CS276181B6

CS276181B6 - A method for isolating 987-β surface antigen by Escherichia coli

Info

Publication number: CS276181B6
Application number: CS902167A
Authority: CS
Inventors: Oto Mudr Csc Sova
Original assignee: Ustav Fyziologie Hospod Zviera
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1990-05-02
Publication date: 1992-04-15
Also published as: CS216790A3

Abstract

-Riešenie sa týká sposobu izolácie povrcho- ' vého pilusového antigénu 987-P z povrchu těla baktérií Escherichia coli, ktorý je vhodný ako imunizačný ochranný prostriedok v prevencii proti kolihnačkám a koliinfekciám-novorodených prasiat a teliat. Baktérie E.coli, nesúce na svojom povrchu pilusový antigén 987-P, sa odstredia, resuspendujú a z povrchu baktérií sa odstránia pilusy s antigénom 987-P. Roztok s antigénom 987-P sa aplikuje do autofokusačného prístroja a antigén sa odíokusuje. Frakcie sa zhromaždia a ich koncentrácia sa upraví tak, aby v riedení 1 ·. 128 vykazovali jasnu precipitačnú líniu pri difdzii v agare voCi antiséru.-The solution relates to a method of isolating the surface pilus antigen 987-P from the body surface of Escherichia coli bacteria, which is suitable as an immunization protective agent in the prevention of colic and coli-infections of newborn pigs and calves. E. coli bacteria, carrying the pilus antigen 987-P on their surface, are centrifuged, resuspended and the pilus with the antigen 987-P are removed from the surface of the bacteria. The solution with the antigen 987-P is applied to an autofocusing device and the antigen is isolated. The fractions are collected and their concentration is adjusted so that at a dilution of 1 ·. 128 they show a clear precipitation line when diffusing in agar in the presence of antiserum.

Description

Vynález sa týká spdsobu izolácie povrchového antigénu 987-P (pilusového) bakteriíThe invention relates to a method for isolating a 987-P (pilus) bacterial surface antigen

Escherichia coli, který sléži buď samostatné k imunizácii prašných prasnic alebo telných krav alebo ako doplnok k iným vakcínam proti črevným zápalom a hnačkám.Escherichia coli, which is used either alone to immunize sows or calf cows or as a supplement to other vaccines against inflammatory bowel disease and diarrhea.

Kolicnteritídy a kolihnačky novorodených teliat a prasiat spósobujú enteropatogénne baktérie Escherichia coli, ktoré sa adherujú na črevné stenu postihnutých zvierat a potom vylučováním enterotoxínov sposobujú črevný zápal a hnačky, v dósledku ktorých novorodenci často hynu. Zdolanie tohoto črevného zápalu je vážným problémem. Najúspešnějsou je imunizácia zvierat antigénom adherencie, ktorý zabraňuje baktériám přilnut’ ku črevnej stene a tým aplikovat’ v potrebnom množstva svoje toxíny a tak sposobovať onemocnenie. Ooteraz najúčinnejšou bola imunizácia matiek před půrodom parenterálnou cestou, celulárnou alebo subcelulárnou vakcínou obsahujúcou buď celé, šetrne usnirtené enteropatogénne baktérie nesúce na svojom povrchu příslušný antigéen, alebo izolovaný pilusový antigén či kombináciu oboch.Colinitis and constipation in newborn calves and pigs are caused by enteropathogenic bacteria Escherichia coli, which adhere to the intestinal wall of affected animals and then, by secreting enterotoxins, cause intestinal inflammation and diarrhea, as a result of which newborns often die. Overcoming this intestinal inflammation is a serious problem. The most successful are the immunization of animals with an adherence antigen, which prevents bacteria from adhering to the intestinal wall and thus applying their toxins in the necessary amounts, thus causing disease. So far, the most effective immunization of mothers before delivery has been parenteral, with a cellular or subcellular vaccine containing either whole, gently killed enteropathogenic bacteria carrying the appropriate antigen on their surface, or an isolated pilus antigen or a combination of both.

V poslednom čase sa stává aktuálnou otázka výroby vakcíny z povrchového antigénu 987-P. Ooteraz známe postupy izolácie tohoto povrchového pilusového antigénu E.coli majú komplikovaný postup a velké prácnosť. Při izolácii sa používá až devať operácií, z ktorých možno spemenéť centrifugáciu, ultracentrifugáciu, ionexovú chromatografiu, zrážanie, ultrafiltráciu, gélovú chromatografiu (Nagy, L.K., Me Kenzie, T., Painter, K.R.: Veterinary record (1985), 117, 408-413), pričom výťažok je relativné nízký.Recently, the production of a vaccine from surface antigen 987-P has become a topical issue. The methods known so far for isolating this E. coli surface pilus antigen have a complicated procedure and a great deal of work. Up to nine operations are used in isolation, including centrifugation, ultracentrifugation, ion exchange chromatography, precipitation, ultrafiltration, gel permeation chromatography (Nagy, LK, Me Kenzie, T., Painter, KR: Veterinary record (1985), 117, 408- 413), the yield being relatively low.

Uvedené nedostatky v podstatnej miere odstraňuje spůsob izolácie povrchového pilusového antigénu 987-P z baktérií Escherichia coli podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že sa pilusový antigén 987-P z povrchu těla enteropatogénnych baktérii E.coli separuje homogenizáciou a izoluje autofokusáciou do takej koncentrácie, že vykazuje jasné precipitačnú liniu pri difúzii v agare voči antiséru anti 987-P až do riedenia 1 : 128.The method of isolating the 987-P surface pilus antigen from Escherichia coli according to the invention substantially eliminates these drawbacks by separating the 987-P pilus antigen from the body surface of enteropathogenic E. coli bacteria by homogenization and isolating them by autofocusing to such a concentration. that it shows a clear precipitation line when diffused in agar against anti-987-P antiserum up to a dilution of 1: 128.

Výhodou izolácie povrchového pilusového antigénu podlá vynálezu sú nízké výrobně náklady, jednoduchá manipulácia pri imunizácii zvierat, jednoduchost’ vlastného spósobu izolácie antigénu, ktorý vylučuje trvalé obsluhu aparatury a potřebu akýchkoťvek chemikálií, protože scparácia prebieha len v apyrogénnej destilovanej vodo.The advantages of isolating the surface pilus antigen according to the invention are low production costs, easy handling in immunizing animals, simplicity of the antigen isolation method itself, which eliminates permanent operation of the apparatus and the need for any chemicals, as the separation takes place only in pyrogen-free distilled water.

Uvedený příklad ilustruje, ale neobmedzuje predmet vynálezu.The above example illustrates but does not limit the scope of the invention.

Příklad 1Example 1

Enteropatogénne baktérie Escherichia coli 987-P, neséce na svojom povrchu pilusový antigén 987-P, r>n po bežnej kultivácii, zaručujúccj produkciu uvedeného antigénu, udstredia a bakteriu bez supurna luntu sa resuspenduje v sterilně destilovanej vodě chladenej na 4 °C pomocou homogenizéra počas 5 až 10 minut při 3 000 1/min a teplete do 4 °C. Tým nastane odseparovanie pilusov obsahujúcich bielkovinové zložku antigénu 987-P. Homogenát sa potom odstředí pri 70 000 m.s^-2 po dobu 20 minét při teplete do 4 °C. Supernatant, ktorého vodivost’ sa upraví na hodnoty do 800 yuS.cm^-1 přidáním destilovanej vody, sa aplikuje do autofokusačnej aparatury a po jej uzatvorení sa aplikuje jednosměrný elektrický préd maximálně 3V a roztok sa fokusuje pri teplote do 4 °C, kým préd neklesne na jednu desatinu svojej původnej hodnoty pri maximálnom napatí 1 000 V. Po fokusácii sa zmeria ve všetkých pracovných komůrkách aparatéry pH a obsah antigénu 987-P ntisérem. Pilusový antigén 987-P fokusuje automaticky k pH 4,2 až 4,8. Z priehradiek s pH v tomto rozmedzí sa zhromažďuje pilusový antigén 987-P. Jeho pil sa upraví na hodnotu 7 a koncentrácie sa upraví tak, že vykazuje pri sledovaní prucipitácie v agare jasné precipitačnú liniu voči antiséru anti 987-P až do riedenia 1 : 128.Enteropathogenic bacteria Escherichia coli 987-P, carrying on their surface the pilus antigen 987-P, r> n after normal cultivation, guaranteeing the production of said antigen, concentrates and the bacterium without supernatant is resuspended in sterile distilled water cooled to 4 ° C by homogenizer for 5 to 10 minutes at 3,000 rpm and warm to 4 ° C. This separates the piluses containing the protein component of the 987-P antigen. The homogenate is then centrifuged at 70,000 ms ^-2 for 20 minutes at a temperature up to 4 ° C. The supernatant, the conductivity of which is adjusted to values up to 800 .mu.l / cm ^{-1 by the} addition of distilled water, is applied to an autofocus apparatus and, after closing, a maximum direct current of 3V is applied and the solution is focused at a temperature of up to 4 DEG C. until to one tenth of its original value at a maximum voltage of 1,000 V. After focusing, the pH and antigen content of the 987-P antigen are measured in all working chambers with a titer. Pilus antigen 987-P focuses automatically to pH 4.2 to 4.8. Pilus antigen 987-P is collected from compartments with a pH in this range. Its pH was adjusted to 7 and the concentration was adjusted to show a clear precipitation line against anti-987-P antiserum up to a dilution of 1: 128 when monitoring prucipitation in agar.

Po dosiahnutí tejto koncentrácie sa do roztoku přidá olejové adjuvans a podává sa parenterálne prašným prasniciam asi 6 týždňov před půrodoni. Táto doba postačuje k tomu, aby uvedená dávka vytvořila u matiek protilátky voči 987-P antigénu a po napití mleziva sa tieto přenesu do čriev novorodencov. Tieto protilátky potom zabraňujú enteropatogénnym baktériám E.coli 987-P adherovať sa na črevné stenu a tak sposobovať kolienteritídy a kolihnačku.After reaching this concentration, an oil adjuvant is added to the solution and administered parenterally to sows about 6 weeks before farrowing. This time is sufficient for said dose to produce antibodies to the 987-P antigen in the mothers, and after drinking the colostrum, these are transferred to the intestines of the newborn. These antibodies then prevent the enteropathogenic bacteria E. coli 987-P from adhering to the intestinal wall and thus causing colienteritis and echinoderms.

CS 276181 86 2CS 276181 86 2

Příklad 2 'Example 2 '

Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost' supernatantu sa upravila dialýzou a pH zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,2.Following the same procedure as in Example 1, the conductivity of the supernatant was adjusted by dialysis, and the pH of the collected piled antigen 987-P was adjusted to 7.2.

Příklad 3Example 3

Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost’ supernatantu sa upravila ultrafiltráciou a pil zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,4.Following the same procedure as in Example 1, the conductivity of the supernatant was adjusted by ultrafiltration, and the pH of the collected pilus antigen 987-P was adjusted to 7.4.

Příklad 4Example 4

Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost’ supernatantu sa upravila dalším přidáním antigénu 987-P a pH zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,5.Following the same procedure as in Example 1, the conductivity of the supernatant was adjusted by further adding 987-P antigen, and the pH of the collected 987-P pilus antigen was adjusted to 7.5.

Vynález může nájsť široké praktické využitie v živočíšnej výrobo vo velkochove ošípaných, kde podstatné může prispieť k znižovaniu úhynu novorodencov z titulu kolienteritíd a kolihnačiek.The invention can find wide practical application in animal production in pig farming, where it can significantly contribute to the reduction of neonatal mortality due to colienteritis and echinoderms.

Claims

PATENT CLAIMS

Method for isolating 987-P protein pilus antigen from the body surface of enteropathogenic bacteria Escherichia coli, characterized in that the pilus antigen 987-P is separated from the body surface by bacteria by homogenization and isolated by autofocusing in an automatically generated pH gradient to pH 4.2 to 4.8 to a concentration at which it shows a clear precipitation line on diffusion! in anti-907-P antiserum agar up to dilution 1 ·. 128.