CZ108095A3

CZ108095A3 - Method of determining sialic acid bonded in lipids, blood plasma or serum and diagnostic set for making the same

Info

Publication number: CZ108095A3
Application number: CZ951080A
Authority: CZ
Inventors: Nonda Dr Katopodis
Original assignee: Anco Medics International Inc
Priority date: 1995-04-26
Filing date: 1995-04-26
Publication date: 1996-11-13

Abstract

Způsob zahrnuje následující simultánně prováděné stupně se vzorkem a se standardem tvořeným běžně komerčně dostupnou n-acetylneuraminovou kyselinou (NANA): zředění pufrem, míchání zředěného vzorku, přidání směsi chlorovaného nižšího alkyluhlovodíku a nižšího alkylalkoholu, zpracován! mícháním a odstreďováníra za vzniku v podstatě ' čisté horní fáze, zpracování horní fáze barvofvomým činiď- ' ' ' lem, míchání, var směsi; chlazení směsi a stanovení množství lipidově vázané sialové kyseliny přítomné ve vzorku porovnáváním optické hustoty vzorku s optickou hustotou (NANA). Diagnostická souprava obsahuje zásobník se směsí chlorovaného nižšího alkyluhlovodíku a nižšího alkylalkoholu, zásobník barvotvomého činidla, zásobník roztoku pufru, zásobník kyseliny n-acetylneuraminové o známé koncentraci a instruktážní návod.The method includes the following simultaneous steps with a sample and with a standard made commercially available n-acetylneuraminic acid (NANA): dilution buffer, mixing the diluted sample, adding the chlorinated mixture lower alkyl hydrocarbon and lower alkyl alcohol treated! agitation and centrifugation to form substantially 'pure top phase, processing the upper phase with a coloring agent '' hem, mixing, boiling mixture; cooling the mixture and determining the amount of lipid-bound sialic acid present in sample by comparing the optical density of the sample to the optical density (NANA). The diagnostic kit contains a tray with a mixture of chlorinated lower alkyl hydrocarbon and lower of an alkyl alcohol, a color former, a reservoir buffer solution, n-acetylneuraminic acid reservoir known concentration and instruction manual.

Description

Způsob stanovení lipidově vázané sialové kyseliny v plazmě nebo séru a diagnostická souprava.Method for determining lipid-bound sialic acid in plasma or serum and a diagnostic kit.

Oblast techniky fTechnical field f

• Vynález se týká způsobu stanovení lipidově vázané sialové kyseliny v plazmě nebo séru, který je méně nákladný, , méně náročný na spotřebu času, přičemž dosahovanéné výsledky při tomto stanovení s různými vzorky se méně navzájem liší a dále je tento postup méně závislý na zručnosti a zkušenosti osoby provádějící toto stanovení. Kromě toho se tento vynález týká testovací diagnostické soupravy na stanovení nádorů, která obsahuje jedinečný standard, pomocí které je možno dosáhnout lepší reprodukovatelnosti výsledků testu a jejich konzistenci při provádění tohoto testu na celém světě.The invention relates to a method for determining lipid-bound sialic acid in plasma or serum which is less expensive, less time consuming, and the results obtained in this assay with different samples are less different from each other, and the process is less dependent on skill and the experience of the person making the determination. In addition, the present invention relates to a tumor diagnostic test kit that includes a unique standard by which the reproducibility of test results and their consistency in the performance of the test can be achieved worldwide.

**

Dosavadní stav techniky „ , ......Při výzkumech v této oblasti bylý provedeny značné’ rozsáhlé práce, přičemž bylo zjištěno, že zvýšená úroveň obsahu kyseliny sialové v krevním séru u pacientů naznačuje na přítomnost rakoviny. V tomto směru je možno uvést například patent Spojených států amerických č. 4 146 603, autor Davidson a kol., ve kterém se uvádí a nárokuje značně komplikovaný postup sériové prováděných operací, ze kterého se odvozuje, že zvýšený obsah kyseliny sialové je určujícím faktorem pokud se týče specifických stanovení přítomnosti rakovinového nádoru.BACKGROUND OF THE INVENTION Considerable research has been done in this field, and it has been found that an increased level of sialic acid in the blood serum of patients indicates the presence of cancer. For example, U.S. Pat. No. 4,146,603 to Davidson et al. Discloses and claims a rather complicated series of operations, which suggests that increased sialic acid content is a determining factor when refers to specific assays for the presence of a cancerous tumor.

V publikaci MacBeth a Bekesi, Cancer Res.MacBeth and Bekesi, Cancer Res.

22; 1170-1176 (1962) se uvádí, že byly zjišťovány glykoproteiny v plazmě, přičemž bylo podle této publikace zjíšrěno, že u případů, rakoviny prsu bez metastáz byl nalezen podíl galaktozy a manozy. V publikaci Kloppel a kol.. Proč. Nati. Acad. Sc. 94-3011-3013 (1977) se uvádí 2,5-násobné zvýšení obsahu glykolipidů síalové kyseliny v séru myší s transplantovatelnými carcinomy prsu a 2-násobné zvýšení těchto glykolipidů sialové kyseliny u lidí s rakovinou. V publikaci Kloppel a kol., Am. J. Vet. Pes. 39:1377-Ϊ3 80 (1978) se rovněž uvádí “zvýšení' obsahu' kyseliny sialové u 93 % ze 24 psů. Podle publikace Lengle,22; 1170-1176 (1962) discloses that plasma glycoproteins were detected and found that galactose and mannose were found to be found in non-metastatic breast cancer cases. In Kloppel et al., Proc. Nati. Acad. Sc. 94-3011-3013 (1977) reported a 2.5-fold increase in the content of sialic acid glycolipids in the serum of mice transplanted with breast carcinomas and a 2-fold increase in these sialic acid glycolipids in cancer patients. Kloppel et al., Am. J. Vet. Dog. 39: 1377-Ϊ380 (1978) also reported an "increase in" sialic acid content in 93% of 24 dogs. According to Lengle,

J. Nat. Cancer inst. 02:1565-1567 bylo zjištěno zvýšení lipidově vázané sialové kyseliny a tymických lymfocytů u myší s leukémií AKR/J v jejich plazmě. Zvýšené hladiny lipidově vázané kyseliny sialové byly zjištěny v plazmě a erythrocytech u lidí trpících, melanomy, viz, Portouklian a kol., Plochém. Biophys.. Res. Commun. 85_: 916-920 (1978). Po chromatografickém oddělení a vyčištění v kolonách následovalo vyhodnocení na chromatografických platech.J. Nat. Cancer inst. 02: 1565-1567 was found to increase lipid-bound sialic acid and thymic lymphocytes in AKR / J leukemia mice in their plasma. Elevated levels of lipid-bound sialic acid have been found in plasma and erythrocytes in humans suffering from melanomas, see, Portouklian et al., Flat. Biophys. Res. Commun. 85: 916-920 (1978). Chromatographic separation and column purification were followed by evaluation on chromatographic plates.

V publikaci„Silver a kol., Cancer 41 .·1497-1499 (1978);In Silver et al., Cancer 41, 1497-1499 (1978);

Cancer-Res -:--39:5036 - 5042 (1979)·* se-«uvádá.- zvýšené hodnoty ^..sialové kyseliny, v séru.u pacientů trpících melanomem, které značně souvisí s nádorovým onemocněním. Ovšem 36 % pacientů s pozorovatelnými tumory nevykazovaly zvýšenou úroveň síalové kyseliny v séru. V publikaci Hogan-Ryan a kol., Br. J. Cancer 41 .· 587- 592 (1980) se uvádí, že celkově nalezené _ zvýšení hladÁny kyseliny sialové vázané v séru u pacientů trpících rakovinou prsu odpovídá stádiu tumoru.Cancer Res: 39: 5036-5042 (1979) reports elevated sialic acid levels in serum in patients with melanoma that are highly related to cancer. However, 36% of patients with observable tumors did not show elevated serum sulfuric acid. Hogan-Ryan et al., Br. J. Cancer 41: 587-592 (1980) reported that the overall increase in serum-bound sialic acid levels found in breast cancer patients corresponds to the tumor stage.

Jedna z metod, vůči které projevuje postup podle uvedeného vynálezu zlepšení, je popsána v publikaci American Association for Cancer Research Annual Meeting Proceedings Vol. 21, March 1980, jako Abstract No. 728, autor Katopodis a kol. Při této metodě se 100 μΐ vzorek plazmy (zmenšený na objem 50 μΐ) podrobí extrakci za pomoci 6 mililitrů směsi chloroformu a methanolu (objemový poměr 2:1). Získaný lipidový extrakt se potom rozdělí za pomoci vody v množství 0,2 svého objemu. Vodná fáze se potom odpaří do sucha a vzniklý zbytek se opětně rozpustí ve vodě. Lipidově vázaná sialová kyseliny se potom vyčistí vysrážením za pomoci systému trichloroctová kyselina-fosforečnanovolfrámová kyselina a po odstranění kapaliny nad usazeninou od výsledné sraženiny se tato sraženina vyhodnotí metodou podle Svennerholma a Mi~ettiena [vizHSveňnérhotm^ Quantitative —Estimatioir of Sialic Acid, Biochem. Biophys, Acta. .24, str; 604-611 (1957)].One of the methods to which the process of the present invention shows improvement is described in American Association for Cancer Research Annual Meeting Proceedings Vol. 21, March 1980; 728 by Katopodis et al. In this method, a 100 μΐ sample (reduced to 50 μΐ) is subjected to extraction with 6 ml of a mixture of chloroform and methanol (volume ratio 2: 1). The lipid extract obtained is then separated with water in an amount of 0.2 of its volume. The aqueous phase is then evaporated to dryness and the residue is redissolved in water. The lipid-bound sialic acid is then purified by trichloroacetic acid-phosphate-tungstic acid precipitation and, after removal of the supernatant from the resulting precipitate, this precipitate is evaluated by the method of Svennerholm and Miethieten (see External Quantities, Estimatioir of Sialic Acid). Biophys Acta. .24, p. 604-611 (1957)].

Další metodou, vůči které vykazuje postup podle uvedeného vynálezu zlepšení, je postup uvedený v patentu Spojených států amerických č. 4 342 567, autor Katopodis a Stock, publikovaný 3. srpna 1982. Tato metoda je podobná jako je výše uvedený postup, ovšem vyžaduje pouze asi 50 μΐ vzorek místo 100 mililitrového vzorku, který je nutno použít podle předchozího dosavadního stavu techniky. Stupeň sušení., je‘tomto případě eliminován a při tomto-postupu se rovněž- % nepoužívá kyselina trichloroctová. Kyselina fosforečnanovolframová se používá samotná.Another method against which the process of the present invention is improved is that disclosed in U.S. Pat. No. 4,342,567 to Katopodis and Stock, published Aug. 3, 1982. This method is similar to the above process but requires only about 50 μΐ sample instead of the 100 milliliters sample to be used according to the prior art. The drying step is eliminated in this case and trichloroacetic acid is also not used in this process. Phosphoric acid is used alone.

Tato výše uvedená metoda ovšem vykazuje celou řadu nevýhod, včetně následujících nedostatků :However, this method has a number of disadvantages, including the following:

- potřeba přesného určení 44,7 μΐ výchozího vzorku,- the need for an accurate determination of 44,7 μΐ of the initial sample,

- lipidově vázaná sialová kyselina se ztrácí během provádění inverzního stupně v trubici, což vede ke zmenšeným konečným hodnotám, vysrážení lipidově vázané sialové kyseliny pomoci kyseliny fosforečnanovolfrámové není úplné, což představuje zejména problém při práci se vzorky, ve kterých množství této lipidově vázané sialové kyseliny převyšuje normální hodnoty pouze o malá množství (což je například v případech, kdy se rakovina vyvíjí), rychlost provádění tohoto testu je omezena nutností čekacího intervalu 5 minut po přídavku fosforečnanowolframové kyseliny, a- the lipid-bound sialic acid is lost during the inversion step in the tube, resulting in reduced endpoints, the precipitation of the lipid-bound sialic acid by phosphate tungstic acid is incomplete, which is particularly a problem when working with samples in which the amount of this lipid-bound sialic acid exceeds normal values by only small amounts (such as in cases where cancer develops), the speed of this test is limited by the need for a waiting period of 5 minutes after the addition of phosphotungstic acid, and

- náklady na provádění tohoto testu nejsou tak nízké jak by bylo potřebné.- the cost of carrying out this test is not as low as would be necessary.

Další metodou, vůči které postup podle vynálezu vykazuje zlepšení je postup uváděný v patentu Spojených států amerických č. 4 748 128, autor Katopodis, který byl publikován 31. května 1988. Podstata tohoto postupu spočívá v provedení následujících stupňů :Another method against which the process of the present invention shows improvement is the process disclosed in U.S. Pat. No. 4,748,128 to Katopodis, published May 31, 1988. The essence of this process is to perform the following steps:

(a) zředění předem stanoveného objemu krevní plazmy nebo séra destilovanou vodou na objem asi čtyřnásobný než je tento předem stanovený objem, (b) míchání tohoto zředěného vzorku po vhodný časový interval za účelem.získání v podstatě, homogenního vzorku, (e) chlazení tohoto promíchaného-,— zředěného .vzorku., na teplotu asi 0 až asi 5 ’C, (d) přidání směsi chlorovaného nižšího alky1uhlovodíku a nižšího alkylalkoholu k tomuto ochlazenému vzorku, přičemž objem této přidávané směsi je asi šedesátkrát větší než je uvedený předem stanovený objem vzorku krevní plazmy nebo :séra.—a--obj.emo.v.y._.p.oměr_.chlorovaného uhlovodíku k alkoholu v této směsi je asi 2:1a teplota této směsi je asi 0 °C až asi 5 ’C, (e) promíchávání této směsi po vhodnou dobu za účelem rozpuštění látky přítomné v tomto vzorku ve směsi chlorovaný uhlovodík/alkohol, (f) zředění této směsi' deionizovanou destilovanou vodou při teplotě v rozmezí od asi 0 ’C do asi 5 ⁴C, přičemž přidávaný objem je asi desetkrát véxší než je předem sxanoyený objem vzorku krevní plazmy nebo séra, (g) zpracovávání xéxo zředěné směsi po vhodný časový inxerval k umožnění vzniku v podsxaxě čiré horní fáze, (h) oddělení z xakxo vzniklé čiré horní fáze předem sxanoveného objemu horní fáze, (i) přidání podílu směsi proteinového srážecí činidlo (neboli činidla na vysrážení proxeinu) a adsorpčního maxeriálu k tomuxo předem stanovenému objemu horní fáze, přičemž tento podíl směsi je dostatečně účinný k provedení 'vysrážení^lipidově vázáné' sialové“kyseliny a *(a) diluting a predetermined volume of blood plasma or serum with distilled water to a volume about four times that of the predetermined volume; (b) mixing the diluted sample for a suitable period of time to obtain a substantially homogeneous sample; and (d) adding a mixture of chlorinated lower alkyl hydrocarbon and lower alkyl alcohol to the cooled sample, the volume of the added mixture being about sixty times greater than the predetermined volume. a blood plasma sample or serum and a volume ratio of chlorinated hydrocarbon to alcohol in the mixture is about 2: 1 and the temperature of the mixture is about 0 ° C to about 5 ° C, (e) mixing the mixture for a suitable time to dissolve the substance present in the sample in a chlorinated hydrocarbon / alcohol mixture; (f) diluting the mixture with deionized distilled water. Dou at a temperature ranging from about 0 ° C to about 5 ⁴ C, the addition volume is about ten times véxší than a predetermined sxanoyený sample volume of blood plasma or serum, (g) processing xéxo diluted mixture for a suitable period inxerval to allow the formation of podsxaxě (h) separating from a clear upper phase a predetermined volume of the upper phase, (i) adding a proportion of a mixture of protein clotting agent (or proxein precipitating agent) and adsorption maxerial to a predetermined volume of the upper phase, of the mixture is sufficiently effective to effect the precipitation of the lipid-bound sialic acid and

k adsorbování' této vysrážené lipidově vázané sialové kyseliny, (j) promíchání této výsledné směsi, (k) oddělení výsledné adsorbované sraženiny, . (1) suspendování této sraženiny ve vhodném objemu destilované vody, a (m) přidání objemového podílu resorcinolového reakčního činidla k této suspendované sraženině, míchání této směsi, var této směsi po dobu 15 minut, chlazení po dobu 10 minut na ledové lázni, odstřeďo.vání, přidání směsi butylacetátu a n-butanolu (v objemovém poměru 85 : 15) v-objemu asi .dvojnásobném- než je objemresorcinolového reakčního činidla, míchání, odstřeďování, oddělení organické vrstvy, zjištění hodnoty modrého zabarvení extraktu přítomného v organické vrstvě při 580 nm a stanovení množství lipidově vázané sialové kyseliny porovnáním hodnoty optické hustoty při 580 nm se standardní křivkou zkonstruovanou za použití známého vzorku n-acetylneuraminové kyseliny (NANA) za stejných podmínek a použitím vzorce : . .to adsorb the precipitated lipid bound sialic acid, (j) mixing the resulting mixture, (k) separating the resulting adsorbed precipitate,. (1) suspending the precipitate in a suitable volume of distilled water, and (m) adding a volume of resorcinol reagent to the suspended precipitate, stirring the mixture, boiling the mixture for 15 minutes, cooling for 10 minutes in an ice bath, centrifuge. Addition of a mixture of butyl acetate and n-butanol (85: 15 by volume) in about twice the volume of the resorcinol reagent, stirring, centrifuging, separating the organic layer, determining the blue color value of the extract present in the organic layer at 580 nm. and determining the amount of lipid bound sialic acid by comparing the optical density at 580 nm with a standard curve constructed using a known n-acetylneuraminic acid (NANA) sample under the same conditions and using the formula:. .

• ,¾ ··<•, ¾ ·· <

LSA (mg/100 ml plazmy) = (x . 10^ gl) / y . z gl . 1000) kde :LSA (mg / 100 ml plasma) = (x, 10 µg) / y. z gl. 1000) where:

x, je odečet hodnoty NANA ze standardní křivky, v znamená objem oddělené horní fáze dělené celkovým objemem celé horní fáze, a z je předem stanovený objem vzorku krevní plazmy nebo séra.x is the NANA reading from the standard curve, v is the volume of the separated upper phase divided by the total volume of the entire upper phase, and z is a predetermined volume of the blood plasma or serum sample.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Uvedený vynález poskytuje zlepšenou metodu stanovení množství lipidově vázané kyseliny sialové přítomné ve vzorku plazmy nebo séra. Postup podle uvedeného vynálezu je jednodušší, ekonomičtější, je možno jej provést rychleji, je snadněji automatizovatelný a vzhledem ke své čistotě je vhodný pro přípravu monoklonálních protilátek. Postup podle uvedeného vynálezu vyžaduje použití méně chemických látek a oproti postupům podle dosavadního stavu techniky má přednost ve specifitě a citlivosti. Postup podle uvedeného vynálezu se odlišuje značně od postupů podle dosavadního stavu techniky -v -tom,. -že-při = provádění /tohoto ..postupu - podle vynálezu není zapotřebí používat proteinového srážecího činidla a rovněž je při tomto postupu eliminována nutnost použití speciálního standardu. Podle uvedeného vynálezu se používá hodnoty optické hustoty standardní komerčně dostupné n-acetylneuraminové kyseliny (NANA), čímž se eliminuje rpotreba^-konstruqy_at_.siand.ardní křivku. Tímto způsobem, je_ možno dosáhnout lepší reprodukovatelnosti výsledků v různých laboratořích a dále to umožňuje použivateli rychlejší a přesnější stanovení úrovně kyseliny sialové ve vzorku.The present invention provides an improved method for determining the amount of lipid-bound sialic acid present in a plasma or serum sample. The process of the invention is simpler, more economical, faster to perform, easier to automate and, due to its purity, suitable for the preparation of monoclonal antibodies. The process of the present invention requires the use of fewer chemicals and has priority over specificity and sensitivity over prior art processes. The process of the present invention differs considerably from the prior art. According to the invention, it is not necessary to use a protein clotting agent and also eliminates the need for a special standard in this process. The optical density values of standard commercially available n-acetylneuraminic acid (NANA) are used, thus eliminating the need for a constructional standard curve. In this way, better reproducibility of the results in different laboratories can be achieved and further allows the user to determine the level of sialic acid in the sample faster and more accurately.

Při provádění postupů podle dosavadního stavu techniky je nutno použít proteinové srážecí činidlo (neboli činidlo na vysrážení proteinů), jako je například kyselina fosforečnanowolfrámová, a adsorbční materiál k tomu, aby došlo k vysrážen! lipidové vázané sialové kyseliny. Při provádění postupu podle uvedeného vynálezu není nutno použít tohoto stupně, neboť bylo zjištěno, že toto provedení není nezbytné v případech, kdy poměr chlorovaného uhlovodíku k alkoholu je přibližně 1 : 1 v tlumícím roztoku.In the prior art, a protein precipitant (or protein precipitant), such as phosphotungstic acid, and adsorbent material must be used to precipitate. lipid bound sialic acids. It is not necessary to use this step in carrying out the process of the present invention since it has been found to be unnecessary in cases where the ratio of chlorinated hydrocarbon to alcohol is approximately 1: 1 in buffer.

Pro postup podle uvedeného vynálezu je významná ta skutečnost, že umožňuje provedení dokonalejšího postupu stanovení koncentrace lipidové vázané sialové kyseliny ve vzorku lidské krevní plazmy nebo séra porovnáním -tohoto vzorku se standardem představujícím n-acetylneuraminovou kyselinu (NANA) v běžně komerčně dostupné formě místo krevní plazmy odebrané od lidí nebo krevní plazmy od zvířat. Tato · _tběžně komerčně dostupná n-acetylneuraminová kyselina (NANA){£ je výhodná z toho důvodu, že je ihned k dispozici, je mimořádně stabilní a má dlouhou skladovací životnost. Při použití tohoto řešení podle vynálezu je rovněž eliminovánaOf importance to the process of the present invention is the fact that it allows for an improved procedure for determining the concentration of lipid-bound sialic acid in a human blood plasma or serum sample by comparing it to a standard representative of n-acetylneuraminic acid (NANA) in commercially available form instead of blood plasma. taken from humans or blood plasma from animals. · _T The commercially available N-acetylneuraminic acid (NANA) {£ it is advantageous because it is readily available, is extremely stable and has a long shelf life. Using this solution according to the invention is also eliminated

nutnost konstruování standardní křivky pro získání ’ ' standardu, jak je tomu při testovacích postupech podle * . . · S dosavadního stavu techniky. ’Postup podle' uvedeného vynálezu^ ' má dále přednost oproti metodám podle dosavadního stavu techniky v tom, že je při jeho provádění eliminována nutnost použití činidla na srážení proteinů, což umožňuje aby LSA frakce mohla být použita ke snadné přípravě specifických monoklonálních protilátek.the need to construct a standard curve to get the standard, as in the * test procedures. . With the prior art. Furthermore, the process of the present invention has priority over prior art methods in that it eliminates the need for the use of a protein clotting agent, allowing the LSA fraction to be used to easily prepare specific monoclonal antibodies.

Nakonec je třeba uvést, že po chemické stránce postup podle uvedeného vynálezu eliminuje nutnost použití směsi butylacetátu a n-butanolu, kterou je nutno použit při provádění postupů podle dosavadního stavu techniky. Tato skutečnost znamená nejenom to, že je postup podle vynálezu lacinější, ale rovněž i to, že se předejde nutnosti pracovat s uvedenou směsí, která má nepříjemný zápach, způsobuje pálivé podráždění nosní membrány u technických pracovníků, kteří se dostanou do styku s tímto materiálem, a se kterou je všeobecně obtížná manipulace.Finally, chemically, the process of the present invention eliminates the need for a mixture of butyl acetate and n-butanol to be used in the prior art. This not only means that the process of the invention is cheaper, but also avoids the need to work with said unpleasant odor composition, causing a burning irritation of the nasal membrane of the technical personnel who come into contact with the material, and which is generally difficult to handle.

Uvedený vynález tedy poskytuje provedení postupu extrakce lipidově vázané sialové kyseliny ze vzorku lidské krevní plazmy nebo séra a stanovení množství této lipidově vázané sialové kyselině^-,’'přítomné v 'tomto' vzorku“ přičemž------podstata tohoto postupu podle uvedeného vynálezu spočívá v tom, že zahrnuje následující stupně :The present invention provides a design method for extraction lipid binding sialic acid from a sample of human blood plasma or serum and determining the amount of lipid-bound sialic acid ^-, '' present in 'the' sample 'wherein ------ essence of the process of the invention consists of the following stages:

(a) zředění předem stanoveného objemu vzorku krevní plazmy nebo séra pomocí roztoku pufru na objem asi pětkrát větší než je uvedený předem stanovený objem, (b) míchání tohoto zředěného vzorku po vhodný časový interval za. účelem získání v podstatě homogenního, vzorku, (c) přidání směsi chlorovaného nižšího alkyluhlovodíku a nižšího alkylalkoholu k uvedené směsi, přičemž objem této přidané, směsi je asi dvacetkrát větší než.je výše uvedený přčdem ^stancvsný objem vzorku, krevní plazmy nebo^séra a objemový poměr uvedeného chlorovaného uhlovodíku., k alkoholu je v této směsi přibližně 1:1, (d) míchání této výsledné směsi po vhodný časový interval za účelem rozpuštění látky přítomné v tomto vzorku ve směsi obsahující chlorovaný uhlovodík/alkohol/pufr, __f.e) odstreďování této směsi po vhodný časový interval vhodnou rychlostí k umožnění vzniku v podstatě čiré horní fáze, (f) separátní oddělení z takto získané čiré horní fáze předem stanoveného objemu horní fáze, (g) přidání barvotvorného reakčního činidla neboli barevného indikátoru k tomuto předem stanovenému objemu čiré horní fáze, (h) míchání této výsledné směsi, (i) var této směsi, (j) chlazení této směsi, (k) míchání a potom odstřeďováni této směsi, oddělení čirého roztoku nad usazeninou od vysráženého materiálu, a (l) stanovení množství lipidově vázané sialové kyseliny přítomné v této kapalině nad usazeninou a tím . množství přítomné ve vzorku krevní plazmy nebo séra.(a) diluting a predetermined volume of the blood plasma or serum sample with a buffer solution to a volume about five times greater than said predetermined volume; (b) stirring the diluted sample for a suitable period of time in. to obtain a substantially homogeneous sample, (c) adding a mixture of chlorinated lower alkyl hydrocarbon and lower alkyl alcohol to said mixture, the volume of said added mixture being about 20 times greater than the above-mentioned sample volume, blood plasma or serum; the volume ratio of said chlorinated hydrocarbon to alcohol in the mixture is approximately 1: 1; (d) stirring the resulting mixture for a suitable period of time to dissolve the substance present in the sample in a chlorinated hydrocarbon / alcohol / buffer containing mixture; centrifuging the mixture for a suitable period of time at a suitable rate to allow the formation of a substantially clear upper phase, (f) separately separating the clear upper phase thus obtained from a predetermined volume of upper phase, (g) adding a coloring reagent or color indicator to said predetermined volume. the volume of the clear upper phase, (h) m mixing the resulting mixture, (i) boiling the mixture, (j) cooling the mixture, (k) stirring and then centrifuging the mixture, separating the clear supernatant from the precipitated material, and (l) determining the amount of lipid bound sialic acid present in the mixture. of this liquid above the sediment and thereby. the amount present in the blood plasma or serum sample.

Stanovení množství^-Íipidově'*vázaně~Tiálové“ kyše líný “v tomto vzorku se provádí porovnáním optické hustoty tohoto vzorku s optickou hustotou standardu sestávajícího z komerčně dostupné NANA, která byla zpracována přesně stejným postupem a současně s testovaným vzorkem,Quantitation ^- Íipidově '* ~ Tiálové to bound "acid is provided lazy" in the sample by comparing the optical density of the sample to the optical density of a standard commercially available consisting of NANA which was treated exactly the same manner and simultaneously with the test sample,

Sf ,i iSf, i

Koncentrace lipidově vázané sialové kyseliny v tomto . jí vzorku se určí vynásobením optické hustoty tohoto vzorku < známou koncentrací standardu (v mg/100 mililitrů) a dělením tohoto výsledku optickou hustotou standardu.The concentration of lipid bound sialic acid in this. The sample is determined by multiplying the optical density of the sample by the known concentration of the standard (in mg / 100 milliliters) and dividing the result by the optical density of the standard.

,·, ·

Tento zdokonalený postup podle uvedeného vynálezu ' - - . /- ¾ poskytuje lepší reprodukovatelnost provádění testu a lepší přesnost výsledků testu v libovolné laboratoři, neboť testovaný vzorek a známý standard jsou zpracovávány přesně stejným postupem a stejnými technickými prostředky. Tímto způsobem se eliminují odlišnosti mezi výsledky testů u vzorku a u standardu, ke kterým dochází v důsledku odlišnosti použité metody nebo technických prostředků používaných při testování tohoto vzorku.This improved process of the present invention. / - ¾ provides better reproducibility of test performance and better accuracy of test results in any laboratory, as the test sample and known standard are processed in exactly the same procedure and with the same technical means. In this way, the differences between the test results for the sample and the standard that are due to the difference in the method used or the technical means used to test the sample are eliminated.

Uvedený vynález rovněž poskytuje metodu diagnostického stanovení rakoviny u lidských subjektů a dále sestavu k provádění tohoto postupu, přičemž tento postup zahrnuje stanovení množství lipidově vázané sialové kyseliny ve vzorku krevní plazmy nebo séra u daného subjektu a porovnání takto stanoveného množství s hodnotami získanými u subjektů, o kterých je známo, že trpí rakovinou.The invention also provides a method of diagnosing cancer in a human subject, and a kit for performing the method, the method comprising determining the amount of lipid-bound sialic acid in a blood plasma or serum sample in a subject and comparing the amount determined with the values obtained in subjects. known to be cancerous.

V alternativním provedení je možno tuto metodu a sestavu podle uvedeného vynálezu použít k pravidelnému stanovování množství lipidově vázané sialové kyseliny přítomné v krevní “plazmě'ňětio v ~séru~daného subjektu- a- tím - k monitorování vývoje terapie u subjektu porovnáním každého takto získaného výsledku s předtím stanoveným výsledkem u tohoto subjektu.Alternatively, the method and kit of the present invention can be used to periodically determine the amount of lipid-bound sialic acid present in the blood plasma of a subject and thereby to monitor the progress of therapy in a subject by comparing each result obtained. with the previously determined result for that subject.

Podle dalšího aspektu se uvedený vynález týká způsobu diagnostického stanovení rakoviny u lidského subjektu,, jehož podstata spočívá v tom, že se určí množství lipidově vázané., sialové kyseliny ve vzorku plazmy nebo séra daného subjektu postupem podle uvedeného vynálezu a takto zjištěné množství se porovná s množstvím, zjištěným u subjektů, o kterých je známo., že trpí rakovinou, nebo v alternativním.^provedení se takto, zjištěné množství porovná s hodnotami získanými během předchozího časového intervalu u stejného subjektu.In another aspect, the present invention relates to a method of diagnosing cancer in a human subject by determining the amount of lipid-bound sialic acid in a subject's plasma or serum sample according to the method of the invention and comparing the amount thus determined to the amount found in subjects known to be cancerous, or alternatively, the amount determined is compared to the values obtained during a previous time interval in the same subject.

Uvedený vynález rovněž poskytuje metodu monitorování vývoje rakoviny u subjektu, jehož podstata spočívá v tom, že .se_v_.p.r.ay.i.deJ.riý_ch__čas.o.vých intervalech stanovuje množství lipidově vázané sialové kyseliny u vzorku krevní plazmy nebo séra daného subjektu postupem podle vynálezu a potom se porovná množství takto stanovené s množstvím stanoveným předtím u tohoto stejného subjektu.The present invention also provides a method for monitoring the development of cancer in a subject, said method comprising determining the amount of lipid-bound sialic acid in a subject's blood plasma or serum sample at intervals according to the method of: of the invention and then comparing the amount thus determined with the amount previously determined in the same subject.

Kromě toho se uvedený vynález týká dokonalejšího provedení sestavy na diagnózu rakoviny, jejíž-podstata , , spočívá v tom, že obsahuje zásobník se směsí nižšího alkylalkoholu a chlorovaného nižšího alkyluhlovodíku, zásobník s předem zředěným resorcinolovým reakčním činidlem, zásobník NANA v běžně komerčně dostupně formě se známou koncentrací lipidově vázané sialové kyseliny a instruktážní návod umožňující uživateli této sestavy provést test a porovnat výsledek se standardem, přičemž tato sestava umožňuje provést stanovení množství lipidově vázané sialové kyseliny v daném vzorku bez odlišností mezi vzorkem aUštándárděm?^- které^- výplývaj í*ž rozdílných použitých*““ technických prostředků a postupů používaných osobami provádějícími tento test.In addition, the present invention relates to a more complete embodiment of a cancer diagnosis kit comprising: a container with a mixture of a lower alkyl alcohol and a chlorinated lower alkyl hydrocarbon; a container with a pre-diluted resorcinol reagent; a NANA container in a commercially available form; a known concentration of lipid-bound sialic acid and instructional instructions allowing the user of this kit to perform a test and compare the result to a standard, which allows the determination of the amount of lipid-bound sialic acid in a given sample without differences between the sample and the Urad? ^- which ^- arise * from the different technical means and procedures used by those performing the test.

Uvedený vynález se rovněž týká metody přípravy čisté frakce (horní fáze), která po lyofilizaci poskytuje základní materiál pro přípravu monoklonálních protilátek, neboř v tomto případě přirozené proteiny v plazmě nebo v séru nejsou zničeny extrakcí a vysrážením' fosforečnanowolfrámovou kyselinou, jak k tomu docházelo u postupů podle dosavadního stavu techniky.The present invention also relates to a method for preparing the pure fraction (upper phase) which, after lyophilization, provides the basic material for the preparation of monoclonal antibodies, since in this case the natural proteins in plasma or serum are not destroyed by extraction and precipitation with phosphotungstic acid. processes according to the prior art.

Podle uvedeného vynálezu je možno stanovit množství lipidově vázané sialové kyseliny ve vzorku lidské krevní plazmy nebo séra a takto stanovené množství potom použít jako diagnostický indikátor rakoviny. V předběžné fázi této metody podle uvedeného vynálezu se získá vzorek, který je určen k testování. Tento vzorek se obvykle získává z celého objemu krve, přičemž odebrání a zpracování tohoto vzorku se provádí za použití běžně známých metod z dosavadního stavu techniky, viz. například patent Spojených států amerických č. 4 748 128, autor Katopodis.The amount of lipid-bound sialic acid in a human blood plasma or serum sample can be determined and used as a diagnostic indicator of cancer. In the preliminary phase of the method of the invention, a sample is obtained which is to be tested. This sample is usually obtained from the whole blood volume, and the collection and processing of the sample is carried out using conventional methods known in the art. for example, U.S. Patent No. 4,748,128 to Katopodis.

Počátečním stupněm této metody podle uvedeného vynálezu je zředění předem stanoveného objemu vzorku krevní plazmy nebo séra roztokem pufru. Toto objemové zředění je asi pětinásobné vzhledem k objemu původního vzorku plazmy. Takže je možno uvést, že jestliže je objem původního vzorku plazmy nebo séra 50 gl v malé zkumavce nebo zásobníku, potom množství přidané destilované vody je asi 250 gl k získání zředěného vzorku o objemu asi 300 gl, to znamená asi Šesti násobný' ob jem než- j e ~obj era původní ho -vzorku—--------------. —The initial step of the method of the present invention is to dilute a predetermined volume of a blood plasma or serum sample with a buffer solution. This volume dilution is about five times that of the original plasma sample. Thus, if the original plasma or serum sample volume is 50 gl in a small tube or container, then the amount of distilled water added is about 250 gl to give a diluted sample of about 300 gl, i.e. about six times the volume of - is the volume of the original sample —--------------. -

Tento zředěný vzorek se potom promíchává, například rozvířením po vhodný časový interval za účelem získání v podstatě homogenního vzorku, což je například přinejmenším 5 sekund.The diluted sample is then mixed, for example by swirling for a suitable period of time to obtain a substantially homogeneous sample, for example at least 5 seconds.

Potom se k tomuto vzorku přidá směs obsahující chlorovaný nižší alkyluhlovodík a nižší alkylalkohol, ve které je objemový poměr tohoto chlorovaného uhlovodíku k alkoholu asi 1:1. Objem této přidané směsi obsahující uvedený chlorovaný uhlovodík a alkohol..je asi dvacetinásobný vzhledem k původnímu objemu, to znamená vzhledem k původnímu předem stanovenému objemu vzorky plazmy, a teplota této směsi odpovídá teplotě místnosti. Takže je možno uvést, že jestliže je původní objem vzorku 50 gl, potom objem přidávané směsi je asi 1,0 mililitr. Mezi uvedené vhodné chlorované uhlovodíky je možno zařadit chloroform, methylenchlorid a ethylenchloriď, přičemž ve výhodném provedení podle uvedeného vynálezu se používá chloroform.Then a mixture containing a chlorinated lower alkyl hydrocarbon and a lower alkyl alcohol is added to the sample in which the volume ratio of the chlorinated hydrocarbon to the alcohol is about 1: 1. The volume of the added mixture containing said chlorinated hydrocarbon and alcohol is about 20 times the original volume, i.e. the original predetermined volume of the plasma sample, and the temperature of the mixture corresponds to room temperature. Thus, if the original sample volume is 50 gI, the volume of the mixture to be added is about 1.0 milliliters. Suitable chlorinated hydrocarbons include chloroform, methylene chloride, and ethylene chloride, with chloroform being preferred.

Uvedeným‘nižším¹alkylalkoholem může být-například-methanol, .Uvedeným'nižším ^one alkyl alcohol could be-for example-methanol.

ethanol, propanol, n~butanol, isopropanol, isobutanol nebo isoamylalkohol. Čím větší je počet atomů uhlíku v alkoholu, tím je daná směs méně efektivní pokud se týče extrakce ’ lipidově vázané sialové kyseliny v porovnání s celkovou extrakcí sialové kyseliny. Z výše uvedeného vyplývá, že ve výhodném provedení podle vynálezu se jako alkoholu používá methanolu, neboť při použití ostatních alkoholů dochází k extrakci většího množství celkové sialové kyseliny a dalších znečišťujících složek a tím se snižuje diagnostická hodnota tohoto testu.ethanol, propanol, n-butanol, isopropanol, isobutanol or isoamyl alcohol. The greater the number of carbon atoms in the alcohol, the less effective the composition is in terms of extracting the lipid-bound sialic acid compared to the overall extraction of sialic acid. It follows from the above that methanol is preferred as the alcohol as other alcohols extract more total sialic acid and other contaminants and thereby reduce the diagnostic value of the test.

Takto získaná směs se potom promíchává po vhodný časový interval rozvířením po dobu přibližně 10 sekund za ——— účelem-rozpuštění· přítomné-látky^-v“tomto* vzorku“ ve~ směsí' ** τ—- —— chlorovaného uhlovodíku a alkoholu. Takto získaná směs se potom odstředí, přičemž doba odstřeďování je asi.pět minut a odstřeďování se provádí asi při 3500 otáčkách za minutu, čímž se získá v podstatě Čirá horní fáze.The mixture is stirred for a suitable period by swirling for approximately 10 seconds ----order dissolution ·-present substance ^- in "this sample *" in mixtures ~ '** τ-- - chlorinated hydrocarbon and alcohol. The mixture is centrifuged at about five minutes and centrifuged at about 3500 rpm to give a substantially clear upper phase.

Předem stanovený objem horní fáze se pojtom separátně ,, . -j oddělí z takto získané v podstatě čiré horní fáze, ve výhodném provedení podle uvedeného vynálezu se tento stupeň provede tak, že se oddělí horní fáze od dolní fáze a dolní íj.The predetermined volume of the upper phase is taken separately. separated from the substantially clear upper phase thus obtained, preferably this step is carried out by separating the upper phase from the lower phase and the lower phase.

fáze se odstraní. Tento předem stanovený objem tímto .phase is discarded. This predetermined volume is hereby determined.

. .. . způsobem, oddělený-,závisí .na objemu původního v-zorku·· plazmy·. -/· - -·· ----Je tedy možno uvést, že jestliže původní objem,' to znamená < předem stanovený objem, plazmy byl asi 50 gl, potom objem horní fáze separátně oddělený bude asi 200 gl.. ... in a separate manner, it depends on the volume of the original plasma sample. Thus, if the original volume, i.e. the predetermined volume, of the plasma was about 50 g, then the volume of the upper phase separately separated would be about 200 g.

K této směsi se potom přidá vhodný objem barvotvorného činidla neboli barevného indikátoru, kterým je ve výhodném provedení podle vynálezu resorcinol, v objemu asi 1,0 mililitr, přičemž takto získaná směs se potom zpracovává rozvířením, prováděným po dobu asi 5 sekund. Tato směs se potom vaří, což se provádí tak, že se trubice obsahující tuto směs umístí do intenzivně vroucí vodní lázně poté, co teplota této lázně dosáhne 100 ’C, na dobu asi 15 minut a potom se taxo smés ochladí, což se provede tak, že se tato trubice umístí do studené vody po dobu asi 5 minut. V dalším postupu se tato smés odstřeďuje po dobu přinejmenším 5 minut při asi 3500 otáčkách za minutu. Koncentrace této sialové kyseliny vázané v kapalině se potom určí oddělením čiré kapaliny nad usazeninou, stanovením hodnoty přítomného modrého zabarvení extraktu při 580 nra, stanovením hodnoty optické hustoty známého standardu, to znamená běžně obchodně — dostupné-NANA,—která- byla -zpracována přesné, stejnýmzpůsobe;® jako tento vzorek a simultánně se zpracováváním tohoto vzorku, a použitím vzorce :To this mixture is added a suitable volume of coloring agent or color indicator, preferably resorcinol, in a volume of about 1.0 milliliters, and the mixture is then swirled for about 5 seconds. The mixture is then boiled by placing the tube containing the mixture in an intensely boiling water bath after the temperature of the bath reaches 100 ° C for about 15 minutes, and then cooling the taxo mixture as required. by placing the tube in cold water for about 5 minutes. Next, the mixture is centrifuged for at least 5 minutes at about 3500 rpm. The concentration of this sialic acid bound in the liquid is then determined by separating the clear supernatant, determining the blue color of the extract present at 580 nm, determining the optical density value of a known standard, i.e. commercially available NANA, which has been treated accurately. in the same manner as ® this sample and simultaneously with the processing of this sample, using the formula:

A x BA x B

LSA (mg/100 ml plazmy) = C ve kterém ;LSA (mg / 100 ml plasma) = C in which;

A je známá hodnota standardu v rag/100 mililitrů,And is the known value of the standard in rag / 100 milliliters,

B je optická hustota neznámého vzorku, a C je optická, hustota standardu.B is the optical density of the unknown sample, and C is the optical density of the standard.

Rozhodující významnost postupu podle uvedeného vynálezu spočívá v objevu, že.tlumící roztok methanolu a chloroformu v poměru 1 1 umožňuje takové provedení. ·< t „ testovacího postupu, při kterém se dosahuje větší citlivosti a eliminuje se při něm nutnost použít proteinového srážecího činidla. Tě ňt o vy š 1'ed ě k' j ě ' možný z toho ďů v Od U,' ž '^počlTe'^^- ’⁷ uvedeného vynálezu bylo zjištěno, že při uvedeném poměru vzniká horní fáze, která-má mnohem-větší-objem a je-téměř , prostá znečišťujících složek. Důležitost většího objemu teti; čiré horní fáze spočívá v tom, že s tímto větším objemem čiré horní fáze se technickým pracovníkům provádějícím tento test mnohem lépe pracuje, přičemž, je možno ze stejné horní _ fáze provést několik testů.The decisive significance of the process according to the invention lies in the discovery that a 1: 1 methanol / chloroform buffer solution allows such an embodiment. A test procedure that achieves greater sensitivity and eliminates the need for a protein clotting agent. I nt of TX 1'ed e k 'j e' made possible the DU from U 'Z' POCl ^ '^ ^-' ⁷ have discovered that, when the rate of formation of the upper phase, which-has mnohem- larger-volume and is-almost, free of pollutants. The importance of more aunt's volume; The clear upper phase consists in the fact that this larger volume of the clear upper phase is more easily handled by the technicians carrying out the test, and several tests can be carried out from the same upper phase.

V následující tabulce č. I je demonstrována větší citlivost testovacího postupu podle uvedeného vynálezu v provedení, kdy je poměr methanolu a chloroformu 1:1 a klesající citlivost v případech, kdy se tento poměr posouvá směrem ke vzájemnému poměru 45 : 55 ať již methanolu ke chloroformu nebo chloroformu k methanolu. V případě, že se poměr methanolu k chloroformu zvýší na 60 : 40, dosahuje ' se* vě Imi“ špat něho'rozdělení 7 * p^ ičěmž”extrěmně kontaminovaná horní fáze již nemůže být použita k provedení testovacího postupu podle vynálezu. Jak je patrné z této tabulky č. Γ, v případě, že se poměr methanolu ke chloroformu zvýší na 70 : 30, nedochází k vůbec žádnému rozdělení.The following Table 1 demonstrates the greater sensitivity of the test procedure of the present invention when the ratio of methanol to chloroform is 1: 1 and the decreasing sensitivity when the ratio is shifted towards a 45: 55 ratio of either methanol to chloroform or chloroform to methanol. If the ratio of methanol to chloroform is increased to 60:40, a very poorly poor distribution of 7 is achieved, and the extremely contaminated upper phase can no longer be used to carry out the test procedure of the invention. As can be seen from this table, no partitioning occurs at all when the methanol to chloroform ratio is increased to 70:30.

V následující tabulce č. II je demonstrován účinek poměru methanolu ke chloroformu na objem horní fáze. Při provádění tohoto testovacího postupu se předpokládá použití vzorku o objemu 1300 mikrolitrů. Z výsledků uvedených v této tabulce č. II je patrné, že při poměru 50 : 50 je objem čiré horní fáze směsi 7Ό0 mikrolitrů a objem-spodní fáze 600 ” ' mikrolitrů. V případě, že se poměr methanolu ke chloroformu zvýší na 52,4 : 47,5, potom odpovídající objemy těchto dvou fází zůstávají přibližně stejné, V případě, že se poměr methanolu ke chloroformu zvýší na 55 : 45, potom objem horní fáze se zvýší na 760 mikrolitrů a v případě, že se tento poměr zvýší na 60 : 40, potom se tento objem zvýší na 840 mikrolitrů, i když oddělení je extrémně špatné a horní fáze není čistá'. Při poměru 70 : 30 již nenastává žádné rozdělení. Na druhé straně je možno uvést, že v případě, kdy se uvedený poměr methanolu ke chloroformu sníží na 78 : 52, potom se objem horní fáze sníží na 600 mikrolitrů, zatímco objem spodní fáze se zvýší na 700 mikrolitrů. V případě, že poměr methanolu ke chloroformu se sníží na 45 : 55, potom objem uvedené horní fáze se dále sníží na 500 mikrolitrů, zatímco objem spodní fáze se zvýší na 800 mikrolitrů.The following Table II demonstrates the effect of the ratio of methanol to chloroform on the volume of the upper phase. This test procedure assumes the use of a 1300 microliter sample. From the results shown in Table II, it can be seen that at a 50:50 ratio, the volume of the clear top phase of the mixture is 7-10 microliters and the volume-bottom phase is 600 microliters. If the ratio of methanol to chloroform increases to 52.4: 47.5, then the corresponding volumes of the two phases remain approximately the same. If the ratio of methanol to chloroform increases to 55:45, then the volume of the upper phase increases to 760 microliters and if this ratio is increased to 60:40, then this volume is increased to 840 microliters, although the separation is extremely poor and the upper phase is not clean. There is no split at 70:30. On the other hand, if the ratio of methanol to chloroform is reduced to 78: 52, then the volume of the upper phase is reduced to 600 microliters, while the volume of the lower phase is increased to 700 microliters. If the ratio of methanol to chloroform is reduced to 45: 55, then the volume of said upper phase is further reduced to 500 microliters, while the volume of the lower phase is increased to 800 microliters.

Z výsledků uvedených v těchto tabulkách č. I a XI je tedy patrné, že optimální kombinace zvýšené citlivosti na přítomnost lipidově vázané sialové kyseliny a největšího objemu čiré horní fáze nastává při poměru methanolu ke chloroformu 50 : 50 neboli 1 ·.: 1.Thus, it is apparent from the results shown in Tables I and XI that the optimum combination of increased sensitivity to the presence of lipid-bound sialic acid and the largest volume of clear top phase occurs at a 50:50 methanol / chloroform ratio of 1: 1.

V následující tabulce č. III je rovněž demonstrována zvýšená citlivost testovacího postupu podle uvedeného vynálezu vyjádřená vyšším pozitivním stupněm identifikace dosahovaným při provádění postupu podle uvedeného vynálezu v porovnání s testem provedeným podle dosavadního stavu techniky, který je uveden v patentu Spojených států amerických č. 4 748 128, autor Katopodis. V této tabulce č. III jsou uvedeny výsledky testů se 532 pacienty, kteří byly testovány na různé typy tumorů, přičemž o 343 pacientech bylo známo, že mají pozitivní příznaky přítomnosti těchto tumorů z jiných testů. Při použití, testovacího postupu podle uvedeného vynálezu bylo. identifikováno průměrně 79 % těch případů, o kterých bylo známo, že mají pozitivní příznaky přítomnosti tumorů, zatímco v případě testovacího postupu podle dosavadního stavu techniky, to znamená podle patentu Spojených států amerických č. 4 748 128, autor Katopodis, bylo identifikováno pouze 52 %. Z výše uvedeného vyplývá, že testovací postup podle uvedeného vynálezu vykazujezvýšení citlivosti o 27 % v porovnání s metodou podle dosavadního stavu'technikypři’zjišťování přítomnosti rakovinových * - nádorů.Table III also demonstrates the increased sensitivity of the test method of the present invention, as expressed by the higher positive degree of identification achieved in the method of the present invention compared to the prior art test disclosed in U.S. Patent No. 4,748 128 by Katopodis. Table III shows the results of tests with 532 patients who were tested for different tumor types, 343 patients were known to have positive signs of these tumors from other tests. In use, the test procedure of the present invention was. an average of 79% of those cases known to have positive signs of tumors were identified, while only 52% were identified in the prior art test procedure, i.e., Katopodis, U.S. Patent No. 4,748,128. . It follows from the above that the test procedure of the present invention shows a sensitivity increase of 27% compared to the prior art method for detecting the presence of cancer * tumors.

a rand r

TABULKA č. ITABLE I

Účinek poměru methanol/chloroform na LSA hodnotyEffect of methanol / chloroform ratio on LSA values

Vzorek Poměr methanolu ke chloroformuSample Ratio of methanol to chloroform

45/55 48/52 50/50 52,5/47,545/55 48/52 50/50 52.5 / 47.5

č. l No l 8.0* 8.0 * 8,3 8.3 ..........8.9...... .......... 8.9 ...... , 7,9 , 7.9 č. 2 No 2 10,3 10.3 12,3 12.3 . 13,4 . 13.4 12,0 12.0 č. 3 No 3 20,7 20.7 23,9 23.9 24,3 24.3 21,2 21.2 č. 4 No. 4 22,0 22.0 25,5. 25.5. 26,9 26.9 20,3 20.3 č. 5 No 5 43,1 43.1 46,5 46.5 48,3 48.3 39,7 39.7

Vzorek Poměr methanolu ke chloroformuSample Ratio of methanol to chloroform

55/45 55/45 60/40 60/40 70/30 70/30 č. C. 1 1 5,1 5.1 fázové phase č. C. 2 2 10,4 10.4 rozdělení distribution č. C. 3 3 17,6 17.6 příliš špatné too bad žádné none v c. in C. 4 * 4 * 18,5 18.5 k tomu, aby to do so rozdělení distribution č. C. 5 5 27,9 27.9 mohl být test proveden could be a test executed

’ Koncentrace lipidově vázané sialové kyseliny ve vzorcích (mg/100 mililitrů)´ Concentration of lipid-bound sialic acid in samples (mg / 100 milliliters)

TABULKA č. IITABLE II

Účinek poměru methanolu ke chloroformu na objem horní fáze v případě vzorku o objemu 1300 mikrolitrů.Effect of the methanol to chloroform ratio on the upper phase volume of a 1300 microliter sample.

Poměr methanolu ke chloroformu 45:55 48:52 50:50 52,5:47,5The ratio of methanol to chloroform 45:55 48:52 50:50 52.5: 47.5

obj em horní V volume IN ςηη w* V V ςηη w * V V V v v V v v 7ΠΛ t w 7ΠΛ t w 700 700 objem spodní lower volume \ * \ * fáze phase (v mikro- (in micro- 800 800 700 700 600 600 600 600 litrech) liters)

Poměr methanolu ke chloroformuThe ratio of methanol to chloroform

55:45 55:45 60:40 60:40 70:.30 _ . 70: .30 _. špatné poorly žádné none rozdělení distribution rozdělení distribution ... ... ob j em ob j em horní upper fáze phase 760 760 460 460 1300 1300 obj em obj em spodní lower fáze phase » -> »-> ..... ..... ·. * - < ·. * - < (v mikro- (in micro- 540 540 840 840 1300 1300 litrech) liters)

TABULKA č. ΓΙΙTABLE NO

Zvýšená citlivost postupu podle vynálezu při identifikování pacientů o kterých je známo, že trpí rakovinou na základě příznaků zjištěných z jiných testů.Increased sensitivity of the method of the invention in identifying patients known to suffer from cancer based on symptoms found in other tests.

Typ tumoru Tumor type Počet testovaných pacientů Number tested patients Počet pacientů s pozitivním Number positive patients Procentuální pozitivní identifikace Percentage positive identification ''onemocněním '' illness dnemocnéni dnemocnéni A* B* A * B *

Prsa Breast 168 168 62 62 37 % 37% 66 % 66% Tračník Colon 92 92 71 71 38 38 56 56 Vaječník Ovary 70 70 53 53 66 66 X 91 X 91 Plíce Lung 55 55 40 40 75 75 87 87 Prostata ' Prostate ' * 45.....--- - -- * 45 .....--- - - -39 - -39 - - -59- - - -59- - -7-9—--^: ·-7-9 —-- ^: · Melanom Melanoma 24' 24 ' 5 5 20 20 May 80 80 Různé Different 78 78 73 73 68 68 95 95 Celkem Total 532 532 343 343 52 % (průměr) 52% (diameter) 79 % (průměr) 79% (diameter)

A* Testovací postup podle dosavadního stavu techniky B* Testovací postup podle uvedeného vynálezuA * Test procedure according to the prior art B * Test procedure according to the present invention

r;r;

σ oσ o

ÍP·ÍP ·

Claims

PATENT CLAIMS

A method for extracting lipid-bound sialic acid from blood plasma or human serum and determining the amount of lipid-bound sialic acid in a human blood plasma or serum sample, comprising the steps of:

(a) diluting a predetermined volume of the blood plasma or serum sample with a buffer solution to a volume of up to six times the predetermined volume, (b) mixing the diluted sample for a suitable period of time in (c) adding a mixture of chlorinated lower alkyl hydrocarbon and lower alkyl alcohol to said mixture, the volume of said added mixture being about 20 times greater than the predetermined volume of the blood plasma or serum sample and the volume ratio of said chlorinated hydrocarbon to the alcohol in the mixture is about 1: 1, (d) stirring the resulting mixture for a suitable period of time to dissolve the substance present in the sample in a chlorinated hydrocarbon / alcohol / buffer mixture, at a rate to allow the formation of a substantially clear upper phase (f) s separating from the clear upper phase thus obtained a predetermined volume of the upper phase, (g) adding a color-forming reagent to said predetermined volume of the clear upper phase,

(h) mixing the resulting mixture, (i) boiling the mixture, ¹ (j) cooling the mixture, (k) stirring and then centrifuging the mixture, separating the clear supernatant from the precipitated material, and (1) determining the amount of lipid-bound sialic acid present in the supernatant and thereby the amount present in the blood plasma or serum sample.

^vin

2. The method of claim 1 wherein i

in step (a), the predetermined volume is about 50 μΐ and this volume. Dilute about 250 μΐ of buffer solution.

In this case, in step (b), mixing comprises stirring for at least 5 seconds.

The process according to claim 2, wherein in step (c) the volume of the mixture to be added is about 1 ml.

5. The process of claim 1 wherein in step (c) said lower alkyl alcohol is methanol, ethanol, propanol, n-butanol, isopropanol, isobutanol or isoamyl alcohol.

The process according to claim 5, wherein in step (c) the lower alkyl alcohol is methanol.

7. The process of claim 1 wherein in step (c), the chlorinated lower alkyl hydrogen is chloroform.

The method of claim 1, wherein in step (d) the mixing comprises stirring for at least 10 seconds.

The method of claim 1, wherein in step (e) the centrifugation is performed at about 3500 rpm for at least 5 minutes.

The method of claim 1, wherein in step (f), the separate separation comprises separating the upper phase j from the lower phase. '

-------- A process of pbd-le-hay-2 --- characterized in that in ----------------- " in step (f), the predetermined volume of the upper phase is about 200 microliters.

12. The process of claim 2 wherein in step (g) the predetermined volume of the coloring agent is about 1 milliliter.

13. The process of claim 1 wherein in step (g), the coloring agent is resorcinol.

14. The method of claim 1, wherein in step (h) the mixing comprises vortexing for about 5 seconds.

15. The process of claim 1 wherein in step (i) the mixture is boiled for about 15 minutes. :

«· *, I

16. The process of claim 1 wherein in step (j) the mixture is cooled for about 5 minutes. ΐ i

'. *. · * ... -T- · -. ·· .-, * í. T .. ".

Method according to claim 1, characterized in that in step (k) the stirring is carried out by stirring for 5 seconds and the centrifugation is carried out for 5 minutes at 3500 rpm.

Method according to claim 1, characterized in that in step (1) the amount of lipid-bound sialic acid is determined by determining the blue color value of the extract at 580 nm present in the supernatant, and determining the amount of lipid-bound sialic acid by comparing obtained at 580 nm with a value obtained with a standard having a known concentration of lipid-bound sialic acid and using the formula:

..... ............. ....... ..., _T ... _ir .. ^. - _r .. ^ ..... ...... ----------- ........ - - .. *. . .

LSA (mg / 100 ml plasma) = A x B / C

A where A is the known concentration of the standard, B is the optical density of the sample and C is the optical density of the standard. . «·

19. The method of claim 18, wherein the known standard is tested in exactly the same manner and at the same time as testing the sample according to the procedure of claim 1.

20. The method of claim 18, wherein the standard. n-acetylheuraminic acid (NANA) is commercially available.

21. A method for diagnosing cancer in a human subject, comprising determining the amount of lipid-bound sialic acid in a subject's blood plasma or serum sample according to the method of claim 1, and comparing it to values obtained in subjects about is known to suffer from cancer.

22. A method for diagnosing cancer in a human subject, wherein the amount of lipid-bound sialic acid in a subject's blood plasma or serum sample is determined at regular intervals according to the method of claim 1, and compared to the amounts determined previously in said subject. .

23. A cancer diagnostic kit comprising a container with a mixture of a chlorinated lower alkyl hydrocarbon and a lower alkyl alcohol in a volumetric ratio of a cinol reagent buffer, a buffer solution buffer, a commercially available n-acetylneuraminic acid buffer container. a known concentration of lipid-bound sialic acid and instructions on sample and standard processing.

24. The cancer diagnostic kit of claim 23, wherein said lower alkyl alcohol is methanol and said lower alkyl hydrocarbon is chloroform.

25. A method for determining the amount of lipid-bound sialic acid in a human plasma or serum sample according to claim 1, wherein the processing of a known standard is carried out simultaneously and in the same manner as the sample processing, with the result that errors in test results this eliminates the various technical means used in sample and standard testing.

It represents.