CZ127797A3 - MUTANT MONOOXYGENASE CYTOCHROME P-450 cam - Google Patents

Description

Oblast techniky oi§oa

Vynález se týká mutantů monooxigen^zového cytochromu P-450_cam a způsobu oxidace urqj_tiý<£hB f ¹ organických sloučenin tímto mutantem. |

Dosavadní stav techniky

Monooxygenázy katalyzují selektivní oxidaci nefunkcionalizovaných uhlovodíků kyslíkem („Cytochrome P-450: Structure, Mechanism a Biochemistry, ed. P.R. Ortiz de Montellano, Plenům Press, New York, 1986) a jsou proto velmi zajímavé pro potenciální použití v organických syntézách. Nicméně další vývoj v této oblasti komplikují problémy spojené s izolací dostatečného množství enzymů a souvisejících proteinů

Navzdory dostupnosti více než 150 různých elektronového přenosu, aminokyselinových sekvencí cytochromových P-450 monooxygenáz, jsou v současnosti dostupná ((T.L. Poulos, B.C. Finzel a A.J. Howard, J. Mol. Biol., 1987, 195, 687-700), (J.A. Peterason,

U.Y. Lu, J. Geisseisoder, S. Graham-Lorence,

C. Carmona, F. Witney a M.C. Lorence, J. Biol. Chem.,

1992,267,14193-14203) a

S.S. Boddupali, C.A. Hasemann, J. Deisenhofer, (K.G. Ravichandran, J.A. Petrson a 216, 731-736) )

Science, 1993, strukturní data pouze tří těchto monooxygenáz a pár jich bylo úspěšně přeexprimováno v bakteriálních systémech (B.P. Unger, I.C. Gunsalus a S.G. Sligar,

J. Biol. Chem.,	1986, 216,	1158-1163; J.	S. Miles,
A.V. Munro, B.N.	Rospendowski,	W.E. Smith, J.	McKnight
a A.J. Thompson,	Biochem. J.	, 1992, 288,	503-509;
T.H. Richardson,	M.J. Hsu, T	. Kronbach, H.J	. Barnes,

G. Chán, M.R. Waterman, B. Kemper a E.F. Johnson, Arch. Biochem. Biophys., 1993, 300, 510-516; S.S. Boddupalli, T. Oster, R.W. Estabrook a J.A. Peterson, J. Biol. Chem., 1992, 267, 10 375-10 380; H. Li K. Darish a T.L. Poulos, J. Biol. Chem., 1991, 26611 909-11 914).

Jedinou cytochromovou P-450 monooxygenázou, která je rozpustná a kterou lze exprimovat v dostatečných množstvích, je vysoce specifická P-450_cam s P.putidy, která katalyzuje regioselektivni a stereoselektivni hydroxylaci kafru (1) na 5-exohydroxykafr (I.C. Gunsalus a G.C. Wagner, Methods Enzymol., 1978, 52,

166-188) . Za použiti zařízeni s vysokou rozlišovací schopností se určila se krystalická struktura P-450_cam (T.L. Poulos, B.C. Finzel a A.J. Howard, J. Mol. Biol., 1987, 195, 687-700) a protože se dá předpokládat, že mechanismus působení tohoto bakteriálního enzymu je velmi podobný mechanismu působení jeho savčích protějšků, ta se použila jako základní struktura, na níž jsou modely savčích enzymů založeny.

Rovněž již byla popsána (B.P. Unger, I.C. Gunsalus a S.G. Sligar, J. Biol. Chem., 1986, 216, 1158-1163;

J.S. Miles, A.V. Munro, B.N. Rospendowski, W.E. smith, J. McKnight a A.J. Thompson, Biochem. J. , 1992, 288,

503-509; T.H. Richardson, M.J. Hsu, T. Kronbach, H.J. Barnes, G. Chán, M.R. Waterman, B. Kemper a E.F. Johnson, Arch. Biochem. Biophys., 1993, 300, 510516; S.S. Boddupalli, T. Oster, R.W. Estabrook a J.A.

Peterson, J. Biol. Chem., 1992, 267, 10 375-10 380; H. Li K. Darish a T.L. Poulos, J. Biol. Chem., 1991, 26611 909-11 914) nukleotidová sekvence a odpovídající aminokyselinová sekvence P-450_cam· Rovněž je známo umístění aktivního místa enzymu a navíc byl zjištěn ((D. Filipovic, Biochemical a Biophysical Research Communications, sv. 189, č. 1, 1992, 30. listopad 1992, str. 488-495) a (S.G. Sligar, D. Filipovic a P.S. Stayton, Methods in Enzymology, sv. 206, str. 31-49)) vztah mezi strukturou a funkčností. Rovněž již byly popsány mutanty P-450_cam v polohách (P.J. Loida a S.G. Sligar, Protein Engineering, sv. 6, č. 2, str. 207-212, 1993) 101, 185, 247 a v poloze (S.F. Tuck a kol., The

Journal of Biological Chemistry, sv. 268, č. 1, 5. ledna 1993, str. 269-275) 87 byl popsán ((C. Di Primou, G. Hui Bin Hoaem, P. Douzou a S. Sligarem, J. Biol. Chem., 1990, 265, 5 361-5 363), (W.M. Atkinsem a S.G.

Sligarem, The Journal of Biological Chemistry, sv. 263, č. 35, 15. prosince 1988, str. 18 842-18 849) a (W.M.

Atkinsem a S.G. Sligarem, Biochemistry 1990, 29, 1 2711 275)) mutant, ve kterém byl tyrosin 96 nahrazen fenylalaninem 96. Ale ve všech těchto případech publikace popisují pouze účinky mutací na mechanismy známých oxidačních reakcí. V žádné z těchto zpráv se neuvádí ani nenavrhuje možnost použít mutaci k získání biokatalyzátoru pro oxidaci jiných substrátů.

Při pokusech nalézt nové biokatalyzátory byl iniciován projekt, jehož cílem je redesignovat aktivní místo P-450_cam tak, aby bylo možné zde provádět specifické oxidace organických molekul, které nejsou substráty pro standardní protein. Prvotním cílem bylo zabudovat do aktivního místa cytochromu P-450_cam „aromatickou kapsu, která by podnítila navázání substrátů, obsahujících aromatické boční řetězce.

Navíc se zjistilo, že povrchový zbytek vzdálený od aktivního místa (cystein-334) má vliv na stabilitu proteinu a na manipulovatelnost s tímto proteinem. Tento cystein je zodpovědný za nežádoucí dimeraci proteinu v průběhu čištění a proto byl nahrazen alaninovým zbytkem, který zlepšil obě tyto vlastnosti.

Třírozměrná struktura cytochromu P-450_cam vykazuje aktivní místo, které umožňuje těsný van der Waalsův kontakt s hydrofobními skupinami kafru, viz obr. 1. Tři aromatické zbytky (Y96,F87 a F98) jsou seskupeny a poskytují kapsu, vážící substrát do řady s vodíkovou vazbou mezi tyrosinem 96 a karbonyloxidem kafru, udržujícím substrát ve správné orientaci a tím zajišťující regiospecifičnost a stereospecifičnost reakce. Náhrada libovolného aromatického zbytku menším, hydrofobním, nearomatickým bočním řetězcem by mohla poskytnout požadovanou „aromatickou kapsu.

Pro stanovení podobných účinků bodových mutací na tři aromatické zbytky se použil molekulární modelling. Pro výpočet energie interakce mezi aromatickou sondou a možnými mutanty cytochromu P-450_cam, ve kterých jsou tyto zbytky nahrazeny alaninem (F87A, Y96A a F98A) se použil program GRID (P.J. Goodford, J. Med. Chem., 1985, 28, 849-857). Výsledky se následně určily graficky, za použití molekulárního modellingového pouzdrového Quanta (Quanta 4.0, Molecular Simulations lne., 16 New England Executive Park, Burlington, MA 01803-5297).

Ukázalo se, že mutant F98A má nej silnější vazebnou interakci uvnitř aktivní bodové dutiny, přístupné pro aromatickou sondu, přičemž Y96A je o něco menší a F87A je podstatně menší. V první instanci se rozhodlo mutovat tyrosin 96 na alanin, protože je blíž ke středu vazebné kapsy, zatímco fenylalanin 98 je součástí jedné strany vazebné kapsy. Odstranění tyrosinu 96 by rovněž mělo snížit specifičnost enzymu ke kafru, díky ztrátě vodíku vázaného na substrát.

Podstata vynálezu

Jak již bylo uvedeno, vynález se týká mutantů monooxygenázového cytochromu P-450_cam, ve kterém je tyrosinový zbytek v poloze 96 a/nebo cysteinový zbytek v poloze 334 nahrazen zbytkem libovolné aminokyseliny s výjimkou fenylalaninu.

Vynález rovněž poskytuje mutant monooxygenázového cytochromu P-450_cam, ve kterém je tyrosinový zbytek v poloze 96 a/nebo cysteinový zbytek v poloze 334 nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem, přičemž tento mutant má schopnost katalyzovat oxidaci libovolné z následujících sloučenin zahrnujících: polycyklické aromatické uhlovodíky, lineární nebo větvené alkany, difenylové a bifenylové sloučeniny zahrnující halogenované varianty těchto sloučenin a halogenované uhlovodíky.

Vynález se dále týká způsobu oxidace sloučenin zvolených ze skupiny zahrnující polycyklické aromatické uhlovodíky, lineární nebo větvené alkany, difenylové a bifenylové sloučeniny zahrnující halogenované varianty těchto sloučenin a halogenované uhlovodíky, přičemž tento způsob zahrnuje uvedení zvolené sloučeniny za oxidačních podmínek do kontaktu s monooxygenázovým cytochromem P-450_cam, ve kterém je tyrosinový zbytek v poloze 96 a/nebo cysteinový zbytek v poloze 334 nahrazen jiným aminokyselinový zbytkem.

Výhodně zvolenou aminokyselinou je některá z následujících aminokyselin: alanin, arginin, asparagin, kyselina asparágová, cystein, kyselina glutamová, glutamin, glycin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, prolin, serin, threonin, tryptofan, tyrosin a valin s tou výjimkou, že v případě tyrosinového zbytku v poloze 96 se nepoužije pro mutaci tyrosin a v případě cysteinového zbytku v poloze 334 nebude použitou aminokyselinou cystein.

Aminokyselinou, která nahradí tyrosin v poloze 96 je běžně jedna z malých hydrofobních aminokyselin, např. alanin, glycin, valin, leucin nebo isoleucin, přičemž výhodnou aminokyselinou je alanin, jak bude uvedeno v příkladové části.

Alternativně může být aminokyselinou nahrazující tyrosin v poloze 96 jedna z aminokyselin s nábojem, např. kyselina aspartová nebo kyselina glutamová s vodíkem, který se naváže na pozitivně nabitý substrát; nebo sloučenina s pozitivním nábojem, např. lysin, arginin nebo histidin s vodíkem, který se naváže na negativně nabitý substrát, který není členem rodiny kafru.

Dá se předpokládat, že mutace v poloze 96 je klíčem, který umožňuje mutantním enzymům katalyzovat oxidaci relativně širokého spektra organických substrátů. Další aminokyseliny sousedící s aktivním místem enzymu lze rovněž mutovat s cílem změnit tvar a specifičnost aktivního místa. Těmito dalšími aminokyselinami jsou např. aminokyseliny v polohách 87, 98, 185, 244, 295 a 297. Dá se předpokládat, že aminokyselina v jedné nebo několika těchto polohách může být nahrazena malou hydrofobní aminokyselinou, čímž dojde ke zvětšení aktivního místa; nebo velkou hydrofobní aminokyselinou, čímž se zvětší velikost aktivního místa; nebo aminokyselinou mající aromatický kruh, který se může navázat na odpovídající aromatický kruh substrátu.

V použité literatuře (uvedené v textu) jsou popsány podmínky oxidačních reakcí. Enzymatický systém zahrnuje zpravidla kromě mutantního enzymu rovněž putidaredoxin a putidaredoxinreduktázu společně s NADH, jako kofaktory. V úvahu lze brát různé třídy organických sloučenin:

i) Organickou sloučeninou je aromatická sloučenina, buď uhlovodík, nebo sloučenina použitá za podmínek, při kterých neaktivuje ani nedenaturuje enzym. Vzhledem k tomu, že při mutaci dojde k vytvoření aromatické vazebné kapsy v povrchu enzymu, je mutantní enzym schopen katalyzovat oxidaci širokého spektra aromatických sloučenin. Oxidace příkladných aromatických a polyaromatických sloučenin je demonstrována v příkladové části, kde se ukazuje, že standardní typ enzymu katalyzuje pouze oxidaci členů kafrové rodiny.

ii) Organickou sloučeninou může být uhlovodík, např.

alifatický nebo alicyklický, nesoucí funkční skupinu. Před oxidační reakcí se k funkční skupině přidá aromatická ochranná skupina, která se po ukončení oxidační reakce odstraní. Vhodnou aromatickou skupinou je fenolová skupina. Očekává se, že aromatická ochranná skupina přidrží substrát na místě, takže tato ochranná skupina má dvě funkce: 1) zvyšuje hydrofobní charakter substrátu a tím zpevňuje vazbu na hydrofobní aromatickou kapsu a 2) přidržuje substrát na místě v aktivním místě enzymu, takže pomocí správné aromatické ochranné skupiny lze dosáhnou jak regioselektivní, tak stereoselektivní hydroxylace substrátu. V příkladové části je tento typ organické sloučeniny demonstrován na příkladu cyklohexylbenzenu. Příklady monofunkčních uhlovodíků jsou cyklohexylové, cyklopentylové a alkylové deriváty (schéma 1). Oxidační produkty těchto sloučenin jsou cennými výchozími materiály pro organické syntézy, zejména pokud jsou připraveny v homochirální formě. Použitelnými aromatickými ochrannými skupinami jsou např. benzyléthery nebo naftyléthery a benzoyiestery nebo naftoylestery a amidy (schéma 1). Zajímavé jsou především benzoxazolové skupiny jako karboxylové ochranné skupiny a N-benyloxazolidinové skupiny jako aldehydové ochranné skupiny. Obě tyto skupiny lze po ukončení enzymatické oxidace snadno oddělit a byly již popsány v literatuře zabývající se mikrobiálními oxidacemi aldehydů a kyselin.

iii) Organickou sloučeninou je alifatický nebo alicyklický uhlovodík s 5 až 12 atomy uhlíku. Oxidace cyklohexanu a lineárních uhlovodíků je demonstrována v příkladové části.

iv) Organickou sloučeninou je halogenovaný alifatický nebo alicyklický uhlovodík. Oxidace tohoto typu organické sloučeniny je v popisné části demonstrována na oxidaci lindanu (hexachlorocyklohexanu).

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje třírozměrnou strukturu aktivního místa cytochromu P-450_cam a přilehlých aminokyselin;

Obr. 2 znázorňuje plynový chromatograf difenylmethanu (A) a hydroxylovaného produktu připraveného následnou inkubací s Y96A mutantem cytochromu P-450_cam .

Příklady provedení vynálezu

Na základě výše zmíněných úvah se připravily mutantní proteiny, které obsahovaly alanin, lysin, valin nebo fenylalanin namísto tyrosinu v poloze 96 (Y96). Dále se připravily mutanty, ve kterých se náhrada aktivních míst zkombinovala s povrchovou mutací cysteinu v poloze 334 na alanin, konečně se několik mutací aktivního místa zkombinovalo s povrchovou mutací v jediném proteinu, čímž se vytvořil násobný mutantní enzym. Geny opatřené kódem cytochrom P-450_cam a jejich přirození partneři elektronového přenosu, puridaredoxin a putidaredoxinreduktáza, se znásobily z celobuněčné DNA P.Putidy pomocí polymerní řetězové reakce (PCR). Použitými kombinacemi expresivního vektoru a E.coli hostitele byli pRH 1091 (J.E. Baldwin, J.M. Blackburn, R.J. Head a J.D. Sutherland, Bioorg, Med. Chem. Letts. 1992, 2, 663-668) v kmenu JM109 pro cytochrom P-450_cam, pUC 118 v kmenu JM109 pro puridaredoxin a pGLWll v kmenu DH5°C pro putidaredoxinreduktázu. Specifická mutageneze oligonukleotidů a cíleného místa se prováděla za použití M13mpl9 subklonu Zoller-Smithovou (M.J. Zoller a M. Smith, Nucleic Acids Res., 1982, 10, 6 487) metodou a mutantní selekce se prováděla Kunkelovou metodou (T.A. Kunkel, Proč. Nati. Acad. Sci., 1985, 82, 488-492) .

Ukázalo se, že mutant Y96A katalyzuje hydroxylaci kafru (1) , ačkoliv v porovnání se standardním typem enzymu je tato reakce méně selektivní, podobně jako v literatuře popsaného případu mutantu Y96F (C. Di Primou, G. Hui Bin Hoaem, P. Douzou a S. Sligarem, J. Biol. Chem., 1990, 265, 5 361-5 363). K tomuto snížení selektivity může přispívat ztráta vodíkové vazby mezi Y96 a kafrem. Vlastnosti standardního typu proteinu a mutantního proteinu Y96A byly dále zjišťovány za použití celé řady testů, zjišťujících vazebnost a aktivitu.

Vazebnost potencionálních substrátů se zjišťovala spektroskopickými metodami. Enzym standardních typů se v nepřítomnosti substrátu nacházel v 6-koordinovaném, nízkospinové formě se slabou vazbou k vodě, obsazujícím šesté koordinační místo, tento enzym vykazuje charakteristické Sorétové maximum při 391 nm. Vazebnost substrátových analogů, adamantanonu (2), adamantanu (3) a norbornanu (4) rovněž zcela konvertují hem na vysokospinovou formu. Avšak difenylmethan (5) absorbční spektrum neposouvá.

I když mutant Y96A poskytuje stejné výsledky pro sloučeniny (3) a (4), nebyl zcela konvertován do vysokospinové formy ani v případě, že se (1) a (2) přidaly v přebytku. Nicméně nejzajímavější je, že na rozdíl od standardního typu, vykazuje mutant Y96A částečnou konverzi na hem na vysokorychlostní formu s difenylmethanem, což naznačuje vaznost této sloučeniny na mutantní protein.

Jak se dalo očekávat, disociační konstanty (K_app) kafru a adamantanonu se v mutantu Y96A zvýšily. Na druhé straně se K_app hodnoty hydrofobních substrátů adamantanu a norbornanu snížily, což naznačuje, že se enzymová kapsa stala selektivnější pro hydrofobní substráty. Největší změny ve vaznosti se dosáhlo u difenylmethanu (5), který se na standardní typ proteinu vázal pouze slabě, ale k mutantu Y96A vykazoval v podstatě vyšší afinitu.

Roztok obsahující 10 μΜ putidaredoxinu, 2 μΜ putidaredoxinureduktázy, 1 μΜ cytochromové P-450_cam monooxygenázy (standardní typ nebo mutant) a 1 mM difenylmethanu ve 100 mM KC1, 20 mM KH₂PO₄, pH 7,4 se předinkuboval při teplotě 25°C 5 minut v třepačce. Enzymatická reakce se iniciovala nejprve přidáním NADH do dosažení celkové koncentrace 2 mM. Další 4 alikvótní podíly NADH (zvýšení koncentrace NADH vždy o 1 mM) se přidávaly v 5 minutových intervalech a reakční směs se dalších 30 minut proplachovala přidáním 0,5 ml chloroformu. Chloroformová vrstva se analyzovala plynovou chromatografii.

Organické extrakty surové inkubační směsi se analyzovaly plynovou chromatografii. Tato chromatografie určila pouze jeden hlavní nový pík (viz obr. 2), který měl stejnou retenční dobu jako autentický vzorek para-hydroxydifenylmethanu (6). Další aromatické hydroxylační produkty, orto- a metaisomery, měly různé retenční doby. Identita produktu, majícího strukturu (6) se rovněž potvrdila pomocí hmotnostní spektrometrie, která poskytla správný hmotnostní pík při 184. Pomocí výše uvedených experimentálních technik se určilo značné množství organických sloučenin, které mohou představovat substráty, jak pro enzym standardního typu cytochromu P-450_cain, tak pro jeho mutantní verzi Y96A. Další práce zahrnovaly mutanty označené Y96V; Y96L; Y96F; C334A; kombinovaný mutant F87A, Y96G, F193A a zkombinované aktivní místo a povrchové mutanty Y96A, C334A; Y96B, C334A; Y96L, C334A; Y96F, C334A; F87A, Y96G, F193A, C334A.

Výsledky pro mutant Y96A jsou uvedeny v tabulce 2, ve které jsou seskupeny strukturně související molekuly. Ty substráty, ve kterých byla oxidace demonstrována NADH přeměnou, jsou označeny znaménkem +.

Spin vysoký/nízký: počet ukazuje procenta cytochromu P-450_cam (OD417 0,2 - 0,4) převedené z nízkospinového rovnovážného stavu do vysokospinového rovnovážného stavu v přítomnosti 200 μΜ testované sloučeniny a ve fosfátovém pufru (400 mM fosfátu, 68 mM draslíku, pH 7,4). Spinový rovnovážný stav se stanovil pomocí UV/vis spektrofotometru: nízký spin při OD₄i₇ a vysoký spin při OD392 (nd znamená neprováděno) .

Vs DTT: ukazuje procentickou náhradu DTT (200 mM) vázané na cytochrom P-450_cam v porovnání s testovanými sloučeninami (200 mM) ve fosfátovém pufru. Výsledkem DTT vazby na cytochrom P-450_cam jsou absorbační píky při OD374 a OD₄₆i, takže toto procentické nahrazení se mohlo měřit pomocí UV/vis spektrofotometru.

Tabulky 2a až 2h uvádějí údaje pro příklady všech tří sloučenin definovaných v bodech i) až iv).

se chromatografie

Reakční produkty některých substrátových sloučenin čistily pomocí vysokovýkonné kapalinové a identifikovaly podle hmotnostní spektroskopie, nukleární magnetické rezonance a/nebo koeluce. Tabulka 3 uvádí spotřebu NADH při oxidaci malých lineárních větvených a cyklických uhlovodíků mutantem Y96A, C334A. Tabulky 4a až 4h uvádějí distribuci produktu při zkombinování mutantu a substrátu.

Schéma 1

WT Y96A

Tabulka 1

Kapp(pM)^a

^a Hodnoty jsou průměrem dvou nezávislých měření prováděných Sligarovou metodou (S.G.Sligar Biochemistry 1976, 15, 5 399 až 5 406) . Hodnota Kapp je silně závislá na koncentraci K⁺ v pufru. Při [K⁺] >150 mM má Kapp pro kafr hodnotu 0,6 μΜ jak pro standardní typ, tak pro mutant Y96A. Výsledky v této tabulce se získaly při [K⁺]=70 mM ve fosfátovém pufru, pH 7,4 aby se zabránilo vysolování substrátů při vyšších iontových koncentracích.

^bNasycení se nedosáhlo.

(S)- (+)-uhlík

-naftalen

-ethylanthrachinon

O

Tabulka 3

Přeměna malých alkenů pomocí mutantu P-450_cam

Všechny níže uvedené mutanty rovněž obsahují mutaci C334A.

Míra přeměny se měřila jako spotřeba NADH (nmol NADH/ nmol P-450_cam/s) .

Alkanový substrát:	Standardní typ	Y96A
Délka hlavního řetězce	Název
C4	n-butan	-	-
C4	2-methylbutan	pozadí	4,6
C4	2,3-dimethylbutan	pozadí	16, 8
C4	2,2-dimethylbutan	pozadí	14,0
C5	n-pentan	pozadí	5,8
C5	2-methylpentan	3,8	11,7
C5	3-methylpentan	1,3	14,2
C5	2,4-dimethylpentan	0,2	12, 6
C5	2,2-dimethylpentan	5,2	12,8
C5	2,2,4-trimethylpentan	0,9	5,3
C5	3-ethylpentan	pozadí	16,2
C6	n-hexan	pozadí	6, 0
C6	2-methylhexan	pozadí	10, 6
C7	n-heptan	2,7	4,4
C7	2-methylheptan	pozadí	2,1
C7	4-methylheptan	1,4	10,2
C8	n-oktan	pozadí	5,8
C7	Cykloheptan	4,4	42,5

Struktury a distribuce produktů následující oxidace substrátu s P-450_cam mutanty s aktivními místy.

„Pozadí - typickým pozadím NADH oxidace je 0,07 nmolu NADH (nmol P-450_Cam)^_1 s^_1.

chemicky nejreaktivnější poloha

Ω

KJ }T

H

O

ÍT ro

N

KJ

H tr ro

N ro ro o

(D'

TJ

H

O

ÍL ť

ř-r rt

KJ ro rt ro ro

Struktura a distribuce produktů oxidace následujících substrátů p-450_can mutanty s aktivními místy. Všechny níže uvedené mutanty rovněž obsahují C334A mutaci.

chemicky reaktivní polohy

	φ
	kí
	H
Ή	0
K	kj
0	tf
ÍL	H
ť	0
tf	tf
rt	Φ

N

Φ <J (lh dP

H &

tf rt kj

O o

re ω

ΟΊ

-j en <_n

Kj

VO

CT>

>

(t

P>

rt kj

Tabulka 4(b)

Ό κ

ο g· ί

2J

Η <£>

<£>

σ>

*1

VD σ>

tr<

κ;

ιο σ>

<

	<D	00
<£>	CTi	^4
ω	O	>

Naftalenové (%) produkty pro mutanty

4hydroxylované produkty

Fenanthrenové (%) produkty pro mutanty

Fluoranthen

o

CD

I—· pr (D

Ό h

o

Ch c

?r r+

O

33

C I rt 4^ fu cn o

rt £ ro

Q b

o x

H' O < pj 3 O' Ό

O sa £

rt

Ό i—* o

o cr cu i-* o

to

O co

I—> 00

ΟΊ kJ kD σ>

>

Hí kD cn κί kD cn t-<

kD cn <

Fluoranthenové (%) produkty pro mutanty <1

I

U.

h o

x ·<

R

O <

Θ'

Ό

K

O

CL £

ŽT rt

Ό »Ú

K

O K Pu Φ C 3 řť o rt <

SJ t-3

Hj kD cn >

k!

<d cn

Hj kD cn r<

Kj kD cn <

tú	*ú	tú
R	kD	00
kD	cn	<1
ω	0

> I I

1-3 &

a

H *“ GJ p) o (%) produkty pro mutanty

(%) produkty pro mu tan ty

Tabulka 4(h)

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mutant monooxygenázového cytochromu P-450_cam, v yznačený tím, že se tyrosinový zbytek v poloze 96 a/nebo cysteinový zbytek v poloze 334 nahradí zbytkem libovolné aminokyseliny s výjimkou fenylalaninu.
2. 2. Mutant monooxygenázového cytochromu P-450_cam, v yznačený tím, že se tyrosinový zbytek v poloze 96 a/nebo cysteinový zbytek v poloze 334 nahradí jiným aminokyselinovým zbytkem, přičemž tento mutant má schopnost katalyzovat oxidaci libovolné z následujících sloučenin zahrnujících: polycyklické aromatické uhlovodíky, lineární nebo větvené alkany, bifenylové a bifenylové sloučeniny zahrnující halogenované varianty těchto sloučenin a halogenované uhlovodíky.
3. 3. Mutant podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že se aminokyselina zvolí z následujících aminokyselin: alanin, arginin, asparagin, kyselina asparágová, cystein, kyselina glutamová, glutamin, glycin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, prolin, serin, threonin, tryptofan, tyrosin a valin s tou výjimkou, že v případě tyrosinového zbytku v poloze 96 se nepoužije pro mutaci tyrosin a v případě cysteinového zbytku v poloze 334 nebude použitou aminokyselinou cystein.
4. 4. Mutant podle některého z nároků laž3, vyznačený tím, že se aminokyselinový zbytek v jedné nebo několika polohách zahrnujících polohy 87, 98, 185,

   244, 247, 295 a 297 nahradí jiným aminokyselinovým zbytkem.
5. 5. Způsob oxidace sloučeniny zvolené ze skupiny zahrnující polycyklické aromatické uhlovodíky, lineární nebo větvené alkany, difenylové a bifenylové sloučeniny zahrnující halogenované varianty těchto sloučenin a halogenované uhlovodíky, vyznačený tím, že zahrnuje uvedení zvolené sloučeniny za oxidačních podmínek do kontaktu s monooxigenázovým cytochromem P-450_cam, ve kterém je tyrosinový zbytek v poloze 96 a/nebo cysteinový zbytek v poloze 334 nahrazený jiným aminokyselinovým zbytkem.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že se aminokyselina zvolí z následujících aminokyselin: alanin, arginin, asparagin, kyselina asparágová, cystein, kyselina glutamová, glutamin, glycin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, prolin, serin, threonin, tryptofan, tyrosin a valin s tou výjimkou, že v případě tyrosinového zbytku v poloze 96 se nepoužije pro mutaci tyrosin a v případě cysteinového zbytku v poloze 334 nebude použitou aminokyselinou cystein.
7. 7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačený tím, že se aminokyselinový zbytek v jedné nebo několika polohách zahrnujících polohy 87, 98, 185, 244, 247, 295 a 297 nahradí jiným aminokyselinovým zbytkem.
8. 8. Mutant monooxigenázového cytochromu P-450_camz vpodstatě jak je zde popsáno, s odkazy na doprovodné obrázky a/nebo příklady.
9. 9. Způsob oxidace sloučeniny zvolené ze skupiny zahrnující polycyklické aromatické uhlovodíky, lineární nebo větvené alkany, bifenylové a bifenylové sloučeniny zahrnující halogenované varianty těchto sloučenin a halogenované uhlovodíky, v podstatě jak je zde popsáno, s odkazy na doprovodné obrázky a/nebo příklady.