CZ20001775A3 - Způsob syntézy oligonukleotidů s použitím vysokovroucích rozpouštědel - Google Patents

Abstract

Způsob snížení odpařování kapalného roztoku činidla při chemické mikrosyntéze v pevné fázi molekuly obsahující podjednotky na povrchu pevného podkladu v otevřeném prostředí. Způsob zahrnuje stupně (1) zajišťující otevřený povrch na pevném podkladu obsahující nejméně jedno vazebné místo, jež je fůnkcionalizovaného reaktivní chemickou skupinou, a (B) ukládání v zásadě regulovaného a nepatrného objemu kapalného roztoku činidla na povrch podkladu v kontaktu s vazebným místem. Roztok činidla obsahuje reakční složky obsažené v nejméně jednom poměrně vysokovroucím rozpouštědle na rozdíl od standardních organických rozpouštědel pro taková reakční činidla. Použití vysokovroucího rozpouštědla značně zmenšuje odpařování roztoku činidla v otevřeném prostředí při syntéze na pevném podkladu, přičemž umožňuje zachování značně vysokého výtěžku reakce.

Description

Způsob syntézy oligonukleotidů s použitím vysokovroucích rozpouštědel

Oblast techniky

Tento vynález se všeobecně týká chemických reakcí za použití vysokovroucích organických rozpouštědel na povrchu pevného podkladu a zvláště se týká syntézy v pevné fázi na malých a otevřených individuálních reaktivních (vazebných) místech prostorově oddělených na pevném podkladu.

Dosavadní stav techniky

Stanovení sekvence DNA, RNA a peptidových fragmentů i nadále hraje významnou roli v lékařské diagnostice, soudním lékařství, molekulárně biologickém výzkumu a farmaceutické farmakogenetice. Nověji se však pozornost obrátila od samotného stanovení sekvence k identifikaci funkce sekvencí při biochemických pochodech a chorobných stavů. Protože je genetický vliv na většinu těchto biochemických pochodů komplexnější než se původně soudilo a typicky zahrnuje mnohonásobné geny, mnohonásobné mutace v genech a složité interakce, vzrostla potřeba zlepšit produktivitu souběžného provádění vícenásobných testů sekvence DNA.

Jeden způsob jak provádět četná souběžná měření představuje uspořádání velkého počtu testů se zkušebními sondami DNA, RNA nebo peptidovými sondami v sériových mikrosestavách, jež lze v dalším souběžně testovat komplexními biologickými vzorky. Každá jednotlivá sonda v této sestavě poskytuje díky hybridizaci (specifickou vazbou) s například DNA nebo RNA neznámého vzorku (nebo bez hybridizace) informaci o přítomnosti nebo nepřítomnosti sekvencí ve vzorku.

··· ·· ··· toto · • ···· ···· • to · ·

Tyto typy testů typicky testují přítomnost specifické sekvence nukleové kyseliny, obvykle sekvence DNA nebo RNA, i když jsou možné i testy jiných specifických vazeb. Jak je v oboru dobře známo, děje se to za použiti oligonukleotidů syntetizovaných se specifickými sekvencemi předem určenými podle potřeby. V typickém případě se tato specifická sekvence zakládá na průzkumu genomových nebo mutačních databází nebo například na hornologii se známými nebo předpokládánými sekvencemi genů nebo aminokyselin, nebo katalogizovanými mutacemi takových sekvenci. Přítomnost nebo nepřítomnost mnoha sekvencí se potom zjíštuje simultánně hybridizaci za podmínek, jež umožňují jen dokonalou a přesnou shodu s připojenými sekvencemi.

Je mnoho příkladů významných mnohonásobných testů uskutečněných simultánní (souběžnou) analýzou sériových mikrosestav. Pro zlepšení produktivity diagnózy choroby lze sestavit sériovou sestavu, v niž se hybridizuje 500 různých sond, z nichž každá odpovídá mutací, jez způsobuje například cystickou fibrózu, s pacientovou DNA tak, že když je přítomna kterákoliv z mutací, jež nemoc způsobila, fluoreskuje v této řadě testovaný vzorek odpovídající této mutaci. V jiném použitelném případě jsou do mikrosestavy umístěny sekvence DNA odpovídající mnoha genům, jejichž funkce jsou neznámy. Mediátorová RNA připravená ze vzorků jednak zdravé, jednak chorobné tkáně se potom může porovnávat tak, že se souběžně měří rozdílná intenzita hybridizace sondy na mnoha různých sekvencích odpovídajících mnoha různým genům. Takovéto geny rozdílně hybridizované v chorobné tkáni a porovnané s normální tkání se potom mohou vzít do úvahy pro průběh choroby a jejich roli v ní. Kromě toho existuje mnoho příkladů v molekulární biologii a farmakologickém výzkumu, kdy je třeba analyzovat přítomnost 'W’’

nebo nepřítomnost velkého množství sekvencí DNA pro stanovení důležitých specifik chorobného stavu, jako je například rezistence k antibiotikům, genotypové faktory závažnosti onemocněni atd.

Konečně je mnoho aplikací, ve kterých se mohou určit interakce lék/receptor aplikací uvažovaného léku (typu malé organické molekuly) nebo biologických receptorů na povrch sériové mikrosestavy a sledováním stupně vzniklého spojení.

Je tedy často nutno vytvořit na mikrosestavě velké množství příbuzných ale rozdílných chemických struktur. V oboru je též obecně známa syntéza sériových sestav vázaných oligonukleotídů nebo peptidů. V jednom pojetí souběžné syntézy, jež je známa jako způsob T-vaku nebo disková struktura se řadová sestava jednotlivých baličku nebo kotoučů pevných nosičů ve tvaru kuliček fyzicky rozdělí do čtyř (4) amiditových podskupin, jež se kontaktují se zvoleným amiditem. Poté, co je každý balíček kuliček ošetřen běžným činidlem, se baličky musí opět ručně rozdělit do čtyř podskupin pro následný cyklus syntézy. Takové rozdělování a opětovné seskupování je však pro přípravu velkých sestav oligonukleotidů příliš obtížné a pracovně náročné.

Jiné uplatnění těchto sériových sestav při syntéze oligonukleotidů vázaných na pevném podkladu je popsáno v patentu USA č. 5,436.327 (Southern a další), kde se provádí syntéza ve velmi úzké spáře mezi dvěma skleněnými deskami. Tento způsob je nejen nepraktický a v provedení nešikovný, protože se musí nanést přesně na specifická místa na skleněném povrchu množství různých činidel, ale navíc tento způsob nedovoluje kontinuální syntézu oligonukleotidů. Kromě toho, protože Southern používá pro syntézu fosforamiditu standardních činidel, musí se pracovat v uzavřeném prostředí, aby se předešlo odpařováni vysoce těkavých

rozpouštědel (například acenonitrilu a dichlormethanu, jak bude v dalším popsáno podrobněji).

Výhodný způsob syntézy řadových sestav oligonukleotidů na površích pevných podkladů otevřených vůči prostředí popisuje Brennan, Patent USA č. 5,474.796, při němž se ovládá uvolňování specifických činidel pomocí přístroje podobného tryskám inkoustových tiskáren s regulovaným dávkováním kapek. Brennan nabízí obecně platný způsob uskutečněni velkého množství reakcí na povrchu pevného podkladu, při němž se přidávají velmi malé objemy roztoků chemických reakčních složek na funkcíonalizovaná vazebná místa na povrchu pevných podkladů pomoci piezoelektrického čerpadla. Aktivovaná vazebná místa jsou vzájemně oddělena pomocí nefunkcionalizovaného povlakového materiálu s odlišným povrchovým napětím.

I když Brennan nespecifikuje povahu v tomto způsobu použitých rozpouštědel, nutných aby se tento způsob reakce na povrchu otevřeném vůči prostředí mohl v chemické syntéze všeobecně používat, většina chemických reakci se v praxi provádí ve vysoce těkavých a nízkovroucích rozpouštědlech jako je acetonitril nebo dichlormethan. Problémem tohoto provedeni syntézy v otevřeném prostředí běžnými rozpouštědly je, že když jsou uvolňované kapky příliš malé, mají rozpouštědla sklon příliš rychle se odpařovat. Tak je tomu zvláště při použití piezoelektrického výtlačného čerpadla používaného Brennanem, protože v typickém případě je objem uvolňovaných kapek mezi asi 20 pikolitry a 2 mikrolitry. Při takto malých rozměrech je tlak par a poměr povrchové plochy k celkovému objemu kapek tak vysoký, že se tato standardní rozpouštědla pro syntézu DNA s vysokými výtěžky odpaří před dokončením reakce.

Rychlost odpařování je funkcí povrchové plochy kapky a • · • · odpovídá 1/R² (kde R je poloměr kapky), což znamená, že čím menší je kapka, tím větší je rychlost odpařování. Při 23 °C se kapka acetonitrilu (ACN) velikosti 100 mikronů odpaří při průletu dráhou dlouhou 1 cm. Po odpaření rozpouštědla se kopulační reakce amiditu v hustém a gumovitém nebo krystalickém zbytku v podstatě zastaví.

Při běžné syntéze oligonukleotidů v pevné fázi například na skle s kontrolovanou pórovitostí (CPG) je pro tetrazolem aktivovaný a dimethoxytritylem chráněný stupeň kopulace nukleotidfosforamiditu výhodným rozpouštědlem acetonitril. Bylo zjištěno, že toto rozpouštědlo daleko převyšuje ostatní běžná rozpouštědla pro fosforamiditovou kopulaci jako je tetrahydrofuran, dimethoxyethan a nitromethan. Acetonitril má ideální kombinaci kyselosti, viskozity, dielektrické konstanty, rozpustnosti a dalších vlastností, umožňující dosažení vysokého výtěžku (nad 99 %) kopulace. Výtěžek postupné kopulace pod 97 % by poskytl nepoužitelnou směs zkrácených a/nebo deletovaných produktů.

Acetonitril (ACN) má bohužel spíše nižší teplotu varu (81 °C) a kapky na povrchu pevného podkladu v otevřeném systému velice rychle odpařují. Ostatní výše uvedená rozpouštědla pro syntézu DNA běžně používaná (to znamená tetrahydrofuran, dimethoxyethan a nitromethan) mají rovněž podobné teploty varu a rychlosti odpařování jako ecetonitril. Proto i tato rozpouštědla mají sklon k velmi rychlému odpařování v otevřeném systému.

Jedním řešením je uvolnit rychle za sebou sérii kapek činidla ve větším objemu s cílem získat reaktivní centra o větším průměru. Tento způsob však je neúčinný pro průměry pod asi 500 mikronů, zatímco průměry nad 500 mikronů jsou v případě mnoha řad příliš velké. Kromě toho lze snížit . -^S-Wk' • · ft ··· • ft ·· ft ♦ · « « ftft · • ftft · rychlost odpařování snížením teploty rozpouštědla a povrchu, na němž k reakci dochází, tím se však může drasticky snížit rychlost kopulační reakce. Konečně lze zmenšit rychlost odpařování kapky zvýšením relativní vlhkosti nebo nasycením prostoru nad místem její depozice acetonitrilem. V praxi je však nesnadné dosáhnout kontroly stabilní vlhkosti ACN a reakční zařízení má sklon chovat se jako mlžná komora.

Podstata vynálezu

Proto je cílem tohoto vynálezu poskytnout způsob a kompozici pro syntézu materiálů na otevřených površích, podstatně snižující odpařování rozpouštědla obsahujícího činidlo, uvolňovaného ve velmi malých objemech.

Dalším cílem tohoto vynálezu je poskytnout způsob a kompozici trvale umožňující značně vysoké výtěžky reakce.

Jiným cílem tohoto vynálezu je poskytnout způsob a kompozici roztoku činidel, jež se může uvolňovat běžným zařízením pro řízené uvolňování kapky.

V souladu s předchozími cíly poskytuje tento vynález způsob pro snížení odpařování kapalného roztoku činidla při chemické mikrosyntéze v pevné fázi molekuly obsahující podjednotky na povrchu pevné podložky v otevřeném prostředí. Způsob zahrnuje tyto stupně: (A) vytvoření povrchu na pevné podložce v otevřeném prostředí, obsahujícího nejméně jedno vazebné místo funkcionalizované reaktivní chemickou skupinou; (B) uložení v podstatě kontrolovaného a nepatrného objemu kapalného roztoku činidla na povrchu pevného podkladu v kontaktu s vazebným místem. Podle tohoto vynálezu obsahuje roztok činidla reakční složky obsažené v nejméně jednom relativně vysokovroucím rozpouštědle, na rozdíl od standardních organických rozpouštědel pro takováto činidla. Toto vysokovroucí rozpouštědlo značně snižuje odpařování roztoku “''Τ********?*'

• ·· ·· ·· tt ··«· · · · ··· • « · · · · · · · · · • ····< ·· ··· · · • · · · · · · · · ··· ·· ·· ·· «· činidla v otevřeném prostředí při syntéze na pevné podložce, přičemž umožňuje značně vysoké výtěžky.

V jiném ohledu tento vynález nabízí způsob syntézy materiálů uspořádaných v sériových sestavách zahrnující kroky: vytvoření rovinného a otevřeného povrchu na pevném podkladu, obsahujícího řadovou sestavu funkcionalizovaných vazebných míst. Každé vazebné misto je izolováno bariérami povrchového napětí z nereaktvních hydrofobních materiálů. Další stupeň představuje uložení kontrolovaného a velmi malého objemu kapalného roztoku činidla na povrch podkladu v každém funkcionalizovaném vazebném místě, tak aby došlo k jeho kontaktu s nejméně jednou podjednotkou molekuly fixovanou na dané vazebné místo. Každý roztok činidla obsahuje nukleosidové reagenty obsažené v polárních aprotických rozpouštědlech s bodem varu nejméně asi 140 °C. Během růstu molekuly je v otevřeném prostředí odpařování velmi malých objemů roztoků činidla díky vysokému bodu varu značně sníženo. Do značné míry se však udrží vysoký výtěžek kopulace.

Stupeň depozice kapek se může provést podle potřeby řízeným uvolňováním kapek roztoku činidla. Toto uvolňování se může uskutečnit běžným ventilovým dávkovačem nebo přístrojem na bázi piezoelektrického čerpadla, pokud je možno dávkování objemu kolem 20 pikolitrů až asi 2 mikrolitry přesně regulovat. V dalším se depoziční stupeň uskutečňuje opatrnou postupnou syntézou polymeru fosforamiditovým způsobem na každém vazebném místě.

V ještě jiném ohledu tento vynález zajišťuje roztok nukleosidového činidla pro přípravu nukleotidu v relativně nepatrných objemech. Roztok činidla obsahuje nukleotidovou reakční složku a polární organické a aprotické rozpouštědlo s teplotou varu nejméně kolem 140 °C. Během růstu ·· «· ··

4 4 4 9 · • · · · 4 4 · ·

444 44 44 444

4 4 4 4 · *♦ oligonukletidu se v malých objemech uvolněných kapek odpařování roztoku činidla v otevřeném prostředí značně snižuje, přičemž se zachovává značně vysoký výtěžek kopulace.

Je výhodné, když tato aprotická rozpouštědla jsou organická a zvolí se ze skupiny obsahující dinitrily, glymy, diglymy, triglymy, dimethylformamidy (DMF), hexamthyltriamidfosfáty (HMPA) a trimethylfosfáty. Tato skupina výhodně vykazuje v zásadě podobnou aciditu jako roztok acetonitrilu. Řečeno přesněji, skupina dinitrilů se vybere ze skupiny obsahující hlavně malononitríl, sukcinonitril, glutaronitril a adiponitril. Polární aprotická organická rozpouštědla se však také mohou vybrat ze skupiny mononitrilů jako je valeronitril a kapronitril.

Tento vynález má ve svém celku ještě další cíle a výhodné stránky, jež budou nejlépe patrné z následujícího popisu nejlepšího způsobu provedeni tohoto vynálezu a připojených nároků, uváší-li se ve spojení s připojenými obrázky, ve kterých:

Obrázek 1 je schematicky znázorněný půdorys zařízení pro syntézu ukládáním roztoku činidla podle tohoto vynálezu do sériové sestavy funkcionalizovaných vazebných míst na povrchu pevného podkladu.

Obrázek 2A a 2B znázorňuje zvětšený bokorys průřezu pevného podkladu a funkcionaJizovaného vazebného místa, ilustrující účinek bariéry vytvořené rozdílným povrchovým napětím na rozhráni různě značených ploch.

I když se tento patent popisuje s odkazem na několik specifických provedení, popis tento vynález jen ilustruje a nemá se interpretovat jako omezení vynálezu. Odborníci mohou nalézt vedle doporučených provedení tohoto vynálezu různé modifikace, aniž by se opustil duch a rozsah vynálezu • * ·« · · ♦ · · · « · « • · · · · · · · · · · · ··· · · · · · · · ·· · · 9 9 9 9 9 9 9 · definovaný připojenými nároky. Poznamenáváme, že pro lepší

porozuměni se \	r různých obrázcích o	značuji	komponenty
odpovídájícími	referenčními čísly.
Rovněž je	třeba rozumět, že i	když j e	tento vynález
zvláště vhodný	pro tvorbu sekvenčně	difinov	aných

oligonukleotidů, způsob a kompozice tohoto vynálezu se může použít pro syntézu kterékoliv molekuly obsahující podjednotky a zvláště pro postupnou adiční syntézu. Takto se sekvenční jednotka nebo podjednotka definuje jako skupina vázaná na ostatní skupiny téhož nebo odlišného druhu za účelem vytvoření složitější molekuly jako jsou oligonukleotidy nebo peptidové řetězce. Rovněž je třeba poznamenat, že termín otevřené prostředí se definuje jako jakékoliv prostředí., jež není. zapojeno v uzavřeném systému nebo systému s tenzí nasycených par pro omezení odpařování těkavých rozpouštědel.

Nyní věnujme pozornost obrázkům 1 a 2, v nichž se ukazuje niikrozařízení obecně označené 10 pro syntézu v pevné fázi molekul obsahujících podjednotky za použití způsobu a kompozice podle tohoto vynálezu, spočívajícího v postupném přidávání podjednotek nebo sekvenčních jednotek na otevřený povrch 11 na pevném podkladu v kapalném roztoku činidla 12. Syntézní zařízeni ní.že podrobněji popisované je sestaveno tak, aby přesně ukládalo malé nebo velmi, malé kapky 13. roztoku čindla na funkcionalizované vazebná místa 14 otevřená vnějším vlivům a umístěná na povrchu 11 pevného podkladu. Podle tohoto vynálezu deponovaný roztok činidla 12. obsahuje chemické reakční složky ve vysokovroucích, polárních, aprotických organických rozpouštědlech, což usnadňuje prevencí, jejich odpařováni při chemické reakci. Na rozdíl od starších standardních nízkovroucich rozpouštědel v otevřených systémech běžně používaných, tato vysokovroucí « »· ·· ·· ·* ·· *··· ♦·· «·«· * · · · » ··· · ·· · * ··· ·* · · ··· ·· * • · · · · · · · · · ····· ·· ·· ·» ·· rozpouštědla značně snižují odpařování malých kapek roztoku činidla z otevřeně exponovaného povrchu na podkladu 11, takže se může dokončit růst molekuly jako je kopulace amiditu. Proto se může molekulární syntéza v otevřeném prostředí provádět dostatečně dlouho při zachování vysokých výtěžků reakce, aniž by bylo třeba použít uzavřeného systému nebo tenze nasycených par pro snížení odpařování těkavých rozpouštědel. Jak již bylo zmíněno, po odpaření rozpouštědel se v hustém a gumovitém nebo krystalickém prostředí kopulační reakce v zásadě zastaví.

Všeobecně lze říci, že rozpouštědlové směsí vyvinuté pro molekulární syntézy v otevřeném prostředí často obsahují relativně nízkovroucí rozpouštědla. Proto se v důsledku náhrady těchto nízkovroucí ch rozpouštědel, relativně vysokovroucími rozpouštědly s podobnými vlastnostmi jako mají nahrazená rozpouštědla, (o nichž se v dalším bude hovořit), může reakce v otevřeném prostředí dokončit bez nutnosti kontrolovat odpařování těchto rozpouštědel. Ačkoliv se tento vynález může v zásadě použít v kterékoli molekulární syntéze, v níž se použití nízkovroucích rozpouštědel považuje v otevřeném prostředí za problematické, náhrada relativně vysokovroucími rozpouštědly byla shledána zvláště výhodnou a prospěšnou při. organických molekulárních syntézách a u biopolymerů jako jsou oligonukleotidy, peptidy a peptidnukleové kyseliny.

Ve výhodném provedeni je teplota varu polárních organických rozpouštědel nejméně asi 140 °C při tlaku jedné (1) atmosféry (atm) na rozdíl od nižší teploty varu asi 81 °C acetonitrilu jako standardního rozpouštědla pro DNA.

Proto stojí za zmínku, že relativně vysoká teplota varu se definuje jako teplota varu rozpouštědla s nejméně asi 140 °C při jedné (1) atmosféře (atm), zatímco relativně nízká

9 9

9 9

9 · • · 9 ·

• · · teplota varu je definována jako teplota varu ne vyšší než asi. 100 °C při jedné (1) atmosféře (atm) pro standardní rozpouštědla DNA acetonitril, tetrahydrofuran, dimethoxyethan, a nitromethan stejně jako pro ostatní nízkovroucí rozpouštědla jako ethanol, aceton a pyridin.

Vyšší teplota varu zajišťuje, že když se v otevřeném prostředí použiji kapky velmi malého nebo malého objemu, typicky v rozmezí asi dvacet (20) pikolitrů až asi 2 (2) míkrolitry, kapičky se při normálních podmínkách okolního prostředí laboratorní syntézy v otevřeném prostředí neodpařují příliš rychle, takže se chemická reakce může prodloužit nebo dokončit. Je důležité, že přidání vysokovroucího rozpouštědla s nízkou tenzí par ke směsi rozpouštědel s vysokou tenzi par obvykl.e značně snižuje tenzi par vzhledem k tenzi par standardních dříve používaných rozpouštědel DNA. Proto se může syntéza DNA dokončit s vysokým výtěžkem drive než se v důsledku odpařováni reakce zastaví.

Kromě toho tyto vysokovroucí rozpouštědlové systémy, írtají-li zajistit vysoké výtěžky postupné kopulace na úrovni nejméně 97 % (běžná norma pro DNA), potřebují vykazovat podobnou aciditu, dielektrickou konstantu a rozpustnost jaké mají dnes běžně používané standardní nízkovroucí rozpouštědlové systémy. Tyto vysokovroucí rozpouštědlové systémy podle tohoto vynálezu nejen že jsou méně těkavé než standardní rozpouštědla, ale také vykazují podobné solubilizační vlastnosti, jimiž napodobují standardní rozpouštědla, takže lze zachovat vysoké výtěžky reakce. Bylo například zjištěno, že existuji určité kombinace vysokovroucí rozpouštědlo/aktivátor, které zajišťuji vysoký výtěžek kopulace s amiditern podobný výtěžkům dvojice acetonitril/tetrazol, přičemž rovněž umožňují menší rychlost • «φ «Φ ·· Φ*

ΦΦΦΦ · · 9 · · · · • Φ φ Φ Φ 9 »* · Φ· * • ΦΦΦ «Φ Φ * * « Φ ΦΦ « • Φ · Φ · Φ ΦΦΦΦ φφφ ΦΦ *♦ *Φ ·· 44 odpařováni potřebnou pro povrchové sériové syntézy v malých kapkách. Ve srovnání s jedním standardním rozpouštědlem DNA (acetonitrilem) se relativní doba odpaření různých zkoušených rozpouštědel podstatně prodloužila přibližně aspoň padesátkrát (50).

Bylo zjištěno, že nej výhodnější vysokovroucí, polární, aprotická organická rozpouštědla jsou ze skupiny tvořené dinitrily, zvláště malononitril, sukcinonitril, glutaronitril, adiponitril a pimeionitril. Ve srovnání s nízkou teplotou varu acetonitrilu (81 °C) je teplota varu těchto rozpouštědel podstatně vyšší, a to 218 °C pro malononitril, 265 °C pro sukcinonitril, 286 °C pro glutaronitril, 298 °C pro adiponitril a 310 °C pro pimeionitril. Z toho plyne, že nej výhodněj ši relativní, teplota, varu bude nejméně kolem 200 °C při jedné (1) atm.

Kromě toho jsou tenze par těchto rozpouštědlových systémů značně nižší než tenze par těkavějších standardních rozpouštědel DNA (například 70 mm pro acetonitril při pokojové teplotě). Tenze par a poměr povrchové plochy k celkovému objemu kapky roztoku činidla obsahujícího rozpouštědlo ze skupiny dinitrilů objemu padesát (50) pikolitrů je proto podstatně nižší než tenze par a uvedený poměr stejně velké kapky obsahující jako rozpouštělo acetonitril.

Proto se tato rozpouštědla při pokojové teplotě a ve standardním prostředí syntézy odpařuji o mnoho pomaleji. Na příklad poločas odpaření kapky objemu 0,1 mikrolitr dinitrilového rozpouštědla je větší než přibližně jedna (1) hodina ve srovnáni s asi deseti (10) sekundami acetonitrilu. Proto jsou v podobném reakčním prostředí škodlivé vlivy odpařováni během syntézy polymeru podle tohoto vynálezu méně pravděpodobné.

• · • · 0«

0000 0000 00 00 00 ·· 00

Je důležité (jak výše řečeno), že tyto rozpouštědlové systémy mají jako rozpouštědla podobné vlastnosti jako má acetonitril pro fosf orarnidity, například kyselost, viskozitu, dielektrickou konstantu a solubilizační vlastnosti. Například skupina dinitril/acetonitrilových analogů má podobnou aciditu jako acetonitril· a dociluje výjimečně vysokých výtěžků kopulace (> 99 %) při použití kyselých katalyzátorů, jako je tetrazol a S-ethyltetrazol, a standardních fosforamiditů. Adiponitril nebo glutaronitril byly s S-ethyltetrazolem jako kyselým katalyzátorem shledány nej výhodně j šími dvoj icemi rozpouštědl.o/aktivátor.

I u mononitrilové skupiny aprotických organických rozpouštědel bylo zjištěno, že v otevřeném prostředí značně usnadňuje syntézu polymeru v malých kapkách. Tato mononitrilová rozpouštědla zahrnují: valeronitril s vysokou teplotou varu 141 °C, kapronitril s vysokou teplotou varu 163 °C a benzonitril s vysokou teplotou varu 190 °C. Tenze par těchto mononitrilů při pokojové teplotě je 5,0 mm, respektive 1,0 mm a 0,5 mm, což je podstatně méně než tenze par standardních rozpouštědel DNA. Tyto mononitrily se proto odpařují při pokojové teplotě mnohem pomaleji než acetonitril při. poločasu odpařování kapky objemu 0,1 mikroli.tr větším než asi jedna (1) hodina.

Přestože bylo zjištěno, že tyto mononitrily jsou horším rozpouštědlem pro fosforamidity ve srovnání s dinitrily, pravděpodobně vlivem jejich dominantních alkylových zbytků , mononitrily přesto mají vůči fosforamiditům jako rozpouštědla podobné vlastnosti (například kyselost.) jako acetonitril.

Polární aprotická skupina kyslíkatých rozpouštědel jako je diethylenglykoldimethylether (diglym) a triethy.leng.Lykoldimethylether (tríglym) byla rovněž označena • · • · jako skupina vhodných vysokovroucích rozpouštědel pro syntézu polymerů. Tato kyslíkatá rozpouštědla rovněž vykazují dobrou rozpustnost pro fosforamidity i když jsou poněkud bazičtější než dinitrily. Proto je potřeba kyselejšího katalyzátoru v zájmu získání vyšších výtěžků kopulace. Jedním takovým katalyzátorem je pyridinhydrochlorid (Py'HCl).

Bod varu diglymu je 162 °C a triglymu 216 °C. Tenze par těchto kyslíkatých rozpouštědel při pokojové teplotě je 1,5 mm respektive 0,5 mm. I zde platí, že protože je tenze par nižší než tenze par standardních rozpouštědel DNA, poločas odpařování kapky o objemu 0,1 mikrolitr je také delší než poločas odpařování standardního rozpouštědla DNA. Výtěžky kopulace byly při použití těchto rozpouštědel větší než 98

O, *O ·

Další vysokovroucí rozpouštědla vykazující dobrou rozpustnost pro fosforamidity, avšak menší výtěžky kopulace při použití PyHCl než výše popsaná rozpouštědla, jsou hexamethyltriamidfosfát (HPMA), N-methylpyrrolidinon (NMP) a dimethylformamíd (DMF). Při použití pro kopulaci s Hfosfonáty se však tato rozpouštědla lépe uplatní v kombinaci s pyridinem.

Způsob a rozpouštědlový systém navržené tímto vynálezem se vedle syntézy DNA též mohou použít při dalších organických syntézách. Jak bude ukázáno v dalším v příkladu 2, vysokovroucí rozpouštědla se též mohou užít v kombinatorické syntéze hydroxamátových derivátů aminokyselin, což poskytuje knihovnu 500 různých hydroxamátsulfonamidových derivátů aminových kyselin.

Tento vynález je obzvlášť vhodný pro aplikaci za použití dávkovacího zařízení podle patentu USA 5,474.796 (Brennan), který je v dalším označován jako patent '796, zde • · ··· ♦ ♦ · · • · · · · · · · ·· · ve své úplnosti zahrnutý odkazem. Stručně řečeno, otevřená a funkcionalizovaná reaktivní vazebná místa 14 ukázaná v obrázcích 1 a 2, jsou vymezena a oddělena nereaktivnim.i hydrofobnimi bariérami povrchového napětí, a jednotlivým vazebným místům se dodávají specifické reagenty pomoci trysek obdobných tryskám v inkoustové tiskárně s řízeným uvolňováním kapek 15. Je výhodné, když je rozměr každého reaktivního nebo funkcionalizovaného vazebného místa 14 typicky kolem dvaceti (20) až 2000 mikronů. Roztoky chemických reakčních složek se na funkcionalizované vazebná místa 14 na povrchu pevného podkladu 11 deponuji, piezoelektrickou nebo solenoidovou tryskou nebo jakoukoliv jinou tryskou schopnou přesně a kontrolované uvolňovat malé kapky. Počáteční velikost ejikované kapky je v zásadě určena průměrem ústí trysky a viskozitou a povrchovým napětím kapalného média. Typické kapky 13 mají rozměr mezi asi dvacetipěti (25) do asi 250 mikronů.

Roztok činidla obsahující chemickou reakční složku a vysokovroucí, polární, aprotické organické rozpouštědlo se může dávkovat na funkcionalizované vazebné místo 14 piezoelektrickým čerpadlem (není na obrázku) v množství, při kterém je roztok chemické reakční složky na každém vazebném místě oddělen od roztoku činidla na ostatních přilehlých vazebných místech povrchovým napětím. K funkci piezoelektrického čerpadla stručně jen tolik, že roztok činidla se vkládá vstupním článkem do komory vytvořené mezi svrchní a protilehlou spodní deskou piezoelektrického čerpadla. Rozdíl napětí mezi svrchní a spodní deskou vyvolá kompresi piezoprvků a vytlačí mikrokapky roztoku činidla z trysky.

Jak je nejlépe vidět na obrázku 2A, mikrokapka roztoku činidla 13 se ukládá na funkcionalizovaném vazebném místě • · • ··· • to ··· to· • to • · • · to · toto « • · «

14. V důsledku rozdílů ve smáčecích vlastnostech roztoku činidla 12 na funkcionalizovaném vazebném místě 14 a okolního povrchu 16 (obrázek 2B), mikrokapka 13 roztoku činidla deponovaná na funkcionalizovaném vazebném místě 1,4 a reakční slcžky v roztoku reagují s povrchem pevného podkladu.

Piezoelektrické čerpadlo použitelné v rámci vynálezu je schopno velice přesně nanášet nepatrné kapičky kapaliny 13 na povrch pevného podkladu 11. Konstrukce pikočerpadla je podobná čerpadlu užitému v inkoustové tiskárně a je schopna při. max. 3000 Hz produkovat kapičky velikosti padesát (50) mikronů nebo šedesátpět (65) pikolitrů.

Z výše uvedeného popisu tohoto přístroje je zřejmé, že způsob podle tohoto vynálezu je určen pro snížení odpařování kapalného roztoku činidel při chemické mikrosyntéze v pevné fázi molekuly obsahující podjednotky na povrchu 11 na pevném podkladu otevřeném vůči prostředí. Tento způsob zahrnuje stupně: (A) zajištěni otevřeného povrchu 11 na pevném podkladu nesoucího alespoň jedno vazebné místo 14 funkcionalizovaného reaktivní chemickou skupinou. Další stupeň zahrnuje: (B) depozici převážně kontrolovaného a nepatrného objemu kapalného roztoku činidla 12 na povrch 11 na pevném podkladu a ve styku s vazebným místem 14. Podle tohoto vynálezu roztok činidla obsahuje reakční složky obsažené v nejméně jednom relativně vysokovroucim rozpouštědle na rozdíl od standardních organických rozpouštědel pro taková činidla. Toto vysokovroucí rozpouštědlo značně, snižuje odpařování rozpouštědla činidla v otevřeném prostředí při syntéze na pevné podložce 11 a zároveň se zachová značně vysoký výtěžek reakce.

Stupeň ukládání se může provést řízeným uvolňováním kapek rozteku činidla 12. Toto uvolňování se může uskutečnit

běžnými dávkovacími prostředky nebo pomocí piezoelektrického čerpadla 15, pokud se uvolňovaný objem asi dvacet (20) pikolitrů až asi dva (2) mikrolitry dá kontrolovat co do přesnosti. Stupeň depozice dále pokračuje opatrnou postupnou syntézou na každém vazebném místě fosforamiditovým nebo Hfosfonátovým způsobem.

V jiném a podrobnějším pohledu tento vynález nabízí způsob chemické syntézy oligonukleotidového řetězce v mikroměřítku, v pevné fázi, na povrchu pevného podkladu a v otevřeném prostředí. Tento způsob zahrnuje stupně (A), zajištěni otevřeného povrchu 11 na pevném podkladu nesoucí.ho alespoň jedno vazebné místo 14 funkcionalizované reaktivní chemickou skupinou; a (B), depozici v zásadě řízeného a nepatrného objemu kapalného roztoku činidla ,12 na povrch 1_1 na pevném podkladu a ve styku s vazebným místem 14 . V tomto provedení roztok činidla 12 obsahuje reakční složky obsažené ve vysokovroucím, polárním, aprotickém organickém rozpouštědle s teplotou varu nejméně 140 °C. Tento způsob podstatně snižuje odpařování roztoku činidla v otevřeném prostředí při syntéze oligonukleotidů na pevném podkladu a přitom zachovává značně vysoký výtěžek kopulace.

Stupně A a B se mohou opakovat se stejnými nebo odlišnými reakčními složkami s cílem vytvořit alespoň jeden souvislý oligonukleotidový řetězec. Když otevřený povrch 11 na pevném podkladu zahrnuje sestavu funkcionalizovaných reaktivních vazebných míst 14 (obrázek 1), stupeň depozice se může provést individuálním uložením roztoků činidla na vybraná vazebná místa 14 této sériové sestavy. Stupeň uloženi může být v dalším uskutečněn uložením roztoku činidla na každé zvolené reakční vazebné místo 14 v takovém množství, aby roztok činidla na každém reakčním místě 14 byl oddělen od roztoku činidla na ostatních vazebných místech povrchovým napětím. Toho se může dosáhnout vytvořením povrchu 14 na pevném podkladu každého funkcionalizovaného reakčního místa, které má vyšší povrchové napětí než okolní povrch 16, obklopující každé funkcionalizované vazebné místo 14 a výhodně sestavený z nereaktivních hydrofobních materiálů.

Následující příklady slouží k úplnějšímu ilustrování způsobu použití výše popsaného patentu, stejně jako pro uskutečnění nej lepšího způsobu uvažovaného pro realizaci různých aspektů vynálezu. Je třeba chápat, že tyto příklady v žádném případě neslouží pro omezení skutečného rozsahu patentu, ale jsou uvedeny spíše z důvodů názornosti.

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD 1

Syntéza oligonukleotidů na desce v sériovém uspořádání

Syntéza oligonukleotidů se prováděla na skleněné šablonované desce opatřené funkcionalizovanými aminoalkylsilanovými ploškami v sériovém uspořádání pro syntézu, oddělenými lipofilními fluoroalkyloxysilany. Takových plošek obsahovala sériová sestava 500 při průměrech 0,5 mm. Sériová sestava se připravila, jak se popisuje v patentu '796 s použitím aminopropyl- a tetradekafluor1,1,2,2-tetrahydrooktylsiloxanu pro primární šablonování.

Konverze krátkého aminopropylového spojovníku na hydroxyalkylový spojovník s dlouhým řetězcem se prováděla působením p-nitrofenylchlorformiátu ve směsi dioxan/DMC v poměru 1:1 po dobu 2 hodiny na sestavu řad. Nezreagované aminopropylové skupiny se blokovaly pomocí směsi acetanhydridu a pyridinu v poměru 1:1. Výsledný karbamátový ;!i a j <

• · · ·· ft· ftft ftft ···· · ft · ftftftft • ft · · ftftftft · ftft · • ftftft ftft ftft ftftft ·· ft • · · ft · · ftftftft • ftft ftft ftft ftft ftft ftft meziprodukt se potom konvertoval na hydroxylovanou močovinu reakcí s 6-aminohexanolem v acetonitrilu přes noc.

Štěpitelný spojovník se potom synthetizoval reakcí šablonovaného povrchu s 5'-DMT-nukleosid-3'-sukcinátem v acetonitrilu za použití jako aktivátoru TOTU po dobu 2 hodin.

Konstrukce oligonukleotidů na takto připravených ploškách se prováděla standardním fosforamiditovým způsobem. Standardní fosforamidity a S-ethyltetrazol se rozpustily ve směsi adiponitrilu (ADN) nebo glutaronitrilu (GLN) a acetonitrilu (ACN). Přídavek definovaného množství nízkovroucího acetonitrilu umožnil regulaci viskozity rozpouštědla a tvorby kapky za tryskou. Směs 90 % ADN a 10 % ACN se ukázala jako optimální pro tvorbu kapky a viskozitu reagentu.

Nanášeni vhodných chráněných nukleotidů a aktivačních činidel na jednotlivé plošky se dělo pomoci zařízení s mikročerpadlem, jak se popisuje v patentu '796. Všechny další stupně (například deblokace DMT, promývání) se v sériové sestavě děly vsádkovým způsobem zaplavením povrchu příslušnými činidly. Potom se činidla odstranila z povrchu odstředěním sériové sestavy při vysoké rychlosti.

Po syntéze se oligonukleotid odštěpil od povrchu a zbavil chránící skupiny vodným roztokem čpavku. Produkt (například T10) se analyzoval HPLC a HPCF, a byla zjištěna kvalita srovnatelná nebo lepši než v případě standardní syntézy oligonukleotidů na CPG. Toto vede k závěru, že postupná syntéza má výtěžky vyšší než 98 %.

PŘÍKLAD 2

Kombinatorická syntéza hydroxamátových derivátů aminokyseliny

• 99 9 β • · 9 9 · • · · 99·· «9 9 9 · 9 99

Podobně jako v příkladu 1 se použila šablonovaná řádková sestava. Na ni se nejdříve kopulací aplikovaly aminokyseliny, které byly v dalším derivatizovány různými sulfonylchloridy pro dosažení diverzity. Aminokyseliny chráněné Fmoc a aktivátor (HATU) se potom rozpustily ve směsi DMF : CH₂C1₂ v poměru 9:1. Obě činidla se nanesla na jednotlivé plošky (vazebná místa), jak se popisuje v patentu '796. Po 15 minutách se tato činidla odstranila odstředěním sériových sestav. Po kopulací se sériová sestava promyla dichlorethanem. V dalším se odstranily chránící skupiny Fmoc aminokyselin zaplavením povrchu řádkové sestavy 10% roztokem piperidinu v DMF po dobu 10 minut. Po promytí DMF a THF se na jednotlivá vazebná místa deponovaly různé sulfonylchloridy rozpuštěné v pyridinu za účelem derivatizace.. Po reakční době 10 minut se odstranila reakční činidla odstředěním a sestava se promyla pyridinem. Po konečném promytí pyridinem, DMF, DMSO a DCE se synthetizované sloučeniny odštěpily pomocí roztoku 2M hydroxylaminu ve směsi voda/dioxan v poměru 1 : 7,5 v utěsněné komoře během 48 hodin a získal se soubor (knihovna) 500 různých hydroxamátsulfonamidových derivátů aminokyselin.

Claims (44)

1. Způsob snížení odpařování kapalného roztoku činidla při chemické syntéze molekuly složené z podjednotek v pevné fázi na povrchu pevného podkladu v otevřeném prostředí, v y značující se tím, že tento způsob se skládá ze stupňů:

(A) zajištění povrchu na pevném podkladu otevřeného prostředí a obsahujícího alespoň jedno vazebné místo funkcionalizované chemickou skupinou; a (B) depozice nepatrného objemu kapalného roztoku činidla na uvedený povrch pevného podkladu a v kontaktu s uvedeným vazebným místem, přičemž uvedený roztok činidla obsahuje reakční složky obsažené v nejméně jednom rozpouštědle s teplotou varu alespoň asi 140 °C, s cílem podstatně snížit odpařování roztoku činidla v otevřeném prostředí při syntéze na uvedeném pevném podkladu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená molekula je organická molekula.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se uvedená molekula vybere ze skupiny složené z oligonukleotidů, peptidů a nukleových kyselin peptidů.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedeným rozpouštědlem s teplotou varu alespoň asi 140 °C.je polární, aprotické a organické rozpouštědlo.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené rozpouštědlo s teplotou varu alespoň asi 140 °C se zvolí ze skupiny složené z dinitrilů, mononitrilů, glymů, diglymů, triglymů, hexamethyltriamidfosfátů (HMPA) a . ιι.υ, i^diywywgy^ • ·· *9 99 99 99

9·· 9 9 99 9 99 9

99 9 9 9999 9 99 9 • 999 99 99 9 9 9 99 9

9 9 9999 9999

99999 99 «9 99 99 trimethylfosfátů.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená skupina dinitrilů má v podstatě podobnou aciditu jakou má acetonitril.

7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená skupina dinitrilů se vybere ze skupiny složené ze sukcinonitrilu, glutaronitrilu, adiponitrilu a pimelonitrilu.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se opakují stupně (A) a (Β), aby vznikl alespoň jeden souvislý oligonukleotidový řetězec.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se syntéza provádí fosforamiditovým způsobem.

10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se syntéza provádí H-fosfonátovým způsobem.

11. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená skupina mononitrilů je složena z valeronitrilu, benzonitrilu a kapronitrilu.

12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se uvedená molekula syntetizuje postupným přidáváním podjednotek.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedená molekula je oligonukleotidový řetězec, peptidový řetězec nebo jejich hybrid.

14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se

• 4

4 4

44 44 44

4 4 4 4 4 ·

4 444 4 44 4

4 4444 4444

44 44 ·· 44 44 tím, že uvedený otevřený povrch na pevném podkladu zahrnuje sériovou sestavu funkcionalizovaných reakčních míst.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedený stupeň depozice se provede individuálním ukládáním roztoků činidla na vybraná reakční místa uvedené sériové sestavy.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedený povrch na pevném podkladu je v podstatě rovinný.

17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedený stupeň depozice se dále provádí ukládáním roztoku činidla na každé vybrané reakční místo v takovém množství, aby roztok činidla na každém reakčním místě byl oddělen od roztoku činidla na ostatních vazebných místech povrchovým napětím.

18. Způsob podle nároku 17,vyznačující se tím, že povrch na pevném podkladu každého funkcionalizovaného reakčního místa má vyšší povrchové napětí ve srovnání s povrchem pevného podkladu obklopujícím každé funkcionalizované vazebné místo.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že tento povrch na pevném podkladu obklopující každé funkcionalizované vazebné místo je z nereaktivních hydrofobních materiálů.

20. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že objem roztoku činidel deponovaného na vybraná reakční místa je asi 20 pikolitrů až asi 2 mikrolitry.

ϊ· ·· '>.' . /·

Φ ·· *· ·* 44 44

44 4 4 4 4 4 4 4 4 9

4 4 4 4 4 444 4 1 4 4

4 441 4 4 1 1 4 4 1 9 1 9

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

444 44 ·· 44 44 44

21. Roztok nukleosidového činidla pro syntézu oligonukleotidu v relativně nepatrných objemech na površích pevných podkladů v otevřeném prostředí obsahující:

nukleotidové činidlo; a rozpouštědlo s teplotou varu nejméně kolem 140 °C za účelem podstatného snížení odpařování roztoku činidla v otevřeném prostředí během růstu oligonukleotidu.

22. Roztok nukleosidového činidla podle nároku 21, vyznačující se tím, že objem deponovaného roztoku činidla je kolem 20 pikolitrů až asi 2 mikrolitry.

23. Roztok nukleosidového činidla podle nároku 22, vyznačující se tím, že teplota varu označená jako vysoká teplota varu je nejméně kolem 200 °C.

24. Roztok nukleosidového činidla podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedené rozpouštědlo se vybere ze skupiny dinitrilů.

25. Roztok nukleosidového činidla podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedená skupina dinitrilů vykazuje v podstatě podobnou aciditu jako acetonitril.

26. Roztok nukleosidového činidla podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedená skupina dinitrilů se vybere ze skupiny sestávající z malononitrilu, sukcinonitrilu, glutaronitrilu, adiponitrilu a pimelonitrilu.

27. Roztok nukleosidového činidla podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedené rozpouštědlo • toto ·· toto toto ·· to·*· ··· · toto to • * * ·* ··· * · · · • ··· >« ·φ ··· ·· * • · ··«· «··· ··· ·· to· ·· ·· ·· se vybere ze skupiny mononitrilů.

28. Roztok nukleosidového činidla podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená skupina mononitrilů se vybere ze skupiny, kterou tvoří valeronitril, benzonitril a kapronitril.

29. Způsob snížení odpařování kapalného roztoku činidla během chemické syntézy molekuly tvořené podjednotkami v pevné fázi na povrchu pevného podkladu s otevřeným prostředím, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně

a) zajištění pevného podkladu s otevřeným prostředím, zahrnujícího alespoň jedno vazebné místo, které je funkcionalizováno chemickou skupiny a

b) ukládání nepatrného objemu kapalného roztoku činidla na tento povrch podkladu v kontaktu s uvedeným vazebným místem, přičemž uvedený roztok činidla zahrnuje činidla obsažená v mononitrilech nebo dinitrilech, pro snížení odpařování roztoku činidla v otevřeném prostředí během syntézy na uvedeném pevném podkladu.

30. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že uvedenou molekulou je oligonukleotid.

31. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že uvedenou molekulou je peptid.

32. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že uvedenou molekulou je nukleová kyselina peptidu.

33. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící ♦ 00 ·0 00 00 00

00 0 0 000 0000

00 0 0 0 000 0 00 0

0 000 00 00 000 00 0

0 0 0000 0000

000 00 00 00 00 00 se tím, že syntéza se provádí fosforamiditovou metodou.

34. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící se tím, že syntéza se provádí H-fosfonátovou metodou.

35. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že uvedené dinitrily zahrnují aciditu v podstatě podobnou acetonitrilu.

36. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že uvedené dinitrily se zvolí ze skupiny zahrnující sukcinonitril, glutaronitril, adiponitril a pimelonitril.

37. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že se opakují stupně A a B do vytvoření alespoň jednoho souvislého oligonukleotidového řetězce.

38. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že mononitrily se zvolí ze skupiny zahrnující valeronitril, benzonitril a kapronitril.

39. Způsob snížení odpařování kapalného roztoku činidla během chemické syntézy oligonukleotidu v pevné fázi na povrchu pevného podkladu s otevřeným prostředím, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně

a) zajištění pevného podkladu s otevřeným prostředím zahrnujícího alespoň jedno vazebné místo, které je funkcionalizováno chemickou skupinou, a

b) ukládání nepatrného objemu kapalného roztoku činidla na tento povrch podkladu v kontaktu s uvedeným vazebným místem, přičemž uvedený roztok činidla • *· ·· Φ· 99 99 • 9 · · ··· · · · · • · 9 9 9 99 9 9 9 9 9

9 999 ·9 99 999 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 99 zahrnuje činidla obsažená v rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující glymy, diglymy, triglymy, dimethylformamidy, hexamethyltriamidfosfáty a trimethylfosfáty, pro snížení odpařování roztoku činidla v otevřeném prostředí během syntézy na uvedeném pevném podkladu.

40. Způsob podle nároku 39, vyznačuj ící se tím, že syntéza se provádí fosforamiditovou metodou.

41. Způsob podle nároku 39, vyznačuj ící se tím, že syntéza se provádí H-fosfonátovou metodou.

42. Způsob syntézy oligonukleotidů podle nároku 39, vyznačující se tím, že stupeň ukládání se provádí s použitím řízeného uvolňování kapek roztoku činidla.

43. Způsob syntézy oligonukleotidů podle nároku 42, vyznačující se tím, že uvedené řízení uvolňování kapek roztoku činidla se provádí prostřednictvím piezoelektrického čerpacího zařízení.

44. Způsob syntézy oligonukleotidů podle nároku 39, vyznačující se tím, že stupeň ukládání se dále provádí opatrnou postupnou syntézou na každém uvedeném vazebném místě fosforamiditovou metodou.