CZ20001356A3 - Metoda pro zvýšení koncetrace konjugované kyseliny linolové v mléčném anebo tkáňovém tuku přežvýkavce, její použití a složení krmivá - Google Patents

Abstract

Způsob zvýšení koncentrace cis-9,trans-11 izomerů kyseliny oktadekadienové v mléčném tuku a/nebo tkáňovém tuku přežvýkavce, při kterém je přežvýkavci podán trans-11 izomer kyseliny oktadecenové buďjako takový nebo sjiným krmivém, odděleně nebo dohromady sjinými mastnými kyselinami.

Description

METODA PRO ZVÝŠENÍ KONCENTRACE KONJUGOVANÉ KYSELINY LINOLOVÉ V MLÉČNÉM ANEBO TKÁŇOVÉM TUKU PŘEŽVÝKAVCE, JEJÍ POUŽITÍ A SLOŽENÍ KRMIVÁ

Oblast techniky

I

Vynález se týká metody pro zvýšeni koncentrace konjugované kyseliny linolové, tj.chemicky přesně vyjádřeno cis-9,trans-11 izomeru kyseliny oktadekadienové (CLA,cis-,trans-11-C18:2) v mléčném anebo tkáňovém tuku přežvýkavce pomoci krmením přežvýkavce bud jako takovou nebo mixovanou s jiným krmivém, odděleně nebo spolu s jinými mastnými kyselinami, kyselinou vakcenovou, tj.chemicky přesně vyjádřeno trans-11 izomerem kyseliny oktadecenové (trans-1 ΙΟΙ 8:1).

Dosavadní stav techniky

Nedávno bylo zjištěno, že konjugovaná kyselina línolová, tj.CLA, poskytuje zcela účinnou ochranu proti rozličným formám rakoviny (Ha Y.L. et al., Cancer Res. 1990, 50:1097; Ip C. et al., Cancer 1994, 74:1050). Bylo zpozorováno, že je účinná proti rakovině kůže a žaludku u myši a proti rakovině mléčné žlázy u krysy (Scimeca J.A. et al., Diet and Breast Cancer. American Inst. Of Cancer Res. 1994, Plenům Press, London). Růst lidských rakovinových buněk může být také úspěšně potlačen v buněčných kulturách (Schultz T.D. et al., Canc lett 1992, 63:125). Též bylo zpozorováno, že má další metabolické účinky, některé z nich jasně naznačuji účinky na zdraví (Banni, S. a J.-C.Martln. 1998. Trans fatty acids in human nutritioin. Ed.Sebedio and Christie, The Oily Press, Dundee).

V přírodě je CLA přítomna hlavně jako složka v tkáňovém tuku a mléčném tuku přežvýkavců, cls-9,trans-11 je hlavním izomerem (přibl.90 %). Malá množství jiných izomerů jsou také přítomna v mléce, ale v tomto kontextu CLA oznčuje specificky cis-9,trans-11 izomer.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je tedy zajistit metodu vhodnou pro živočišné hospodářství, již by koncentrace CLA v mléčných tucích anebo tkáňových tucích přežvýkavce byla zvýšena. To bylo provdeno ve shodě s vynálezem způsobem odhaleným v připojených patentových nárocích.

Metoda ve shodě s vynálezem je vhodná pro všechny přežvýkavce, zvláště pra přežvýkavce produkující mléko jako kráva, čímž že možné produkovat pro spotřebitele mléko a mléčné výrobky s pozměněným složením mastné kyseliny. Změna ve složeni mastné kyseliny mléka a mléčných výrobků je výhodná pro zdrav! spotřebitelů. CLA obvykle, tj. mastná kyselina ds-9,trans-11-C18:2 tvoří 0,3 % hmotnostního procenta až 0,7 % hmotn.procenta všech mastných kyselin v kravském mléce. Dokonce už v této koncentraci může ochránit lidi konzumujíc! mléčné výrobky před rakovinou, pokud příjem mléčného tuku je dostatečně vysoký (Knekt P.R.et al., BritJ.of Cancer 1996, 73:687). V posledních letech se změnily zvyky ve spotřebě potravinových tuků. Spotřeba tuků, zvláště mléčných tuků, se snížila, a následkem toho klesl také příjem CLA v potravinách. Zvýšením komncentrace CLA v mléce pomocí množství odpovídajícího snížení ve spotřebě mléčného tuku by bylo možné navrátit se zpět k příjmu CLA v potravinách na úroveň předchozích let, aniž by bylo zapotřebí zvýšit spotřebu tuků. Zvýšení koncentrace CLA v mléce může tedy mlt velký význam pro zdraví veřejnosti. Zvýšení koncentrace CLA v mléce na úroveň vyšší než dříve by mělo mlt zvláště pozitivní účinek, protože při pokusech na zvířatech bylo zpozorováno, že ochranný vliv CLA má jasnou reakci na dávku (Ip C.et al.,Cancer 1994, 74:1050). CLA v potravě může také snížit množství špatného cholesterolu (LDL) v krvi (Lee et al. 1994. Atherosderosís. 108:19). Přírodní izomer CLA mléčného tuku byl lidmi přijímán v potravě po tisíciletí, aniž by byly pozorovány nějaké nedostatky.

Tvořeni konjugované kyseliny linolové (cis-9,trans-11-C18:2) při izomeraci kyseliny linolové (cis-9,cis-12-C-18:2) v bachoru bylo popsáno následovně:

cis-9,cis-12-C18:2 (kyselina linolová) i cis-9,trans-11-C18:2 (konjugovaná kyselina linolová, CLA) i trans-11-C18:1 (kyselina vakcenová)

4/

C18:0 (kyselina stearová)

Koncentrace CLA v mléce byla úspěšně zvyšována krmením krav rostlinnými oleji, které obsahuji kyselinu linolovou (Griinari J.M. et al., J.Dairy Sci.1998, 81:1251). Kelly a kol. (Kelly M L. et al., J.Nutr.1998, 128:881) porovnal tři olejové rostlinné přísady do krmeni a jejich účinek na mléčnou koncentraci CLA a zpozoroval, že olejová přísada s nejvyššl koncentraci kyseliny linolové (slunečnicový olej) poskytla nejlepší mléčnou CLA reakci. Zaznamenal, že koncentraci CLA v mléce lze zvýšit krmením zvířat olejovými tuky specificky obsahujícími kyselinu linolovou.

Věřilo se, že CLA, která přešla do mléčného tuku, je odvozena pouze od kyseliny linolové přítomné v krmřvu pro zvířata, tj. od cis-9,cis-12 izomeru kyseliny oktadekadienové, jež izomerují mikrobi z bachoru na cis-9,trans-11-C18:2 před její redukci na kyselinu vakcenovou (trans-11-C18:1) a dále na kyselinu strearovou (C18:0). CLA se netvoři ve zjistitelném množství při hydrogenaci kyseliny linolové, tj cis-9,cis-12,cis-15-C18:3 izomeru kyseliny oktadekatrienové, ale důležitým biohydrogenačnlm produktem kyseliny linolové je také kyselina vakcenová (Harfoot and Hazleood 1988, The rumen microbial ecosystem. Ed.Hobson, P.N.EIsevier Science Publlshers B.V., Amsterdam, The Netherlands). Ve shodě s obecnou teorií některé CLA vytvořené jako meziprodikt při biohydrogenaci kyseliny linolové unikají z bachoru spolu s nepřetržitým odtokem bachorové tekutiny předtím, než začne redukovat kyselinu vakcenovou. CLA, která unikla z bachoru je absorbována hlavně v malém tračníku, je přenesena krvi do prsní žlázy a zde je vázána jako součást mastné kyseliny mléčného tuku.

Autoři předloženého vynálezu zpozorovali, že rybí olej, jenž obsahuje nízké hladiny kyseliny linolové (složeni uvedené v tabulce 1), zvýšil koncentraci CLA v mléce (tabulka 2).

Tabulka 1

Složeni mastné kyseliny rybího oleje %

Kyselina myristová (14:0) 8,6

Kyselina palmltová (16:0) 18,6

Kyselina palmitolejová (cis-9-16:1) 11,9

Kyselina stearovó (18:0) 3,6

Kyselina olejová (cis-9-18:1) 0,9

Další cis-kyseliny 0,9

Kyselina vakcenová (trans-11 -18:1) 5,2 • · · · ··«· ··· · ···· · ·· ·

	• · · · · 4	• · ·· ·· · ·
Kyselina elaidová (trans-9-18:1)	0,2
Kyselina llnolová (18:2,n-6)	2,5
EPA (20:5,n-3)	10,2
DHA (22:6,n-3)	7,6
Tabulka 2
Účinek krmivá s rybím olejem na	složení mléčné mastné kyseliny (% všech
mastných kyselin)	Žádná olejová	Přísada rybího
	přísada	oleje
C12.0	3,4	1,9
C14:0	12,8	9,3
C16:0	38,1	34,3
C18:0	9.7	3.8
C18:1	26,1	28,6
trans-11-C 18:1	1,1	3,2
C18:2	2,4	2,6
C18:3	0,2	0,5
CLA	0,7	1,9
Obecné osvědčený mechanismus	tvoření CLA popsaný	výše (Harfoot and
Hazlewood 1988) také nevysvětluje zvýšeni koncentrace CLA v mléce, když krávy
přijimaji jako jediné krmivo trávu na pastvě (Griinarí et al.	1998 J.Diary Sci. 81
(Suppl.1):300 (Abst.)), protože hlavni mastná kyselina v tuku přitomném v trávě pastvy je kyselina linolová a podíl kyseliny linolové je typicky zcela nízký. Na základě pozorování citovaných výše tito vynálezci dospěli k závěru, že CLA v mléce může také být odvozena od jiného zdroje než izomeraci kyseliny linolové probíhající v bachoru. Mimoto protože v bachoru krávy krmené pouze trávou z

pastvy byly přítomny jisté tzomery CLA (cis-9,trans-11-18:2 a trans-9,trans-1 ΙΟ: 18:2) v průměrném poměru 1:1, ale v mléce koncentrace cis-9,trans-11-C18:2 izomeru byla 10křát vyšší než trans-9,trans-11-C:18:2 izomeru (Gríinarí and Nurmela, nepublikováno), přítomni vynálezci zaznamenali, že CLA mléčného tuku může být vytvořena v určité situaci při krmeni z velké míry někde jinde než v bachoru. Bylo zpozorováno, že výše zmíněné ízomery CLA se přemisťuji ze zažívacího traktu do mléka téměř stejnou měrou, takže to, co je zahrnuto v této situaci, není diskriminace jednoho z izomerů mastné kyseliny (Chouinard et al. 1998

J.Diary Sci.81 (Suppl.1) :353 (Abst.)).

Tudíž předložený vynález je založen na překvapivém pozorování, že olejová přísada do krmivá obsahujícího nízké hladiny kyseliny linolové způsobila podstatné zvýšení v koncentraci CLA v mléce. Počáteční substance CLA musí však být tvořena v bachoru, protože CLA je přítomna ve významném množství pouze v mléčném tuku a tkáňovém tuku přežvýkavců.

Bylo také zpozorováno ve spojení s předloženým vynálezem, že u krav krmených pouze trávou na pastvě koncentrace několika trans-mastných kyselin (tj.izomerů mastných kyselin vytvořených v bachoru) v natrávenině proudící ven z bachoru přesně předpovídá koncentraci těchto mastných kyselin v mléce (obr.1). Přesná korelace mezi koncentrací v natrávenině bachoru a koncentrací v mléčném tuku podporuje hypotézu o bachorovém původu těchto izomerů mastné kyseliny. Co se týká CLA, zmíněná korelace je však nespolehlivá (obr.2a). Koncentrace vakcenové kyseliny (trans-11) ve tráveném krmivu proudícím ven z bachoru ve skutečnosti vysvětluje střídání v koncentraci CLA v mléce podstatně lépe (obrázek 2b). Zkoumáni vztahu vakcenové kyseliny k CLA v mléčném tuku ukazuje, že korelace je dokonce těsnější (obrázek 2c). Tato velmi těsná korelace je pravděpodobně vysvětlena jako vztah metabolického substrátu (trans-11-C18:1) a produktu (cis9,trans-11-C18:2).

Na základě výše uvedeného zkoumání korelace a uvedeného závěru byla v souvislosti s předloženým vynálezem vedena překvapivá pozorováni toho, že mléčná CLA může v jistém skupenství krmivá být tvořena hlavně desaturací kyseliny vakcenové na CLA. Zmíněná přeměna se odehrává následovně za působeni enzymu Δ-9 desaturázy v živočišných tkáních:

Δ-9 desaturáza trans-11-C18:1 (kyselina vakcenové) -> ds-9,trans-11-C18:2 (CLA)

Tudíž je možné, že CLA mléčného tuku je tvořena hlavně ve tkáni přežvýkavce, protože Δ-9 desaturáza přidává ds-9 dvojitou vazbu k mastné kyselině trans-11C18:1, Jež se tvoři v bachoru a odchází z bachoru spolu s tráveným krmivém. Δ-9 desaturáza je aktivní enzym v mnoha různých tkáních, ale jeho aktivita byla pozorována zvláště v kravských prsních žlázách, kde desaturuje kyselinu stearovou

4 4 4 4 4

444 4 4444 • 4 ·· 44 4 · (018:0) na kyselinu olejovou (cis-9-C18:1) (Kinsella J.E., Lipids 1972, 7:349). Na druhou stranu bylo pozorováno, jak mikrosomálnl Δ-9 desaturáza v jaternlch buňkách u krys desaturuje mastnou kyselinu trans-11-018:1 na cis-9,trans-11-CLA in vitro (Mahfouz M.M.et al., Biochim.Biophys.Acta 1980,618:1).

Krmivo, které zvyšuje tvoření kyseliny vakcenové, tj. mastné kyseliny trans-11-018:1 v bachoru, může tudíž vzhledem k desaturaci mastné kyseliny trans-11-018:1 v prsní žláze nebo jinde v kravském organismu zvýšit koncentraci CLA v mléce. Výše zmíněný účinek rybího oleje zvyšujícího koncentraci CLA v mléce by tudíž byl vysvětlitelný pomoci účinku rybího oleje na syntézu mastné kyseliny trans-11-018:1 v bachoru. To je podpořeno komentářem Penguina a Davise (J.Diary Sci.1975. 58:49) ke zvýšeni syntézy kyseliny vakcenové v bachoru, když byl podán krávám rybí olej. Ve shodě s předloženým vynálezem je zvýšeni koncentrace CLA v mléce za jistého složeni krmeni široce vysvětleno pomoci tvořeni mastné kyseliny trans-1 ΙΟΙ 8:1 v bachoru a desaturaci zmíněné mastné kyseliny na CLA v organismu krávy, a tedy ne tvořením CLA v bachoru, jak se věřilo tak dlouho (Harfoot and Hazlewood 1988). Dříve popsané obohacení cis-9,trans-11-CLA izomeru v mléce v poměru ke koncentraci trans-9,trans-11-CLA izomeru u krav krmených na pastvě je vysvětlen skutečnosti, že trans-9, trans-11 izomer nemůže být tvořen v kravských tkáních, kdežto cis-9,trans-11 izomer by mohl být tvořen hlavně jako produkt desaturace. Samostatně s krmivém z pastvy je tvořen snad pouze malý poměr mléčné cis9,trans-11-CLA v bachoru.

Předložený vynález je založen na zvýšení koncentrace OLA v mléčném tuku a tukové tkáni pomoci krmení přežvýkavce mastným doplňkem, který obsahuje mastnou kyselinu trans-11-018:1, tj. kyselinu vakcenovou, tj. substrát přírodní Δ-9 desaturázy organismu. Kyselina vakcenová je přeměněna v organismu, např. v prsní žláze, na cis-9,trans-11-CLA a je vylučována do mléka. Podobně CLA tvořená ve tkáních může být začleněna do lipidové tkáně.

US Patent 5,416,115 odkrývá metodu, jejíž pomoci lze snížit tuky kravského mléka a zvýšit produkci mléka užitím trans-mastných kyselin. V metodě, například trans18:1 izomerová vazba byla zavedena do krávy. Avšak tato publikace neuvádí, že doplněk mastné kyseliny trans-18:1 ve zvířecím krmivu by zvýšil koncentraci CLA v mléčném tuku a tkáňovém tuku.

Bylo zjištěno, že krmivo, jež obsahuje mastnou kyselinu trans-11-C18:1 zvyšuje koncentraci cte-9,trans-11CLA v krvi (Salminen et al. J.Nutr. Biochem. 1998.9:93) když strava testovaných jedinců obsahovala, na rozdíl od běžné stravy, velmi malé

• • · •	• ···	• · · • t ··♦	• · · · • · · «
• · ·	• e	• e · ·	♦ · · »

množství polynenasycených mastných kyselin. Zvýšeni koncentrace CLA v krvi udané Salminenem et al. (1998) ukazuje, že desaturace trans-mastné kyseliny dříve pozorovaná v jaternich buňkách (Mahfouz M.M.et al.,Biochim.Biophys.Acta 1980, 618:1) Je aktivním procesem také u lidských jedinců, ale omezuje se na stravy, které obsahuji limitované množství polynenasycených mastných kyselin. Santora et al. (1998)(dokument prezentovaný na roční schůzce AOCS, Chicago) zaznamenal, že když byla kyselina vakcenová vpravena do myší, jejich koncentrace CLA v tukové tkáň! se ztrojnásobila. Tvořeni CLA se snížilo, když krmivo myši obsahovalo 5 % hmotnostních procent kukuřičného oleje. Kukuřičný olej obsahuje velké množství polynenasycených mastných kyselin, tj.aktivita desaturasy je závislá na stupni nenasycenosti stravy.

Předložený vynález ukazuje, že přežvýkavec může být použit pro produkci přirozeně nejbéžnějšího izomeru CLA pro lidskou potravu pomoci přidáni kyseliny vakcenové (trans-11-C18:1) do potravy přežvýkavců. Přežvýkavcem je přednostně přežvýkavec produkujíc! mléko, jako např. kráva, ale vynález lze také aplikovt na přežvýkavce určené k produkci masa.

V krmivu přežvýkavce je vhodné chránit pomoci známých ochranných metod tuk trans-11-C18:1 před účinky bachorové biohydrogenace. Například U.S. patent 4,642,317 objevuje běžně používanou metodu pro ochranu tuku.

Pro zvýšeni koncentrace CLA v mléčném tuku, je vhodné vložit kyselinu vakcenovou, tj. trans-11-C18:1 do směsi, jež obsahuje velké množství nasycených mastných kyselin, protože přechod saturovaných mastných kyselin do prsní žlázy podporuje aktivitu Δ-9 desaturázy prsní žlázy a může tim také podporovat převod izomeru trans-11 nacls-9,trans-11CLA.

Nejvhodnějšim způsobem dávkování kyseliny vakcenové zvířatům je přidat ji namíchanou s krmivém nebo jako oddělený doplněk krmivá. Vhodnél dávky kyseliny vakcenové pro přidáni můžou být stanoveny měřením množství kyseliny vakcenové, čímž se získá optimální hladina CLA v mléce, takže přidání je dostatečně ekonomické, pokud jde o náklady.

Vynález je Ilustrován pomoci dále uvedených příkladů.

• to · · · * • ♦ ·· · to · · • to · · · toto · • · · · ··

Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1

Cílem pokusu bylo ukázat, že trans-11-C18:1 podávaná krávám produkujícím mléko po přežvýkání do zažívacího traktu byla přeměněna na cis-9, trans-11-CLA ve tkáních. Pokus byl proveden zaváděním odtučněného mléka (nosič, 5 kg/den) do krávy plynulou infuzí do abomasu po tři dny (úvodní perioda). Během dalších tří dnů (infuze) 25 g/den směsi mastné kyseliny trans-11 a mastné kyseliny trans-12-C 18:1 emulgované v odtučněném mléce bylo zaváděno infuzí do krávy. Koncentrace trans-11-C 18:1 a CLA byly určeny z mléka krav třetí den jak úvodní periody tak infuze. Výsledky jsou uvedeny v doprovodné tabulce 3.

Tabulka 3

	Úvodní doba	Infuze	% zvýšeni
Mléčná mastná kyselina
(mg/g mléčného tuku)
trans-11-C18:1	12,0	14,0	17
cis-9,trans-11-C18:2	2,8	4,1	46

Koncentrace trans-11-C18:1 v mléce se zvýšila během infuze, což ukazuje, že infuzí zavedená mastná kyselina byla absorbována, přešla do prsní žlázy a stala se součásti mléčného tuku. Koncentrace CLA se také zvýšila, což ukazuje, že význačná část mastné kyseliny trans-11-C18:1 získané zvířetem byla převedena v kravské tkáni na CLA. Tento pokus ukazuje, že přežvýkavci, kteří přirozeně produkuji CLA ve svém těle, zvyšuji produkci CLA, pokud získají mastnou kyselinu trans-11-C18:1 v absorbovatelné formě, například přidanou do krmivá. Mastná kyselina trans-11-C 18:1 musí být dávkována do krmivá denně, protože koncentrace CLA v mléce se snižuje okamžitě, jakmile je přívod zastaven. V tomto pokusu koncentrace CLA v mléce skapaném na bazálni hladinu ve dvou dnech po infuzi trans-mastných kyselin byla přerušena (obrázek 3).

• • · * • •	•	4 4 9 4 4 4 9 4	4 4 4 · 4 4 4 4
• · ·	4 4	• 9 ·4	4 4 4 ·

Přiklad 2

Dojnice (n=2) byly krmeny ztuženou rostlinnou mastnou směsi (0, 200 nebo 400 g/den), která obsahovala 7,9 % hmotnostních procent mastné kyseliny trans-11C18:1. Koncentrace CLA v mléce se zvýšila, když se zvýšilo krmení ztuženými rostlinnými tuky (tabulka 4). Tento pokus demonstruje účinek reakce na dávku mezi přísunem stravy mastné kyseliny trans-11-C18:1a koncentrací CLA v kravském mléce.

Tabulka 4

	Kontrola, 0 g/den	200 g/den	400 g/den
U mléčných mastných kyselin, %
trans-11-C18:1	1,2	2,1	2,6
cls-9,trans-11-C18:2	0,5	1,0	1,4

ΛΖ ,áW-

• · ·	• ·	•	9 9	9 9
• ♦ ♦·	• ·	···	9 9	9 ·
• · ·	• ·	• ·	9 9	• ·
e · · · ·	• ·	99	9 ·	• ·

Claims (10)

1. Metoda pro zvýšeni koncentrace cis-9,trans-11 izomerů kyseliny oktadekadienové v mléčném tuku anebo tkáňovém tuku přežvýkavce vyznačujíc! se tim, že trans-11 izomer kyseliny oktadecenové je podán přežvýkavci buď jako takový nebo mixovaný s jiným krmivém, odděleně nebo dohromady s jinými mastnými kyselinami

2. Metoda podle nároku 1 vyznačující se tlm, že přežvýkavcem je přežvýkavec produkujíc! mléko.

3. Metoda podle nároku 1 nebo 2 vyznačujíc! se tím, že trans-11 izomer kyseliny oktadecenové Je chráněn před redukcí v bachoru.

4. Metoda podle výše uvedených nároků vyznačující se tim, že dalšími mastnými kyselinami jsou nasycené mastné kyseliny.

5. Použití trans-11 izomerů kyseliny oktadecenové pro zvýšení koncentrace cis9,trans-11 izomerů kyseliny oktadekadienové v mléčném tuku anebo v tkáňovém tuku přežvýkavce jeho podáním přežvýkavci buď jako takovým nebo namíchaným s jiným krmivém, odděleně nebo dohromady s jinými mastnými kyselinami.

6. Použití podle nároku 5 vyznačující se tím, že přežvýkavec je přežvýkavec produkující mléko.

7. Použití podle nároku 6 vyznačující se tlm, že trans-11 izomer kyseliny oktadecenové je chráněn před redukcí v bachoru.

8. Použiti podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačujíc! se tim, že dalšími mastnými kyselinami Jsou nasycené mastné kyseliny.

9. Složení krmivá pro zvíře vyznačující se tlm, že obsahuje alespoň trans-11 izomer kyseliny oktadecenové.

10. Složeni krmivá pro zvíře vyznačující se tím, že obsahuje jako doplněk další mastné kyseliny.

• 00 0 0 00 • 0 • 0 0· 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0· 0 0 ··· 0 0 0 • » 0 · * 00 0 ·· 0 0 0 0 • 0