CS274362B1 - Method of fungal laccase preparation - Google Patents

Description

Vynález sa týká fungálnej lakkázy a sposobu jej přípravy při priemyslovej výrobo hlivy (Pleurotus species).

Enzým lakkáza (EC 1.10.3.2) patří do skupiny polyfenol-oxidáz, ktorý oxiduje velmi široký okruh substrátov zahrnujúcich monofenoly, trifenoly, kyselinu askorbovú ako i ortoa para- difenoly (A.M. Mayer a E. Harel: Phytochemistry 18, 193 /1979/). Nachádza sa v rastlinách ale i mnohých organizmoch, z ktorých sa móže vhodným sposobom izolovat’. Je to extracelulárny enzým, ktorý organizmy sekretujú do kultivačného média. Zatialčo v živých rastlinných buňkách sa lakkáza nachádza vo vel’mi nízkých koncentráciách v hubách je jeho koncentrácia podstatné vyššia. Najlahšie sa lakkáza izoluje z húb hlavně Lactarius, Polyporus, Psalliota, Glomerela, Podospora, Botritis, Pleurotus, Neurospora, Polystictus a Russula. Váčšina húb hlavně sposobujúcich bielu hnilobu dřeva produkuje lakkázu (T.Kent Kirk: Ann. REV. Microbiol. 41, 465 /1987/), ktorá má podstatný vplyv na změnu chemickej štruktúry ligninu, výsledkem čoho je jeho 1’ahšia rozpustnost pri delignifikácii bielou hnilobou napadnutého dřeva. Keďže lakkáza katalyzuje rovnaký typ reakcii ako peroxidáza a tyrozináza je tu možnost' využit lakkázu pri čistění odpadných vód kontaminovaných fenolmi a substituovanými fenolmi (K.L. Shuttleworth a J.M. Bollag: Enzyme Microb. Technol. 8, 171 /1986/). Priemyslovému využitiu lakkázy v tomto smere bránili doposial hlavně ekonomické důvody, pretože příprava lakkázy pře priemyslove aplikácie nebola vyriešená.

Uvedené nedostatky sa riešia podl’a vynálezu, ktorý umožňuje velkovýrobu lakkázy i pre priemyslové použitie.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že enzým lakkáza (EC 1.10.3.2) sa izoluje zo substrátu pri priemyslovom pěstovaní hlív (Pleurotus species) s výhodou Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, Pleurotus cornucopise, Pleurotus eryngii, alebo ich hybridy tak, že použitý substrát s výhodou před nasadzovaním plodnic sa vylisuje a z vylisovanej šťávy sa surový enzým lakkáza izoluje niektorým zo známých spósobov, alebo sa priemyslovo aplikuje v tekutom stave bez jeho izolácie.

Zistilo sa totiž, že aktivita lakkázy vo vylisovanej šťave použitého substrátu pri pěstovaní hlivy (slama, bavlněný odpad, řepková slama, lanový a konopný odpad, dřevené piliny) je velmi vysoká. Aktivita lakkázy meraná na syringaldazín ako substrátu (J.M. Harkin a J.R. Obst: Sciece 180, 296 /1973/) sa pohybuje v rozsahu 16 000 až 32 000 U/ml čo je podstatné vyššie ako v doteraz publikovaných prácach. Podía použitého substrátu možno jeho lisováním získat’ priamo 40 až 50 litrov šťávy na 100 kg vyplodeného substrátu. Vylisovaný pevný zbytok je možné použit ako doteraz na skrmovanie ako přísadu do viaczložkových ktmnych zmesi. Ďalej sa zistilo, že 8 násobným zahuštěním vylisovanej šťávy na vákuovej odparke při teplote 60 až 70 °C dochádza ku strate aktivity lakkázy len 10 až 20 % z póvodnej aktivity.

Lyofilizovaním neupravenej vylisovanej šťávy z vyplodeného substrátu sa získá suchý enzýmový preparát s obsahom bielkovinového dusíka 2 až 3,5 % a aktivitou 200 až 600 U/mg. Fungálna lakkáza připravená podía nového postupu má pH optimum v rozmedzí 5,0 až 6,0.

Hlavnou výhodou nového výrobku enzýmu lakkázy je, že sa dá připravit z odpadu vznikajúceho při priemyslovom pěstovaní hlivy jednoduchým vylisováním vyplodeného substrátu, pričom vylisovaný zbytok sa móže použit na přípravu ktmnych zmesi. Navrhovaný postup umožňuje připravit lakkázu za mnohonásobné nižšiu cenu, čo je základným predpokladom pře jej rožne priemyslové aplikácie.

Příklad 1

100 kg substrátu z pšeničnej slamy před nasadzovaním plodnic hlivy ustricovej s obsahom sušiny 20 až 30 % sa lisuje na kontinuálnom šnekovom lise, pričom sa získá 40 až 50 litrov vylisovanej šťávy o aktivitě 16 až 32 tisíc U/ml lakkázy. Vylisovaná šťava je sýteho čajového zafarbenia, nie je zakalená a móže sa priamo použit vo vhodných priemyslových aplikáciách.

CS 274 362 Bl

Příklad 2

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že vylisovaná štava sa na vákuovej odparke zahustí na osminu póvodného objemu, vychladí sa na 4 °C a lakkáza sa vyzráža naliatim zahuštěného roztoku do rovnakého objemu acetonu vychladeného na -10 °C, zrazenina lakkázy sa odfiltruje a na filtri sa Sálej odvodní ďalším podileom vychladeného acetonu. Aceton sa z produktu oddestiluje vákuovo a získá sa suchý prášok surového enzýmu lakkázy s obsahom dusíka 3,4 % a aktivitou 420 U/mg.

Příklad 3

Postup ako v příklade 1 as tým rozdielom, že vylisovaná šťava se lyofilizuje, čím sa získá preparát o aktivitě 600 U/Mg.

Příklad 4 štaavy.

Postup ako v příklade 2 s tým rozdielom, že lakkáza sa zo zahustenej vylisovanej vy vyzráža rozpuštěním pevného síranu amonného v množstve 350 g na liter zahustenej šť Vyzrážaná lakkáza sa odfiltruje alebo odcentrifuguje a nakoniec sa odvodní vychladeným acetonom. Získaný produkt je světlejší a má aktivitu 250 U/mg.

Příklad 5 slama

Postup ako v příklade 1 . Lisováním sa získá 45 s tým rozdielom, že ako substrát sa použije vyplodená řepková litrov vylisovanej šťávy s aktivitou lakkázy 25 000 U/ml.

Příklad 6

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že ako vyplodený substrát sa použijú dřevené piliny. Lisováním sa získá 40 litrov šťávy s aktivitou lakkázy 22 000 U/ml.

Příklad 7

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa na substrát naočkuje huba Pleurotus pulmonarius. Lisováním substrátu sa získá 42 litrov šťávy o aktivitě lakkázy 28 000 U/ml.

Příklad 8

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa na substrát naočkuje huba Pleurotus cornucopise. Lisováním sa získá 50 litrov šťávy o aktivitě lakkázy 29 500 U/ml.

Příklad 9

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa na substrát naočkuje huba Pleurotus eryngii. Lisováním sa získá 42 litrov šťávy o aktivitě lakkázy 25 000 U/l.

Příklad 10

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa na substrát naočkuje huba Pleurotus eryngii a substrát po prvej úrodě plodníc sa vylisuje. Získá sa 50 litrov šťávy o aktivitě lakkázy 2 700 U/l.

Vynález má využitie v biotechnologii, hlavně v priemyslových aplikáciách při odstraňovaní fenolových zlúčenín z odpadných vod, ďalej v analytike enzýmov, připadne v organickej chemii pri enzymatických reakciách niektorých fenolových zlúčenín.

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   Spůsob přípravy fungálnej lakkázy vyznačujúci sa tým, že ako zdroj enzýmu lakkázy slúži substrát pre priemyselné pestovanie hlivy, Pleurotus species, například Pleurotus oslrcatus, Pleurotus pulmonarius, Pleurotus cornucopiae, Pleurotus eryngii alebo ich hybridov, ktorý sa před nasadzovaním plodníc lisuje a z vylisovanej šťávy sa připadne známým spůsobom izoluje čistý enzym.