, thien-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž kruhy v R₄ jsou substituovány jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomů vodíku a fluoru;

představuje skupinu vzorce C(O)NR₈R_g; a • · · · · · · · • · · ♦··· · · · ···· · · · · · • ·*····· · · ·· ·

Rg představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, hydroxyskupinu nebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku; a

R₉ představuje atom vodíku, cykloalkylskupinu se 4 až atomy uhlíku, cykloalkylalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku v cykloalkylové a 1 až 5 atomy uhlíku v alkylové části, methylen-perfluorovanou alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alkylové části, pyridylskupinu, pyrrolidinylskupinu, oxazolilylskupinu, thiazolylskupinu, imidazolylskupinu, piperidylskupinu, benzothiazolylskupinu nebo thiochromanylskupinu; nebo

R_g představuje alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, která je popřípadě substituována substituentem zvoleným ze souboru sestávajícího z cykloalkenylskupiny se 4 až 6 atomy uhlíku, fenylskupiny, thienylskupiny, pyridylskupiny, pyrrolidinylskupiny, oxazolylskupiny, thiazolylskupiny, imidazolylskupiny, pyrazolylskupiny, piperidylskupiny, morfolinylskupiny, thiomorfolinylskupiny, 1-oxothiomorfolinylskupiny a 1,1-dioxothiomorfolinylskupiny, přičemž uvedená alkylskupina s 1 až 5 atomy uhlíku nebo alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku je popřípadě přídavně substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, aminoskupiny, mono-N- a di-N,Nalkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, kyanoskupiny, karboxyskupiny a alkoxykarbonylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části; a ·· · ·· · kde každý z kruhů v Rg je na uhlíku popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, aminoskupiny, mono-N- a di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, karbamoylskupiny, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části a karbamoylskupiny.

Z bezprostředně předcházející druhé skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost sloučeninám, kde

a) Rj představuje 5-chlor, R₁₀ a R^j představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_g představuje methylskupinu, R_g představuje 3-(dimethylamino)propylskupinu;

b) stereochemie na atomu uhlíku (a) je (S);

R^ představuje 5-chlor, R₁₀ a R-^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_g představuje methylskupinu a R_g představuje 3-pyridylskupinu;

c) stereochemie na atomu uhlíku (a) je (S);

R_x představuje 5-chlor, R₁₀ a R_i;l představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_g představuje methylskupinu a R_g představuje 2-hydroxyethylskupinu a

d) stereochemie na atomu uhlíku (a) je (S);

R₃ představuje 5-fluor, R₁₀ a R₁₃ představují atomy vodíku, R₄ představuje 4-fluorfenylmethylskupinu, R_g představuje methylskupinu a R_g představuje 2-morfolinoethylskupinu.

Třetí skupinou zvláště přednostních sloučenin jsou sloučeniny, které spadají do první skupiny přednostních sloučenin, kde ·· ·

Rg představuje skupinu vzorce C(O)NRgR_g; a

R_g představuje alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, která je popřípadě substituována substituentem zvoleným ze souboru sestávajícího z cykloalkenylskupiny se 4 až 6 atomy uhlíku, fenylskupiny, thienylskupiny, pyridylskupiny, pyrrolidinylskupiny, oxazolylskupiny, thiazolylskupiny, imidazolylskupiny, pyrazolylskupiny, piperidylskupiny, morfolinylskupiny, thiomorfolinylskupiny, 1-oxothiomorfolinylskupiny a 1,1-dioxothiomorfolinylskupiny, přičemž uvedená alkylskupina s 1 až 5 atomy uhlíku nebo alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku je popřípadě přídavně substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku, aminoskupiny, mono-N- a di-N,Nalkylaminoskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, kyanoskupiny, karboxyskupiny a alkoxykarbonylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části; a ·· 9 ·♦ · ·· • 99 9 · · · · * · • · · · 9 · · · · • 9999999 · · · 9 9

9 99 ·9· 99 999 kde každý z kruhů v R_g je na uhlíku popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, aminoskupiny, mono-N- a di-N,N-alkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, karbamoylskupiny, alkoxykarbonylskupiny s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části a karbamoylskupiny.

Z bezprostředně předcházející třetí skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost sloučeninám, kde

a) R-l představuje 5-chlor, R₁₀ a R^l představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_g představuje methylskupinu, R_g představuje 2-hydroxyethoxyskupinu;

b) stereochemie na atomu uhlíku (a) je (S);

R^ představuje 5-chlor, R₁₀ a R^ představují atomy vodíku, R₄ představuje 4-fluorfenylmethylskupinu, R_g představuje methylskupinu a R_g představuje methoxyskupinu; a

c) stereochemie na atomu uhlíku (a) je (S);

R^ představuje 5-chlor, R₁₀ a Rj-^ představují atomy vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, R_g představuje methylskupinu a R_g představuje methoxyskupinu.

Druhou skupinu přednostních sloučenin obecného vzorce IA tvoří sloučeniny, kde

Rj_ představuje skupinu 5-halogen, 5-methyl, 5-kyano nebo trifluormethyl;

4 • 4

4 4 4 4 4 • ·4444 4 4 4

4 4 4 4

4 44

R_lo á R-^ představuje každý nezávisle atom vodíku nebo atom halogenu;

A přestavuje skupinu -C(H)=;

R₂ a R₃ představují atomy vodíku;

R₄ představuje atom vodíku, fenylalkylskupinu s 1 až atomy uhlíku v alkylové části, thien-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, fur-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž každý z výše uvedených kruhů je nezávisle substituován jedním nebo dvěma atomy vodíku nebo fluoru;

R₅ představuje atom vodíku; a

R₆ představuje alkoxykarbonylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části.

Třetí skupinu přednostních sloučenin obecného vzorce IA tvoří sloučeniny, kde

R^ představuje skupinu 5-halogen, 5-methyl, 5-kyano nebo trifluormethyl;

R₁₀ a představuje každý nezávisle atom vodíku nebo atom halogenu;

A přestavuje skupinu -C(H)=;

R₂ a R₃ představují atomy vodíku;

R₄ představuje atom vodíku, methylskupinu nebo fenylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové • 9 9

9 9 • 9 9 9 • 99999 • 99

9 ·

• · části, přičemž uvedená fenylskupina je substituovaná jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z atomu vodíku, atomu halogenu, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny a přičemž je uvedená fenylskupina popřípadě přídavně nezávisle substituována jedním nebo dvěma atomy vodíku nebo halogenu; nebo

-4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, isothiazol-3-, -4- nebo -5-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alky- lové části, pyridazin-3- nebo -4-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrimidin-2-,

-4-, -5- nebo -6-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, pyrazin-2- nebo -3-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části nebo l,3,5-triazin-2-ylalkylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, přičemž heterocyklický zbytek v R₄ je na uhlíku popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty nezávisle zvolenými

4 4 4 4 4 · ·· • ····· · · · 4 4 4 4

4 4 444 44 ze souboru sestávajícího z atomu halogenu, trifluor methylskupiny, alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny a hydroxyskupiny;

R₅ představuje atom vodíku; a

R₆ představuje karboxyskupinu.

Z této třetí skupiny přednostních sloučenin se dává přednost sloučeninám, které spadají do první skupiny zvláště přednostních sloučenin, kde

R₁₀ a R^^. představují atomy vodíku a

R₄ představuje atom vodíku.

Z bezprostředně předcházející skupiny zvláště přednostních sloučenin se dává přednost sloučeninám, kde Rj představuje 5-chlor.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je způsob léčení savců postižených stavem resistence na insulin, jehož podstata spočívá v tom, že se savci postiženému stavem resistence na insulin podává terapeuticky účinné množství

a) první sloučeniny, přičemž touto první sloučeninou je inhibitor aldosa reduktasy; a

b) druhé sloučeniny, přičemž touto druhou sloučeninou je inhibitor glykogen fosforylasy.

Jako příklady stavů resistence na insulin, at již individuálně nebo ve skupině, je možno přednostně uvést diabetes, hyperinsulinemii, porušenou glukosovou toleranci,

Μ 9 • · · · • · « 9 9

9999999 hyperglykemii a/nebo hyperlipidemii po jídle, diabates typu II, změněné složení těla, snížení hmoty svalové tkáně, která v podstatě neobsahuje tuk, obesitu (zejména abdominální viscerální obesitu), hypertensi, dyslipidemii (například zvýšenou hladinu volných mastných kyselin, triglyceridů,

VLDL cholesterolu a LDL cholesterolu a sníženou hladinu HDL cholesterolu), atherosklerosu, tkáňovou ischemii a kardiovaskulární choroby, obesitu, syndrom X (který je také označován jako metabolický syndrom), těhotenství, infekční stavy, urémii, hyperadrogenismus, hyperkortisolemii a jiné stavy nadbytku adrenokortikálních hormonů, akromegalii, nadbytek růstového hormonu nebo polycystická ovaria.

Takovým stavem je zejména dyslipidemie, tkáňová ischemie, obesita, polycystická ovaria, syndrom X a hypertense.

Stavem resistence na insulin je zvláště přednostně diabetes.

Inhibitorem aldosa reduktasy je přednostně 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolyljmethyl]-1-ftalazinoctová kyselina nebo její farmaceuticky vhodná sůl.

Inhibitorem glykogen fosforylasy je přednostně [(1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-((3S)-hydroxypyrrolidin-l-yl)-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

·· ·· · • 9

• * ····

9

[(1S)—((R)-hydroxydimethylkarbamoylmethyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S) -(R)-hydroxymethoxymethylkarbamoyl)methyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

t(1S)-((R)-hydroxy-[(2-hydroxyethyl)methylkarbamoyl]methyl) -2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((cis)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)—(2R)— -hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyljamid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(1,l-dioxothiazolidin-3-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-(4-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-((3RS)-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

• A A AAA • AAA · A • A A A A A A · A • A A A ·

AA A A* A [2-oxo-2-((1RS)-oxothiazolidin-3-yl)ethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny; nebo [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.

Ve zvláště přednostním provedení je savcem člověk mužského nebo ženského pohlaví.

Dále se dává přednost provedení, podle něhož se první sloučenina a druhá sloučenina podávají v podstatě simultánně.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je synergická famaceutická kompozice pro zvyšování citlivosti na insulin u savců, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje

a) množství první sloučeniny, kterou je inhibitor aldosa reduktasy; a

b) množství druhé sloučeniny, kterou je inhibitor glykogen fosforylasy přičemž množství první sloučeniny samotné a množství druhé sloučeniny samotné nepostačuje pro zvýšení citlivosti na insulin, podává-li se samotné, a kombinovaný účinek množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny je vyšší než součet účinků zvyšujících citlivost na insulin, kterých lze dosáhnout s množstvími první a druhé sloučeniny odděleně;

a farmaceuticky vhodné ředidlo nebo nosič.

Dalším předmětem vynálezu je kit, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje

a) terapeuticky účinné množství inhibitoru aldosa reduktasy a farmaceuticky vhodný nosič v první jednotkové dávkovači formě;

b) terapeuticky účinné množství inhibitoru glykogen fosforylasy a farmaceuticky vhodný nosič ve druhé jednotkové dávkovači formě; a

c) kontejner pro uvedenou první a druhou dávkovači formu.

Dále je předmětem vynálezu synergický způsob zvyšování citlivosti na insulin u savců, kteří trpí stavy resistence na insulin, jehož podstata spočívá v tom, že se takovému savci podává

a) množství první sloučeniny, kterou je inhibitor aldosa reduktasy; a

b) množství druhé sloučeniny, kterou je inhibitor glykogen fosforylasy přičemž množství první sloučeniny samotné a množství druhé sloučeniny samotné nepostačuje pro zvýšení citlivosti na insulin, podává-li se samotné, a kombinovaný účinek množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny je vyšší než součet účinků zvyšujících citlivost na insulin, kterých lze dosáhnout s množstvími první a druhé sloučeniny odděleně.

Dalším předmětem vynálezu je způsob snižování poškození tkání, které jsou, nebo by mohla být, vyvolána ischemií, jehož podstata spočívá v tom, že se savci, který takové léčení potřebuje, podává terapeuticky účinné množství

a) inhibitoru aldosa reduktasy; a

b) inhibitoru glykogen fosforylasy.

Přednostními ischemickými tkáněmi, bráno jednotlivě nebo jako skupina, jsou ischemické tkáně srdce, mozku, jater, ledvin, plic, střeva, kosterního svalstva, sleziny, slinivky, nervů, míchy, retiny, vaskulatura nebo intestinální tkáň.

Zvláště přednostní tkání je tkáň srdce.

Kombinace podle vynálezu se přednostně podává profylakticky.

K ischemickému poškození, které je léčitelné podle tohoto vynálezu, může dojít během transplantace orgánu.

Kombinace podle vynálezu se přednostně podává před operací srdce.

Pod pojmem stavy resistence na insulin se rozumějí stavy (syndrom nebo stav resistence na insulin), při nichž je citlivost a/nebo responsibilita na insulin v orgánech, tkáních nebo buňkách organismu savce ve srovnání s normálním stavem (či stavem citlivosti na insulin) snížena. Tato resistence vede k mnohačetným abnormalitám v metabolismu glukosy, proteinů a lipidů, nerovnováze elektrolytů a iontů a růstu například orgánů, tkání a buněk, což se může manifestovat v podobě jednoho nebo většího počtu stavů, jejichž neomezujícími příklady jsou hyperinsulinemie, porušená glukosová tolerance (IGT), hyperglykemie a/nebo hyperlipidemie po jídle, diabetes typu II, změněné složení těla, snížení hmoty svalové tkáně, která v podstatě neobsahuje tuk, obesita (zejména abdominální viscerální obesita), hypertense, dyslipidemie (například zvýšená hladina volných mastných kyselin, triglyceridů, VLDL cholesterolu a LDL cholesterolu ··· ···· · · · ···· ·· · ·· • ······· · · · · · a snížená hladina HDL cholesterolu), atherosklerosa, tkáňová ischemie a kardiovaskulární choroby (Kopelman a Albon,

1997; DeFronzo a Ferrannini, 1991; Reaven, 1991; Malmstrom et al., 1997). Výsledkem stavu resistence na insulin je, že pro přístup nebo dosažení stejného biologického účinku insulinu v orgánech, tkáních a buňkách je ve srovnání s normálním stavem (či stavem citlivosti na insulin) třeba většího množství insulinu. To ve slinivce vede ke zvýšení nároku na sekreci většího množství insulinu (zhoršená hyperinsulinemie), a v extrémním případě selhání slinivky a nedostatku insulinu, který vede k diabetickému stavu typu I. Stavy resistence na insulin mohou například zahrnovat obesitu, syndrom X (také označovaný jako metabolický syndrom), těhotenství nebo infekční stavy, urémii, hyperadrogenismus, hyperkortisolemii a jiné stavy nadbytku adrenokortikálních hormonů, akromegalii, nadbytek růstového hormonu nebo polycystická ovaria nebo mohou být spojeny s vyšším věkem nebo specifickými ethnickými skupinami (Kopelman a Albon, 1997).

Pod pojmem účinek zvyšující citlivost na insulin se rozumí účinek, který pacientovy tkáně přiměje k normální nebo lepší než normální biologické odpovědi na dané množství insulinu.

Do rozsahu pojmu snížení kromě v podstatě úplné prevence spadá také prevence částečná, která je méně než 100%, avšak vyšší, než jsou výsledky dosažené za použití placeba nebo bez podávání léčiva.

Pod pojmem tkáňové poškození vyvolané ischemii se rozumí stavy, které jsou přímo spojeny se snížením přívodu krve ke tkáni, například vlivem sraženiny nebo obstrukce cév, které danou tkáň zásobují krví, což mj. vede ke snížení dodávky kyslíku této tkáni, zhoršení jejího výkonu, dysfunk999·· 9 9 •9 9 99 999 99 999 ci a nekrose. V alternativním případě, kdy je krevní tok a perfuse orgánů kvantitativně adekvátní, může být kapacita krve nebo perfušního média přenášet kyslík snížena, například v hypoxickém prostředí, takže dochází k chudšímu zásobování tkání kyslíkem a následné poruše výkonu, dysfunkci a nekrose tkáně.

Pod pojmem inhibitor aldosa reduktasy se rozumí sloučeniny, které inhibují biokonversi glukosy na sorbitol katalysovanou enzymem aldosa reduktasou.

Pod pojmem inhibitor glykogen fosforylasy se rozumí jakákoliv látka, činidlo nebo kombinace látek a/nebo činidel redukující, retardující nebo eliminující enzymatické působení glykogen fosforylasy. Enzymatické působení glykogen fosforylasy, které je v současné době známo, spočívá v degradaci glykogenu katalýzou reversibilní reakce makromolekuly glykogenu a anorganického fosfátu na glukosa-l-fosfát a makromolekulu glykogenu, která je o jeden glukosylový zbytek kratší než původní makromolekula glykogenu (při reakci probíhající ve směru glykogenolýzy).

Pod označením léčení se zde rozumí také preventivní (tj. profylaktické) a palliativní ošetření.

Přívlastku farmaceuticky vhodný se používá pro označení nosičů, ředidel, excipientů a/nebo solí, které musí být kompatibilní s dalšími složkami formulace a nepoškozují recipienta.

Pod pojmem proléčiva se rozumí sloučeniny, které jsou prekursory léčiv, které po podání působením určitého chemického nebo fyziologického mechanismu uvolňují léčivo in vivo (například se proléčivo vystaví fyziologickému pH nebo se na požadovanou formu léčiva převede enzymatickým působě61 ··· ·· · ·· • · · ···· · · · ním). Taková proléčiva například při štěpení uvolňují odpovídající volnou kyselinu.

Pod pojmem alkylen se rozumí nasycený uhlovodíkový zbytek s řetězcem přímým nebo rozvětveným, ž jehož obou terminálních atomů uhlíku je odstraněn vodíkový atom. Jako příklady takových skupin (které berou v úvahu stanovenou délku řetězce) je možno uvést methylen-, ethylen-, propylen-, butylen-, pentylen-, hexylen- a heptylenskupinu.

Pod pojmem halogen se rozumí chlor, brom, jod nebo fluor.

Pod pojmem alkyl se rozumí nasycený uhlovodíkový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Jako příklady takových alkylskupin (které berou v úvahu stanovenou délku řetězce) je možno uvést methyl-, ethyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, sek.butyl-, terč.butyl-, pentyl-, isopentyl-, neopentyl-, terč.pentyl-, 1-methylbutyl-, 2-methylbutyl-, 3-methylbutyl-, hexyl-, isohexyl-, heptyl- a oktylskupinu.

Pod pojmem alkoxy se rozumí nasycená alkylskupina s řetězcem přímým nebo rozvětveným, která je vázána přes atom kyslíku. Jako příklady takových alkoxyskupin (které berou v úvahu stanovenou délku řetězce) je možno uvést methoxy-, ethoxy-, propoxy-, isopropoxy-, butoxy-, isobutoxy-, terč.butoxy-, pentoxy-, isopentoxy-, neopentoxy-, terč.pentoxy-, hexoxy-, isohexoxy-, heptoxy- a oktoxyskupinu.

V uvedených mono-N- nebo di-N,N-alkylových skupinách s 1 až x atomy uhlíku v každé z alkylových částí (kde x představuje celé číslo), je počet atomů uhlíku každé z alkylových částí brán nezávisle.

Jestliže karbocyklický nebo heterocyklický zbytek může být vázán nebo jinak připojen k uvedenému substrátu prostřednictvím různých atomů kruhu a konkrétní místo takového připojení není uvedeno, potom přicházejí v úvahu všechna možná místa připojení, ať již prostřednictvím atomu uhlíku, nebo například trojvazného atomu dusíku. Tak se například pod pojmem pyridyl rozumí 2-, 3- nebo 4-pyridylskupina, pod pojmem thienyl 2- nebo 3-thienylskupina atd.

Pod pojmem farmaceuticky vhodné soli se rozumějí soli obsahující netoxické anionty. Jako neomezující příklady takových solí je možno uvést chlorid, bromid, jodid, sulfát, hydrogensulfát, fosfát, acetát, maleát, fumarát, oxalát, laktát, tartrát, citrát, glukonát, methansulfonát a 4-toluensulfonát. Do rozsahu pojmu farmaceuticky vhodné soli rovněž spadají soli s netoxickými kationty. Jako neomezující příklady takových solí je možno uvést soli, které obsahují kationty sodíku, draslíku, vápníku, hořčíku, amonia nebo protonovaného benzathinu (N,N'-dibenzylethylendiaminu), cholinu, ethanolaminu, diethanolaminu, ethylendiaminu, megluminu (N-methylglukaminu), benethaminu (N-benzylfenylethylaminu), piperazinu nebo tromethaminu (2-amino-2hydroxymethyl-1,3-propandiolu).

Pod pojmem rozpouštědlo inertní vůči reakci nebo inertní rozpouštědlo se v tomto textu rozumí rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel neinteragující s výchozími látkami, reakčními činidly, meziprodukty nebo produkty způsobem, který by měl nepříznivé účinky na výtěžek požadovaného produktu.

Znaménka + nebo v závorkách označují směr, jakým konkrétní stereoisomer otáčí rovinu polarizovaného světla.

• · « · · · · · • · · ···· · · · • · · · ·· · ·· • ······· · · · « ·

Odborníku v oboru chemie bude jasné, že určité sloučeniny podle tohoto vynálezu budou obsahovat jeden nebo více atomů, které mohou být ve zvláštních stereochemických nebo geometrických konfiguracích za vzniku stereoisomerů a konfiguračních isomerů. Všechny takové isomery a jejich směsi jsou předmětem tohoto vynálezu.

Do rozsahu vynálezu také spadají hydráty a solváty sloučenin podle vynálezu.

Zkratkou DTT se označuje dithiothreitol, zkratkou DMSO se označuje dimethylsulfoxid a zkratkou EDTA ethylendiamintetraoctová kyselina.

Další znaky a výhody vynálezu budou zřejmé z dále uvedeného podrobného popisu a nároků.

Sloučeniny podle vynálezu je možno připravovat za použití o sobě známých způsobů, zejména ve světle popisu, který je uveden v tomto textu. Některé způsoby výroby sloučenin podle vynálezu představují další znaky tohoto vynálezu a jsou ilustrovány v následujících reakčních schématech. Jiné způsoby mohou být popsány v příkladech provedení vynálezu.

Jako sloučeniny (účinné látky) podle tohoto vynálezu je možno použít jakéhokoliv inhibitoru aldosa reduktasy. Pod pojmem inhibitor aldosa reduktasy se rozumí sloučeniny, které inhibují biokonverzi glukosy na sorbitol katalyzovanou enzymem aldosa reduktasou. Takovou inhibici odborník v tomto oboru snadno staví za použití standardních zkoušek (J. Malone, Diabetes, 29: 861 až 864, 1980, Red Cell Sorbitol, an Indicator of Diabetic Control). Různé inhibitory aldosa reduktasy jsou uvedeny dále s příslušnými odkazy. Odborníkům v tomto oboru však budou známy ještě další takové látky. US patenty jsou zde uváděny náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu. Spolu s odkazy na příslušnou patentovou literaturu, která se týká daných sloučenin, jsou tyto látky popsány za použití chemického názvosloví USÁN a dalších označení v závorkách, pokud je lze použít.

Aktivitu inhibitoru aldosa reduktasy v tkáni je možno stanovit tak, že se zkouší množství inhibitoru aldosa reduktasy, které je potřebné pro snížení tkáňového sorbitolu (tj. inhibicí další produkce sorbitolu následkem blokování aldosa reduktasy) nebo snížení tkáňové fruktosy (inhibici produkce sorbitolu následkem blokování aldosa reduktasy a následkem toho produkce fruktosy). Aniž bychom se chtěli vázat jakoukoliv konkrétní teorií nebo mechanismem, máme za to, že inhibitor aldosa reduktasy inhibicí aldosa reduktasy zabraňuje poškození následkem ischemie neboje snižuje, jak je popsáno dále.

Jako příklady inhibitorů aldosa reduktasy, které jsou užitečné v kompozicích a při způsobech podle vynálezu, je tedy možno uvést:

1. 3-(4-brom-2-fluorbenzyl)-3,4-dihydro-4-oxo-l-ftalazinoctovou kyselinu (ponalrestat, US 4 251 528);

2. N-{[(5-trifluormethyl)-6-methoxy-l-naftalenyl]thioxomethyl}-N-methylglycin (tolrestat, US 4 600 724);

3. 5-[(Z,E)-p-methylcinnamyliden]-4-oxo-2-thioxo-3-thiazolidenoctovou kyselinu (epalrestat, US 4 464 382,

US 4 791 126, US 4 831 045);

4. 3-(4-brom-2-fluorbenzyl)-7-chlor-3,4-dihydro-2,4-dioxo-l(2H)-chinazolinoctovou kyselinu (zenarestat,

US 4 734 419 a 4 883 800);

5. 2R,4R-6,7-dichlor-4-hydroxy-2-methylchroman-4-octovou kyselinu (US 4 883 410);

6. 2R,4R-6,7-dichlor-6-fluor-4-hydroxy-2-methylchroman-4-octovou kyselinu (US 4 883 410)

7. 3,4-dihydro-2,8-diisopropyl-3-oxo-2H-l,4-benzoxazin-4-octovou kyselinu (US 4 771 050);

8. 3,4-dihydro-3-oxo-4-[(4,5,7-trifluor-2-benzothiazolyl)methyl]-2H-1,4-benzothiazin-2-octovou kyselinu (SPR-210, US 5 252 572);

9. N-[3,5-dimethyl-4-[(nitromethyl)sulfonyl]fenyl]-2-methylbenzenacetamid (ZD5522, US 5 270 342 a US 5 430 060);

10. (S)-6-fluorspiro[chroman-4,4'-imidazolidin]-2,5'-dion (sorbinil, US 4 130 714);

11. d-2-methyl-6-fluorspiro(chroman-4',4'-imidazolidin)-2',5'-dion (US 4 540 704);

12. 2-fluorspiro(9H-fluoren-9,4'-imidazolidin)2',5'-dÍon (US 4 438 272);

. 2,7-difluorspiro(9H-fluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dÍon (US 4 436 745, US 4 438 272);

14. 2,7-difluor-5-methoxyspiro(9H-fluoren-9,4 ' -imidazolidin)-2',5'-dion (US 4 436 745, US 4 438 272);

• 9999999 9

9 99

15. 7-fluorspiro(5H-indenol[l,2-b]pyridin-5,3'-pyrrolidin)-2,5'-dion (US 4 436 745, US 4 438 272);

16. d-cis-6'-chlor-2',3'-dihydro-2'-methylspiro(imidazolidin-4,4'-4'-H-pyrano(2,3-b)pyridin)-2,5-dion (US 4 980 357);

17. spiro[imidazolidin-4,5'(6H)chinolin]-2,5-dion-3'-chlor-7',8'-dihydro-7'-methyl-(5'-cis) (US 5 066 659);

18. (2S,4S)-6-fluor-2',5'-dioxospiro(chroman-4,4'-imidazolidin)-2-karboxamid (US 5 447 946) a

19. 2-[(4-brom-2-fluorfenyl)methyl]-6-fluorspiro[isochinolin-4(1H),3'-pyrrolidin]-l,2',3,5'(2H)tetron (ARI-509, US 5 037 831)

Jako příklady jiných inhibitorů aldosa reduktasy je možno uvést sloučeniny obecného vzorce I

kde

Z představuje kyslík nebo síru;

R¹ představuje hydroxyskupinu nebo skupinu, kterou je možno odstranit in vivo za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, kde R¹ představuje hydroxyskupinu; a ·· · ·· 4 44 • 4 · «··· 4 4 4 • · · · · 4 · · · • ······« · · ·· 4

4 44 444 44 444

X a Ý jsou stejné nebo různé a představují každý nezávisle vodík, trifluormethylskupinu, fluor nebo chlor;

a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Z výše uvedených inhibitorů aldosa reduktasy se dává přednost sloučeninám číslo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10 a 17 a následujícím sloučeninám obecného vzorce I:

20. 3,4-dihydro-3-(5-fluorbenzothiazol-2-ylmethyl)-4-oxoftalazin-l-yloctové kyselině [R¹ = hydroxy, X = F, Y = H]

21. 3-(5,7-difluorbenzothiazol-2-ylmethyl)-3,4-dihydro-4-oxoftalazin-l-yloctové kyselině [R¹ = hydroxy, X = = Y = F];

22. 3-(5“Chlorbenzothiazol-2-ylmethyl)-3,4-dihydro-4-oxoftalazin-l-yloctové kyselině [R¹ - hydroxy, X = Cl,

Y = H];

23. 3-(5,7-dichlorbenzothiazol-2-ylmethyl)-3,4-dihydro-4-oxoftalazin-l-yloctové kyselině [R¹ = hydroxy, X = = Y = Cl];

24. 3,4-dihydro-4-oxo-3-(5-trifluormethylbenzoxazol -2-ylmethyl)ftalazin-l-yloctové kyselině [R¹ = hydroxy, X = CF₃, Y = H];

25. 3,4-dihydro-3-(5-fluorbenzoxazol-2-ylmethyl)-4-oxoftalazin-l-yloctové kyselině [R¹ = hydroxy, X = F, Y =

H];

26. 3-(5,7-difluorbenzoxazol-2-ylmethyl)-3,4-dihydro-4-oxoftalazin-l-yloctové kyselině [R¹ = hydroxy, X = = Y = F];

27. 3-(5-chlorbenzoxazol-2-ylmethyl)-3,4-dihydroη

-4-oxoftalazin-l-yloctove kyselině [R = hydroxy, X = Cl,

Y = H];

28. 3-(5,7-dichlorbenzoxazol-2-ylmethyl)-3,4-dihydro-4-oxoftalazin-l-yloctové kyselině [R^x = hydroxy,

X = Y = Cl] a

29. zopolrestatu, 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolyl]methyl]-1-ftalazinoctové kyselině [R¹ = hydroxy, X = trifluormethyl, Y = H].

Ve sloučeninách 20 až 23 a 29 Z představuje síru a ve sloučeninách 24 až 28 Z představuje kyslík.

Z výše uvedené podskupiny přednostních sloučenin se větší přednost dává sloučeninám 20 až 29 a zvláštní přednost se dává sloučenině 29.

Sloučeniny, které jsou inhibitory aldosa reduktasy podle vynálezu, jsou snadno dostupné nebo je odborník v tomto oboru může snadno syntetizovat za použití obvyklých postupů syntézy organických sloučenin, zejména s ohledem na popisy obsažené v relevantní patentové literatuře.

Jako druhou sloučeninu podle vynálezu je možno použít jakéhokoliv inhibitoru glykogen fosforylasy. Pod pojmem inhibitor glykogen fosforylasy se rozumí jakákoliv látka, činidlo nebo kombinace látek a/nebo činidel redukující, retardující nebo eliminující enzymatické působení glykogen fosforylasy. Enzymatické působení glykogen fosfo69 * ·4 4 44 4

444 4 4 ·4 44 44 • 444 44 4 44 4

4 4444 444 4444 4

4 44 4 4· 4

4 ·4 4 4 4 44 444 rylasy, které je v současné době známo, spočívá v degradaci glykogenu katalýzou reversibilní reakce makromolekuly glykogenu a anorganického fosfátu na glukosa-l-fosfát a makromolekulu glykogenu, která je o jeden glukosylový zbytek kratší než původní makromolekula glykogenu (při reakci probíhající ve směru glykogenolýzy). Takové účinky odborník v tomto oboru snadno stanoví za použití standardních zkoušek (jaké jsou například popsány dále). Různé takové sloučeniny jsou popsány ve zveřejněných PCT přihláškách WO 96/39384 a WO 96/39385. Odborníkům v tomto oboru však budou známy ještě další takové inhibitory glykogen fosforylasy.

Sloučeniny obecného vzorce I a IA je možno vyrobit způsoby, které jsou o sobě známé. Některé způsoby výroby sloučenin obecného vzorce I a IA, které tvoří další znaky tohoto vynálezu, jsou znázorněny dále v reakčních schématech

Reakční • · • ···* • · schéma

R10 R11 R10 R11 vodný

OH'

R4 R6 r₄

COOEt \

r₃ lil

-r₇ r₅ r₇

N \

r₃ r₅

R10 R11

Reakční schéma II ···

VIIIA

Reakční schéma III • · · • ····

z*⁶—Ry Rs

R-io R11

XVI ·· ·

- 73 Reakční schéma IV ^JT\

Rd

N CHO r₃

XX

CN

N I

R₃ OH XXI

Rd

R₃ OH XXIII

P_T\ b/COOAlkyl

N

XXV i>CONR₈R₉;C(O)R₁₂

HN

R₃ OH XXVI • ···· · • ·

Reakční schéma t?4

N COOH

I

R3 XXX

^R3 XXXII

XXXIII * ·*·· · ·

Reakční schéma

báze, R₃“X

COOH r₃ ^xli

1. PhCHO, redukce

2. NaCNBHs/RsCHÓ

3. vyčerpáv. H2, Pd/C

R4

HN COOH r₃

XXX

Reakční schéma VII » ······« 4 » · · · ⁴·· · ··

Ρτ^

4

Reakční schéma • 44 ·

4 4 · ·

4 4444 · 4 · · ·

VIII

LXIII

LXVI • · ₍··** » · í schéma IX

LXVIII r₃

LXIX

Reakční schéma

Podle reakčního schématu I se mohou sloučeniny obecného vzorce I, kde Rj, R₁₀, ^riv A, ^r2' ^R3' R4, ^r5' ^r6' R7 mají výše uvedený význam, připravovat kterýmkoliv ze dvou dále uvedených obecných postupů. Při prvním postupu se slou• ···· · · cenina obecného vzorce I může vyrobit kopulací příslušné indol-2-karboxylové kyseliny nebo indolin-2-karboxylové kyseliny obecného vzorce I s příslušným aminem obecného vzorce III (tj. acylací aminu obecného vzorce III). Při druhém z těchto postupů se sloučenina obecného vzorce I může připravit kopulací příslušné sloučeniny obecného vzorce IV (tj. sloučeniny obecného vzorce I, kde Rg představuje karboxyskupinu) s příslušným alkoholem obecného vzorce R_gR_gNH nebo aminem nebo alkoholem obecného vzorce R₁₂H, ^{kde R}8' ^R9 a R₁₂ mají výše uvedený význam (tj. acylací tohoto aminu nebo alkoholu).

Obvykle se přitom postupuje tak, že se sloučenina vzorce II smíchá se sloučeninou vzorce III (nebo se sloučenina vzorce IV smíchá s příslušným aminem) (například vzorce R₁₂H nebo R_gR₉NH) nebo alkoholem za přítomnosti vhodného kopulačního činidla. Vhodným kopulačním činidlem je činidlo, které převádí karboxylovou kyselinu na reaktivní látku, která je schopna reakcí s aminem nebo alkoholem vytvořit amidovou nebo esterovou vazbu.

Kopulačním činidlem může být reakční činidlo, které je schopno při smísení karboxylové kyseliny s aminem nebo alkoholem vyvolat kondenzaci těchto látek v jedné reakční nádobě. Pokud se má kyselina kondenzovat s alkoholem, přednostně se jako reakčního rozpouštědla používá velkého nadbytku tohoto alkoholu, popřípadě za přidání 1,0 až 1,5 ekvivalentu přidaného dimethylaminopyridinu. Jako příklady kopulačních činidel je možno uvést kombinaci l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidhydrochloridu s hydroxybenzotriazolem (DEC/HBT), karbonyldiimidazol, kombinaci dicyklohexylkarbodiimidu s hydroxybenzotriazolem (HBT) a 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolin (EEDQ), kombinaci karbonyldiimidazolu a HBT a diethylfosforylkyanid. Kopulace se provádí v inertním rozpouštědle, přednost• · · ·«

ně v aprotickém rozpouštědle, při teplotě od asi -20 do asi 50°C, po dobu od asi 1 do asi 48 hodin, jako příklady vhodných rozpouštědel je možno uvést acetonitril, dichlormethan, dimethylformamid a chloroform.

Jako kopulačního činidla se také může použít činidla převádějícího karboxylovou kyselinu na aktivovaný meziprodukt, který se izoluje a/nebo který se vytvoří v prvním stupni, a potom se tento meziprodukt nechá reagovat ve druhém stupni s příslušným aminem nebo alkoholem. Jako příklady takových kondenzačních činidel je možno uvést thionylchlorid a oxalylchlorid (těmito činidly se karboxylová kyselina převádí na chlorid kyseliny), fluorid kyseliny kyanurové (tímto činidlem se karboxylová kyselina převádí na fluorid kyseliny) nebo alkylchlorformiát, jako je isobutyl- nebo isopropenylchlorformiát (za přítomnosti terciární aminové báze) (tímto činidlem se karboxylová kyselina převádí na směsný anhydrid karboxylové kyseliny). Pokud se jako kopulačního činidla používá oxalylchloridu, s výhodou se jako pomocného rozpouštědla, které se přidává k jinému rozpouštědlu (jako je například dichlormethan), spolupoužívá malého množství dimethylformamidu za účelem katalýzy tvorby chloridu kyseliny. Používání těchto kopulačních činidel a vhodná volba rozpouštědel a teplot leží v rozsahu zkušeností odborníků v tomto oboru a lze je také snadno určit na základě literárních údajů. Tyto a jiné příkladné podmínky, které jsou vhodné pro kopulace karboxylových kyselin, jsou popsány v publikaci Houben-Weyl, sv. XV, část II, E. Winsch, Ed., G. Thieme Verlag, 174, Stuttgart a M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag Berlin, 1984 a The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology (ed. E. Gross a J. Meienhofer), sv. 1 až 5 (Academie Press, NY, USA, 1979 až 1983).

• ·«·· · ·

4

Sloučeniny obecného vzorce IV, kde R_lz R₁₀, R_11z A, R₂, R₃, R₄, R₅ a R_? mají výše uvedený význam, je možno připravit z odpovídajícího esteru vzorce V (tj. sloučeniny obecného vzorce I, kde R_g představuje alkoxykarbonylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části nebo benzyloxykarbonylskupinu) hydrolýzou vodnou alkálií při teplotě od asi -20 do asi 100°C, obvykle při teplotě asi 20°C, po dobu od asi 30 minut do asi 24 hodin.

Alternativně se sloučeniny obecného vzorce IV připravují tak, že se indolkarboxylová kyselina obecného vzorce II aktivuje kopulačním činidlem (popsaným výše) a vzniklý aktivovaný meziprodukt (jako je chlorid kyseliny, fluorid kyseliny nebo směsný anhydrid) se potom nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce III, kde R₃, R₄, R₅ a R₇ mají význam uvedený výše a R₆ představuje karboxyskupinu, ve vhodném rozpouštědle za přítomnosti vhodné báze. Jako vhodná rozpouštědla je možno uvést vodu, methanol a jejich směsi, společně s pomocným rozpouštědlem, jako je dichlormethan, tetrahydrofuran nebo dioxan. Z vhodných bází je možno uvést hydroxid sodný, draselný nebo lithný, hydrogenuhličitan sodný nebo draselný, uhličitan sodný nebo draselný nebo uhličitan draselný spolu s tetrabutylamoniumbromidem (1 ekvivalent) v dostatečném množství pro spotřebování kyseliny uvolněné při reakci (obvykle v takovém množství, aby se hodnota pH reakční směsi udržela nad 8). Báze se může přidávat po částech spolu s aktivovaným meziproduktem, aby se zajistila vhodná regulace pH reakční směsi. Reakce se obvykle provádí při teplotě v rozmezí od -20 do 50°C. Izolační postupy může odborník v tomto oboru individuálně navrhnout tak, aby se odstranily nečistoty. Obvykle se přitom odstraňují s vodou mísitelná pomocná rozpouštědla odpařováním, nečistoty se extrahují organickými rozpouštědly při vysoké hodnotě pH, provede se okyselení na nízkou hodnotu pH (1 až 2) a požadovaný produkt se odfiltruje nebo extrahuje • 9 • ·

999 pomocí vhodného rozpouštědla, jako je ethylacetát nebo dichlormethan.

Sloučeninu obecného vzorce V je možno připravit kopulací vhodné sloučeniny obecného vzorce III, kde R_gpředstavuje alkoxykarbonylskupinu s vhodnou sloučeninou obecného vzorce II za použití postupu, který je analogický výše popsanému postupu (například za použití postupu A).

Alternativně se mohou sloučeniny obecného vzorce I obsahující atom síry v oxidačním stavu sulfoxidu nebo sulfonu připravovat z odpovídajících sloučenin obecného vzorce I obsahujících atom síry v neoxidované formě působením vhodného oxidačního činidla, jako například m-chlorperoxobenzoové kyseliny v dichlormethanu při teplotě od asi 0 do asi 25 °C po dobu od asi 1 do asi 48 hodin (pro konverzi na sulfoxidový oxidační stav je třeba použít asi 1 až asi 1,3 ekvivalentu kyseliny m-chlorperoxobenzoové a pro konverzi na sulfonový oxidační stav je zapotřebí použít této látky v množství vyšším než jsou asi 2 ekvivalenty.

Sloučeniny obecného vzorce I, které jsou v aminoalkoxyskupině ve zbytku R₅ mono- nebo dialkylovány, je možno alternativně připravit z odpovídajících sloučenin obecného vzorce I, kde R₅ představuje aminoalkoxyskupinu, monoalkylací nebo dialkylací aminoskupiny ve zbytku R₅ za vzniku požadovaných sloučenin obecného vzorce I. Taková mono- nebo dialkylace se může provádět tak, že se na R₅-aminoalkoxysloučeninu působí jedním ekvivalentem vhodné karbonylové sloučeniny (v případě monoalkylace) nebo více než dvěma ekvivalenty vhodné karbonylové sloučeniny (v případě dialkylace) a vhodným redukčním činidlem ve vhodném rozpouštědle. Vhodné redukční podmínky zahrnují použití natriumkyanoborhydridu nebo tetrahydroboritanu sodného v methanolu nebo ethanolu nebo použití vodíku za přítomnosti hydrogenač• · ního katalyzátoru (jako je palladium na uhlíku) v polárním rozpouštědle, jako je voda, methanol nebo ethanol, při teplotě od asi 0 do asi 60°C po dobu 1 až 48 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde R₅ představuje alkanoyloxyskupinu (RCOO-), je možno alternativně získat 0-acylací příslušné sloučeniny obecného vzorce I vhodným chloridem kyseliny nebo jiným aktivovaným derivátem kyseliny, popřípadě za přítomnosti vhodné báze (například terciární aminové báze, jako je trialkylamin nebo pyridin), přednostně v aprotickém rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran nebo dichlormethan, při teplotě od asi 0 do asi 50°C po dobu od asi 0,5 do asi 48 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde R₅ a R_? dohromady představují oxoskupinu, je možno alternativně vyrobit oxidací odpovídající sloučeniny obecného vzorce I, například sloučeniny, kde R₅ představuje hydroxyskupinu a R₇představuje atom vodíku, působením vhodného oxidačního činidla. Jako příklady vhodných oxidačních činidel je možno uvést Dess-Martinovo činidlo v dichlormethanu, karbodiimid a dimethylsulfoxid a kyselý katalyzátor (Pfitzner-Moffattovy podmínky nebo jejich modifikace, jako je použití vodorozpustného karbodiimidu) nebo reakce Swernova typu (například za použití směsi oxalylchloridu, dimethylsulfoxidu a triethylaminu). Sloučeniny obecného vzorce I obsahující jiné funkční skupiny citlivé k oxidaci je přitom možno chránit vhodnými chránícími skupinami, které se později odštěpí.

Tak například některé ze sloučenin obecného vzorce I v reakčním schématu I obsahují primární a sekundární aminoskupiny nebo karboxyskupiny v části molekuly definované symboly R₅ nebo R_g. Tyto skupiny mohou interferovat se zamýšlenou kopulační reakcí znázorněnou v reakčním schématu I, pokud se meziprodukt obecného vzorce III nebo amin obecného • ·

AA · ♦♦ .

A A A A A A

A · A A A · • A ···· · · · • A A · · »·

AA AAA vzorce R₁₂H nebo RgRgNH ponechá bez ochrany. Během kopulační reakce znázorněné v reakčním schématu I může být tedy primární nebo sekundární aminová funkční skupina chráněna vhodnou chránící skupinou, pokud je přítomna ve zbytcích R₅nebo Rg meziproduktu obecného vzorce III nebo v aminu (vzorce RgRgNH nebo R₁₂H). Jako produkt takové kopulační reakce se získá sloučenina obecného vzorce I obsahující chránící skupinu. Přítomná chránící skupina se může odštěpit v následném stupni za vzniku sloučeniny obecného vzorce I. Vhodné chránící skupiny pro chránění aminoskupiny a karboxyskupiny zahrnují chránící skupiny, kterých se běžně používá při syntéze peptidů (jako je N-terc.butoxykarbonylskupina, N-benzyloxykarbonylskupina a 9-fluorenylmethylenoxykarbonylskupina, v případě aminů a nižší alkylesterová skupina nebo benzylesterová skupina, v případě karboxylových kyselin) a které nejsou chemicky reaktivní za výše popsaných kopulačních podmínek (tyto podmínky jsou také uvedeny v postupu A, který bezprostředně předchází příkladové části) a které lze odstranit bez chemického pozměnění jiných funkčních skupin ve sloučenině obecného vzorce I.

Výchozí indol-2-karboxylové kyseliny a indolin2-karboxylové kyseliny, kterých se používá při reakci znázorněné v reakčním schématu I, jsou buď obchodně dostupné nebo známé z dosavadního stavu techniky (dosavadní stav techniky je v rozsáhlé míře publikován) nebo jsou dostupné běžnými syntetickými metodami. Tak například podle reakčního schématu II je možno indolester obecného vzorce VII vyrobit ze sloučeniny obecného vzorce VI (kde Q se volí tak, aby se získal zbytek A definovaný výše) Fischerovou syntézou indolů (viz The Fischer Indole Synthesis, Robinson B (Wiley, New York, USA, 1982), po níž se provede zmýdelnění výsledného indolesteru obecného vzorce VII za vzniku odpovídající kyseliny obecného vzorce VIII. Výchozí aryl85 ·· « ·» « ·· .., « » ·· · » . . t · · · * · · « · »«·« « · · · * · · • · · * · · · ’ hydrazon je možno připravit kondenzací snadno dostupného hydrazinu s příslušným karbonylovým derivátem nebo JappKlingemanovou reakcí (viz Organic Reactions, Philips R. R., 1959, 10, 143).

Indol-2-karboxylová kyselina obecného vzorce VIIIA se může připravit kondenzací o-methylnitrosloučeniny obecného vzorce IX s esterem kyseliny šřavelové, načež se vzniklý indolester obecného vzorce X redukuje na nitroskupině a vzniklý produkt se hydrolyzuje.

Tento třístupňový postup je znám jako Reissertova syntéza indolů (Reissert, Chemische Berichte 1897, 30,

1030). Podmínky vhodné pro provedení této sekvence a příslušné odkazy na další literaturu jsou uvedeny v Kermack, et al., J. Chem. Soc. 1921, 119, 1602; Cannon et al., J. Med. Chem. 1981, 24, 238; Julian et al., Heterocyclic Compounds, sv. 3 (Wiley, New York, USA, 1962, R. C. Elderfield, ed.) str. 18. Příklad specifického provedení této sekvence je uveden v příkladech 10A až 10C uvedených dále.

3-Halogen-5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny je také možno vyrobit halogenací 5-chlor-lH-indol-2-karboxylových kyselin.

Alternativně (vzhledem k reakčnímu schématu II) je možno substituované indoliny obecného vzorce XIV připravit redukcí odpovídajících indolů obecného vzorce XV redukčním činidlem, jako je hořčík v methanolu, při teplotě od asi 25 do asi 65°c během asi 1 až asi 48 hodin (viz reakční schéma III).

Indolinkarboxylové kyseliny obecného vzorce XVI se připravují zmýdelněním odpovídajícího esteru obecného vzorce XVII (viz reakční schéma III). Sloučeniny obecného vzorce • · •···· · ·

XVII se připravují redukcí odpovídajících indolesterů obecného vzorce VII redukčním činidlem, jako je hořčík v methanolu, způsobem popsaným výše v souvislosti s konverzí sloučenin obecného vzorce XV na sloučeniny obecného vzorce XIV.

V následujících odstavcích je popsána příprava různých aminů, kterých se používá při reakcích znázorněných ve výše uvedených reakčních schématech.

Podle reakčního schématu IV se sloučeniny obecného vzorce XXII (aminy obecného vzorce III z reakčního schématu I, kde R₅ představuje hydroxyskupinu, R₇ představuje atom vodíku a R₆ představuje esterovou skupinu) nebo sloučeniny obecného vzorce XXVI (R_g představuje skupinu vzorce C(O)NRgR_g nebo C(O)R₁₂) připravují z N-chráněného (chránění je znázorněno skupinou P_T) aldehydu obecného vzorce XX. Na aldehyd vzorce XX nebo na adukt aldehydu vzorce XX s hydrogensiřičitanem sodným se působí kyanidem draselným nebo kyanidem sodným ve vodném roztoku za přítomnosti pomocného rozpouštědla, jako je dioxan nebo ethylacetát, při teplotě od asi 0 do asi 50°C, za vzniku kyanhydrinu obecného vzorce XXI. Na tento kyanhydrin se působí alkoholem (například alkanolem s 1 až 6 atomy uhlíku, jako methanolem) a silně kyselým katalyzátorem, jako je chlorovodík, při teplotě od asi 0 do asi 50°C a potom se k reakční směsi popřípadě přidá voda. Je-li stále ještě přítomna chránící skupina ^PT' odštěpí se vhodnou deprotekční metodou, a tak se získá sloučenina obecného vzorce XXII. Je-li například N-chránicí skupinou P_Tve sloučenině vzorce XX terč.butoxykarbonylskupina (t-Boc), vznikne sloučenina vzorce XXIII přímo ze sloučeniny vzorce XXI a přídavek vody není nutný. Sloučenina vzorce XXII může být na dusíku chráněna vhodnou chránící skupinou, čímž vznikne sloučenina vzorce XXIII. Potom se může provést hydrolýza esteru vodnou alkálií při teplotě od asi 0 do asi 50°C v rozpouštědle, které je inertní vůči této reakci, a • · • · • · · • · · · · · • ♦······ ·

- 87 - ·..· : ·..· .

tak Se získá odpovídající hydroxykyselina obecného vzorce XXIV. Sloučenina vzorce XXIV se kopuluje (analogickým postupem vzhledem ke kopulačnímu postupu popsanému v reakčním schématu I) s příslušnou aminosloučeninou obecného vzorce RgRgNH nebo HR₁₂· Sloučenina obecného vzorce XXV, která vznikne při této reakci, se potom zbaví chránící skupiny za vzniku sloučeniny obecného vzorce XXVI (tj. sloučeniny obecného vzorce III, kde R^ představuje hydroxyskupinu, R? představuje atom vodíku a Rg představuje skupinu vzorce C(O)R₁₂ nebo C(O)NR_gRg. Příklad konverze kyanhydrinu obecného vzorce XXI na odpovídající methylester obecného vzorce XXII s odštěpením chránící skupiny t-Boc, je uveden v příkladu la PCT publikace WO/9325574. Jiné příklady reakcí, při nichž se kyanhydrin převádí na nižší alkylestery obecného vzorce XXIII, je možno nalézt v US patentu č.

814 342 a EP 0 438 233.

Některé sloučeniny obecného vzorce I jsou stereoisomerické díky stereochemické konfiguraci na atomech uhlíku označených písmeny a a b. Odborník v tomto oboru může vyrobit meziprodukty obecného vzorce XXII a XXVI s požadovanou stereochemii podle reakčního schématu IV. Tak například aldehyd vzorce XX je dostupný v obou enantiomerických formách (stereochemie na a) postupy popsanými v literatuře, které jsou uvedeny dále (viz reakční schéma V). Kyanhydrin obecného vzorce XXI je možno připravit ze sloučeniny obecného vzorce XX působením kyanidu sodného nebo draselného, jak je to popsáno výše za současného zachování stereochemie na atomu uhlíku a. Tak se získá směs stereoisomerů na atomu uhlíku b.

Pro oddělení isomerů nebo čištění jednoho z isomerů je v této fázi možno použít krystalizace.

• ·

Příprava sloučeniny vzorce XXI, kde P_T představuje BOC, R₃ představuje atom vodíku, R₄ představuje benzylskupinu, stereochemie na atomu uhlíku a je (S) a na atomu uhlíku b (R) za použití výše uvedeného postupu, jakož i čištění překrystalováním, jsou popsány v Biochemistry 1992, 31, 8125 až 8141.

Separace isomerů se alternativně může provádět chromá tografickými nebo rekrystalizačními technikami po převedení sloučeniny obecného vzorce XXI (směsi isomerů) na sloučeninu obecného vzorce XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, V, IV nebo I postupy a/nebo sekvencemi postupů, které jsou charakterizovány v tomto popisu. Meziprodukty obecného vzorce XXI se specifickou stereochemií na atomech uhlíku a a b je možno převést na meziprodukty obecného vzorce XXII za součas ného zachování této stereochemie reakcí s alkoholem a silně kyselým katalyzátorem a následným případným přidáním vody, jak to bylo popsáno výše.

Požadovaný isomer sloučeniny obecného vzorce XXI je alternativně možno získat také derivatizací meziproduktu obecného vzorce XXI a chromatografickou separací diastereomerních derivátů (například za použití trimethylsilylchloridu (TMS) nebo terč.butyldimethylsilylchloridu (TBDMS), přičemž se získají O-TMS nebo O-TBDMS deriváty). Silylový derivát meziproduktu obecného vzorce XXI s jedinou stereoisomerní formou na atomech uhlíku a a b se za zachování stereochemie převede na meziprodukt obecného vzorce XXII (pokud se silylskupina neodštěpí v tomto stupni, odštěpí se dodatečně vhodnou metodou, jako například působením tetrabutylamoniumfluoridu v tetrahydrofuranu) způsobem popsaným výše v souvislosti s konverzí sloučenin obecného vzorce XXI na sloučeniny obecného vzorce XXII.

Podle reakčního schématu V se aldehydy obecného vzorce XX (výchozí látky pro postup znázorněný v reakčním schématu IV) připraví z odpovídajících aminokyselin obecného vzorce XXX. Aminokyselina vzorce XXX se přitom chrání na dusíku chránící skupinou P_T, jako například skupinou BOC. Chráněná sloučenina se esterifikuje alkoholem a převede na ester, přednostně methyl- nebo ethylester sloučeniny obecného vzorce XXXI. To se může provést reakcí sloučeniny vzorce XXX s methyl- nebo ethyljodidem za přítomnosti vhodné báze (například uhličitanu draselného v polárním rozpouštědle, jako je dimethylformamid. Sloučenina vzorce XXXI se redukuje, například diisobutylaluminiumhydridem v hexanu nebo toluenu nebo jejich směsi, při teplotě od asi -78 do asi -50°C s následným rozložením reakční směsi methanolem při -78°C, jak je to popsáno v J. Med. Chem., 1985, 28, 1779 až 1790, za vzniku aldehydu obecného vzorce XX. Alternativně (není znázorněno v reakčním schématu V) je možno analogické N-methoxymethylamidy (odpovídající sloučenině obecného vzorce XXXI, přičemž však alkoholový substituent esteru je nahrazen skupinou N(OMe)Me) připravit ze sloučeniny obecného vzorce XXX, Ν,Ο-dimethylhydroxylaminu a vhodného kopulačního činidla (například l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidhydrochloridu (DEC). Výsledná sloučenina se redukuje, například lithiumaluminiumhydridem v rozpouštědle, které je inertní vůči této reakci, jako je ether nebo tetrahydrofuran, při teplotě od asi 0 do asi 25°C, a tak se získá aldehyd vzorce XX. Tato dvoustupňová metoda je obecně použitelná pro konverzi N-chráněných α-aminokyselin na aldehydy obecného vzorce XX (Fehrentz a Castro, Synthesis 1983, 676 až 678).

Alternativně lze aldehydy obecného vzoce XX připravit oxidací chráněných aminoalkoholů obecného vzorce XXXIII, například za použití komplexu pyridin/oxid sírový, při teplotě od asi -10 do asi 40°C v rozpouštědle, které je inertní vůči této reakci, jako je s výhodou dimethylsulfoxid. Chráněné aminoalkoholy obecného vzorce XXXIII jsou buď obchodně dostupné nebo je lze vyrobit chráněním aminoalkoholů obecného vzorce XXXII. Aminoalkoholy vzorce XXXII se připravují redukcí aminokyselin vzorce XXX. Tato redukce se provádí tak, že se na sloučeniny vzorce XXX působí lithiumaluminiumhydridem způsobem popsaným v Dickman et al.,

Organic Syntheses; Wiley, New York, 1990; kolekt. sv. VII, str. 530 nebo působením směsi kyseliny sírové a tetrahydroboritanu sodného způsobem popsaným v Abiko a Masamune, Tetrahedron Lett. 1992, 233, 5517 až 5518 nebo také působením směsi tetrahydroboritanu sodného a jodu způsobem popsaným v McKennon a Meyers, J. Org. Chem. 1993, 58, 3568 až 3571. V posledně uvedené citaci je také uveden přehled jiných vhodných postupů pro konverzi aminokyselin vzorce XXX na aminoalkoholy vzorce XXXII.

Sloučeniny obecného vzorce XXX, kterých se používá při postupu znázorněném v reakčním schématu V, je možno vyrobit podle reakčního schématu VI následujícím způsobem: Nejprve se připraví aminokyseliny obecného vzorce XLI N-alkylací chráněných (P_T) aminokyselin obecného vzorce XL za použití vhodné báze a alkylačního činidla. Specifické postupy vhodné pro tuto alkylaci jsou uvedeny v publikaci Benoiton, Can. J. Chem. 1977, 55, 906 až 910 a Hansen, J. Org. Chem. 1985, 50, 945 až 950. Pokud R₃ představuje methylskupinu, může se například použít natriumhydridu a methyljodidu v tetrahydrofuranu. Sloučenina vzorce XXX se potom získá odštěpením chránící skupiny ze sloučeniny vzorce XLI.

Alternativně je možno aminokyselinu obecného vzorce XLII N-alkylovat třístupňovým postupem, který zahrnuje reduktivní benzylaci (například hydrogenací katalyzovanou palladiem na uhlíku, která se provádí za přítomnosti benz• · aldehydu). Získaný mono-N-benzylderivát se potom reduktivně aminuje vhodnou acylsloučeninou (například formaldehydem a natriumkyanborhydridem, za účelem zavedení methylskupiny ve významu R₃) za vzniku N-benzyl-N-R₃-substituované aminokyseliny. Chrániči N-benzylskupina se snadno odštěpí (například hydrogenací za přítomnosti vhodného katalyzátoru), a tak se získá sloučenina obecného vzorce XXX. Specifické podmínky vhodné pro tento třístupňový alkylační postup jsou uvedeny v publikaci Reinhold et al., J. Med. Chem. 1968,

II, 258 až 260.

Preparativního postupu popsaného bezprostředně výše je také možno použít pro zavedení skupiny R₃ do meziproduktu obecného vzorce XLIV za vzniku meziproduktu obecného vzorce XLV (což je meziprodukt vzorce III, kde R₇ představuje hydroxyskupinu). Preparativního postupu popsaného bezprostředně výše je také možno použít pro zavedení skupiny R₃ do meziproduktu obecného vzorce lila (což je meziprodukt vzorce

III, kde R₃ představuje atom vodíku).

Aminokyseliny použité při postupech podle schémat znázorněných v tomto popisu (například sloučeniny obecného vzorce XL a XLII) jsou buď obchodně dostupné, známé z literatury, nebo je lze připravit různými metodami známými odborníkům v tomto oboru. Může se například použít Streckerovy syntézy a jejích obměn. Aldehyd obecného vzorce R₄CHO se tedy může nechat reagovat s kyanidem sodným nebo draselným a chloridem amonným za vzniku odpovídajícího aminonitrilu. Tento aminonitril se hydrolyzuje minerální kyselinou za vzniku požadované aminokyseliny vzorce XLII (R₄C(NH₂)COOH). Alternativně se může použít Bucherer-Bergovy metody, při níž se připravuje hydantoin zahříváním aldehydu vzorce R₄CHO s uhličitanem amonným a kyanidem draselným a ten se posléze hydrolyzuje (například hydroxidem barnatým v refluxujícím • ·

- 92 dioxanu) působením kyseliny nebo báze za vzniku požadované aminokyseliny vzorce XLII (R₄C(NH₂)COOH).

V literatuře jsou popsány i jiné způsoby syntézy α-aminokyselin umožňující odborníkovi v tomto oboru přípravu požadovaných intermediárních aminokyselin vzorce XLII (R₄C(NH₂)COOH), kterých je zapotřebí pro syntézu sloučenin obecného vzorce I.

Vhodné způsoby syntézy a štěpení na isomery sloučenin vzorce XLII je možno nalézt v přehledech uvedených v Duthaler, Tetrahedron 1994, 50, 1539 až 1650 nebo Williams R M. Synthesis of Optically Active Amino Acids, Pergamon, Oxford, Velká Británie, 1989.

Jako specifickou metodu syntézy meziproduktu vzorce XLII v kterékoliv z enantiomerních forem z odpovídajícího meziproduktu obecného vzorce R₄X, kde X představuje atom chloru, bromu nebo jodu, je možno uvést postup podle Pirrunga a Krishnamurthyho (J. Org. Chem. 1993, 58, 957 až 958) nebo postup podle 0'Donella et al. (J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 2353 až 2355). Požadované meziprodukty vzorce R₄X se snadno připraví mnoha metodami, které jsou známé odborníkům v tomto oboru. Sloučeniny, v nichž R₄X představuje skupinu ArCH₂X, je například možno připravit radikálovou halogenací sloučeniny vzorce ArCHg nebo formylací arénu vzorce Ar-H a konverzí alkoholu na bromid.

Jinou specifickou metodou syntézy meziproduktů obecného vzorce XLII v libovolné enantiomerní formě je metoda podle Coreye a Linka (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 1906 až 1908). Přitom se meziprodukt vzorce R₄COC1₃ enantiospecifíčky redukuje na meziprodukt vzorce R₄CH(OH)CC1₃, který se působením azidu a báze převede na meziprodukt vzorce R₄CH(N₃)COOH a posledně uvedená sloučenina se ka• · talytickou hydrogenací redukuje na požadovanou sloučeninu vzorce XLII. Potřebný trichlormethylketon (R₄COCC1₃) se získá reakcí aldehydu vzorce R₄CHO s trichlormethidovým aniontem a následující oxidací (Gallina a Giordano, Synthesis, 1989, 466 až 468).

Intermediární aminy obecného vzorce III (používané v reakčním schématu I), kde R₅ a R_? představuje vždy atom vodíku, je možno připravit způsobem znázorněným v reakčním schématu 7. Aminokyselina vzorce L (účelně chráněná chránící skupinou P_T) se aktivuje převedením na chlorid kyseliny, fluorid kyseliny nebo směsný anhydrid (například za použití isobutylchlorformiátu a triethylaminu v inertním rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran nebo dioxan, při teplotě od asi -0 do asi -40°C) a aktivovaný meziprodukt se potom nechá reagovat s diazomethanem za vzniku diazoketonu obecného vzorce LI. Na diazoketon vzorce LI se působí alkoholem vzorce ROH (například alkanolem s 1 až 6 atomy uhlíku, jako methanolem) a vhodným katalyzátorem, jako je teplo, oxid stříbrný nebo benzoát stříbrný, za vzniku esteru vzorce LII. Ester vzorce LII se zbaví chránící skupiny, a tak se získá sloučenina vzorce IIIA (Wolffovým přesmykem). Alternativně se může ester vzorce LII hydrolyzovat, například alkálií a kondenzovat s vhodným aminem vzorce R₁₂ ^{H ne}^° HNRgRg, a tak se získá sloučenina vzorce IIIB, podobně jako to bylo popsáno výše.

Intermediární aminy obecného vzorce III, kde Rg představuje substituent vázáný přes atom kyslíku (například alkoxyskupinu) (používané v reakčním schématu I) je možno připravit způsobem znázorněným v reakčním schématu VIII takto: sloučenina vzorce LXI se alkyluje na kyslíku působením vhodného alkylačního činidla (například alkyljodidu, alkylbromidu, alkylchloridu nebo alkyltoluensulfonátu) a báze (hydridu sodného nebo hydridu draselného) • · v množství dostatečném pro vznik alkoxidu, ve vhodném polárním aprotickém rozpouštědle (například dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu) při teplotě od asi 0 do asi 150°C, přičemž se získá sloučenina vzorce LXII. Požadovaný aminový meziprodukt se získá odštěpením chránící skupiny ze sloučeniny vzorce LXII.

Intermediární aminy obecného vzorce III, kde R₅představuje alkoxykarbonylalkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v první alkoxylové části (používané v reakčním schématu I) je možno připravit takto: sloučenina vzorce LXI se alkyluje esterem halogenalkanové kyseliny za vzniku sloučeniny vzorce LXIII, která se deprotekcí převede na požadovaný amin. Odpovídající kyselinu je možno připravit hydrolýzou tohoto esteru za použití vodné alkálie ve vhodném rozpouštědle. Aminy obecného vzorce III, v nichž R_g obsahuje esterovou skupinu a R₅ obsahuje karboxyskupinu, je možno připravit z aminu vzorce LXIII (vyrobeného postupem uvedeným v předchozím odstavci), kde R₅ obsahuje funkční skupinu karboxylové skupiny, chráněnou v podobě terc.butylesteru, působením bezvodé kyseliny, za vzniku odpovídající kyseliny v R₅bez hydrolýzy esteru v poloze R_g.

Sloučeniny vzorce LXVI (intermediární aminy vzorce III, kde R^ představuje chráněnou aminoalkoxyskupinu) je možno připravit ze sloučeniny vzorce LXI. Sloučenina vzorce LXI se alkyluje halogenalkannitrilem za vzniku sloučeniny vzorce LXIV. Sloučenina vzorce LXIV se redukuje na primární amin působením vodíku za přítomnosti vhodného katalyzátoru (například rhodia na uhlíku) a za přítomnosti amoniaku, přednostně v polárním protickém rozpouštědle, jako je voda, methanol nebo ethanol, za vzniku primárního aminu vzorce LXV. Sloučenina vzorce LXV se chrání na dusíku chránící skupinou P_T1, která je orthogonální vzhledem k jiné chránící skupině Prp, a potom se odštěpí chránící skupina P_T za vzniku •···· · · požadované sloučeniny vzorce III. Chráněná sloučenina obecného vzorce III se kopuluje s příslušnou sloučeninou obecného vzorce II a výsledná chráněná sloučenina obecného vzorce I se zbaví chránící skupiny.

Sloučeniny obecného vzorce LXIII a LXIV, kde n představuje číslo 2, se přednostně připravují tak, že se na sloučeninu vzorce LXI působí nadbytkem esteru akrylové kyše líny nebo akrylonitrilu za přítomnosti vhodné báze, jako je hydroxid draselný nebo sodný, ve vhodném rozpouštědle, před nostně polárním protickém rozpouštědle.

Podle reakčního schématu IX se sloučeniny obecného vzorce LXVII a LXIX (sloučeniny obecného vzorce III, kde R₅představuje atom fluoru, nebo R₅ a R_? představuje vždy atom fluoru) mohou připravit ze sloučeniny vzorce LXI. Na slouče ninu vzorce LXI se působí vhodným fluoračním činidlem, jako diethylaminosulfurtrifluoridem v rozpouštědle, které je inertní vůči této reakci, jako je aprotické rozpouštědlo, přednostně dichlormethan, za vzniku sloučeniny obecného vzorce LXVII. Sloučenina obecného vzorce LXVII se účelně zbaví chránící skupiny.

Sloučenina vzorce LXI se oxiduje na sloučeninu vzorce LXVIII za použití podmínek popsaných výše pro přípravu sloučeniny obecného vzorce I, kde R₅ a R₇ dohromady tvoří oxoskupinu. Sloučenina vzorce LXVIII se difluoruje za vhodných podmínek (například působením diethylaminosulfurtrifluoridu v dichlormethanu).

Podle reakčního schématu X se sloučenina vzorce LXXIII nebo LXIV, kde R₇ představuje alkylskupinu (tj. sloučenina obecného vzorce III, kde R₇ představuje alkylskupinu) připravuje ze sloučeniny vzorce LXX (analogická příprava aminu je také popsána v reakčním schématu V). Na • * • · · φ ·· ·«

sloučeninu vzorce LXX se působí organokovovým činidlem vzorce R_?M a výsledný sekundární alkohol se oxiduje tak, jako je to popsáno v předchozím odstavci, na sloučeninu vzorce LXXI. Sloučenina vzorce LXXI se převede přes kyanhydrin vzorce LXXII na sloučeninu vzorce LXXIII za použití stejných podmínek, jakých se používá pro konverzi sloučeniny vzorce XXI na sloučeninu vzorce XXII (viz reakční schéma IV).

Alternativně se sloučenina vzorce LXXII převede na sloučeninu vzorce LXIV způsobem popsaným v souvislosti s konverzí kyanového meziproduktu na amid podle reakčního schématu V.

Sloučenina vzorce R_gNH₂ nebo R_gNH₂ se monoalkyluje karbonylovou sloučeninou odpovídající významu R_g nebo R_g za vhodných podmínek reduktivní aminace, a tak se získá amin obecného vzorce R_gR_gNH. Pro zabránění dialkylaci může být vhodné chránit aminy (vzorce R_gNH₂ nebo R_gNH₂) vhodnou chránící skupinou Ρφ za vzniku chráněných aminů vzorce R_g(P_T)NH nebo R_g(P_T)NH, například reakčí s benzaldehydem a redukčním činidlem. Chráněné aminy se monoalkylují karbonylovou sloučeninou odpovídající významu R_g nebo R_g za vhodných podmínek reduktivní aminace, a tak se získá amin obecného vzorce R_gR_gN(P_T). Chrániči skupina P_T se odštěpí (například vyčerpávající katalytickou hydrogenací, pokud P_T představuje benzylskupinu), a tak se získá sloučenina vzorce R_gR_gNH. Vhodné podmínky reduktivní aminace může odborník snadno určit na základě literárních údajů. Tyto podmínky zahrnují podmínky uvedené v Borch et al., J. Am. Chem. Soc., 1971, 2897 až 2904 a v Emerson, Organic Reactions, Wiley:

New York, 1948 (14), 174, Hutchins et al., Org. Prep.

Proced. Int 1979 (11), 20 a Lané et al., Synthesis 1975,

135. Podmínky reduktivní aminace favorizující N-monoalkylaci jsou například popsány v publikaci Morales et al., ·· ·

Synthetic Communications 1984, 1213 až 1220 a Verardo et al., Synthesis, 1992, 121 až 125. Aminy vzorce R_gNH₂ nebo R_gNH₂ je také možno monoalkylovat příslušnou sloučeninou vzorce R_gX nebo RgX, kde X představuje chloridový, bromidivý, tosulfonátový nebo methansulfonátový zbytek. Alternativně se může meziprodukt vzorce R_g(P_T)NH nebo R_g(P_T)NH alkylovat příslušnou sloučeninou vzorce R_gX nebo R_gX a chránící skupina se může odštěpit za vzniku sloučeniny vzorce R_gR_gNH.

Pro přípravu aminů obecného vzorce R_gR_gNH, kde skupina R_g-NH nebo R_g-NH je vázána vazbou kyslík-dusík, je možno použít dalších metod. Tak lze snadno dostupnou sloučeninu vzorce alkoxykarbonyl-NHOH (s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části) nebo NH₂CONHOH dialkylovat na dusíku a kyslíku působením báze a nadbytku vhodného alkylačního činidla vzorce R-X za vzniku odpovídající sloučeniny vzorce alkoxykarbonyl-N(R)OR (s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části), která se potom hydrolyzuje za vzniku sloučeniny vzorce R_gR_gNH (kde R_g = R_g = R). Vhodné podmínky, báze a alkylační činidla jsou například uvedeny v publikacích Goel a Krolls, Org. Prep. Proced. Int. 1987, 19, 75 až 78 a Major a Fleck, J. Am. Chem. Soc. 1928, 50, 1479. Alternativně se může amin vzorce NH₂CONH(OH) alkylovat postupně, nejprve na kyslíku, za vzniku sloučeniny vzorce NH₂CONH(OR') a potom na dusíku, za vzniku sloučeniny vzorce

NH₂CON(R)(OR') postupným zpracováním alkylačním činidlem vzorce R'X a RX za přítomnosti vhodné báze. Vhodné báze a alkylační činidla jsou uvedeny v publikacích Kreuzkamp a Messinger, Chem. Ber. 100, 3463 až 3465 (1967) a Danen et al. (J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 5716 až 5724). Hydrolýzou těchto alkylovaných derivátů hydroxymočoviny se získají aminy vzorce R'ONH₂ a RONHR, které odpovídají určitým aminům vzorce R_gR_gNH, Odborníci v tomto oboru mohou přizpůsobit postupy popsané v tomto odstavci tak, aby bylo ·· · .**. .

» · · · „ · · » ··«·» · · · • · í .

možno použít jiných alkylačních činidel R, R' a R-X pro výrobu jiných aminů obecného vzorce RgRgNH, kde zbytky Rg-N nebo R_g-N jsou připojeny vazbou kyslík-dusík. Uno et al. (SynLett 1991, 559 až 560) popisují adici organokovového činidla vzorce R-Li na O-alkyloxim vzorce R'CH=N-OR, která je katalyzována fluoridem boritým, za vzniku sloučenin obecného vzorce R'RCH-NH(OR). Tohoto způsobu je také možno použít pro získání sloučenin obecného vzorce RgRgNH, kde jeden ze zbytků vzorce Rg-NH a Rg-NH je připojen vazbou kyslík-dusík.

Proléčiva podle vynálezu, v nichž je karboxylová skupina karboxylové kyseliny obecného vzorce I nahrazena esterovou skupinou, je možno připravovat tak, že se na karboxylovou kyselinu působí vhodným alkylhalogenidem za přítomnosti báze, jako je uhličitan draselný, v inertním rozpoutědle, jako je dimethylformamid, při teplotě od asi 0 do 100°C v průběhu asi 1 až asi 24 hodin. Alternativně se může kyselina smíchat s příslušným alkoholem, jako rozpouštědlem, za přítomnosti katalytického množství kyseliny, jako je koncentrovaná kyselina sírová, při teplotě v rozmezí od asi 20 do asi 120°C, přednostně při teplotě zpětného toku, přičemž reakční doba leží přibližně v rozmezí od 1 do 24 hodin. Další způsob provedení této reakce spočívá ve smíchání kyseliny se stechiometrickým množstvím alkoholu za přítomnosti katalytického množství kyseliny v inertním rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran, přičemž voda vzniklá při reakci se průběžně odstraňuje fyzikálním způsobem (například za použití Dean-Starkova odlučovače) nebo chemickým způsobem (například za použití molekulového síta.

Proléčiva podle vynálezu, v nichž je funkční skupina alkoholu derivatizována za vzniku etheru, je možno připravit tak, že se alkohol smíchá s vhodným alkylbromidem nebo alkyljodidem za přítomnosti báze, jako je uhličitan ·· · draselný, v inertním rozpouštědle, jako je dimethylformamid, a reakce se nechá probíhat při teplotě v rozmezí od asi 0 do asi 100°C po dobu asi 1 až asi 24 hodin. Alkanoylaminomethyl ethery je možno získat reakcí alkoholu s bis(alkanoylamino)methanem za přítomnosti katalytického množství kyseliny v inertním rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran, způsobem popsaným v US 4 997 984. Alternativně je možno tyto sloučeniny připravit způsoby popsanými v Hoffman et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 3530.

Dialkylfosfátové estery je možno připravit reakcí alkoholu s dialkylchlorfosfátem za přítomnosti báze v inertním rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran. Dihydrogenfosfáty je možno připravit reakcí alkoholu s diaryl- nebo dibenzylchlorfosfátem způsobem popsaným výše s následnou hydrolýzou nebo hydrogenací za přítomnosti katalyzátoru na bázi ušlechtilého kovu.

Glykosidy je možno připravit reakcí alkoholu se sacharidem v inertním rozpouštědle, jako je toluen, za přítomnosti kyseliny. Voda vzniklá při reakci se obvykle průběžně odstraňuje výše popsaným způsobem. Alternativní provedení reakce spočívá v působení vhodně chráněného glykosylhalogenidu na alkohol za přítomnosti báze a následujícím odštěpení chránící skupiny.

N-(1-hydroxyalkyl)amidy, N-(1-hydroxy-l-(alkoxykarbonyl) methyl) amidy nebo sloučeniny, kde zbytek R₂ je nahrazen zbytkem vzorce C(OH)C(O)OY, je možno připravit reakcí rodičovského amidu nebo indolu s příslušným aldehydem za neutrálních nebo bázických podmínek, například za přítomnosti ethoxidu sodného v ethanolu) při teplotě v rozmezí od 25 do 70°C. N-Alkoxymethylindoly nebo N-l(alkoxyJalkylindoly je možno připravit reakcí N-nesubstituovaného indolu s požadovaným alkylhalogenidem za pří·· ·

• ·····

- íoo ^A..· :

tomnosti báze v inertním rozpouštědle. 1-(N,N-Dialkylaminomethyl)indol, l-(l-(N,N-dialkylamino)ethyl)indol a Ν,Ν-dialkylaminomethylamidy (například sloučeniny, v nichž R₃ představuje dimethylaminomethylskupinu) je možno připravit reakcí rodičovské NH-sloučeniny s příslušným aldehydem a aminem v alkoholickém rozpouštědle při 25 až 70°C

Cyklická proléčiva (například proléčiva podle vynálezu, v nichž R₂ a R₃ představují společný atom uhlíku, je možno připravit reakcí rodičovské sloučeniny (léčiva) s aldehydem nebo ketonem nebo jeho dimethylacetalem v inertním rozpouštědle za přítomnosti katalytického množství kyseliny a za současného odstraňování vody nebo methanolu. Alternativně je možno tyto sloučeniny připravit reakcí aminoalkoholu nebo hydroxyamidu s gem-dibromalkanem za přítomnosti báze (například uhličitanu draselného) v inertním rozpouštědle (například dimethylformamidu).

Sloučeniny obecného vzorce IA je možno připravovat způsoby popsanými dále.

Číslování reakčních schémat a vzorců uvedených v následující části je nezávislé na číslování v předchozím textu (nemělo by tedy dojít k záměně s číslováním, jehož se používá v předchozím textu).

- 101

Reakční schéma XI

R10 R11

- 102

Reakční schéma XII ····· · · * • · · · • · ·

VIIIA

Reakční schéma XIII

Rr • · « ·« • · · · · • · · · » · τηο · ·····♦· ·

103 - · · * · · • · · * ·

R10 R11 ,CO₂Et

R10 R11

CO₂Et co₂h

Nredukční 'R2 činidlo

N-R₂ OH'

N-r₂ yj/

R10 R11

Rr

R10 R11

Rrfw

R10 R11

VII

XVII

XVI

104

Reakční schéma XIV ··· ·· · ·· • · · » · · · «·· ···· · · · · * • · φ · · · · · · · ·· φ φφ « ·· φφφ ·· ···

Η

R4

COOH r₅ r₃

XVIII

Ri₂H

R₈R₉nh

R4

R4 'N

CONR₈R₉;C(O)R₁₂

HN r₅ r₃

XXV

Rs r₃ lllb

Reakční schéma XV

105 _M · ······· « • · · · · ·

* 4

106

Reakční • · · 4

4444* · · schéma XVI ^ρτ\

báze,

N

I r₃

FL, Rs

COOH

XLI

R4 _z ^R5

1. PhCHO, redukce

2. NaCNBHŠŽ “* vhodná karbonylová sloučenina

3. vyčerp. H₂, Pd/C

HN COOH

Rs

XXX

Podle reakčního schématu XI se mohou sloučeniny obecného vzorce IA, kde R_lz R₁₀, R_llz A, R₂z ^R3' ^R4' ^R5 ^{a R}6 mají výše uvedený význam, připravovat kterýmkoliv ze dvou dále uvedených obecných postupů. Při prvním postupu se sloučenina obecného vzorce IA může vyrobit kopulací příslušné indol-2-karboxylové kyseliny, indolin-2-karboxylové kyseliny nebo benzimidazol-2-karboxylové kyseliny obecného vzorce II s příslušným aminem obecného vzorce III (tj. acylací aminu obecného vzorce III). Při druhém z těchto postupů se sloučenina obecného vzorce IA může připravit kopulací příslušné sloučeniny obecného vzorce IV (tj. sloučeniny obecného vzorce IA, kde Rg představuje karboxyskupinu) s příslušným alkoholem nebo aminem obecného vzorce RgR_gNH nebo R₁₂H, ^de Rg, R_g a R₁₂ mají výše uvedený význam (tj. acylací tohoto

- 107 aminu nebo alkoholu). Prvnímu postupu (kopulace sloučeniny vzorce II se sloučeninou vzorce III) se obvykle dává přednost, když R₄ nepředstavuje atom vodíku a Rg představuje atom vodíku).

Obvykle se přitom postupuje tak, že se sloučenina vzorce II smíchá se sloučeninou vzorce III (nebo se sloučenina vzorce IV smíchá s příslušným aminem (například vzorce R₁₂H nebo R₈R_gNH)) nebo alkoholem za přítomnosti vhodného kopulačního činidla. Vhodným kopulačním činidlem je činidlo, které převádí karboxylovou kyselinu na reaktivní látku, která je schopna reakcí s aminem nebo alkoholem vytvořit amidovou nebo esterovou vazbu.

Kopulačním činidlem může být reakční činidlo, které je schopno při smísení karboxylové kyseliny s aminem nebo alkoholem vyvolat jednostupňovou kondenzaci těchto látek. Pokud se má kyselina kondenzovat s alkoholem, přednostně se jako reakčního rozpouštědla používá velkého nadbytku tohoto alkoholu, popřípadě za přidání 1,0 až 1,5 ekvivalentu přidaného dimethylaminopyridinu. Jako příklady kopulačních činidel je možno uvést kombinaci l-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylkarbodiimidhydrochloridu s hydroxybenzotriazolem (DEC/HBT), karbonyldiimidazol, kombinaci dicyklohexylkarbodiimidu s hydroxybenzotriazolem (HBT) a 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), kombinaci karbonyldiimidazolu a HBT, anhydrid propanfosfonové kyseliny (PPA) a diethylfosforylkyanid. Kopulace se provádí v inertním rozpouštědle, přednostně v aprotickém rozpouštědle, při teplotě od asi -20 do asi 50°C, po dobu od asi 1 do asi 48 hodin a popřípadě za přítomnosti terciární aminové báze, jako je triethylamín. Jako příklady vhodných rozpouštědel je možno uvést acetonitril, ethylacetát, dichlormethan, dimethylformamid a chloroform a jejich směsi. Jako příklad

108 ·* · ·· · ·» • · · · · ·· · · · • · · · · « · Α· • 9 9999 999 9 9 9 9 #· · 99 999 99 999 vhodného kopulačního postupu je možno uvést postup A uvedený v tomto popisu těsně před příklady provedení.

Jako kopulačního činidla se také může použít činidla převádějícího karboxylovou kyselinu na aktivovaný meziprodukt, který se izoluje a/nebo který se vytvoří v prvním stupni. Potom se tento meziprodukt nechá reagovat ve druhém stupni s příslušným aminem nebo alkoholem. Jako příklady takových kondenzačních činidel je možno uvést thionylchlorid a oxalylchlorid (těmito činidly se karboxylová kyselina převádí na chlorid kyseliny), fluorid kyseliny kyanurové (tímto činidlem se karboxylová kyselina převádí na fluorid kyseliny) nebo alkylchlorformiát, jako je isobutyl- nebo isopropenylchlorformiát (za přítomnosti terciární aminové báze) (tímto činidlem se karboxylová kyselina převádí na směsný anhydrid karboxylové kyseliny). Pokud se jako kopulačního činidla používá oxalylchloridu, s výhodou se jako pomocného rozpouštědla, které se přidává k jinému rozpouštědlu (jako je například dichlormethan), spolupoužívá malého množství dimethylformamidu za účelem katalýzy tvorby chloridu kyseliny. Tento chlorid kyseliny se může kopulovat tak, že se smíchá s meziproduktem obecného vzorce III ve vhodném rozpouštědle spolu s vhodnou bází. Jako vhodné kombinace rozpouštědlo/báze je například možno uvést dichlormethan, dimethylformamid nebo acetonitril nebo jejich směsi za přítomnosti terciární aminové báze, jako je například triethylamin. Jako jiné vhodné kombinace rozpouštědlo/báze je možno uvést vodu nebo alkoholy s 1 až 5 atomy uhlíku nebo jejich vzájemné směsi spolu s pomocným rozpouštědlem, jako je dichlormethan, tetrahydrofuran nebo dioxan a bází, jako je uhličitan sodný nebo draselný, hydroxid sodný, draselný nebo lithný nebo hydroxenuhličitan sodný. Báze se používá v množství postačujícím pro zachycení kyseliny uvolněné v průběhu reakce. Pokud se používá směsi pomocných rozpouštědel, která jsou jen zčásti mísitelná

109 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9999999 9 • 9 9 9 9 9 9 9

9 99 999 99 (například směsi dichlormethanu a vody nebo dichlormethanu a methanolu), je výhodné je použití katalyzátoru fázového přenosu (obvykle 1 až 10 % molárních), jako je kvaterní amoniumhalogenid (například tetrabutylamoniumbromid nebo methyltrioktylamoniumchlorid). Používání těchto kopulačních činidel a vhodná volba rozpouštědel a teplot leží v rozsahu zkušeností odborníků v tomto oboru a lze je také snadno určit na základě literárních údajů. Tyto a jiné příkladné podmínky, které jsou vhodné pro kopulace karboxylových kyselin, jsou popsány v publikaci Houben-Weyl, sv. XV, část II, E. Winsch, Ed., G. Thieme Verlag, 1974, Stuttgart a M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag Berlin, 1984 a The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology (ed. E. Gross a J. Meienhofer), sv. 1 až 5 (Academie Press, NY, USA, 1979 až 1983).

Sloučeniny obecného vzorce IV, kde Rj, R₁₀, ^Rii' ^A' R₂, R₃, R₄ a R₅ mají výše uvedený význam, je možno připravit z odpovídajícího esteru vzorce V (tj. sloučeniny obecného vzorce I, kde R_g představuje alkoxykarbonylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části nebo benzyloxykarbonylskupinu) hydrolýzou vodnou alkálií při teplotě od asi -20 do asi 100°C, obvykle při teplotě asi 20°C, po dobu od asi 30 minut do asi 24 hodin.

Alternativně se sloučeniny obecného vzorce IV připravují tak, že se indolkarboxylová kyselina obecného vzorce II aktivuje kopulačním činidlem (popsaným výše) a vzniklý aktivovaný meziprodukt (jako je chlorid kyseliny, fluorid kyseliny nebo směsný anhydrid) se potom nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce III, kde R₃, R₄ a R₅ mají význam uvedený výše a R_g představuje karboxyskupinu, ve vhodném rozpouštědle za přítomnosti vhodné báze. Jako vhodná rozpouštědla je možno uvést vodu, methanol a jejich směsi, společně s pomocným rozpouštědlem, jako je dichlormethan, • 9

110 • 9 9 • 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9

9

tetráhydrofuran nebo dioxan. Z vhodných bází je možno uvést hydroxid sodný, draselný nebo lithný, hydrogenuhličitan sodný nebo draselný, uhličitan sodný nebo draselný nebo uhličitan draselný spolu s tetrabutylamoniumbromidem (1 ekvivalent) v dostatečném množství pro spotřebování kyseliny uvolněné při reakci (obvykle v takovém množství, aby se hodnota pH reakční směsi udržela nad 8). Báze se může přidávat po částech spolu s aktivovaným meziproduktem, aby se zajistila vhodná regulace pH reakční směsi. Reakce se obvykle provádí při teplotě v rozmezí od -20 do 50°C. Izolační postupy může odborník v tomto oboru individuálně navrhnout tak, aby se odstranily nečistoty. Obvykle se přitom odstraňují s vodou mísitelná pomocná rozpouštědla odpařováním, nečistoty se extrahují organickými rozpouštědly při vysoké hodnotě pH, potom se provede okyselení na nízkou hodnotu pH (1 až 2) a požadovaný produkt se odfiltruje nebo extrahuje pomocí vhodného rozpouštědla, jako je ethylacetát nebo dichlormethan.

Sloučeninu obecného vzorce V je možno připravit kopulací vhodné sloučeniny obecného vzorce III, kde R_gpředstavuje alkoxykarbonylskupinu, s vhodnou sloučeninou obecného vzorce II za použití postupu, který je analogický výše popsanému postupu (například za použití postupu A).

Alternativně se mohou sloučeniny obecného vzorce IA obsahující atom síry v oxidačním stavu sulfoxidu nebo sulfonu připravovat z odpovídajících sloučenin obecného vzorce IA obsahujících atom síry v neoxidované formě působením vhodného oxidačního činidla, jako například m-chlorperoxobenzoové kyseliny v dichlormethanu při teplotě od asi 0 do asi 25°C po dobu od asi 1 do asi 48 hodin (pro konverzi na sulfoxidový oxidační stav je třeba použít asi 1 až asi 1,3 ekvivalentu kyseliny m-chlorperoxobenzoové a pro kon111 • · • · · • ···· verzi na sulfonový oxidační stav je zapotřebí použít této látky v množství vyšším než jsou asi 2 ekvivalenty.

Tak například některé ze sloučenin obecného vzorce IA v reakčním schématu XI obsahují primární a sekundární aminoskupiny a karboxyskupiny v části molekuly definované symbolem Rg. Tyto skupiny mohou interferovat se zamýšlenou kopulační reakcí znázorněnou v reakčním schématu XI, pokud se meziprodukt obecného vzorce III nebo amin obecného vzorce R₁₂H nebo RgRgNH ponechá bez ochrany. Během kopulační reakce znázorněné v reakčním schématu XI může být tedy primární nebo sekundární aminová funkční skupina nebo karboxylová funkční skupina chráněna vhodnou chránící skupinou, pokud je přítomna ve zbytku Rg meziproduktu obecného vzorce III nebo v aminu (vzorce RgRgNH nebo R₁₂H). Jako produkt takové kopulační reakce se získá sloučenina obecného vzorce IA obsahující chránící skupinu. Přítomná chránící skupina se může odštěpit v následném stupni za vzniku sloučeniny obecného vzorce IA. Vhodné chránící skupiny pro chránění aminoskupiny a karboxyskupiny zahrnují chránící skupiny, kterých se běžně používá při syntéze peptidů (jako je N-terc.butoxykarbonylskupina, N-benzyloxykarbonylskupina a 9-fluorenylmethylenoxykarbonylskupina, v případě aminů a nižší alkylesterová skupina nebo benzylesterová skupina, v případě karboxylových kyselin) a které nejsou chemicky reaktivní za výše popsaných kopulačních podmínek (tyto podmínky jsou také uvedeny v postupu A, který bezprostředně předchází příkladové části) a které lze odstranit bez chemického pozměnění jiných funkčních skupin ve sloučenině obecného vzorce IA.

Výchozí indol-2-karboxylové kyseliny a indolin2-karboxylové kyseliny, kterých se používá při reakci znázorněné v reakčním schématu XI, jsou buď obchodně dostupné nebo známé z dosavadního stavu techniky (dosavadní

112 • 9 9 •99 9 • 9 · 9 9 • 9 9 9 99 9 9 ·· ·

9 ·

9 9 9

99 9 stav techniky je v rozsáhlé míře publikován) nebo jsou dostupné běžnými syntetickými metodami. Tak například podle reakčního schématu XII je možno indolester obecného vzorce VII (kde A nepředstavuje atom dusíku) vyrobit ze sloučeniny obecného vzorce VI (kde Q se volí tak, aby se získal zbytek A definovaný výše, s výjimkou dusíku) Fischerovou syntézou indolů (viz The Fischer Indole Synthesis, Robinson B (Wiley, New York, USA, 1982), po níž se provede zmýdelnění výsledného indolesteru obecného vzorce VII za vzniku odpovídající kyseliny obecného vzorce VIII. Výchozí arylhydrazon je možno připravit kondenzací snadno dostupného hydrazinu s příslušným karbonylovým derivátem nebo Japp-Klingemanovou reakcí (viz Organic Reactions, Philips R. R., 1959, 10, 143).

Indol-2-karboxylová kyselina obecného vzorce VIIIA se alternativně může připravit kondenzací o-methylnitrosloučeniny obecného vzorce IX s esterem kyseliny štavelové, načež se vzniklý indolester obecného vzorce X redukuje na nitroskupině a vzniklý produkt se hydrolyzuje.

Postupem podle reakčního schématu XIII je možno intermediární benzimidazol-2-karboxylovou kyselinu vzorce XI připravit kondenzací o-diaminové sloučeniny obecného vzorce XIII s glykolovou kyselinou a následnou oxidací vzniklého benzimidazol-2-methanolu vzorce XII (Bistrzycki, A. a Przeworski, G. , Ber. 1912, 45, 3483).

Alternativně (vzhledem k reakčnímu schématu XII) je možno substituované indoliny obecného vzorce XIV připravit redukcí odpovídajících indolů obecného vzorce XV redukčním činidlem, jako je hořčík v methanolu, při teplotě od asi 25 do asi 65°C během asi 1 až asi 48 hodin (viz reakční schéma III).

Indolinkarboxylové kyseliny obecného vzorce XVI se připravují zmýdelněním odpovídajícího esteru obecného vzorce XVII (viz reakční schéma XIII). Sloučeniny obecného vzorce XVII se připravují redukcí odpovídajících indolesterů obecného vzorce VII redukčním činidlem, jako je hořčík v methanolu, způsobem popsaným výše v souvislosti s konverzí sloučenin obecného vzorce XV na sloučeniny obecného vzorce XIV.

Podle reakčního schématu XIV se a-aminokyselina obecného vzorce XXIII může chránit na dusíku vhodnou chrániči skupinou (P_t) (například terc.butoxykarbonylskupinou t-Boc) za vzniku sloučeniny vzorce XXIV. Odborníci v tomto oboru mohou snadno určit vhodnou chránící skupinu a způsob pro její zavedení. Tak například chrániči skupina t-Boc se může zavést tak, že se na aminokyselinu působí diterc.butyldikarbonátem, přednostně v protickém rozpouštědle nebo jejich směsi při vysoké hodnotě pH. Jako další příklad

114 ♦ * · 4 4 • 4 4 4 · 4 < *444444 «

4 4 4 4 ·· · 44 běžné chránící skupiny je možno uvést skupinu Cbz. Tato skupina se zavádí působením benzylchlorformiátu ve vhodném, přednostně protickém rozpouštědle nebo směsi rozpouštědel za přítomnosti báze na aminokyselinu. Sloučenina obecného vzorce XXIV se kopuluje (podobným postupem, jako je kopulační postup popsaný v souvislosti s reakčním schématem XI) s příslušným aminem vzorce R_gR_gNH nebo HR₁₂ a vzniklá sloučenina obecného vzorce XXV se potom zbaví chránící skupiny za vzniku sloučeniny vzorce Illb (tj. sloučeniny obecného vzorce III, kde R_g představuje skupinu C(O)R₁₂ nebo C(O)NRgR_g). Pokud je chránící skupinou skupina t-Boc, provádí se její odstraňování ze sloučeniny obecného vzorce XXV působením kyseliny ve vhodném, přednostně aprotickém rozpouštědle. Z kyselin, které se hodí pro tuto deprotekci je možno uvést kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu methansulfonovou nebo kyselinu trifluoroctovou.

Podle reakčního schématu XV se může připravit sloučenina obecného vzorce XXXI (N-chráněný amin obecného vzorce III, kde R_g představuje alkoxykarbonylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku v alkoxylové části nebo benzyloxykarbonylskupinu). Při tom se do nechráněné aminokyseliny obecného vzorce XXX zavede N-chránicí skupina (za vzniku chráněné aminokyseliny obecného vzorce XXXI) a potom se provede esterifikace. Esterifikaci sloučeniny obecného vzorce XXXIII je například možno provést vhodným alkoholem za přítomnosti kyselého katalyzátoru, jako je chlorovodík nebo thionylchlorid. V případě, že má být esterifikačním činidlem terc.butanol, nechá se aminokyselina reagovat s isobutylenem a kyselým katalyzátorem, jako je koncentrovaná kyselina sírová. Také se může použít reakce s alkylhalogenidem (například methyljodidem) a bází (například uhličitanem draselným) . Alternativně se může esterifikace provádět před stupněm zavádění chránící skupiny.

·♦ · • · · · · ··· Λ · · • »♦····· « • · · · ·

Sloučeniny obecného vzorce XXX, kde R₃ nepředstavuje atom vodíku, kterých se používá při postupu znázorněném v reakčním schématu XV, je možno vyrobit podle reakčního schématu XVI následujícím způsobem: Nejprve se připraví aminokyseliny obecného vzorce XLI N-alkylací chráněných (P_T) aminokyselin obecného vzorce XL za použití vhodné báze a alkylačního činidla. Specifické postupy vhodné pro tuto alkylaci jsou uvedeny v publikaci Benoiton, Can. J. Chem. 1977, 55, 906 až 910 a Hansen, J. Org. Chem. 1985, 50, 945 až 950. Pokud R₃ představuje methylskupinu a skupinou P_T je Boc, může se například použít natriumhydridu a methyljodidu v tetrahydrofuranu. Sloučenina vzorce XXX se potom získá odštěpením chránící skupiny ze sloučeniny vzorce XLI.

Alternativně je možno aminokyselinu obecného vzorce XLII N-alkylovat třístupňovým postupem, který zahrnuje reduktivní benzylaci (například za použití reakce s benzaldehydem a hydrogenace katalyzované palladiem na uhlíku). Získaný mono-N-benzylderivát se potom reduktivně aminuje vhodnou karbonylovousloučeninou (například formaldehydem a natriumkyanborhydridem, za účelem zavedení methylskupiny ve významu R₃) za vzniku N-benzyl-N-R₃-substituované aminokyseliny. Chrániči N-benzylskupina se snadno odštěpí (například hydrogenací za přítomnosti vhodného katalyzátoru), a tak se získá sloučenina obecného vzorce XXX. Specifické podmínky vhodné prd tento třístupňový alkylační postup jsou uvedeny v publikaci Reinhold et al., J. Med. Chem. 1968, 11, 258 až 260.

Preparativního postupu popsaného bezprostředně výše je také možno použít pro zavedení skupiny R₃ do meziproduktu obecného vzorce lila (což je meziprodukt vzorce III, kde R₃ představuje atom vodíku).

• 9 * ·

9

9 9

9999 9 9

- 116 99

9 > · 9 «99 * · · 9 9 9 9 • * 9 9 9 « ♦· ··· 99 999

Aminokyseliny použité ve schématech znázorněných v tomto popisu (například sloučeniny obecného vzorce XL a XLII) jsou buď obchodně dostupné, známé z literatury, nebo je lze připravit různými metodami známými odborníkům v tomto oboru. Může se například použít Streckerovy syntézy a jejích obměn. Aldehyd obecného vzorce R₄CHO se tedy může nechat reagovat s kyanidem sodným nebo draselným a chloridem amonným za vzniku odpovídajícího aminonitrilu. Tento aminonitril se hydrolyzuje minerální kyselinou za vzniku požadované aminokyseliny vzorce XLII (R₄C(NH₂)COOH). Alternativně se může použít Bucherer-Bergovy metody, při níž se připravuje hydantoin zahříváním aldehydu vzorce R₄CHO s uhličitanem amonným a kyanidem draselným a ten se posléze hydrolyzuje (například hydroxidem barnatým v refluxujícím dioxanu) působením kyseliny nebo báze za vzniku požadované aminokyseliny vzorce XLII (R₄C(NH₂)COOH).

Vhodné způsoby syntézy a/nebo štěpení na isomery sloučenin vzorce XLII je možno nalézt v přehledech uvedených v Duthaler, Tetrahedron 1994, 50, 1539 až 1650 nebo Williams R. M., Synthesis of Optically Active Amino Acids, Pergamon, Oxford, Velká Británie, 1989.

Jako specifickou metodu syntézy meziproduktu vzorce XLII v kterékoliv z enantiomerních forem z odpovídajícího meziproduktu obecného vzorce R₄X, kde X představuje atom chloru, bromu nebo jodu, je možno uvést postup podle Pirrunga a Krishnamurthyho (J. Org. Chem. 1993, 58, 957 až 958) nebo postup podle 0'Donella et al. (J. Am. Chem. Soc.

117 ·· · • * · • · · » • · ·««· • · · ·· · ·· ·» »· • A · ·· ···

1989, 111, 2353 až 2355). Požadované meziprodukty vzorce R₄X se snadno připraví mnoha metodami, které jsou známé odborníkům v tomto oboru. Sloučeniny, v nichž R₄X představuje skupinu ArCH₂X, je například možno připravit radikálovou halogenací sloučeniny vzorce ArCH₃ nebo formylací arénu vzorce Ar-H a konverzí alkoholu na bromid.

Jinou specifickou metodou syntézy meziproduktů obecného vzorce XLII v libovolné enantiomerní formě je metoda podle Coreyho a Linka (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 1906 až 1908). Přitom se meziprodukt vzorce R₄COCC1₃ enantiospecifíčky redukuje na meziprodukt vzorce R₄CH(OH)CC1₃, který se působením azidu a báze převede na meziprodukt vzorce R₄CH(N₃)COOH a posledně uvedená sloučenina se katalyticky hydrogenuje na požadovanou sloučeninu vzorce XLII. Potřebný trichlormethylketon (R₄COCC1₃) se získá reakcí aldehydu vzorce R₄CHO s trichlormethidovým aniontem a následující oxidací (Gallina a Giordano, Synthesis, 1989, 466 až 468).

Sloučenina vzorce RgNH₂ nebo R_gNH₂ se monoalkyluje karbonylovou sloučeninou odpovídající významu R_g nebo R_g za vhodných podmínek reduktivní aminace, a tak se získá amin obecného vzorce RgRgNH. Pro zabránění dialkylaci může být vhodné chránit aminy (vzorce RgNH₂ nebo R_gNH₂) vhodnou chránící skupinou P_T za vzniku chráněných aminů vzorce Rg(P_T)NH nebo Rg(P_T)NH, například reakcí s benzaldehydem a redukčním činidlem. Chráněné aminy se monoalkylují karbonylovou sloučeninou odpovídající významu Rg nebo Rg za vhodných podmínek reduktivní aminace, a tak se získá amin obecného vzorce RgR_gN(P_T). Chránící skupina P_T se odštěpí (například vyčerpávající katalytickou hydrogenací, pokud P_T představuje benzylskupinu), a tak se získá sloučenina vzorce RgRgNH. Vhodné podmínky reduktivní aminace může odborník snadno určit na základě literárních údajů. Tyto podmínky

- 118 ·· · • · · • · · · • · ··· • · ·

9 ·» • 9 • · • · · • · ·« »· zahrnují podmínky uvedené v Borch et al., J. Am. Chem. Soc., 1971, 2897 až 2904 a v Emerson, Organic Reactions, Wiley: New York, 1948 (14), 174, Hutchins et al., Org. Prep.

Proced. Int 1979 (11), 20 a Lané et al., Synthesis 1975,

135. Podmínky reduktivní aminace favorizující N-monoalkylaci jsou například popsány v publikaci Morales et al., Synthetic Communications 1984, 1213 až 1220 a Verardo et al., Synthesis, 1992, 121 až 125. Aminy vzorce R_gNH₂ nebo R_gNH₂ je také možno monoalkylovat příslušnou sloučeninou vzorce R_gX nebo R_gX, kde X představuje chloridový, bromidivý, tosylátový nebo mesylátový zbytek. Alternativně se může meziprodukt vzorce R_g(P_T)NH nebo R_g(P_T)NH alkylovat příslušnou sloučeninou vzorce R_gX nebo R_gX a chránící skupina se může odštěpit za vzniku sloučeniny vzorce R_gR_gNH.

Pro přípravu aminů obecného vzorce R_gR_gNH, kde skupina R_g-NH nebo R_g-NH je vázána vazbou kyslík-dusík, je možno použít dalších metod. Tak lze snadno dostupnou sloučeninu vzorce alkoxykarbonyl-NHOH (s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části) nebo NH₂CONHOH dialkylovat na dusíku a kyslíku působením báze a nadbytku vhodného alkylačního činidla vzorce R-X za vzniku odpovídající sloučeniny vzorce alkoxykarbonyl-N(R)OR (s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxylové části), která se potom hydrolyzuje za vzniku sloučeniny vzorce R_gR_gNH (kde R_g = R_g = R). Vhodné podmínky, báze a alkylační činidla jsou například uvedeny v publikacích Goel a Krolls, Org. Prep. Proced. Int. 1987, 19, 75 až 78 a Major a Fleck, J. Am. Chem. Soc. 1928, 50, 1479. Alternativně se může N-hydroxymočovina vzorce NH₂CONH(OH) alkylovat postupně, nejprve na kyslíku, za vzniku sloučeniny vzorce NH₂CONH(OR') a potom na dusíku, za vzniku sloučeniny vzorce NH₂CON(R)(OR*) postupným zpracováním alkylačním činidlem vzorce R'X a RX za přítomnosti vhodné báze. Vhodné báze a alkylační činidla jsou uvedeny v publikacích Kreuzkamp a Messinger, Chem. Ber. 100, 3463 až 3465 (1967) a Danen et

119 al. (J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 5716 až 5724). Hydrolýzou těchto alkylovaných derivátů hydroxymočoviny se získají aminy vzorce R'ONH₂ a RONHR, které odpovídají určitým aminům vzorce RgRgNH, Odborníci v tomto oboru mohou přizpůsobit postupy popsané v tomto odstavci tak, aby bylo možno použít jiných alkylačních činidel R, R' a R-X pro výrobu jiných aminů obecného vzorce RgRgNH, kde zbytky Rq-N nebo Rg-N jsou připojeny vazbou kyslík-dusík. Uno et al. (SynLett 1991, 559 až 560) popisují adici organokovového činidla vzorce R-Li na O-alkyloxim vzorce R'CH=N-OR, která je katalyzována fluoridem bořítým, za vzniku sloučenin obecného vzorce R'RCH-NH(OR). Tohoto způsobu je také možno použít pro získání sloučenin obecného vzorce RgRgNH, kde jeden ze zbytků vzorce Rg-NH a R_g-NH je připojen vazbou kys1ík-dus ík.

Proléčiva podle vynálezu, v nichž je karboxylová skupina karboxylové kyseliny obecného vzorce IA nahrazena esterovou skupinou, je možno připravovat tak, že se na karboxylovou kyselinu působí vhodným alkylhalogenidem za přítomnosti báze, jako je uhličitan draselný, v inertním rozpouštědle, jako je dimethylformamid, při teplotě od asi 0 do asi 100°C v průběhu asi 1 až asi 24 hodin. Alternativně se může kyselina smíchat s příslušným alkoholem, jako rozpouštědlem, za přítomnosti katalytického množství kyseliny, jako je koncentrovaná kyselina sírová, při teplotě v rozmezí od asi 20 do asi 120°C, přednostně při teplotě zpětného toku, přičemž reakční doba leží přibližně v rozmezí od 1 do 24 hodin. Další způsob provedení této reakce spočívá ve smíchání kyseliny se stechiometrickým množstvím alkoholu za přítomnosti katalytického množství kyseliny v inertním rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran, přičemž voda vzniklá při reakci se průběžně odstraňuje fyzikálním způsobem (například za použití Dean-Starkova odlučovače) nebo chemickým způsobem (například za použití molekulového síta.

• ·

- 120 Proléčiva podle vynálezu, v nichž je funkční skupina alkoholu derivatizována za vzniku etheru, je možno připravit tak, že se alkohol smíchá s vhodným alkylbromidem nebo alkyljodidem za přítomnosti báze, jako je uhličitan draselný, v inertním rozpouštědle, jako je dimethylformamid, a reakce se nechá probíhat při teplotě v rozmezí od asi 0 do asi 100°C po dobu asi 1 až asi 24 hodin. Alkanoylaminomethyl ethery je možno získat reakcí alkoholu s bis(alkanoylamino)methanem za přítomnosti katalytického množství kyseliny v inertním rozpouštědle, jako je tetráhydrofuran, způsobem popsaným v US 4 997 984. Alternativně je možno tyto sloučeniny připravit způsoby popsanými v Hoffman et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 3530.

Dialkylfosfátové estery je možno připravit reakcí alkoholu s dialkylchlorfosfátem za přítomnosti báze v inertním rozpouštědle, jako je tetráhydrofuran. Dihydrogenfosfáty je možno připravit reakcí alkoholu s diaryl- nebo dibenzylchlorfosfátem způsobem popsaným výše s následnou hydrolýzou nebo hydrogenací za přítomnosti katalyzátoru na bázi ušlechtilého kovu.

N-(1-hydroxyalkyl)amidy, N-(1-hydroxy-l-(alkoxykarbonyl)methyl)amidy nebo sloučeniny, kde zbytek R₂ je nahrazen zbytkem vzorce C(OH)C(O)OY, je možno připravit reakcí rodičovského amidu nebo indolu s příslušným aldehydem za neutrálních nebo bázických podmínek, například za • 9 ·

- 121 • 99 · · · · · · · • 999 99 9 99

9999999 9 9 99 9 přítomnosti ethoxidu sodného v ethanolu) při teplotě v rozmezí od 25 do 70°C. N-Alkoxymethylindoly nebo N-l(alkoxy)alkylindoly je možno připravit reakcí N-nesubstituovaného indolu s požadovaným alkylhalogenidem za přítomnosti báze v inertním rozpouštědle. 1-(N,N-Dialkylaminomethyl)indoly, l-(l-(N,N-dialkylamino)ethyl)indoly a Ν,Ν-dialkylaminomethylamidy (například sloučeniny, v nichž R₃ představuje dimethylaminomethylskupinu) je možno připravit reakcí rodičovské NH-sloučeniny s příslušným aldehydem a aminem v alkoholickém rozpouštědle při 25 až 70°C.

Proléčiva podle vynálezu, v nichž R₂ a R₃ představují společný atom uhlíku, je možno připravit reakcí rodičovské sloučeniny (léčiva) s benzaldehydem nebo ketonem nebo jeho dimethylacetalem v inertním rozpouštědle za přítomnosti katalytického množství kyseliny a za současného odstraňování vody nebo methanolu.

Výchozí látky a reakční činidla pro výše popsaná reakční schémata (například aminy, substituované indolkarboxylové kyseliny, substituované indolinkarboxylové kyseliny a aminokyseliny) jsou také snadno dostupné, nebo je lze snadno syntetizovat běžnými metodami organické syntézy známými odborníkům v tomto oboru. Tak například mnohé mezipro dukty používané při výše popsaných postupech pro výrobu sloučenin obecného vzorce IA jsou příbuzné přírodním aminokyselinám nebo se jedná o jejich deriváty. Na látky tohoto typu se upírá značný vědecký zájem a existuje po nich značná obchodní potávka, a v důsledku toho jsou mnohé z těchto meziproduktů obchodně dostupné nebo jsou popsány v literatuře nebo jsou snadno připravitelné z jiných běžně dostupných látek metodami citovanými v literatuře. Takové meziprodukty zahrnují například sloučeniny obecného vzorce XXX, XLII, XXXII a XXXIII.

* ···· ·

- 122

Některé preparativní metody, které jsou užitečné pro přípravu sloučenin popsaných v tomto textu (například sloučenin obecného vzorce I, sloučenin obecného vzorce IA) mohou vyžadovat chránění vzdálených funkčních skupin (tj. primárních a sekundárních aminoskupin a dále též karboxyskupin) v prekursorech sloučenin obecného vzorce I. Potřeba takového chránění se může měnit v závislosti na druhu vzdálené funkční skupiny a podmínkách použitých při přípravě. Potřebu takového chránění může odborník v tomto oboru snadno určit. Používání metod zavádění/odštěpování chránících skupin leží v rozsahu zkušeností běžného odborníka. Obecný popis chránících skupin a jejich používání je možno nalézt v publikaci T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, USA, 1991.

Některé sloučeniny podle tohoto vynálezu obsahují asymetrické atomy uhlíku, a proto se vyskytují ve formě enantiomerů nebo diastereomerů. Diasteromerické směsi je možno dělit na individuální diastereomery na základě jejich fyzikálně chemických odlišností o sobě známými metodami, například chromatografií a/nebo frakční krystalizací. Enantiomery je možno dělit tak, že se enantiomerická směs převede na diasteromerickou směs reakcí s vhodnou opticky aktivní sloučeninou (například alkoholem), potom se oddělí diastereomery a jednotlivé diastereomery se převedou (například hydrolýzou) na odpovídající čisté enantiomery. Do rozsahu vynálezu spadají všechny takové isomery, včetně diastereomerů a enantiomerů, jakož i jejich směsi. Některé ze sloučenin podle vynálezu jsou atropoisomery (například substituované biaryly), které rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Mnohé sloučeniny podle vynálezu jsou kyselé, a mohou tvořit soli s farmaceuticky vhodnými kationty. Některé ze sloučenin podle vynálezu jsou bázické a mohou tvořit soli

123 s farmaceuticky vhodným aniontem. Všechny takové soli spadají do rozsahu tohoto vynálezu a je možno je připravovat konvenčními metodami. Tak například je možno je připravit jednoduše tak, že se kyselé a zásadité složky smíchají, obvykle ve stechiometrickém poměru, ve vodném, nevodném nebo zčásti vodném prostředí, podle toho, jak je to vhodné. Soli se izolují buď filtrací nebo srážením nerozpouštědlem s následující filtrací, nebo odpařením rozpouštědla nebo v případě vodných roztoků také lyofilizací.

Pokud sloučeniny podle vynálezu tvoří hydráty nebo solváty, potom tyto formy také spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Užitečnost kombinací podle vynálezu jako léčiv vhodných pro léčení uvedených chorob u savců (například člověka) je možno demonstrovat pomocí účinnosti sloučenin podle vynálezu při konvenčních zkouškách a při zkouškách účinnosti in vitro a in vivo popsaných dále. Tyto zkoušky představují rovněž prostředek umožňující porovnání účinnosti sloučenin podle vynálezu s účinnostmi jiných známých sloučenin. Výsledky těchto srovnávacích zkoušek jsou užitečné pro určení úrovně dávkování u savců, včetně člověka, při léčení takových chorob.

Zkouška inhibiční účinnosti na aldosa reduktasu

Účinnost inhibitoru aldosa reduktasy je možno stanovit jako množství inhibitoru aldosa reduktasy, které je potřebné pro snížení tkáňového sorbitolu, a tedy snížení tkáňové fruktosy, za použití následujícího postupu.

U samců potkana Sprague-Dawley se i.v. injekčním podáním streptozocinu v dávce 55 mg/kg v citrátovém pufru o pH 4,5 vyvolá diabetes. Potkani jsou krmeni ad libitum za

124 • · ·« · řízených chovných, teplotních a světelných podmínek. Po 5 týdnech diabetes se potkani anestetizují předávkováním pentobarbitalem, tkáně se rychle odeberou a analyzují na sorbitol a fruktosu.

Hladiny sorbitolu se analyzují postupem popsaným v Donald M. Eades et al., Rapid Analysis of Sorbitol, Galactitol, Mannitol and Myoinositol Mixtures From Biological Sources, Journal of Chromatography, 490, 1 až 8, 1989.

Fruktosa ve tkáních potkanů se měří enzymaticky za použití modifikovaného postupu popsaného v Ameyama, Methods in Enzymology, 89: 20 až 29, 1982, přičemž se ferrikyanid nahradí resazurinem, barvivém, které se redukuje na vysoce fluorescentní resorufin. Množství resorufinové fluorescence je ve stechiometrickém poměru k množství fruktosy oxidované fruktosa dehydrogenasou. Zkoušební směs obsahuje 0,1 ml neutralizovaného extraktu z nervů, získaného za použití 6% kyseliny chloristé, v konečném objemu 1,5 ml. Po 60minutové inkubaci při teplotě místnosti v uzavřeném prostoru se stanoví fluorescence vzorku při excitaci 560 nm, emisi 580 nm s 5mm štěrbinami ve fluorescenčním spektrometru Perkin-Elmer model 650-40. Koncentrace fruktosy se vypočítá porovnáním se sérií známých fruktosových standardů.

Zkouška inhibiční účinnosti na glykogenfosforylasu

Dále popsanými postupy je možno připravit tři různé purifikované isoenzymy glykogen fosforylasy (GP), v nichž je glykogenfosforylasa v aktivovaném a stavu. V dalším popisu jsou tyto enzymy označeny jako glykogen fosforylasa a nebo pod zkratkou GPa), konkrétně glykogen fosforylasu a z lidských jater (HLGPa), glykogen fosforylasu a z lidských svalů (HMGPa) a glykogen fosforylasu a z lidského mozku (HBGPa).

«9 · • · · 4 4 ··· · · · · 4 4 4

4 4 4 4« 4 44

44444 «4 4 4 4« 4

- TOR — ·*! 444 44

4 44 ,4φ 4» 4

Exprese a fermentace

HLGP a HMGP cDNA se exprimují z plasmidu pKK233-2 (Pharmacia Biotech. Inc. Piscataway, New Jersey, USA) v E. coli kmene XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, Kalifornie, USA). Tímto kmenem se inokuluje LB médium (které se skládá z 10 g tryptonu, 5 g kvasinkového extraktu, 5 g chloridu sodného a 1 ml 1M hydroxidu sodného, vztaženo na 1 litr média) s přísadou 100 mg/litr ampicilinu, 100 mg/litr pyridoxinu a 600 mg/litr chloridu manganatého. Buňky se nechají růst při 37°C do optické density OD_55Q = 1,0. Potom se buňky indukují lmM isopropyl-l-thio-p-D-galaktosidem (IPTG). Tři hodiny po indukci se buňky sklidí centrifugací a buněčná peleta se zmrazí při -70°C. V tomto stavu se skladuje až do následné purifikace.

HBGP cDNA lze exprimovat několika postupy, například postupem popsaným v Crerar et al., J. Biol. Chem. 270: 13748 až 13756. Postup pro expresi HBGP popsaný v Crerar et al., J. Biol. Chem. 270: 13748 až 13756 je následující: HBGP cDNA je možno exprimovat z plasmidu pTACTAC v E. coli kmene 25A6. Tímto kmenem se inokuluje LB médium (které se skládá z 10 g tryptonu, 5 g kvasinkového extraktu, 5 g chloridu sodného a 1 ml 1M hydroxidu sodného, vztaženo na 1 litr média) s přísadou 50 mg/litr ampicilinu. Buňky se nechají růst přes noc a poté resuspendují v čerstvém LB médiu s přísadou 50 mg/litr ampicilinu. Buněčnou suspenzí se zaočkuje 40násobný objem média LB/amp s obsahem 250μΜ isopropyl-l-thio^-D-galaktosidu (IPTG), 0,5mM pyridoxinu a 3mM chloridu hořečnatého. Buňky se 48 až 50 hodin nechají růst při 22°C a poté je lze sklidit centrifugací. Buněčná peleta se zmrazí při -70°C a v tomto stavu skladuje až do purifikace.

• · · · · · * ·

126

HLGP cDNA se exprimuje z plasmidu pBlue Bac III (Invitrogen Corp._ř San Diego, CA, USA), který je kotransfekován lineární virovou DNA BaculoGold (Pharmingen, San Diego, CA, USA) do buněk Sf9. Rekombinantní virus se poté purifikuje přes plaky. Buňky Sf9 pěstované v médiu bez séra se za účelem produkce proteinu infikují při multiplicitě infekce (moi) 0,5 a densitě buněk 2 x 10 buněk/ml. Po 72 hodinovém růstu při 27°C se buňky centrifugují, buněčné pelety se zmrazí na -70°C a při této teplotě skladují až do purifikace.

Purifikace glykogen fosforylasy exprimované v E. coli

Buňky E. coli z pelet popsaných výše se resuspendují ve 25mM β-glycerofosfátu (pH 7,0) s přísadou DTT (0,2mM), chloridu hořečnatého (lmM) a následujících inhibitorů proteasy:

pepstatin A 0,7 μg/ml leupeptin 0,5 μg/ml fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 0,2mM

EDTA 0,5mM

Provede se lyže buňek předběžným zpracováním 200 μg/ml lysozymu a 3 μg/ml DNAasy s následným zpracováním ultrazvukem na ledu (vždy 5 x 1,5 minuty za použití 250ml várky) v ultrazvukovém zařízení pro rozbíjení buněk Branson Model 450 (Branson Sonic Power Co., Danbury, CT, USA). Lyzáty buněk E. coli se vyčeří centrifugací při 35 000 x g po dobu 1 hodiny a potom se přefiltrují přes filtry s průměrem otvorů 0,45 μιη. GP v rozpustné frakci lyzátu (odhadem se jedná o množství pod 1 % celkového proteinu) se purifikuje monitorováním enzymatické aktivity (jak je to popsáno v části Zkoušení

- 127 ··· ·· « 9 *

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 • ······· · 9 99 9 • * t · · · «· ·· * · · 9 99 9 9 9 aktivity GPa, uvedené dále, ve vzorcích získaných sérií chromatografických stupňů, která je podrobně popsána dále.

Imobilizovaná kovová afinitní chromatografie (IMAC)

Tento stupeň je založen na metodě Luonga et al. (Luong et al., Journal of Chromátography (1992) 584, 77 až 84). 500 ml přefiltrované rozpustné frakce buněčného lyzátu (připravené asi ze 160 g až 250 g původní buněčné pelety) se nanese na 130ml sloupec IMAC Chelating-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersey, USA), který byl předběžně upraven ekvilibračním pufrem o pH 7 s obsahem chloridu měďnatého (50mM), β-glycerofosfátu (25mM), chloridu sodného (250mM) a imidazolu (lmM). Sloupec se promývá ekvilibračním pufrem tak dlouho, dokud se hodnota A₂₈₀nevrátí na základní linii. Potom se vzorek eluuje ze sloupce stejným pufrem, který však obsahuje imidazol v lOOmM koncentraci, aby se odstranil vázaný GP a jiné vázané proteiny. Frakce obsahující aktivitu GP se shromáždí (přibližně 600 ml) a přidá se k ní ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) do 0,3mM koncentrace, DL-dithiothreitol (DTT) do 0,2mM koncentrace, fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) do 0,2mM koncentrace, leupeptin do 0,5 μg/ml a pepstatin A do 0,7 μg/ml. Spojená GP frakce se odsolí na sloupci Sephadex G-25 (Sigma Chemical Company, St.Louis, Missouri, USA) ekvilibrovaném pufrem A (pufr A: 25mM Tris-HCl (pH 7,3),

3mM DTT), aby se odstranil imidazol. Takto zpracovaná frakce se až do provedení druhého chromatografického stupně skladuje na ledu.

Chromatografie na 5'-AMP-Sepharose

Odsolený shromážděný vzorek GP (přibližně 600 ml) se potom smísí se 70 ml 5'-AMP Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersey, USA), která byla ekvili128

9 9	9 · · 9 «9 9 9 9 9 •99999 9	9 9 9 9	99 9 9 9 9 • 9 9	9
• ♦ «	9 9 •
9 »		• 9 ·	9 9 9	9-9

brována s pufrem A (viz výše). Směs se 1 hodinu jemně míchá při 22°C a potom se uloží do kolony. Kolona se promývá pufrem A tak dlouho, dokud se hodnota A₂₈₀ nevrátí na základní linii. GP a jiné proteiny se ze sloupce eluují pufrem B (pufr B: 25mM Tris-HCl, 0,2mM DTT a lOmM adenosin-5'-monofosfát (AMP), pH 7,3). Frakce obsahující GP se spojí po jejich identifikaci stanovením aktivity enzymu (viz dále) a vizualizuje se M, přibližně 97kDa GP proteinový pás elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s natriumdodecylsulfátem (SDS-PAGE) a následným obarvením stříbrem (2D-silver Stain II Daiichi Kit, Daiichi Pure Chemicals Company, Ltd., Tokyo, Japonsko a GP se shromáždí. Shromážděný GP se dialyzuje do pufru C (pufr C; 25mM β-glycerofosfát, 0,2mM DTT, 0,3mM EDTA, 200mM chlorid sodný, pH 7,0) a potom skladuje na ledu až do následujícího použití.

Před použitím se GP enzym převede z neaktivní formy exprimované v E. coli kmene XL-1 Blue (označené GPb) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornie, USA) na aktivní formu (označenou GPa) postupem popsaným v části (A) aktivace GP, která je uvedena dále.

Purifikace glykogen fosforylasy exprimované v buňkách Sf9

Buňky Sf9 z pelet popsaných výše se resuspendují ve 25mM β-glycerofosfátu (pH 7,0) s přísadou DTT (0,2mM), chloridu hořečnatého (lmM) a následujících inhibitorů proteasy:

pepstatin A 0,7 μg/ml leupeptin 0,5 μg/ml fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)

EDTA

0,2mM 0,5mM

129 • · 9 • · 9 9 • · 9 9 9·

9 9 ·

• 99 9

Provede se lyže buňek předběžným zpracováním za použití 3 μg/ml DNAasy s následným zpracováním ultrazvukem (3x1 min na ledu) po dávkách za použití ultrazvukového zařízení pro rozbíjení buněk Branson Model 450 (Branson Sonic Power Co., Danbury, CT, USA). Lyzáty buněk Sf9 se vyčeří centrifugací při 35 000 x g po dobu 1 hodiny a potom se přefiltrují přes filtry s průměrem otvorů 0,45 μιη. GP v rozpustné frakci lyzátu (odhadem se jedná o množství 1,5 % celkového proteinu) se purifikuje monitorováním enzymatické aktivity (jak je to popsáno v části Zkoušení aktivity GPa uvedené dále) ve vzorcích získaných sérií chromatografických stupňů, která je podrobně popsána dále.

Imobilizovaná kovová afinitní chromatografie (IMAC)

Imobilizovaná kovová afinitní chromatografie se provádí způsobem popsaným výše. Shromážděná odsolená GP se až do dalšího zpracování skladuje na ledu.

Aktivace GP:

Před další chromatografií se frakce inaktivního enzymu převede z inaktivní formy, v níž je exprimován buňkami Sf9 (tato forma se označuje zkratkou GPb) na aktivní formu (tato forma se označuje zkratkou GPa) postupem popsaným dále v části (A) nazvané Aktivace GP.

Chromatografie na anexu

Aktivace IMAC purifikované GPb na GPa se provádí reakcí s imobilizovanou fosforylasa kinasou. Shromážděné frakce GPa se dialyzují proti 25mM Tris HCl, pH 7,5, s obsahem 0,5mM DTT, 0,2mM EDTA, l,0mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF), 1,0 μg/ml leupeptinu a 1,0 μg/ml pepstatinu A. Vzorek se umístí na sloupec pro anexovou chromatografii

130 • 4 ·

4444 A « • 4

MonoQ (Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, New Jersey,

USA). Sloupec se poté promývá ekvilibračním pufrem, dokud se A₂₈₀ nevrátí na základní linii. Vzorek se ze sloupce eluuje lineárním gradientem 0 až 0,25M chloridu sodného, aby se odstranila GP a další navázané proteiny. Frakce obsahující GP se eluují při koncentračním rozmezí chloridu sodného 0,1 až 0,2M, jak se stanoví monitorováním eluantu na pík absorbance proteinu při Α₂₈θ· GP protein se identifikuje vizualizací M_r přibližně 97kDa GP proteinového pásu elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s natriumdodecylsulfátem (SDS-PAGE) a následným obarvením stříbrem (2D-Silver Stain II Daiichi Kit, Daiichi Pure Chemicals Company, Ltd., Tokyo, Japonsko) a poté shromáždí. Shromážděná GP se dialyzuje do pufru (pufr: 25mM N,N-bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethansulfonová kyselina, l,0mM DTT, 0,5mM EDTA, 5mM chlorid sodný, pH 6,8) a potom skladuje na ledu až do následujícího použití.

Stanovení enzymatické aktivity GP

A) Aktivace GP: Konverze GPb na GPa

Před stanovením enzymatické aktivity GP se enzym převede z inaktivní formy, v níž je exprimován E. coli kmene XL-1 (tato forma se označuje zkratkou GPb) (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, Kalifornie, USA) na aktivní formu (tato forma se označuje zkratkou GPa) fosforylací GP za použití fosforylasa kinasy postupem popsaným dále. Frakce inaktivního enzymu, jak je exprimován v buňkách Sf9 (tato forma se označuje zkratkou GPb) se rovněž převede na aktivní formu (která se označuje zkratkou GPa) za použití následujícího postupu.

131 ·

• · 9 9 * · 9 9 9

99999 9 9

9

Reakce GP s imobilizovanou fosforylasa kinasou

Fosforylasa kinasa (Sigma Chemical Company,

St.Louis, Missouri, USA) se imobilizuje na afinitním gelu Affi-Gel 10 (BioRad Corp. Melvile, New York, USA) podle instrukcí výrobce. V krátkosti lze použitý postup popsat takto: Enzym fosforylasa kinasa (10 mg) se inkubuje s promytými perlami Affi-Gelu (1 ml) ve 2,5 ml lOOmM HEPES a 80mM chloridu vápenatého o pH 7,4 4 hodiny při 4°C. Potom se perly Affi-Gelu jednou promyjí stejným pufrem, načež následuje blokování jednohodinovým působením 50mM HEPES a 1M methylesteru glycinu o pH 8,0 při teplotě místnosti. Blokovací pufr se odstraní a nahradí se 50mM HEPES (pH 7,4), lmM β-merkaptoethanolem a 0,2% azidem sodným pro skladování. Před použitím na konverzi GPb na GPa se fosforylasa kinasa imobilizovaná na perlách Affi-Gelu ekvilibruje promýváním pufrem použitým pro provedení reakce s kinasou, který se skládá z β-glycerofosfátu (25mM), DTT (0,3mM) a EDTA (0,3mM) a má pH 7,8 (pufr pro stanovení kinasy).

Zčásti purifikovaný inaktivní GPb získaný při výše uvedené chromatografii na 5'-AMP-Sepharose (z E. coli) nebo směs GPa a GPb získaná chromatogragií IMAC (z buněk Sf9) se zředí v poměru 1 : 10 pufrem pro stanovení kinasy a potom smísí s výše popsaným enzymem fosforylasa kinasou, který je imobilizován na perlách Affi-Gelu. Ke směsi se přidá NaATP (do 5mM koncentrace) a chlorid hořečnatý (do 6mM koncentrace). Vzniklá směs se 30 až 60 minut jemně míchá při 25°C. Vzorek se oddělí od perel a stanoví se aktivace (v %) spočívající v konverzi GPb na GPa. Stupeň aktivace se odhaduje na základě stanovení aktivity enzymu GP za přítomnosti a nepřítomnosti 3,3mM AMP. Procentická aktivita celkového GP, tj. aktivita enzymu GPa (aktivita nezávislá na AMP) se potom vypočítá pomocí následujícího vzorce:

132 • A AAA • A A AA

Aktivita HLGP - AMP Podíl HLGPa (%) = Aktivita HLGP + AMP

Alternativně je konverzi GPb na GPa možno monitorovat isoelektrickou fokusací na základě posunu v elektroforetické mobilitě, která je zaznamenána po konverzi GPb na GPa. Vzorky GP se analyzují isoelektrickou fokusací (IEF) za použití Pharmacia PfastGel System (Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, New Jersey, USA) za použití předlitých gelů (pí v rozmezí 4 až 6,5) a podle pokynů výrobce. Pásy rozdělené GPa a GPb se vizualizují na gelu následným obarvením stříbrem (2D-silver Stain II Daiichi Kit, Daiichi Pure Chemicals Company, Ltd., Tokyo, Japonsko). GPa a GPb se identifikují porovnáním se standardy GPa a GPb z E. coli, které se získají paralelně na stejných gelech, jako u experimentálních vzorků.

B) Stanovení aktivity GPa

Kurativní a profylatickou účinnost proti uvedeným chorobám nebo chorobným stavům je u sloučenin podle vynálezu možno nepřímo stanovit zjištěním účinku sloučenin podle vynálezu na aktivitu aktivované formy glykogen fosforylasy (GPa) za použití některé ze dvou dále uvedených metod. Bud’ se aktivita glykogen fosforylasy měří při reakci probíhající ve směru tvorby glukosa-l-fosfátu z glykogenu (štěpná reakce) na základě sledování obsahu glukosa-l-fosfátu nebo se měří při reversní reakci (syntetická reakce), při níž se syntetizuje glykogen z glukosa-l-fosfátu, na základě sledování uvolňování anorganického fosfátu. Všechny reakce se provádějí se třemi replikacemi v 96-jamkových mikrotitrových miskách a měří se změna absorbance vlivem tvorby reakčního produktu při vlnové délce uvedené dále za použití čtecího zařízení MCC/340 MKII Elisa Reader (Lab Systems, Finsko)

133 • ·» 9 99 9 9 9 připojeného k zařízení Titertech Microplate Stacker (ICN Biomedical Co., Huntsville, Alabama, USA).

Pro měření aktivity enzymu GPa při reakci probíhající ve směru štěpení se sleduje tvorba glukosa-l-fosfátu z glykogenu multienzymovým spojeným obecným postupem, který popsali Pesce et al. (Pesce M. A., Bodourian S. H., Harris R. C. a Nicholson J. F. (1977) Clinical Chemistry 23, 1711 až 1717), který je modifikován takto: 1 až 100 gg GPa, 10 jednotek fosfoglukomutasy a 15 jednotek glukosa-6-fosfát dehydrogenasy (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) se zředí na 1 ml pufrem A (pufr A: pH 7,2, 50mM HEPES, lOOmM chlorid draselný, 2,5mM ethylenglykoltetraoctová kyselina (EGTA), 2,5mM chlorid hořečnatý, 3,5mM dihydrogenfosforečnan draselný a 0,5mM dithiothreitol) 20 μΐ zásobního vzorku se přidá k 80 μΐ pufru A s obsahem 0,47 mg/ml glykogenu, 9,4mM glukosou a 0,63mM oxidovanou formou nikotinamidadenindinukleotid fosfátu (NADP⁺).

Zkoušená sloučenina se přidá vždy v podobě 5 μΐ roztoku v 14% dimethylsulfoxidu před přidáním enzymu. Základní hodnota aktivity enzymu HLGPa za nepřítomnosti inhibitorů se stanoví za použití přídavku 5 μΐ 14% dimethylsulfoxidu a plně inhibovaná hodnota aktivity enzymu GPa se stanoví za použití přídavku 20 μΐ 50mM roztoku pozitivní kontrolní zkušební látky, kofeinu. Reakce se sleduje při teplotě místnosti měřením konverze oxidovaného NADP⁺ na redukovaný NADPH při 340 nm.

Při měření aktivity enzymu GPa při reversní reakci (tj. syntetické reakci), při níž z glukosa-l-fosfátu vzniklá glykogen a anorganický fosfát, se používá obecného způsobu, který popsali Engers et al. (Engers H. D., Shechosky, S. a Madsen N. B. (1970) Can. J. Biochem. 48,

746 až 754), který je modifikován takto: 1 až 100 μg GPa se zředí na 1 ml pufrem B (pufr B: pH 7,2, 50mM HEPES, • 9

- 134

9 « 9 9

9 9 9 9 9 • 9999999 9 · 9 9 9 · 99 lOOmM chlorid draselný, 2,5mM ethylenglykoltetraoctová kyselina (EGTA), 2,5mM chlorid horečnatý a 0,5mM dithiothreitol). 20 μΐ zásobního vzorku se přidá k 80 μΐ pufru B s obsahem 1,25 mg/ml glykogenu, 9,4mM glukosou a 0,63mM glukosa-l-fosfátem. Zkoušená sloučenina se přidá vždy v podobě 5 μΐ roztoku v 14% dimethylsulfoxidu před přidáním enzymu. Základní hodnota aktivity enzymu GPa za nepřítomnosti přidaných inhibitorů se stanoví za použití přídavku 5 μΐ 14% dimethylsulfoxidu a hodnota úplné inhibice aktivity enzymu GPa se stanoví za použití přídavku 20 μΐ 50mM roztoku kofeinu. Směs se inkubuje 1 hodinu při teplotě místnosti a anorganický fosfát uvolněný z glukosa-l-fosfátu se měří obecným postupem, který popsali Lanzetta et al. (Lanzetta P. A., Alvarez L. J., Reinach P. S. a Candia O. A. (1979) Anal. Biochem. 100, 95 až 97), který je modifikován takto: ke 100 μΐ směsi obsahující enzym se přidá 150 μΐ roztoku molybdenanu amonného o koncentraci 10 mg/ml a malachitová zeleň (0,38 mg/ml) v 1M kyselině chlorovodíkové. Vzniklá směs se 20 minut inkubuje při teplotě místnosti a měří se absorbance při 620 nm.

Výše uvedené zkoušky prováděné v rozmezí koncentrací zkoušených sloučenin umožňují stanovit hodnotu IC₅₀(koncentraci zkoušené sloučeniny potřebnou pro 50% inhibici) pro in vitro inhibici aktivity enzymu GPa těmito zkoušenými sloučeninami.

Indikační zkoušky resistence na insulin

Kombinace podle vynálezu je možno snadno upravit na hypoglykemická činidla vhodná pro klinické použití. Hypoglykemickou účinnost kombinací podle vynálezu je možno určit na základě množství zkoušené sloučeniny snižující hladinu glukosy vzhledem k vehikulu bez zkoušené sloučeniny u samců myši ob/ob. Tato zkouška také umožňuje stanovení • ·

9 9

99 99

- 135 99 * « « · · • · · · · • 9 9 9

99 ·<· ··· přibližné minimální účinné dávky (MED) pro in vivo snížení hladiny glukosy v myší plasmě pomocí těchto zkoušených sloučenin.

Vzhledem k tomu, že koncentrace glukosy v krvi je blízce spjata s vývojem diabetických poruch, kombinace podle vynálezu prostřednictvím svého hypoglykemického účinku zabraňují, zastavují a/nebo regretují diabetické poruchy.

Pětitýdenní až osmitýdenní samci myši C57 BL/6J-ob/ob (od Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) se po pěti umístí do klecí, kde se ošetřují standardními způsoby. Po jednotýdenním aklimatizačním období se zvířata zváží a před jakýmkoliv ošetřením se jim z retroorbitálního sinu odebere 25 μΐ krve. Krevní vzorek se ihned zředí v poměru 1 : 5 fyziologickým roztokem chloridu sodného, který obsahuje 0,025 % sodné soli heparinu. Získaný vzorek se až do analýzy na metabolit uchovává na ledu. Zvířata se přidělí do ošetřovaných skupin tak, aby každá skupina vykazovala podobnou střední hodnotu koncentrace glukosy v plasmě. Po přidělení do skupin se zvířatům po dobu celkem 5 dnů orálně podává každý den vehikulum sestávající z buď 1) roztoku methylcelulosy ve vodě o koncentraci 2,5 g/litr bez úpravy pH, nebo 2) 0,1% roztoku prostředku Pluronic^^R^ P105 (bloková kopolymerní povrchově aktivní látka, výrobek firmy BASF Corp., Parsippany, New Jersey, USA) v 0,1% fyziologickém roztoku chloridu sodného bez úpravy pH. Pátý den se zvířata znovu zváží a orální cestou se jim podá zkoušená sloučenina nebo samotné vehikulum. Všechna léčiva se podávají ve vehikulu sestávajícím z buď 1) roztoku methylcelulosy ve vodě o koncentraci 2,5 g/litr bez úpravy pH, nebo 2) 10% dimethylsulfoxidu/0,1% roztoku prostředku Pluronic^^R^ P105 (BASF Corp., Parsippany, New Jersey, USA) v 0,1% fyziologickém roztoku chloridu sodného bez úpravy pH. Po dalších 3 hodinách se zvířatům z retroorbitálního sinu odebere krev

136 • 9

9999 pro stanovení hladiny metabolitu v krvi. Čerstvě odebrané vzorky se 2 minuty odstřeďují při 10 000 x g a teplotě míst nosti. Supernatant se analyzuje na glukosu, například za použití zařízení Abbott Vp(^R) (Abbot Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX, USA) a VP Super System^) Autoanalyzer (Abbot Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX, USA) nebo Abbott Spectrum CCX^^R\ Autoanalyzer (abbott Laboratories, Irving, TX, USA), přičemž se používá systému reakčních činidel A-Gent^^R^ Glucose-UV Test (Abbot Laboratories, Irving, TX, USA) (jedná se o modifikaci metody popsané v Richterrich a Dauwalder, Schweizerische Médizinische Wochenschrift, 101, 860 (1971)). Při této hexokinasové metodě se používá standardů o koncentraci 100 mg/100 ml. Hladina glukosy v plasmě se potom vypočítá podle rovnice:

Glukosa Hodnota v plasmě = naměřená x 8,14 (mg/100 ml) ve vzorku kde číslo 8,14 představuje faktor ředění přizpůsobený plasmovému hematokritu (za předpokladu, že hernatokrit je 44%).

U zvířat, kterým se podává pouze vehikulum, se udr žuje hyperglylemická hladina glukosy (například 250 mg/100 ml nebo vyšší) v podstatě beze změny, zatímco zvířata ošetřená zkoušenými sloučeninami ve vhodných dávkách vykazují podstatně sníženou hladinu glukosy. Hypoglykemická účinnost zkoušených sloučenin se určuje statistickou analýzou (nepárový t-test) za použití střední hodnoty koncentrace glukosy v plasmě u skupiny, jíž byla podávána zkoušená sloučenina a skupiny, jíž bylo podáváno pouze vehikulum v den 5. Výše uvedená zkouška prováděná s určitým rozmezím dávek zkoušených sloučenin umožňuje stanovení přibližné • 4 •··♦ · 4

- 137 • · • * » · · · 0

4

4 minimální účinné dávky (MED) pro in vivo snížení koncentrace glukosy v plasmě.

Sloučeniny podle vynálezu lze snadno zpracovat na činidla vyvolávající reversi hyperinsulinemie, činidla snižující hladinu triglyceridů a hypocholesterolemická činidla vhodná pro klinické použití. Tuto aktivitu je možno stanovit jako množství zkoušené sloučeniny, které u samce myši ob/ob snižuje koncentraci insulinu, triglyceridů nebo cholesterolu vzhledem ke kontrolnímu vehikulu bez zkoušené sloučeniny.

Vzhledem k tomu, že koncentrace cholesterolu v krvi má úzký vztah k vývoji kardiovaskulárních, cerebrálních vaskulárních nebo periferních vaskulárních poruch, kombinace podle vynálezu díky svému hypocholesterolemickému účinku zabraňují vzniku atherosklerosy nebo její průběh zastavují a/nebo regretuj í.

Vzhledem k tomu, že koncentrace insulinu v krvi má úzký vztah ke zvyšování růstu vaskulárních buněk a zvýšenému zadržování sodíku v ledvinách (kromě jiných účinků, jako je například zvyšování utilizace glukosy) a vzhledem k tomu, že je známo, že tyto funkce vyvolávají hypertensi, kombinace podle vynálezu díky svému hypoinsulinemickému účinku zabraňují vzniku hypertenze nebo hypertenzi zastavují a/nebo regretuj i.

Vzhledem k tomu, že koncentrace triglyceridů a volných mastných kyselin v krvi přispívá k celkové hladině lipidů v krvi, kombinace podle vynálezu prostřednictvím své účinnosti na snižování hladiny triglyceridů a volných mastných kyselin zabraňují vzniku hyperlipidemie nebo její průběh zastavují a/nebo regretují.

• A

- 138 AAA

A A A A A *· A • « ·Α

AAA A A « • · · · · A A • * A A A · ** ··· ·· ·»·

Volné mastné kyseliny se podílejí na celkové hladině lipidů v krvi a nezávisle byly u různých fysiologických a pathologických stavů byly nezávisle korelovány s citlivostí na insulin.

Pětitýdenní až osmitýdenní samci myši C57 BL/6J-ob/ob (od Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) se po pěti umístí do klecí, kde se ošetřují standardními způsoby a podává se jim standardní krmivo pro hlodavce ad libitum. Po jednotýdenním aklimatizačním období se zvířata zváží a před jakýmkoliv ošetřením se jim z retroorbitálního sinu odebere 25 μΐ krve. Krevní vzorek se ihned zředí v poměru 1 : 5 fyziologickým roztokem chloridu sodného, který obsahuje 0,025 % sodné soli heparinu. Získaný vzorek se až do analýzy glukosy v plasmě uchovává na ledu. Zvířata se přidělí do ošetřovaných skupin tak, aby každá skupina vykazovala podobnou střední hodnotu koncentrace glukosy v plasmě. Zkoušená sloučenina se zvířatům podává orální sondou ve formě roztoku o koncentraci asi 0,2 až 20 g/litr buď 1) v 10% DMSO/0,1% roztoku prostředku Pluronic^^R^ P105 (bloková kopolymerní povrchově aktivní látka, výrobek firmy BASF Corp., Parsippany, New Jersey, USA) v 0,1% fyziologickém roztoku chloridu sodného bez úpravy pH nebo 2) v roztoku methylcelulosy ve vodě o koncentraci 2,5 g/litr, bez úpravy pH. Dávkování se provádí jednou denně (s.i.d.) nebo dvakrát denně (b.i.d.) po dobu celkem 1 až například 15 dnů.

Kontrolní myši dostávají pouze 10% DMSO/0,1% Pluronic^^R^

P105 v 0,1% fyziologickém roztoku chloridu sodného bez úpravy pH nebo roztok methylcelulosy ve vodě o koncentraci

2,5 g/litr, bez úpravy pH.

Tři hodiny po poslední podané dávce se zvířata usmrtí dekapitací a krev z trupu se zachytí do 0,5ml zkumavek pro separaci séra obsahujících vždy 3,6 mg směsi fluoridu sodného a štavelanu draselného v hmotnostním poměru

139 • 9 · 49 •94 9 9

9 4 9 9 · • 4999994 *

4« : 1. Čerstvě odebrané krevní vzorky se 2 minuty centrifugují při 10 000 x g při teplotě místnosti a sérový supernatant se oddělí a zředí v objemovém poměru 1 : 1 roztokem aprotininu (lTIU/ml) v 0,1% roztoku chloridu sodného bez úpravy pH.

Zředěné vzorky séra se až do analýzy uchovávají při -80°C. Po roztátí se zředěné vzorky séra analyzují na insulin, triglyceridy, volné mastné kyseliny a cholesterol. Koncentrace insulinu v séru se stanoví za použití soupravy Equate(^R) RIA INSULIN (metoda se dvěma protilátkami; podle návodu výrobce) zakoupené od firmy Binax, South Portland,

ME, USA. Mezizkouškový koeficient rozptylu je nižší nebo rovný 10 %. Hladina triglyceridů v séru se stanoví za použití Abbott Vp(^R) a VP Super System^) Autoanalyzer (Abbot Laboratories, Irving, TX, USA) nebo Abbott Spectrum CCX^^R^ (Abbott Laboratories, Irving, TX, USA). Při tom se používá systému reakčních činidel A-Gent^^R^ Triglycerides Test (Abbot Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX, USA) (enzymatická metoda spojená s použitím lipázy; modifikace metody popsané v Sampson et al., Clinical Chemistry 21,

1983 (1975)). Celková hladina cholesterolu v séru se stanoví za použití Abbott Vp(^R) a VP Super System^^R^ Autoanalyzer (Abbot Laboratories, Irving, TX, USA) nebo Abbott Spectrum CCx(^R) (Abbott Laboratories, Irving, TX, USA). Při tom se používá systému reakčních činidel A-Gent^^R^ Cholesterol Test (enzymatická metoda spojená s použitím cholesterol esterasy; modifikace metody popsané v Allain et al., Clinical Chemistry 20, 470 (1974)) za použití standardů o koncentraci 100 a 300 mg/100 ml. Koncentrace volných mastných kyselin se stanoví za použití kitu od firmy Amano International Enzyme Co., Inc., který je přizpůsoben pro použití se zařízením Abbott Vp(^R) a VP Super System^) Autoanalyzer (Abbot Laboratories, Irving, TX, USA) nebo Abbott Spectrum CCX^^R^ (Abbott Laboratories, Irving, TX, USA). Hladina insulinu,

140 • ··«·· · * < ···· · • · · · · · · · · ·· · ·· «·· ·· «·· triglyceridů a cholesterolu celkem v séru se vypočítá z dále uvedených rovnic

Inzulín v séru (μυ/ml) = Hodnota ve vzorku x 2

Triglyceridy v séru (mg/100 ml) = Hodnota ve vzorku x 2 Cholesterol celkem v séru (mg/100 ml) = Hodnota ve vzorku x 2 Volná mastná kyselina v séru ^ekv./litr) = Hodnota ve vzorku x 2 kde číslo 2 představuje faktor ředění.

U zvířat, kterým se podává pouze vehikulum, se udržuje zvýšená hladina insulinu v séru (například 275 μυ/ml), triglyceridů v séru (například 235 mg/100 ml), volných mastných kyselin v séru (například 1500 μβΚν./ιηΙ) a cholesterolu celkem v séru (například 190 mg/100 ml) v podstatě beze změny, zatímco zvířata ošetřená zkoušenými sloučeninami podle vynálezu obecně vykazují sníženou hladinu insulinu, triglyceridů, volných mastných kyselin a cholesterolu celkem v séru. Účinnost zkoušených sloučenin na snižování hladiny insulinu, triglyceridů, volných mastných kyselin a cholesterolu celkem v séru se určuje statistickou analýzou (nepárový t-test) za použití střední hodnoty koncentrace insulinu, triglyceridů, volných mastných kyselin a cholesterolu celkem v séru u skupiny, jíž byla podávána zkoušená sloučenina a kontrolní skupiny, jíž bylo podáváno pouze vehikulum.

Účinnost sloučenin podle vynálezu spočívající v ochraně před ischemii (například poškození srdeční tkáně) je možno demonstrovat in vitro za použití postupu popsaného V Butwell et al., Am. J. Physiol., 264, H1884 až H1889,

1993 a Allard et al., Am. J. Physiol., 1994, 267, H66 až H74. Pokusy se provádějí za použití isovolumetrického přípravku z izolovaného krysího srdce v podstatě způsobem popsaným ve výše uvedeném článku. Normálním krysím samcům

141 • · · ο • · 9 · ·

9 9999 9 9

9 9 9

9

Spraque-Dawley, krysím samcům Spraque-Dawley, u nichž byla vyvolána srdeční hypertrofie podvázáním aorty, akutně diabetickým krysím samcům BB/W a nediabetickým krysím samcům BB/W (kontrolním zvířatům stejného stáří) se nejprve podá heparin (intraperitoneálně 1000 jednotek) a potom pentobarbital (intraperitoneálně 65 mg/kg). Po dosažení hluboké anesteze, což je zjistí vymizením reflexu na tlapce, se zvířatům rychle vyřízne srdce a umístí se do ledem vychlazeného fyziologického roztoku chloridu sodného. Srdce se podrobí retrográdní perfusi aortou (během 2 minut). Frekvence srdečního tepu a ventrikulární tlak se stanoví pomocí latexového balónku v levém ventrikulu za použití vysokotlaké trubky připojené k měřiči tlaku. Pro perfusi srdce se použije roztoku obsahujícícho chlorid sodný (118mM), chlorid draselný (4,7mM), chlorid vápenatý (l,2mM), chlorid hořečnatý (l,2mM), hydrogenuhličitan sodný (25mM) a glukosu (llmM). Zařízení pro perfusi je dobře termostatováno na teplotu srdce 37°C za použití termostatických lázní pro perfusát a vodního duplikátorového pláště okolo perfusní trubky. Oxygenace perfusátu se provádí pomocí pediatrického oxygenačního zařízení s dutými vlákny (Capiax, Terumo Corp., Tokyo, Japonsko) bezprostředně u srdce. Srdce se exponuje působení perfusního roztoku se zkoušenou sloučeninou nebo bez ní, po dobu asi 10 minut nebo déle a potom následuje 20 minut globální ischemie a 60 minut reperfuse za nepřítomnosti zkoušené sloučeniny. V období po ischemii se provede porovnání frekvence srdečního tepu u kontrolních vzorků se vzorky za použití zkoušené sloučeniny. V tomto období se porovnává tlak v levém ventrikulu u kontrolního srdce s tlakem ve ventrikulu u srdce ošetřeného zkoušenou sloučeninou. Na konci pokusu se při perfusi také provede barvení, aby se zjistil podíl plochy infarktu z celé ohrožené plochy (% IA/AAR), způsobem popsaným dále.

142 • · · · • · · · · ······· ·

Terapeutické účinky sloučenin podle vynálezu při prevenci poškození srdeční tkáně, k němuž by jinak došlo ischemickým insultem, je také možno demonstrovat in vivo způsobem popsaným v publikaci Liu et al., Circulation, sv. 84, č. 1 (červen 1991), jak je to konkrétně uvedeno v tomto popisu. Při zkoušení in vivo se zjištuje ochrana srdce zkoušenou sloučeninou vzhledem ke kontrolní skupině, jíž se podává pouze solné vehikulum. Pro vysvětlení je třeba uvést, že bylo zjištěno, že krátká období ischemie myokardu, po nichž následuje reperfuse koronární artérie, chrání srdce před následující prudkou ischemií myokardu (Murry et al., Circulation 74: 1124 až 1136, 1986). Srdeční ochranu, kterou dokumentuje snížení rozsahu infarktu myokardu, je možno farmakologicky indukovat za použití intravenosně podaných antagonistů receptorů adenosinu intaktním anestetizovaným králíkům studovaným jako in šitu model prekondiciované ischemie myokardu (Liu et al., Circulation 84: 350 až 356, 1991). Při zkoušení in vivo se zjišfuje, zda jsou zkoušené sloučeniny schopny farmakologicky indukovat srdeční ochranu, tj. zabezpečit snížení velikosti infarktu myokardu při parenterálním podání intaktním anestetizovaným králíkům. Účinky sloučenin podle tohoto vynálezu je možno porovnat s prekondiciováním ischemie za použití agonisty Al adenosinu, z:

N -l-(fenyl-2R-isopropyl)adenosinu (PIA), o němž je známo, že farmakologicky indukuje srdeční ochranu u intaktních anestetizovaných králíků (studie in šitu) (Liu et al., Circulation 84: 350 až 356, 1991). Přesná metodologie je popsána dále.

Chirurgické ošetření

Samci novozélandského bílého králíka (3 až 4 kg) se anestetizují sodnou solí pentobarbitalu (30 mg/kg i.v.). Prostřednictvím ventrální centrální cervikální incise se provede tracheotomie a ventilace králíků se provádí tlako•···· · ·

143 vým ventilátorem pomocí 100% kyslíku. Katetry pro podávání léčiva se vloží do levé jugulární vény, zatímco katetry pro měření tlaku se vloží do levé karotidové artérie. Srdce se exponuje levou throrakotomií a okolo prominentní větve levé koronární artérie se umístí smyčka (00 hedvábí). Ischemie se vyvolá těsným zatažením smyčky a jejím upevněním pomocí svorky. Při uvolnění smyčky se umožní reprefuse postižené plochy. Ischemií myokardu dokumentuje místní cyanosa.

Důkazem reperfuse je reaktivní hyperemie.

Protokol

Pokus se zahájí po přinejmenším 30 minutách ustáleného arteriálního tlaku a frekvence srdečního tepu. Ischemické předběžné ošetření se vyvolá dvojnásobnou okluzí koronární artérie, vždy na dobu 5 minut, po nichž následuje 10minutová reperfuse. Farmakologické předběžné ošetření se indukuje dvojnásobnou infusí zkoušené sloučeniny, například vždy po dobu 5 minut, přičemž před další intervencí se nechá uplynout 10 minut, nebo infuzí agonisty adenosinu, PIA (0,25 mg/kg). Po ischemickém předběžném ošetření se provede farmakologické předběžné ošetření nebo se neprovede žádné předběžné ošetření (předběžné ošetření vehikulem pro kontrolu) , načež následuje 30minutová okluze artérie a potom dvouhodinová reprefuse pro indukci infarktu myokardu. Zkoušená sloučenina a PIA se rozpustí v roztoku chloridu sodného nebo jiném vhodném vehikulu a podává v množství od 1 do 5 mg/kg.

Barvení

Barvení se provádí způsobem popsaným v Liu et al., Circulation 84: 350 až 356, 1991. Na konci dvouhodinového reperfušního období se srdce rychle vyjme, zavěsí do Langendorffova zařízení a 1 minutu proplachuje normálním fyziolo·· ·

- 144

gickým roztokem chloridu sodného zahřátým na tělesnou teplotu (38°C). Šicí hedvábí použité pro vytvoření smyčky se potom těsně zatáhne, aby se vyvolala reokluze artérie a s perfusátem se infusí podá 0,5% suspenze fluorescentních čátic (1 až 10 μπι) (Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA, USA), aby se vybarvil celý myokard s výjimkou ohrožené plochy (nefluorescenční ventrikulum). Srdce se rychle zmrazí a přes noc uloží v prostoru o teplotě -20°C. Následující den se srdce nařeže na 2mm řezy, které se obarví 1% trifenyltetrazoliumchloridem (TTC). Jelikož TTC reaguje s živou tkání, je možno obarvením odlišit živou (červeně zbarvenou) tkáň od mrtvé (nevybarvené infarktové) tkáně. U každého řezu levého ventrikula se za použití předběžně kalibrovaného obrazového analyzátoru vypočítá infarktová plocha (neobarvená) a ohrožená plocha (bez fluorescentních částic). Pro normalizaci ischemického poškození s ohledem na rozdíly v ohrožené ploše mezi srdci se data vyjádří jako poměr infarktové plochy a ohrožené plochy (% IA/AAR). Všechna data se vyjádří jako střední hodnoty ± směrodatná odchylka a provede se statistické porovnání za použití jednofaktorového testu ANOVA nebo nepárového t-testu. Signifikance je uvažována při hodnotě p < 0,05.

Kompozice a způsoby podle vynálezu je možno zkoušet na užitečnost při snižování nebo prevenci ischemického poškození nesrdečních tkání, jako je například mozek nebo játra, za použití postupů popsaných ve vědecké literatuře. Sloučeniny podle tohoto vynálezu je možno přednostním způsobem podávání a za použití přednostního vehikula a v přednostní dobu podávání buď před ischemickou episodou, během ischemické episody nebo během všech dále uvedených zkouškových etap.

Prospěšný vliv kompozic a způsobů podle vynálezu, který spočívá ve snížení ischemického poškození mozku je > · · · · ·

145 možno demonstrovat například na savci za použití postupu popsaného v Park et al., Ann. Neurol. 1988, 24: 543 až 551. Stručně je tento postup možno popsat takto: dospělí samci potkana Sprague Dawley se nejprve anestetizují 2% halothanem a poté mechanickou ventilací směsí oxidu dusného (70 %) a kyslíku (30 %) s obsahem 0,5 až 1 % halothanu. Následně se provede tracheostomie. Pracovní obsah válce ventilátoru se nastaví tak, aby se udržoval arteriální tlak oxidu uhličitého na asi 4,67 kPa a adekvátní arteriální okysličení (PaO₂ >

kPa). Tělesnou teplotu lze sledovat pomocí rektálního teploměru a zvířata je možno udržovat normotermická, pokud je to nezbytné, vnější dodávkou tepla. Poté se zvířata podrobí subtemporální kraniektomii za účelem expozice hlavního kmene levé střední cerebrální artérie (MCA) pod operačním mikroskopem. Exponovaná artérie se uzavře mikrobipolární koagulací, čímž v mozkové kůře a bazálním gangliu vzniknou rozsáhlé ischemické léze. Po 3 hodinách okluze MCA se potkani hluboce anestetizují 2% halothanem a za účelem infuse heparinizovaného solného roztoku do levého ventrikula se provede thorakotomie. Výtok se shromáždí naříznutím pravého atria. Po promytí solným roztokem se tkáně promyjí asi 200 ml 40% roztoku formaldehydu, ledové kyseliny octové a absolutního methanolu (FAM, v objemovém poměru 1:1:8), načež se zvířata dekapitují. Hlava se 24 hodin udržuje v fixativu, načež se z ní odebere mozek, který se zbaví tkání, zpracuje, uloží do parafinového vosku a nařeže (asi 100 řezů na jeden mozek). Řezy se barví hemotoxylin-eosinem nebo kombinací kresyl-violeti a modře Luxol Fast Blue a zkoumají na světelném mikroskopu za účelem identifikace a kvantifikace ischemického poškození za použití analyzátoru obrazu (například Quantimet 720). Hodnotu objemu a plochy ischemie se vyjádří v absolutních jednotkách (mm³ a mm²) a stanoví se procentický podíl celkové vyšetřované oblasti. Zaznamená se účinek kompozic a způsobů podle vynálezu, který spočívá ve snížení ischemického poškození

9

- 146

mozku indukovaného MCA okluzí, na základě zmenšení plochy nebo objemu relativního nebo absolutního ischemického poškození v řezech mozku potkanů v léčené skupině ve srovnání s řezy mozku potkanů z kontrolní skupiny ošetřované placebem.

Pro demonstraci užitečnosti kompozic a způsobů podle vynálezu při snížení ischemického poškození mozku je alternativně možno použít například postupů popsaných v Nakayama et al., Neurology 1988, 38: 1667 až 1673,

Memezawa et al., Stroke 1992, 23: 552 až 559, Folbergrova et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 1995, 92: 5057 až 5059 a Gotti et al., Brain Res. 1990, 522: 290 až 307.

Užitečnost kompozic a způsobů podle vynálezu při snižování ischemického poškození jater u savců je možno demonstrovat například za použití postupu popsaného v Yokoyama et al., Am. J. Physiol. 1990, 258: G564 až G570. Stručně lze tento postup popsat takto: Dospělí samci potkana Sprague Dawley se na lačno anestetizují sodnou solí pentobarbitalu (40 mg/kg i.p.). Poté se zvířata tracheotomizují a mechanicky ventilují vzduchem z místnosti. Játra se vyjmou a uchovávají v komoře s řízeným prostředím při konstantní teplotě 37°C. Následně se játra promyjí portální vénou za konstantního tlaku 147 Pa modifikovaným Krebsovým-Henseleitovým pufrem bez hemoglobinu (118mM chlorid sodný, 4,7mM chlorid draselný, 27mM hydrogenuhličitan sodný, 2,5mM chlorid vápenatý, l,2mM síran hořečnatý, 1,2mM dihydrogenfosforečnan draselný, 0,05mM EDTA a llmM glukosa s přídavkem 300 U heparinu). Hodnota pH perfusátu se udržuje na 7,4 tak, že se pufr aeruje směsí kyslíku a oxidu uhličitého v poměru 95 : 5. Každá játra se promývají jednocestným způsobem rychlostí 20 ml/min po dobu 30 minut za účelem promytí a ekvilibrace (preischemické období), poté po dvouhodinové období celkové ischemie a po další dvouhodinové období

147 repeřfuse za podmínek jaké jsou popsány pro preischemické období. Během preischemického období, bezprostředně po oklusivním ischemickém období a každých 30 minut dvouhodinového reperfušního období se shromáždí alikvoty (20 ml) perfusátu. Vzorky perfusátu se zkoušejí na přítomnost hepatocelulárních enzymů, například aspartát aminotransferasu (AST), alanin aminotransferasu (ALT) a laktát dehydrogenasu (LDH). Tyto vzorky se odebírají, aby kvantitativně reflektovaly stupeň ischemického poškození tkáně jater během postupu. Aktivitu AST, ALT a LDH v perfusátu je možno stanovit několika postupy, například reflektometrickým postupem za použití automatického analyzátoru Kodak Ektachem 500 (viz Nakano et al., Hepatology 1995, 22: 539 až 545). Účinek kompozic a způsobů podle vynálezu při snižování ischemického poškození jater indukovaného oklusí se zaznamenává na základě snížení uvolňování hepatocelulárních enzymů bezprostředně po oklusivním období a/nebo během postischemického-reperfušního období v perfundovaných játrech u potkanů z léčené skupiny ve srovnání s perfundovanými játry potkanů z kontrolní skupiny ošetřované placebem.

Další postupy a parametry, kterých je možno alternativně využít pro demonstraci účinku kompozic a způsobů podle vynálezu při snižování ischemického poškození jater je například možno nalézt v Nakano et al., Hepatology 1995, 22: 539 až 545.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou podávat jakoukoliv metodou, pomocí které je možno je dodat do požadované tkáně, (například do tkání jater a/nebo srdce) Tyto metody zahrnují orální, parenterální, intraduodenální cestu atd. Sloučeniny podle vynálezu se obvykle podávají v jediné dávce, například jednou denně, nebo v několika dávkách.

148

Kombinace podle vynálezu jsou užitečné při snižování nebo minimalizaci přímého poškození všech tkání, které mohou být suspceptibilní k ischemickému/reperfusnímu poranění (například srdce, mozek, plíce, ledviny, játra, střeva, kosterní svalstvo a retina) následkem ischemické příhody (například infarktu myokardu). Účinné sloučeniny podle vynálezu se tedy s výhodou využívají profylakticky za účelem zabránění, tj. (prospektivního nebo profylaktického) zmírnění nebo zastavení, poškození tkání (například tkáně myokardu) u pacientů, kteří jsou ohroženi ischemii (například ischemii myokardu).

Sloučeniny podle vynálezu se obvykle podávají orálně, ale možné je i parenterální podávání (například intravenosní, intramuskulární, subkutánní nebo intramedulární podávání), kterého se účelně používá například v případech, kdy je orální podávání pro konkrétní zacílení nevhodné nebo kdy pacient není schopen léčivo požít. Také se může indikovat topické podávání, například když pacient trpí gastrointestinálními poruchami nebo když lékař dojde k závěru, že nejvhodnější způsob aplikace léčiva je na povrch tkáně nebo orgánu.

Dvě různé sloučeniny podle vynálezu je možno podávat současně nebo postupně v jakémkoliv pořadí, nebo je možno podávat jedinou farmaceutickou kompozici, která obsahuje výše popsaný inhibitor aldosa reduktasy a výše popsaný inhibitor glykogen fosforylasy ve farmaceuticky vhodném nosiči.

Množství a doba podávání sloučeniny nebo sloučenin podle vynálezu budou samozřejmě závislé na léčeném subjektu, na závažnosti postižení, způsobu podávání a úsudku ošetřujícího lékaře. S ohledem na značnou variabilitu pacientů je třeba považovat dále uvedené dávkování pouze za

- 149 ·· 9 » · · » · · ·

I 9 9999 vodítko, přičemž lékař může dávku léčiva upravit tak, aby dosáhl účinnosti (například účinnosti spočívající ve snižování hladiny glukosy; hladiny insulinu), kterou považuje pro pacienta za vhodnou. Při úvahách o požadovaném stupni účinku, jehož se má dosáhnout, musí lékař zvážit nejrůznější faktory, jako je věk pacienta, dříve prodělané choroby, jakož i přítomnost dalších chorob (například kardiovaskulární choroby).

Tak například při jednom režimu podávání je kombinaci podle vynálezu možno podat těsně před operací srdce (například během 24 hodin), kdy dochází ohrožení ischemií myokardu. Při alternativním režimu je sloučeniny možno podat následně po operaci srdce (například během 24 hodin po operaci), kdy dochází k ohrožení ischemií myokardu. Sloučeniny podle vynálezu lze rovněž podávat v denním dlouhodobém režimu.

Obvykle se používá takového množství kombinace podle vynálezu, které je dostatečné pro dosažení odpovídajícího účinku, který spočívá ve zvýšení citlivosti na insulin.

Jinak řečeno, používá se takového množství kombinace podle vynálezu, které je dostatečné pro dosažení normálního biologického účinku insulinu při normální koncentraci, která by kromě normálního tlaku a normální glukosové tolerance byla patrná z přetrváváj ící euglykémie, normoglykémie a normální lipidemie (například u triglyceridů, cholesterolu a volných mastných kyselin).

Rovněž je kombinaci podle vynálezu možno použít v množství, které je účinné pro ochranu před ischemií.

4

- 150

Inhibitoru aldosa reduktasy se podle vynálezu používá v množství, které je vhodné pro dosažení účinků podle tohoto vynálezu, například účinku, který spočívá ve snížení triglyceridů a cholesterolu a reversi hyperinsulinémie. Denní účinná dávka inhibitorů aldosa reduktasy podle vynálezu obvykle leží v rozmezí od asi 0,1 mg/kg do 100 mg/kg, přednostně od 0,1 mg/kg do 20 mg/kg, a lze ji podávat ve formě jediné dávky nebo několika dílčích dávek.

Účinná denní dávka inhibitoru glykogen fosforylasy podle vynálezu vhodná pro dosažení požadované účinnosti, například pro snížení hladiny glukosy, triglyceridů, volných mastných kyselin a cholesterolu v krvi a pro reversní účinek na hyperinsulinemii leží v rozmezí od 0,005 do 50 mg/kg, přednostně od 0,01 do 25 mg/kg a nejvýhodněji od 0,1 do 15 mg/kg.

Sloučeniny podle vynálezu se obvykle podávají v podobě farmaceutických kompozic obsahujících přinejmenším jednu sloučeninu podle vynálezu a dále též farmaceuticky vhodné vehikulum nebo ředidlo. Sloučeniny podle vynálezu je tedy možno podávat jednotlivě nebo v společně v jakýchkoliv vhodných orálních, parenterálních, rektálních nebo transdermálních dávkovačích formách.

V případě orálního podávání se může používat farmaceutických kompozic v podobě roztoků, suspenzí, tablet, pilulí, tobolek, prášků apod. Tablet obsahujících různé excipienty, jako je citrát sodný, uhličitan vápenatý a fosforečnan vápenatý se používá spolu s různými rozvolňovadly, jako je škrob, přednostně bramborový nebo tapiokový škrob a určité komplexní silikáty a různými pojivý, jako je polyvinylpyrrolidon, sacharosa, želatina a klovatina. Pro tabletovací účely se dále také hodí lubrikanty, jako je stearan hořečnatý, natriumlaurylsulfát a mastek. Podobných

151 kompozic se také může používat jako náplní pro měkké a tvrdé želatinové tobolky. Přednostní kompozice tohoto typu obsahují také laktosu a vysokomolekulární polyethylenglykoly. Má-li se pro orální podávání použít vodných suspezí a/nebo elixírů, mohou se sloučeniny podle vynálezu mísit s různými sladidly, ochucovadly, barvicími činidly, emulgátory a/nebo suspenzními činidly, jakož i jinými ředidly, jako je voda, ethanol, propylenglykol, glycerol a jejich různé kombinace.

Pro účely parenterálního podávání se může použít roztoků v sesamovém nebo arašídovém oleji nebo ve vodném propylenglykolu, jakož i sterilních vodných roztoků odpovídajících vodorozpustných solí. Takové vodné roztoky mohou být účelně pufrovány a kapalné ředidlo je předem isotonizováno dostatečným množstvím roztoku chloridu sodného nebo glukosy. Takové vodné roztoky se zvláště hodí pro intravenosní, intramuskulární, subkutánní a intraperitoneální injekční podávání. Sterilní vodná média vhodná pro tyto aplikace je možno snadno vyrobit standardními technologiemi, které jsou dobře známé odborníkům v tomto oboru.

Pro účely transdermálního (například topického) podávání se může použít zředěných sterilních vodných nebo zčásti vodných roztoků (obvykle o přibližné koncentraci 0,1 až 5 % hmotnostních). Jinak jsou tyto roztoky podobné výše uvedeným parenterálním roztokům.

Způsoby výroby různých farmaceutických kompozic s určeným množstvím účinné přísady jsou známé nebo jsou zřejmé odborníkům v tomto oboru na základě tohoto popisu. Jako vhodné vodítko lze použít standardní farmaceutické příručky, jako je Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, PA, USA, 15. vydání, z roku 1975).

• ·

Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou obsahovat 0,1 až 95 %, přednostně 1 až 70 % sloučeniny nebo sloučenin podle vynálezu. V každém případě je vhodné zajistit, aby podávaný prostředek obsahoval sloučeninu nebo sloučeniny podle vynálezu v množství, které je účinné pro léčení choroby nebo chorobného stavu pacienta.

Jelikož vynález obsahuje aspekt, který se týká například léčení stavu resistence na insulin za použití kombinace účinných složek, které mohou být podávány odděleně, je předmětem vynálezu také kombinace oddělených farmaceutických kompozic ve formě křtu. Kit zahrnuje dvě oddělené farmaceutické kompozice: na bázi výše popsaného inhibitoru aldosa reduktasy a na bázi výše popsaného inhibitoru glykogen fosforylasy. Kit zahrnuje obalový prostředek pro oddělené kompozice, jako rozdělenou lahvičku nebo rozdělený foliový balíček. Kit obvykle zahrnuje pokyny pro podávání oddělených složek. Forma kitu je zvlášť výhodná, když se oddělené složky přednostně podávají v různých dávkovačích formách (například orálně a parenterálně), různých dávkových intervalech nebo když předepisující lékař vyžaduje odměřování jednotlivých složek kombinace.

Jako příklad takového kitu je možno uvést tzv. blistrová (protlačovací) balení. V obalovém průmyslu jsou blistry dobře známy a ve velkém měřítku se jich používá pro balení farmaceutických jednotkových dávkovačích forem (tablet, tobolek apod.). Blistry obvykle sestávají z listu relativně tuhého materiálu potaženého folií přednostně z transparentního plastového materiálu. Během balicího procesu se v plastové folii vytvarují dvorce. Dvorce mají velikost a tvar balených tablet nebo tobolek. Poté se do dvorců umístí tablety nebo tobolky a na opačnou stranu (vzhledem ke směru v němž byly vytvořeny dvorce) plastové folie se připevní list relativně tuhého materiálu. Výsledkem

9 9 » · 9

9 9 9 9 9

9 ···· · · ·

je, že tablety nebo tobolky jsou uzavřeny ve dvorcích mezi plastovou folií a listem. Pevnost listu je přednostně taková, že tablety nebo tobolky je možno z blistru vyjímat tak, že se rukou zatlačí na dvorec, přičemž otvor v listu vznikne v místě dvorce. Tablety nebo tobolky je možno vyjímat výše popsaným postupem.

Do blízkosti tablet nebo tobolek je vhodné umístit pomůcku usnadňující kontrolu odebírání dávkových forem z balení. Tato pomůcka může mít podobu čísel, která odpovídají dnům režimu, v němž mají být tablety brány. Jako další příklad je možno uvést kalendář, jako První týden, pondělí, úterý ... atd., Druhý týden, pondělí, úterý ... atd. Další varianty takových pomůcek jsou zcela zřejmé. Denní dávku je možno podávat ve formě jediné tablety nebo tobolky nebo ve formě několika pilulí nebo tobolek, které se berou v daný den. Denní dávka první sloučeniny může sestávat z jedné tablety nebo tobolky, zatímco denní dávka druhé sloučeniny může sestávat z několika tablet nebo tobolek, nebo naopak. Tento případ by měl být zohledněn v pomůckách usnadňujících kontrolu odebírání dávkových forem z balení.

Podle jiného konkrétního provedení se používá dávkovače léků (dispenzéru) uzpůsobeného pro dávkování denních dávek v určitou dobu v zamýšleném pořadí. Dávkovač je přednostně vybaven pomůckou usnadňující odebírání dávkových forem, pokud to napomáhá zvyšování kompliance s režimem.

Jako příklad pomůcky usnadňující kontrolu odebírání dávkových forem je možno uvést mechanické počítadlo oddělených denních dávek. Jiným přikladen takové pomůcky je mikročipová pamět napájená z baterie spojená s displejem s tekutými krystaly nebo zvukovým upomínacím signálem, který například ukazuje datum, kdy byla odebrána poslední dávka a/nebo připomíná kdy se má brát další dávka.

154 • · ···· ·« • 9

9

Sloučeniny podle vynálezu samotné nebo ve vzájemné kombinaci nebo v kombinaci s jinými sloučeninami se budou podávat ve formě obvyklých formulací. Dále uvedené příklady formulací mají pouze ilustrativní charakter a rozsah vynálezu nijak neomezují. Pod pojmem účinná složka se rozumí sloučenina nebo sloučeniny podle vynálezu a může se vztahovat k inhibitoru aldosa reduktasy nebo inhibitoru glykogen fosforylasy nebo ke kombinaci těchto dvou inhibitorů.

Formulace 1: Želatinové tobolky

Tvrdé želatinové tobolky se připraví za použití následujících složek:

Složka Množství (mg/tobolka)

Účinná složka	0,25	až	100
Škrob, NF	0	až	650
Škrobový sypký prášek	0	až	50
Kapalný silikon
o kinetické viskositě 350.10⁶ m².s^_1	0	až	15

Za použití dále uvedených složek se připraví tabletová formulace:

Formulace 2: Tablety

Složka Množství (mg/tableta)

Účinná složka	0,25	až	100
Mikrokrystalická celulosa	200	až	650
Sublimovaný oxid křemičitý	10	až	650
Kyselina stearová	5	až	15

• ·

155 • · · · · · • ······· · • · · · * ·· · ··

Složky se smísí a vzniklá směs se lisuje na tablety.

Tablety, z nichž každá obsahuje 0,25 až 100 mg účinných složek se alternativně připraví následujícím postupem:

Formulace 3: tablety

Složka Množství (mg/tableta)

Účinná složka 0,25 až 100

Škrob 45

Mikrokrystalická celulosa 35

Polyvinylpyrrolidon (jako 10% roztok ve vodě) 4

Sodná sůl karboxymethylcelulosy 4,5

Stearan hořečnatý 0,5

Mastek 1

Účinné složky, škrob a celulosa se protlačí sítem o velikosti ok 355 μιη a důkladně promísí. Výsledný prášek se smísí s roztokem polyvinylpyrrolidonu a vzniklá směs se proti lačí přes síto o velikosti ok 1400 μιη. Takto připravené granule se vysuší při 50 až 60C a protlačí přes síto o velikosti ok 1000 μιη. Ke granulím se přidají sodná sůl karboxymethylcelulosy, stearan hořečnatý a mastek, prosáté přes síto o velikosti ok 250 μιη. Složky se promísí a na tabletovacím stroji se lisují tablety.

Suspenze obsahující 0,25 až 100 mg účinné složky na 5ml dávku se připraví následujícím způsobem:

• 9 • 9

Složka

- 156

9 99

9 · 9 · • · · · 9 9 • 9 9999 · · · • 9 · · 9 • · ·

99 9

Formulace 4: suspenze

Množství (mg/5 ml)

Účinná složka

Sodná sůl karboxymethylcelulosy Sirup

Roztok benzoové kyseliny Látka upravující aroma nebo chut Barvicí látka

Purifikovaná voda

0,25 až 100 mg 50 mg 1,25 mg 0,10 ml

q. v. q.v.

do 5 ml

Účinná složka se protlačí sítem o velikosti ok 355 μιη a smísí se sodnou solí karboxymethylcelulosy a sirupem za vzniku hladné pasty. Roztok kyseliny benzoové, látka upravující aroma nebo chuť a barvicí látka se zředí vodou a za míchání přidají k pastě. Ke vzniklé směsi se přidá voda v množství dostatečném pro dosažení požadovaného objemu.

Aerosolový roztok se připraví za použití následujících složek:

Formulace 5: aerosol

Složka

Množství (% hmot.)

Účinná složka 0,25

Ethanol 25,75

Hnací látka 22 (chlordifluormethan) 70,00

Účinná složka se smísí s ethanolem a vzniklá směs se přidá k části hnací látky 22, výsledná směs se ochladí na 30°C a převede do plnicího zařízení. Nerezová nádoba se naplní požadovaným množstvím a její obsah se zředí zbývající hnací látkou. Nádoba se poté opatří ventilem.

157

4 ··

4 4 · ·

4 4 4 4 4

444444 4 4

4 4 4 4

4

Čípky se připraví následujícím postupem:

Formulace 6: Čípky

Složka Množství (mg/čípek)

Účinná složka 250

Glyceridy nasycených mastných kyselin 2000

Účinná složka se protlačí sítem o velikost ok 250 μιη a suspenduje v glyceridech nasycených mastných kyselin roztavených za použití minimálně nezbytného tepla. Směs se poté nalije do licí formy pro čípky o nominální kapacitě 2 g a nechá zchladnout.

Intravenosní formulace se připraví následujícím postupem:

Formulace 7: Intravenosní roztok

Složka

Množství

Účinná složka 20 mg

Isotonický solný roztok 1000 ml

Roztok výše uvedených složek se pacientu podává intravenosně rychlostí asi 1 ml/min.

Do rozsahu pojmu účinná složka také spadají kombinace činidel.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se t i m , že obsahuje terapeuticky účinné množství

a) inhibitoru aldosa reduktasy;

b) inhibitoru glykogen fosforylasy; a

c) farmaceuticky vhodný nosič.
2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitorem aldosa reduktasy je 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolyl]methyl]-l-ftalazinoctová kyselina nebo její farmaceuticky vhodná sůl.
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že inhibitorem glykogen fosforylasy je [(1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-((3S)-hydroxypyrrolidin-l-yl)-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-1H-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxydimethylkarbamoylmethyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxymethoxymethylkarbamoyl)methyl)-2-fenylethyl ]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(lS)-((R)-hydroxy-[(2-hydroxyethyl)methylkarbamoyl]methyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

·· ·

- 159 t · · · · • · · · · · • · ···· · · · • · · · · ·· » *·
4 »» ·· · · · • · ·

9 · · · • · » »·» ·· · [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((cis)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(1,l-dioxothiazolidin-3-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

t(1S)-(4-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl] amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-((3RS)-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-oxo-2-((lRS)-oxothiazolidin-3-yl)ethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny; nebo [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.

4. Farmaceutická kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že množství inhibitoru aldosa reduktasy je asi 0,1 mg/kg až asi 20 mg/kg.

• ···· · ·

160
5. Farmaceutická kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že množství inhibitoru glykogen fosforylasy je asi 0,1 mg/kg až asi 15 mg/kg.
6. Způsob léčení savců postižených stavem resistence na insulin, vyznačující se tím, že se takovému savci podává terapeuticky účinné množství

a) inhibitoru aldosa reduktasy; a

b) inhibitoru glykogen fosforylasy.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že stavem resistence na insulin je diabetes, hyperinsulinemie, porušená glukosová tolerance, hyperglykemie a/nebo hyperlipidemie po jídle, diabetes typu II, změněné složení těla, snížení hmoty svalové tkáně, která v podstatě neobsahuje tuk, obesita, hypertense, dyslipidemie atherosklerosa, tkáňová ischemie, kardiovaskulární choroba, obesita, syndrom X, těhotenství, infekční stav, urémie, hyperadrogenismus, hyperkortisolemie nebo jiný stav nadbytku adrenokortikálních hormonů, akromegalie, nadbytek růstového hormonu nebo polycystická ovaria.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že stavem resistence na insulin je diabetes.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t í m , že inhibitorem aldosa reduktasy je 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolylJmethyl]-1-ftalazinoctová kyselina nebo její farmaceuticky vhodná sůl.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující tím, že inhibitorem glykogen fosforylasy je

161 [(lS)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-((3S)-hydroxypyrrolidin-l-yl)-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(lS)-((R)-hydroxydimethylkarbamoylmethyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxymethoxymethylkarbamoyl)methyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxy-[(2-hydroxyethyl)methylkarbamoyl]methyl) -2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(l,l-dioxothiazolidin-3-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((cis)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)—(2R)— -hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

• · ·

162 [(1S)-(4-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyljamid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-((3RS)-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-OXO-2-((1RS)-oxothiazolidin-3-yl)ethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny; nebo [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačujíc se t í m , že množství inhibitoru aldosa reduktasy je asi 0,1 mg/kg až asi 20 mg/kg a množství inhibitoru glykogen fosforylasy je asi 0,1 mg/kg až asi 15 mg/kg.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačujíc se t í m , že savcem je člověk mužského nebo ženského pohlaví.
13. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že stavem resistence na insulin je obesita.

s e tická

15. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že stavem resistence na insulin je syndrom X.

16. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že stavem resistence na insulin je hypertense
14. Způsob podle nároku 6, vyznačující tím, že stavem resistence na insulin jsou polycysovária.

• ·· • · · · · • · · · · · • ······· ·

- 163 - · * : ·..· .
17. Kit, vyznačující se tím, že obsahuje

a) terapeuticky účinné množství inhibitoru aldosa reduktasy a farmaceuticky vhodný nosič v první jednotkové dávkovači formě;

b) terapeuticky účinné množství inhibitoru glykogen fosforylasy a farmaceuticky vhodný nosič ve druhé jednotkové dávkovači formě; a

c) kontejner pro uvedenou první a druhou dávkovači formu.
18. Kit podle nároku 17, vyznačující se t i m , že inhibitorem aldosa reduktasy je 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolyl]methyl]-1-ftalazinoctová kyselina nebo její farmaceuticky vhodná sůl.
19. Kit podle nároku 18, vyznačující se t i m , že inhibitorem glykogen fosforylasy je [(1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-((3S)-hydroxypyrrolidin-l-yl)-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxydimethylkarbamoylmethyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxymethoxymethylkarbamoyl)methyl)-2-fenylethyl] amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

164 • ······· · [(1S)-((R)-hydroxy-[(2-hydroxyethyl)methylkarbamoyl]methyl) -2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

(2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(1,l-dioxothiazolidin-3-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

t(1S)-benzyl-3-((cis)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)—(2R)— -hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-(4-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyljamid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-((3RS)-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-oxo-2-((lRS)-oxothiazolidin-3-yl)ethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny; nebo [ (1S)-benzyl-2-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.

165 ···· · 9 9 · • 99999·· 9 · 99
20. Kit podle nároku 19, vyznačující se t i m , že množství inhibitoru aldosa reduktasy je asi 0,1 mg/kg až si 20 mg/kg.
21. Kit podle nároku 20, vyznačující se t i m , že množství inhibitoru glykogen fosforylasy je asi 0,1 mg/kg až asi 15 mg/kg.
22. Farmaceutická kompozice pro zvyšování citlivosti na insulin u savců, vyznačující se tím, že obsahuje

a) množství první sloučeniny, kterou je inhibitor aldosa reduktasy; a

b) množství druhé sloučeniny, kterou je je inhibitor glykogen fosforylasy přičemž množství první sloučeniny samotné a množství druhé sloučeniny samotné nepostačuje pro zvýšení citlivosti na insulin, podává-li se samotné, a kombinovaný účinek množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny je vyšší než součet účinků zvyšujících citlivost na insulin, kterých lze dosáhnout s množstvími první a druhé sloučeniny odděleně;

a farmaceuticky vhodné ředidlo nebo nosič.
23. Farmaceutická kompozice podle nároku 22, vy značující se tím, že inhibitorem aldosa reduktasy je 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolyl]methyl]-l-ftalazinoctová kyselina nebo její farmaceuticky vhodná sůl.
24. Farmaceutická kompozice podle nároku 23, vy značující se tím, že inhibitorem glykogen fosforylasy je

166

44 · 44 4 ··

444 4 4 4 4 ··

444· · · · ·4

4 4444444 4 4 44 4 •4 · ·· 4 4 4 ·· [(1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-((3S)-hydroxypyrrolidin-l-yl)-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(lS)-benzyl-3-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)—((R)-hydroxydimethylkarbamoylmethyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxymethoxymethylkarbamoyl)methyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxy-[(2-hydroxyethyl)methylkarbamoyl]methyl) -2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[ 2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl] amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(lS)-benzyl-3-((cis)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(1,l-dioxothiazolidin-3-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-1H-indol-2-karboxylové kyseliny;

167 • · · · · • · · · · · • ······· · • · · * · ·· · ·· [(1S)-(4-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-((3RS)-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-oxo-2-((lRS)-oxothiazolidin-3-yl)ethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny; nebo [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.
25. Farmaceutická kompozice podle nároku 24, vy značující se tím, že množství inhibitoru aldosa reduktasy je asi 0,1 mg/kg až asi 20 mg/kg.
26. Farmaceutická kompozice podle nároku 25, vy značující se tím, že množství inhibitoru glykogen fosforylasy je asi 0,1 mg/kg až asi 15 mg/kg.
27. Způsob zvyšování citlivosti na insulin u savce, který trpí stavem resistence na insulin, vyznačující se tím, že se takovému savci podává

a) množství první sloučeniny, kterou je inhibitor aldosa reduktasy; a

b) množství druhé sloučeniny, kterou je inhibitor glykogen fosforylasy přičemž množství první sloučeniny samotné a množství druhé sloučeniny samotné nepostačuje pro zvýšení citlivosti na insulin, podává-li se samotné, a kombinovaný účinek množství první sloučeniny a množství druhé sloučeniny je vyšší než

9 9 • 9

- 168 součet účinků zvyšujících citlivost na insulin, kterých lze dosáhnout s množstvími první a druhé sloučeniny odděleně.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se t í m , že inhibitorem aldosa reduktasy je 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolyl]methyl]-1-ftalazinoctová kyselina nebo její farmaceuticky vhodná sůl
29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se t í m , že inhibitorem glykogen fosforylasy je [(lS)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-((3S)-hydroxypyrrolidin-l-yl)-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxydimethylkarbamoylmethyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[ (lS)-((R)-hydroxymethoxymethylkarbamoyl)methyl)-2-fenylethyl] amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-((R)-hydroxy-[(2-hydroxyethy1)methylkarbamoylJmethy1)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid

5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

169 • · 4 · · • · · · · ·

4 4 4 4 4 4

4 4 4444 · 4 4

4 4 · · ·

44 · 4· 4 [(1S)-benzyl-2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl] amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(1,l-dioxothiazolidin-3-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-1H-indo1-2-karboxylové kyseliny;

[(lS)-benzyl-3-((cis)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-(4-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl ]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-((3RS)-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-OXO-2-((lRS)-oxothiazolidin-3-yl)ethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny; nebo [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.
30. Způsob podle nároku 29, vyznačujíc se t í m , že množství inhibitoru aldosa reduktasy je asi 0,1 mg/kg až asi 20 mg/kg.
31. Způsob podle nároku 30, vyznačujíc setím, že množství inhibitoru glykogen fosforylasy je asi 0,1 mg/kg až asi 15 mg/kg.
32. Způsob podle nároku 31, vyznačujíc se t í m , že savcem je člověk mužského nebo ženského pohlaví.

170 ·· · ·· · ·· · • · · · ·· · · ·· ··· · · ♦ · · · ···«··· · · · · · · • · · · · · · · • · · ·· ··· ·· ·· ·
33. Způsob snižování tkáňového poškození vyvolaného ischemii, vyznačující se tím, že se savci, který takové léčení potřebuje, podává terapeuticky účinné množství

a) inhibitoru aldosa reduktasy; a

b) inhibitoru glykogen fosforylasy.
34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se t i m , že tkání je tkáň srdce, mozku, jater, ledvin, plic, střeva, kosterního svalstva, sleziny, slinivky, nervů, míchy, retiny, vaskulatura nebo intestinální tkáň.
35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se t i m , že inhibitorem aldosa reduktasy je 3,4-dihydro-4-oxo-3-[[5-(trifluormethyl)-2-benzothiazolylJmethyl]-1-ftalazinoctová kyselina nebo její farmaceuticky vhodná sůl.
36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se t i m , že inhibitorem glykogen fosforylasy je [(1S)-benzyl-(2R)-hydroxy-3-((3S)-hydroxypyrrolidin-l-yl)-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-3-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(lS)-((R)-hydroxydimethylkarbamoylmethyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(lS)-((R)-hydroxymethoxymethylkarbamoyl)methyl)-2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

• 9

- 171

99 9

9 9 9

9 9 9 9 [(1S)-((R)-hydroxy-[(2-hydroxyethy1)methylkarbamoyl]methyl) -2-fenylethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[ (1S)-benzyl-2-(3-hydroxyiminopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-((3S,4S)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-(cis-3,4-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl] amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-(1,l-dioxothiazolidin-3-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(lS)-benzyl-3-((cis)-dihydroxypyrrolidin-l-yl)-(2R)-hydroxy-3-oxopropyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-(4-fluorbenzyl)-2-(4-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[(1S)-benzyl-2-((3RS)-hydroxypiperidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny;

[2-oxo-2-((1RS)-oxothiazolidin-3-yl)ethyl]amid 5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny; nebo [(1S)-benzyl-2-(3-hydroxyazetidin-l-yl)-2-oxoethyl]amid

5-chlor-lH-indol-2-karboxylové kyseliny.

172

44 4 4*

4 4 4 4 4 4

9 4 4 4 4 4

9 9949444 4

9 4 4 4 4

44 4 44 4
37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se t í m , že množství inhibitoru aldosa reduktasy je asi 0,1 mg/kg až asi 20 mg/kg a množství inhibitoru glykogen fosforylasy je asi 0,1 mg/kg až asi 15 mg/kg.
38. Způsob podle nároku 37, vyznačuj ící se t í m , že savcem je člověk mužského nebo ženského pohlaví.
39. Způsob podle nároku 38, vyznačující se t í m , že tkání je tkáň srdce.
40. Způsob podle nároku 38, vyznačující se t í m , že tkání je tkáň mozku.
41. Způsob podle nároku 38, vyznačující se t í m , že tkání je tkáň jater.
42. Způsob podle nároku 38, vyznačující se t í m , že tkání je tkáň ledvin.
43. Způsob podle nároku 38, vyznačující se t í m , že tkání je tkáň plic.
44. Způsob podle nároku 38, vyznačující se t í m , že tkání je tkáň střeva.
45. Způsob podle nároku 38, vyznačující tím, že tkáni je tkáň kosterního svalstva.
46. Způsob podle nároku 38, vyznačující tím, že tkání je tkáň sleziny.
47. Způsob podle nároku 38, vyznačuj ící se t í m , že tkání je tkáň slinivky.

- 173

9· • ♦ • · · · ··
48. Způsob podle nároku 38, vyznačující tím, že tkání je tkáň retiny.
49. Způsob podle nároku 39, vyznačující tím, že se kombinace podává profýlaktický.

se tím zákrokem.

Způsob podle nároku 38, vyznačující , že se kombinace podává před kardiochirurgickým
51. Způsob podle nároku 33, vyznačující se t í m , že ke tkáňovému poškození vyvolanému ischemií došlo během transplantace orgánu.
52. Způsob léčení savce, který trpí stavem resistence na insulin, vyznačující se tím, že se takovému savci podává kompozice podle nároku 1.
53. Způsob snižování tkáňového poškození vyvolaného ischemií, vyznačující se tím, že se savci, který takové léčení potřebuje, podává kompozice podle nároku 1