CS273630B2 - Method of resorufine's derivatives production - Google Patents
Method of resorufine's derivatives production Download PDFInfo
- Publication number
- CS273630B2 CS273630B2 CS104187A CS104187A CS273630B2 CS 273630 B2 CS273630 B2 CS 273630B2 CS 104187 A CS104187 A CS 104187A CS 104187 A CS104187 A CS 104187A CS 273630 B2 CS273630 B2 CS 273630B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- carboxylic acid
- mixture
- acid
- silica gel
- acetic acid
- Prior art date
Links
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical class C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 90
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 85
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 21
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 15
- -1 antibody Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 10
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical compound NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims abstract description 5
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims abstract description 5
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims abstract description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract 5
- 125000006527 (C1-C5) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 132
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 68
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 51
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 45
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 24
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 23
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 16
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 14
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 14
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N manganese dioxide Chemical compound O=[Mn]=O NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- SRJOCJYGOFTFLH-UHFFFAOYSA-N isonipecotic acid Chemical compound OC(=O)C1CCNCC1 SRJOCJYGOFTFLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N oxalyl chloride Chemical compound ClC(=O)C(Cl)=O CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 6
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229910021626 Tin(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 235000011150 stannous chloride Nutrition 0.000 claims description 6
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims description 5
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 4
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 4
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 4
- TXUICONDJPYNPY-UHFFFAOYSA-N (1,10,13-trimethyl-3-oxo-4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl) heptanoate Chemical compound C1CC2CC(=O)C=C(C)C2(C)C2C1C1CCC(OC(=O)CCCCCC)C1(C)CC2 TXUICONDJPYNPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical class C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000005518 carboxamido group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001119 stannous chloride Substances 0.000 claims description 3
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 3
- AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L tin(II) chloride (anhydrous) Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Sn+2] AXZWODMDQAVCJE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 claims description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 108
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 68
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 51
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims 51
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims 49
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims 49
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims 45
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 30
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 14
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 claims 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 12
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims 12
- AKEUNCKRJATALU-UHFFFAOYSA-N 2,6-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=C(O)C=CC=C1O AKEUNCKRJATALU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 10
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 10
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 claims 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- ZYUPLDFSBVJNIH-UHFFFAOYSA-N 3-(1,3-dimethyl-2,6-dioxopurin-7-yl)propanoic acid Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1N(CCC(O)=O)C=N2 ZYUPLDFSBVJNIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 7
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 6
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 4
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 claims 4
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 claims 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims 4
- LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N nitromethane Chemical compound C[N+]([O-])=O LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 4
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 claims 3
- UFXHMKCFGLKNNF-HNNXBMFYSA-N (2s)-3-[4-(4-hydroxy-3,5-diiodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound IC1=CC(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 UFXHMKCFGLKNNF-HNNXBMFYSA-N 0.000 claims 3
- KUDHATWUNGXIQC-UHFFFAOYSA-N 1-(2-aminoethyl)-5,5-diphenylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound NCCN1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KUDHATWUNGXIQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- GUODTJDYAURGDJ-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-6-nitrosobenzene-1,3-diol Chemical compound CCC1=CC(N=O)=C(O)C=C1O GUODTJDYAURGDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims 3
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims 3
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 claims 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims 3
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- SIFCHNIAAPMMKG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) acetate Chemical compound CC(=O)ON1C(=O)CCC1=O SIFCHNIAAPMMKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 claims 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 claims 2
- WKBLRSUVOPQYMO-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-4-nitrosobenzene-1,3-diol Chemical compound CC1=C(O)C=CC(N=O)=C1O WKBLRSUVOPQYMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- UYEMGAFJOZZIFP-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC(O)=C1 UYEMGAFJOZZIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- JVTXZVVELSONAM-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-6-nitrosobenzene-1,3-diol Chemical compound OC1=CC(O)=C(N=O)C=C1Cl JVTXZVVELSONAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 claims 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims 2
- 150000001719 carbohydrate derivatives Chemical class 0.000 claims 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 2
- OWFXIOWLTKNBAP-UHFFFAOYSA-N isoamyl nitrite Chemical compound CC(C)CCON=O OWFXIOWLTKNBAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims 2
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 claims 2
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 claims 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims 2
- MYKMOIQAHCMLIR-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2-(methylamino)acetate Chemical compound CNCC(=O)OC(C)(C)C MYKMOIQAHCMLIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 claims 2
- VSGRWOHSMUGJIF-LTCKWSDVSA-N (2s)-2-amino-3-[4-(4-hydroxy-3,5-diiodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]propanoic acid;sodium;hydrate Chemical compound O.[Na].IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 VSGRWOHSMUGJIF-LTCKWSDVSA-N 0.000 claims 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WNDKIGQUFDOYIB-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione;propanoic acid Chemical compound CCC(O)=O.ON1C(=O)CCC1=O WNDKIGQUFDOYIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- GPDPNAWCXCYAPK-UHFFFAOYSA-N 10h-phenoxazine-2-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC(C(=O)O)=CC=C3OC2=C1 GPDPNAWCXCYAPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YAQLSKVCTLCIIE-UHFFFAOYSA-M 2-bromobutanoate Chemical compound CCC(Br)C([O-])=O YAQLSKVCTLCIIE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- ZTMADXFOCUXMJE-UHFFFAOYSA-N 2-methylbenzene-1,3-diol Chemical compound CC1=C(O)C=CC=C1O ZTMADXFOCUXMJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanimidamide Chemical compound NC(=N)CC1=CC=CC=C1 JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JHUUPUMBZGWODW-UHFFFAOYSA-N 3,6-dihydro-1,2-dioxine Chemical compound C1OOCC=C1 JHUUPUMBZGWODW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- CAKKYRPAEHEPKD-UHFFFAOYSA-N 4-(5-ethyl-2,4,6-trioxo-5-phenyl-1,3-diazinan-1-yl)butanoic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)N(CCCC(O)=O)C1=O CAKKYRPAEHEPKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YLYKCSDPNQQFPL-UHFFFAOYSA-N 4-nitrosonaphthalene-1,3-diol Chemical compound C1=CC=CC2=C(N=O)C(O)=CC(O)=C21 YLYKCSDPNQQFPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ISSGEVVFFNVECI-UHFFFAOYSA-N 9-hydroxy-12-oxido-5-oxobenzo[a]phenoxazin-12-ium-8-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C3=[N+]([O-])C(C=CC(O)=C4C(=O)O)=C4OC3=CC(=O)C2=C1 ISSGEVVFFNVECI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- INQHRPGOFLKCNY-UHFFFAOYSA-N 9-hydroxy-8-(piperazine-1-carbonyl)benzo[a]phenoxazin-5-one Chemical compound OC1=CC=C2N=C(C3=CC=CC=C3C(=O)C=3)C=3OC2=C1C(=O)N1CCNCC1 INQHRPGOFLKCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 claims 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 claims 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 claims 1
- 101000610640 Homo sapiens U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Proteins 0.000 claims 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101001110823 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-A Proteins 0.000 claims 1
- 101000712176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-B Proteins 0.000 claims 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 claims 1
- 102100040374 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Human genes 0.000 claims 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims 1
- 244000309464 bull Species 0.000 claims 1
- AILAQOYFPLQIFN-UHFFFAOYSA-N butyl piperazine-1-carboxylate Chemical compound CCCCOC(=O)N1CCNCC1 AILAQOYFPLQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 claims 1
- YWEUIGNSBFLMFL-UHFFFAOYSA-N diphosphonate Chemical compound O=P(=O)OP(=O)=O YWEUIGNSBFLMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 claims 1
- FQTIYMRSUOADDK-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-bromopropanoate Chemical compound CCOC(=O)CCBr FQTIYMRSUOADDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 claims 1
- UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;methanol Chemical compound OC.CCOC(C)=O UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000004672 ethylcarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 claims 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 claims 1
- 229950008325 levothyroxine Drugs 0.000 claims 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 claims 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 claims 1
- XAVNWNCTXQDFLF-UHFFFAOYSA-N methyl piperidin-1-ium-4-carboxylate;chloride Chemical compound Cl.COC(=O)C1CCNCC1 XAVNWNCTXQDFLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims 1
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentoxide Inorganic materials O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 claims 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N sec-butyl acetate Chemical compound CCC(C)OC(C)=O DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims 1
- FJPYVLNWWICYDW-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diphenylimidazolidin-1-ide-2,4-dione Chemical compound [Na+].O=C1[N-]C(=O)NC1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FJPYVLNWWICYDW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N triacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CC(O)=O ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 abstract description 2
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 abstract 1
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 abstract 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 16
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical group [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical group [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical group C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Chemical group BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 2
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(6+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+6].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N trimethylenediamine Chemical compound NCCCN XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003021 water soluble solvent Substances 0.000 description 2
- 150000005207 1,3-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 1
- RNHDAKUGFHSZEV-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane;hydrate Chemical compound O.C1COCCO1 RNHDAKUGFHSZEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical group [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000220479 Acacia Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000001951 carbamoylamino group Chemical group C(N)(=O)N* 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001244 carboxylic acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 239000011243 crosslinked material Substances 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 150000003948 formamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012477 high molecular weight ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Chemical group 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Chemical group 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical class OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby nových derivátů resorufinu, která mohou jakožto fluorescenčně značené r.ízkomolekulámí o vysokomolekulární sloučeniny nacházet mnohostranné použití.
Fluoreskující sloučeniny nacházejí r.a základě své schopnosti vysílat po aktivaci světlem určité vlnové délky, Široké použití jako značkující sloučeniny v chemických a biologických postupech, jeko například v klinické analytice, avšak také ve stále větším počtu nových oblastí, V biochemii nacházejí fluorescenční barvivo jako vysoce citlivé značkovací látky rostoucí použití. Přitom so používá jak sloučenin z fluorescenčních barviv s nízkomolekulárními, tak i vysocemolekulérnírai látkami. Jako příklady pro široký rozsah použití takovýchto fluorescenčních konjugátů lze uvést;
Fluorescenční imunoanalýzu, pro kterou oe používá bu5 hapten, ontigen nebo specifická protilátka značená fluorescenčním barvivém. Specifickou vazbou protilátky r.a hapten nebo antigen lze pomocí různých postupů stanovit koncentraci těchto látek nebo protilátky.
V imunofluorescenční mikroskopii se antigeny, jako například celé buňky nebo bílkoviny stávají pod mikroskopem působením fluorescenčně značených protilátek viditelnými (srov. Wang a další, Meth. Enzymology 85, 514 a další).
Rovněž tak je možno přímo pozorovat rozdělení haptenu nebo antigénu v buňce, jestliže se do buňky přivede příslušná sloučenina fluorescenčně značená a sleduje se pod mikroskopem.
Fluorescenčně značené částice latexu nacházejí použití při třídění buněk v Fluoroscent Activated Cell Sorter (FACS).
Nikoli v poslední řodě slouží látky nesoucí fluorescenční značení ke stanovení o měření aktivity enzymů.
Kompetitivní imunoanalýzy jsou založeny na konkurenci mezi ligandem, který so má stanovit ve vzorku, a značeným a ve známé koncentraci přítomným ligančom, týkající se známého, avšak omezeného počtu vazebných míst lignndů na protilátky, které jsou specifické jak pro určované, tak i pro značené ligandy. koncentrace určovaného ligandu ve vzorku je rozhodující pro to, kolik značených molekul je vázáno na protilátky. Koncentrace komplexů sestávajících z protilátek a fluorescenčně značených ligandů je možno zjistit spektroskopickými metodami.Tato koncentrace je obráceně proporcionální vůči určované koncentraci ligandu, který se nachází ve vzorku. Jako značených ligandů, které se přidávají ke vzorku se stanovovanými ligandy ve známé koncentraci, se původně převážně používalo ligandů značených radioisotopy. Vzhledem ke známým nevýhodám značení radioisotopy nabývá značení fluoreskujícími sloučeninami na stále větším významu. Fluoreskující sloučeniny se přitom vážou na molekuly stanovované látky. Tyto konjugáty se pak mohou používat principiálně pro nejrůznější fluorescenční imunoanalýzy, jako je například fluorescenční polarisační imunoanalýza, fluorescenční imunoanalýza s řízeným zastavením reakce nebo fluorescenční imunoanalýza s použitím pomocných prostředků.
Jako značkovací látky se hodí principiálně všechna fluorescenční barviva, která mají vysoký koeficient extinkce a vysoký kvantový výtěžek, jakož i dostatečnou stabilitu za podmínek, při kterých so test provádí. Dosud oe tudíž obvykle používalo fluoreoceinu nebo derivátu fluoresceinu (J. London and S. S. Kamel v slmmunooaoeyo GOa,
Univ. Park Press. Baltimore, tíd., 1930, str. 91 až 112). Fluoreaceinem nebo jeho deriváty značné vysokomolekulární nabo nízkoraolekulámí sloučeniny mojí však různé nevýhody, Absorpční a emisní maximo látek značených fluoresceinem se pohybují vo vlnovém rozsahu mezi 490 a 520 nm. Vzhledem k tomu, že značná část analytických metod, především fluorescenční imunoanalýzy, se provádějí v tělních tekutinách, jako například v séru, dochází v uvedeném spektrálním rozsahu k poruchám vlastní fluorescencí biologického materiálu ve vzorku. Zejméně pak je to v důsledku bilirubinu, který rovněž absorbuje světlo v rozsahu vlnových délek kolem 500 nm a emituje fluorescenci.
Mnohá měřicí zařízení.vyžadují značící látky s pokud možno velkým Stokeoovým posunem, U derivátů fluoresceinu činí tento posun nejvýše 30 nm. To vede k problémům s rozptylem světla, což ovlivňuje citlivost fluúrescenčního měření. Pro takovéto případy by byly žádoucí sloučeniny' s větším Stokeaovým posunem, než jaký mají doriváty fluoresceinu.
Úkolem předloženého vynálezu bylo tudíž připravit sloučeniny, která by neměly uvedené nevýhody. Tento úkol byl vyřešen nalezením nových derivátů resorufinu.
Předmětem předloženého vynálezu je tudíž způsob výroby derivátů resorufinu obecných vzorců la a Ib
A (la)
ve kterých
CS 273630 D2 a1 ? 3 4 5
S', a, 0 R, které nohou být vždy stejné nebo ncvzájen rozdílné, znamenají atom vodíku, atom halogenu, karboxyskupinu, korboxaniSoskupinu, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, kyanoskuplnu, nitroskupinu, alkylovou skupinu s 1 oS 5 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinu e 1 až 5 atomy uhlíku, které jsou popřípadě substituovány karboxyskupinou, karboxamidoskupinou, alkoxykcrbonylovou skupinou s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, kyanoskupinou nebo nitroskupinou,
5 přičemž íc a R mohou společně představovat cnelover.ý aromatický uhlovodík se 6 až 10 atomy uhlíku, který je popřípadě substituován jednou nebo několika substituenty svolenými ze skupiny, která je tvořena sulfoskupinou, korboxyskupinou a alkoxyskupinou. s 1 až 5 atomy uhlíku., znamená mústkový člen vytvořený ze zbytků X~, X2, X“1, 0 M, přičemž X1, X2, X^, X^ a M mají dále uvedené významy, znamená zbytek haptenu, antigenu, protilátky, substrátu či nosiče a
200.
799 ve významu substituentů Β , 3*', R', výhodně s 1 až 3 atomy uhlíku, Zvlášn znamená celé číslo od 1 do
Alkylové skupiny, poořípadě nlkoxyskupiny 4 5
R a R obsahují uhlovodíkové řetězce s 1 až 5, to výhodnými jsou methylová skupina a ethylová skupina, popřípadě aethoxyskupina a ethoxyskupina.
Halogenem ve významu substituentů r\ P2, Rj, B^, 3 3J je fluor, chlor, brom nebo jod. Zvláště výhodnými jsou chlor a brom,
Anelovaný aromatický uhlovodík se 6 až 10 atomy uhlíku, který je tvořen substi4 5 tuenty Ir a R , je výhodně představován benzenem r.ebo naftelenem. Zvláště výhodným je benzen. Uvedené aromatické uhlovodíky mohou být nesubstituovány nebo mohou obsahovat jeden nebo několik substituentů, zvolených se skupiny, která je tvořeno sulfoskupinou (—SO-jH), karboxyskupinou (-COOH) nebo alkoxyskupinou s 1 sž 5 atomy uhlíku.
Můstkový člen Z se tvoří obvyklými adičními popřípadě reaktivním substituentem x\ X2, X-1, X^ s M.
V následující tabulce 1 jsou uvedeny příklady možných i p tuentů X“ a X , jakož i mústkový člen Z, vzniklý při této kondenzačními reakcemi mezi významů takovýchto substireakci.
Tabulka 1:
Kěkteré významy reaktivních skupin X1 a X2, jakož i můstkového členu Z, liter;/ z nich vzniká
X2
| -COOH | -NH2 | -CffllH- |
| -CCCTX | -kh2 | -CONH- |
| -C00C02Tlxx | ~KH2 | -COKH- |
| -MGO | -NHCONH- | |
| -NCS | -íiHCSKH- |
| N-- -NH-// 'n A | -nh2 |
| -KCsCH-CO- | -SH |
| -CKC | -nh2 |
| -SO2C1 | -nh2 |
| -COCH2~halogen | -SH |
| -CCCHg-halogen | -OH |
| -(CH2)m -NH^ | -COOH |
-S-CH-CH2-CO-CH=N-SOgKH-coch2-s-coch2-o~(CH2)m -NH-CO-CO-N
COOI*
I®2
-co-n
CO-NHT znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku nebo elektronegativní aktivovanou esterovou skupinu, jako například Il-hydroxysukcinimidoesterovou skupinu
T1 znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku ra znamená celá čís.lo od 0 do 3.
Místo primárních aminů, tak jak jsou uvedeny v tabulce 1, se mohou jako reaktivní 1 2 skupiny X nebo X používat podle smyslu také sekundární aminy za vzniku odpovídajících produktů.
Jako bifunkční sloučeniny obecného vzorce X^-M-X^ jsou výhodné diaminy, dikarboxylové kyseliny, jakož i jejich deriváty, dialdehydy, aminokarboxylové kyseliny a další sloučeniny, které se obvykle používají k výrobě takovýchto kopulovaných sloučenin. Jako příklady takovýchto sloučenin lze uvést piperazin, 1,'2-ethylendiamin, jantarovou kyselinu, glutardialdehyd glycin, sarkosin,0-alanin a piperidin-4-karboxylevou kyselinu.
Ligandera ve významu, symbolu A se rozumí hapten, antigen, protilátka, substrát nebo nosič,
Haptenem se ve smyslu tohoto vynálezu rozumí látka s nižší molekulovou hmotností, která sama o sobě není zpravidla schopna tvořit protilátky. Jako látky s nižší molekulovou hmotností se označují sloučeniny s molekulovou hmotností od asi 100 do asi 2000. Jako příklady takových látek lze uvést fyziologicky aktivní látky, které jsou přítomny v organismu savců nebo lidí, jakož i jejich metabolity nebo léčiva, která se podávají zvířatům nebo lidem, jakož i jejich metabolity. Pojmem hapten se však tozumí také další nízkomolekulámí sloučeniny, pokud tyto sloučeniny mají molekulovou hmotnost pouze ve shora uvedeném rozmezí. Jako příklady možných haptenů lze uvést aminy, steroidy, hormony, glycidy, peptidy, oligonukleotidy, jejich kombinace atd.
Antigeny jsou vysokomolekulární sloučeniny. Antigeny mají obvykle schopnost tvořit v organismu, který byl jimi ošetřen, protilátky. Ve smyslu tohoto vynálezu jsou vysokomolekulórními sloučeninami takové sloučeniny, které mají molekulovou hmotnost alespoň 2000, výhodně však takové sloučeniny, které mají molekulovou hmotnost alespoň asi 5000, Molekulová hmotnost takovýchto sloučenin nemůže být směrem nahoru omezena. Může činit až hodnot 20 milionů, avšak může být ještě i nad touto molekulovou hmotností. Antigeny, které se mohou vyskytovat jako ligandy ve sloučeninách obecného vzorce Ia/Ib, jsou představovány bílkovinami, nukleovými kyselinami, polysacharidy, kombinacemi těchto látek nebo dalšími vysoce molekulárními látkami. Ve smyslu tohoto vynálezu oe pojmem antigen rozumí všechny vysokomolekulární sloučeniny, které mají minimální molekulovou hmotnost alespoň asi 2000.
Protilátky jsou představovány všemi těmi bílkovinami nebo glykoproteiny, které s antigeny nebo hapteny, jakož i se sloučeninami, které jsou od nich odvozeny, specificky reagují a tvoří s nimi komplex. Podle vynálezu se nohou jako ligandy používat ve sloučeninách obecného vzorce Is/Ib intaktní protilátky nebo také jejich fragmenty. Také tyto fragmenty se mohou podle vynálezu označovat jako protilátky pokud mají schopnost vázat antigeny, hapteny a od nich odvozené sloučeniny. '
Substráty se rozumí sloučeniny, které v chemické reakci zůstávají bez prokezotclné změny. Tak například se mohou těmito substráty rozumět všechny ty sloučeniny nebo od nich odvozené látky, na které působí enzymy, jako jsou nopříklad aminokyseliny, peptidy, bílkoviny, glykosidy, oligosacharidy nebo polysacharidy, nukleotidy, nukleinové kyseliny, kombinace těchto látek nebo další enzymaticky směnitelné látky.
Nosiči mohou být přirozeně se vyskytující nebo syntetické, zesítené nebo nezesítěné materiály s určitou formou nebo bez určité formy. Sozumí se jimi jednotlivé sloučeniny nebo směsi sloučenin. Jako nosiče se mohou používat například sloučeniny nebo směsi sloučenin, jako jsou polysacharidy, nukleové kyseliny, peptidy, bílkoviny, kombinace těchto látek nebo také klovatina, lignin, sklo, ulili, syntetické adiční nebo kondenzační polymery, jako polystyren, polyakryl, vinylové sloučeniny, polyester, polyethery a polyamidy nebo také komplexní útvary, jako částice latexu, vesikel, liposomy, části buněčných stěn nebo dokonce celé buňky.
Zásadně se mohou k tvorbě -sloučenin obecného vzorce Ia nebo Ib podle vynálezu používat všechny ligandy, které obsahují volné aminoskupiny, hydroxylové skupiny, morkapto skupiny nebo karboxylové skupiny, přes které se mohou ligandy vázat se základním skeletem resorufinu za mezizařazení můstkového členu. Zvláště výhodnými jsou volné aminoskupiny nebo karboxylové skupiny. Volnými aminoskupinami se rozumí jak primární, tok i sekundární aminoskupiny. Nemají-li ligandy žádné vhodné skupiny, pak se musí tokové skupiny zavést syntetickou cestou, jako například aminoskupiny nebo karboxylové skupiny. Dále je možné, popřípadě přítomné, nereaktivní funkční skupiny takových ligandů chemicky aktivovat. Vzhledem k tomu, že takto vzniklé látky nejsou o původními sloučeninami již zcela shodné, hovoří se o analozích ligandu.
Číslo n udává, kolik molekul resorufinu je vázáno na jeden ligand. Toto číslo závisí na počtu reaktivních skupin v odpovídajícím ligandu nebo analogonu ligandu. Čím více reaktivních skupin ligand má, tím více molekul resorufinu se může vázat, číslo n činí obvykle 1 až 200, zvláště výhodně 1 až 100.
Podle tohoto vynálezu se sloučeniny' obecných vzorců Ia s Ib připravují, tím, že se nn sloučeniny obecných vzorců Ha a lib
(Ila)
(lib) ve kterých
S”, R3, j>4 a j>5 juQj-f významy uvedené pod obecným vzorcem la }? znamená roaktivní skupinu, působí bifunkčr.í sloučeninou obecného vzorce IV
X3 - K - X4 ve kterém
X3 η X4 znamenají reaktivní skupiny a
M ' znamená zbytek biofunkční sloučeniny, o ligandem obecného vzorce III
X2 - A
Ib, a (IV) (III)
C3 273SJO G2 ve kterém
O
V~ znamená reaktivní skupinu a znamená zbytek ligandu, přičemž se popřipadě při jednotlivých reakčních stupních zavedou chránící skupiny a , .. u se mohou převés
2 jotom se opčt odštěpí o jednotlivé reaktivní skupiny X , X , Xu o na jiné reaktivní skupiny.
Reaktivními skupinami ve významu substituentů X , X1, X se nohou rozumět principiálně všecliny obvyklé reaktivní funkční skupiny. Zvláště výhodná jako funkční skupiny jsou zbytky kyselin, jako karboxylových kyselin nebo sulfcnových kyselin, ja koš i od nich odvozené skupiny, jako estery, amidy, onhydridy, hslogenidy, kyselin, nebo různé zbytky' jako primárního nebo sekundárního aminu, kyanátové, icokyonátové. thiokynr.átové, izothiokyanátové, aldehydové, sulfhydrylové, hydroxylové, CÍ -ketohalogenidové zbytky atd.
(W ve kterém
-3 ,4 a X
M o ligandem obecného vzorce III znamenají reaktivní skupiny a znamená zbytek bifunkční sloučenin;/ s 1 až 5 atomy uhlíku (III) ve kterém o
X zněměná reaktivní skupinu, jako skupinu -NH,, -SH,
-CH, -COOH nebo sekundární ominoskupinu odpovídající skupině -KH,, nebo raá význara shora uvedeného substitv,entu X s tím, že pri téže reakci je vyznara substi tuontů X a Ν' stejný nebo navzájem různý, a
A raá shora uvedeny’’ význam, přičemž se popřípadě při jednotlivých reakčních stupních zavedou chránící skupiny a potom se opět odštěpí ra jednotlivé reraktivní skupiny ib, ve kterém
(V)
4 5 , 3 o R mají význam uvedeny shora, reakcí s deriváty resorcinu obecného vzorce VI ve kterém
X
HO
OH
R‘ ,2 (VI)
mají shora uvedený význam a znamená reaktivní skupinu.
Reakce sloučenin obecného vzorce V s deriváty resorcinu obecného vzorce VI se provádí účelně v přítomnosti oxidu manganičitého a kyseliny sírové při nízkých teplotách. Při reakci vznikají nejdříve deriváty resazurinu, které se dají snadno převést na deriváty resorufinu obecného vzorce Ha a lib.
Reakce sloučenin obecného vzorce V se sloučeninami obecného vzorce VI sě provádí obvykle při teplotách mezi -10 a 50 °C, výhodně při teplotách mezi 0 a 30 °C. Zvláště 'šetrně probíhá reakce, jestliže se sloučeniny obecného vzorce V a obecného vzorce VI smísí při teplotě asi 0 °C a reakční směs se pak nechá zahřát na teplotu místnosti. Koncentrace oxidu manganičitého má činit účelně 0, 5 až 5, výhodně 1 až 2 mol/litr. Koncentrace kyseliny sírové by měla činit 0,5 až 5, výhodně 1 až 3 mol/litr.
Redukce zprvu vzniklých derivátů resazurinu na resorufiny obecných vzorců Ha a lib se provádí výhodně v amoniakálním roztoku zinkovým prachem /srov. Nietzki a další, Ber. Dtsch. Chem Ges. 22. 3020 (1889)/nebo natriumborhydridem. Jako rozpouštědla se používá účelně směsí vody a alkoholu, výhodně směsi sestávající z 1 dílu vody a 0 až 4 dílů methanolu. N 1 mol redukované sloučeniny se přidává 1 až 20, výhodně 1 až 5 mol zinkového prachu, popřípadě natriumborhydridu. Teplota reakčního roztoku se přitom udržuje na -10 až +35 °C, výhodně na +5 až +10 °C. Přesné dodržování teplotního rozsahu se ukázalo jako nutným opatřením pro jednoznačný průběh reakce. Bez chlazení vede exothermní reakce k vedlejším produktům, které lze těžko oddělit.
Za zvolených mírných podmínek probíhá reakce mezi látkami obecného vzorce V a obecného vzorce VI jednoznačně a s dobrým výtěžkem. Zvolený způsob syntézy je ovšem schopen obměn. To otevírá zejména s ohledem na přípravu nesymetricky substituovaných derivátů resorufinu četné možnosti syntézy. V důsledku tohoto mimořádně variabilního způsobu výroby je dostupná celá řada sloučenin značených resorufinem, které svými rozdílnými substituenty v různých polohách chromoforu otevírají široký rozsah barev.
Před reakci derivátů resorufinu obecných vzorců Ha a lib se sloučeninami obecného vzorce IV a III se sloučeniny obecných vzorců Ha a lib převádějí účelně n8 deriváty tríocyldihydroresorufinu obecného vzorce VII ο
CS 272630 Ε2
(VID ve kterém τ 2 *3 / c: τ
HA, B\ S . 2\ ?? s X1 P.6 nají význam uvedeny' v obecných vzorcích Ila a lib o zněměná alkylovou skupinu, arylovou skupinu nsbo aralkylovou skupinu.
Alkylovou skupinou ve vyznánu substituentu B ja alkylové skupina 3 1 až 5 nicmy uhlíku, výhodné s 1 až 3 atomy uhlíku. Zvláště výhodnou je methylová skupino ε ethylová skupina. Jako arylová skupina je zvláště výhodná fenylová skupina. Arelkylcvá skupina obsahuje výhodně jako arylovou část fenylovou skupinu, zatímco alkylová část obsahuje 1 až 5 atomů uhlíku, výhodně 1 až 3 atomy uhlíku. Jako aršíkylové skupina je zvláště výhodná benzylová 3kupina.
Za účelem výroby triacylderivátů obočného vzorce VII se odpovídající deriváty resorufinu. obecných vzorců Ila a lib nejdříve elektrochemicky redukují pomocí silného redukčního činidla, jako například chloridu cínatého nebo octanu chronnatého. Zs účelem redukce se zahřívá derivát resorufinu 10 minut až jednu hodinu se 2 až 10, výhodně sc 2 až 6 ekvivalenty redukčního činidla ve vhodném rozpouštědle, výhodně e chloridem cínatýn v 5 sž 35'?A vodné chlorovodíkové kyselin?. Při ochlazení ce vyloučí dihydroderivát. Acylacc se provádí obvyklým způsobem působením vhodného acylačního činidla, například acetanhydridu. benzoylchloridu atd. Výhodně se sloučeniny obecného vzorce VII vyrábějí postupem prováděným v jediné reakční nádobě redukční acylocí derivátů resorufinu obecného vzorce Ila a lib. Odpovídající derivát resorufinu. sc pro tyto účely zahřívá ee 2 až 6 ekvivalenty redukčního činidla po dobu 5 minut až 3 hodin za přítomnosti acylnčního činidla ve vhodném rozpouštědle k varu pod zpětným chladičem nebo při teplotě místnosti po dobu 4 až 16 hodin.
V takto získaných derivátech triacyldihyčrorescrufinu obecného ______ ___ ___ přeměnit reaktivní skupinu X^ před další reakcí popřípadě na jinou reaktivní skupinu. Zejména, jestliže X“ znamená karboxylovou skupinu, je účelné převést tuto skupinu na chlorid karboxylové kyseliny, na anhydrid karboxylové kyseliny nebo na reaktivní esterovou funkci. To lze alkoholů, halocenidů pozici četné postupy provádět nejrůzr.ěj
K-hydroxyaukcinim známá z literatury čími způsoby, například působením karbodiimidů idu atd. Odborníkovi jsou v tomto směru k dis. Zvláště výhodné je převedení funkce korbexylové kyseliny ns chlorid karboxylové kyseliny, například působením smčsi hionylchlorid a dimethylformamidu nebo směsi oxalylchloridu a dimethylformamidu, jakož i na aktivovaný ester, například na N-hydroxysukcinimidester.
Obsahuje-li ligand nebo analog ligandu volnou aminoskupinu, hydroxylovou skupinu nebo merkaptoskupinu, pak mohou tyto ligandy reagovat jako reaktivní skupiny X2. Ligandy, popřípadě analoga ligand vzorce X2-A pak mohou přímo reagovat se sloučeninami obecného vzorce Ila a lib, popřípadě po předchozí přeměně na deriváty triacyldihydroresorufinu nebo/a po aktivaci skupiny X3- za vzniku amidů, esterů nebo thioesterů. Na základě své stability se za zvláště výhodný pokládá vznik alespoň jedné amidové vazby, přičemž se za účelem jejího vzniku vychází výhodně ze sloučenin obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě VII, ve kterých X^ znamená halogenid karboxylové kyseliny. Jeho reakce s ligandem, který obsahuje aminoskupinu, popřípadě s analogonem ligandu, který obsahuje aminoskupinu, se provádí podle obvyklých metod, například v organickém rozpouštědle, jako v dichlormethanu, za přídavku terciárního aminu, jako triethylaminu, jako báze. Vždy podle velikosti ligandu, popřípadě analogonu ligandu a s tím souvisejícím počtem jeho volných aminoskupin a podle použitého množství sloučenin obecných vzorců Ila/IIb se může na jednu molekulu ligandu, popřípadě na jednu molekulu analogonu ligandu vázat několik chromoforů.
Použijí-li se k výrobě sloučenin obecných vzorců Ia a Ib podle vynálezu triacylderiváty obecného vzorce VII, pak se mueí po reakci acylové zbytky části dihydroresorufinu, které byly použity jako chránící skupiny, selektivně odštěpit a výsledný zbytek leukobarviva se oxiduje na chromofor sloučeniny obecného vzorce Ia/Ib.
O-Acylové zbytky části dihydroresorufinu se odštěpují zvláště výhodně reakcí se 2 až 10 mol, výhodně se 2 až 4 mol siřičitanu sodného, ve směsi vody a rozpouštědla, které je rozpustné ve vodě, jako 1,4-dioxanu, methanolu nebo ethanolu, výhodně ve směsi vody a 1,4-dioxanu v poměru 1:1. Reakční teplota Siní 20 až 100 °G, výhodně 80 až 100 °C. Za těchto reakčních podmínek se dají deriváty N-acyldihydroresorufinú vyrábět ve vysokých výtěžcích.
Oxidace části dihydroresorufinu na sloučeniny obecných vzorců Ia a Ib se může provádět působením mírných oxidačních činidel. Výhodně se používá hexakyanoželezitanu draselného, který je přítomen ve dvojnásobném až šestinésobném molárním nadbytku, zvláště výhodně ve dvojnásobném až čtyřnásobném molárním nadbytku vůči leukobarvivu ve směsi vody a rozpouštědla, které je mísitelné s vodou, jako je 1,4-dioxan, methanol nebo ethanol, výhodně ve směsi vody a methanolu v poměru 3:1. Reakce se výhodně provádí v přítomnosti pomocné báze, jako hydrogenuhličitanu sodného nebo uhličitanu sod ného. Reakční teplota činí 10 až 40 °C, výhodně pak se pracuje při teplotě místnosti.
Zvláště výhodně je možno provádět selektivní odštěpení N-acylového zbytku, jež byl použit.jako chránící skupina, a oxidace části dihydroresorufinu v jediné reakční nádobě. Za tím účelem se k N-acylovanému derivátu dihydroresorufinu ve směsi vody a methanolu v poměru 3:1 přidá nejdříve 2 až 4 mol hydrogenuhličitanu sodného a ekvimolární množství IN roztoku hydroxidu sodného a potům 2- až 4-násobný molární nadbytek hexakyanoželezitanu draselného. Po asi 10 minutách až 2 hodinách, výhodně po 0,5 hodině při teplotě místnosti je reakce ukončena.
Je účelné spojit sloučeniny obecných vzorců Ila/IIb s ligandem, popřípadě s anaT A logem ligandu III za mezizařazení seskupení X -M-X\ Pro tyto Účely se mohou používat všechny sloučeniny,'která se obvykle používají pro tuto reakci, výhodně s alespoň dvěma reaktivními skupinami. Zvláště výhodné jsou diaminy nebo aminokarboxylové kyseliny. Volba se přitom řídí podle druhu funkčních skupin X1 a X2, které se mají kopulovat se sloučeninou tvořící můstek.
Sloučeniny, které se získají reakcí derivátů resorufinu obecných vzorců Ila/IIb s bifunkčními sloučeninami obecného vzorce IV v jednom nebo v několika stupních, napři klad pres sloučeniny obecného vzorce VII, lze znázornit obecnými vzorci Vlila a VHIb
(Vlila)
(9IIIb) ve kterých r\ R2, r3, r4 a mají významy uvedeny pod obecnými vzorci la a lb a
M a X4 mají významy uvedené pod obecným vzorcem IV a
X^ znamená funkční skupinu, která vzniká reakcí skupin X^ a X^.
Funkčními skupinami X^ mohou být všechny v úvahu přicházející skupiny, které vznikají reakcí reaktivních skupin uvedených ve významu substituentů X1 a X^ navzájem. Výhodnými skupinami X1^ jsou amidy, thioethery, ethery, sekundární nebo terciární aminy, ureidoskupiny a thioureidoskupiny atd.
Znamená-li substituent X1 v obecných vzorcích Ila/IIb, popřípadě v obecném vzorci VII funkci karboxylové kyseliny, popřípadě od ní odvozenou reaktivní skupinu a předsta vují-li reaktivní substituenty X2 ligandu, popřípadě analogonu ligandu aminoskupiny, hydroxylové skupiny nebo merkaptoskupiny, pak se volí účelně wezimůstek X^-M-X4, přičemž X^ znamená aminoskupinu a X4 znamená funkci karboxylové kyseliny, popřípadě jejího reaktivního derivátu. Terminální aminoskupina se může vázat na funkci karboxylové kyseliny sloučenin obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě obecného vzorce VII, a terminální karboxyskupina se může vázat na ligand nebo analogon ligandu X2-A. Představují-li však jak X , tak i X vždy funkci karboxylové kyseliny, popřípadě od ní odvozený fc aktivovaný derivát, pak ae jako mezimůstek volí diaminy.
Heakce derivátů resorufinu obecného vzorce Ila a lib s bifunkčním mezimůatkem obecného vzorce IV a ligandem’, popřípadě anologonem ligandu se provádí výhodně ve dvou stupních, Nejdříve se mohou spojit sloučeniny obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě po předchozím převedení na aktivní sloučeniny obecného vzorce VII, s mezimůatkem obecného vzorce IV. Z této reakce vzniklé deriváty se pak mohou ve druhém stupni uvádět v reakci s ligan dem, popřípadě s analogonem ligandu obecného vzorce III. Je samozřejmě možné volit i obrácené pořadí, tj. vázat v prvním stupni mezimůstek obecného vzorce IV na ligand, popřípadě na analogon ligandu obecného vzorce III a získaný produkt potom ve druhém stupni nechat reagovat s derivátem resorufinu obecného vzorce Ila/IIb, popřípadě s aktivovanou sloučeninou obecného vzorce VII.
Jako aminokarboxylové kyseliny se používají výhodně aminokarboxylové kyseliny. Jako zvláště výhodné se ukázaly glycin, alanin, sarkosin a piperidin-4-karboxylová kyselina. kopulace derivátů resorufinu obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě VII s aminokarboxylovými kyselinami za vzniku amidické vazby se provádí podle metod, které jsou každému odborníkovi běžné. Zcela zvláště výhodné je pro tyto účely použití methylesterů nebo terc.butylesterů odpovídajících aminokyselin. Po vzniku amidické vazby se popřípadě odštěpí předtím zavedené chránící skupiny a to selektivně podle obvyklých metod. Necháli se reagovat například aktivovaný derivát obecného vzorce VII a aminokarboxylovou·kyselinou, která má chráněnou karboxyskupinu, pak je zapotřebí selektivně hydrolyzovat 0a N-acylové skupiny dihydroresorufinového skeletu, leukobarvivo opět oxidovat na resorufinový systém a potom odštěpit za obvyklých podmínek chránící skupinu karboxyskupiny váženou na aminokarboxylovou kyselinu, výhodně působením trifluoroctové kyseliny. Volná karboxylová kyselina se potom může aktivovat za účelem konjugace ligandu nebo analogonu ligandu obecného vzorce III příslušným způsobem, jak popsáno pro deriváty resorufinu dbecných vzorců Ila a lib. Tato konjugace sama se provádí analogicky, jak je uvedeno pro přímou konjugaci ligandů nebo analog ligand na deriváty resorufinu obecných vzorců Ila a lib.
V případě ligandů obsahujících karboxylové skupiny nebo analogů ligandů obsahujících karboxylové skupiny je účelné převést deriváty resorufinu obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě obecného vzorce VII na sloučeniny, které obsahují aminoskupiny, které potom lze uvádět v reakci s ligandy, které obsahují karboxylové skupiny, popřípadě s analogy ligand, které obsahují karboxylové skupiny, za vzniku amidické vazby. Pro tento Účel se jako zvláště jednoduchá a výhodná ukázala reakce sloučenin obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě obecného vzorce VII s diaminy (obecný vzorec IV s aminoskupinou ve významu X^ a X^). Výhodnými diaminy v tomto smyslu jsou například piperazin, 1,2-diaminoethan nebo 1,3-diaminopropan.
Převedení derivátů resorufinu obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě obecného vzorce VII s diaminy na deriváty s volnou aminoskupinou se provádí podle metod, které jsou každému odborníkovi běžné. Aby se dosáhlo zvláště vysokých výtěžků monosubstituovaných diaminů, uvádějí se do reakce takové diaminy, které mají pouze jednu reaktivní aminoskupinu á jejichž druhá funkční skupina je blokována chránící skupinou. Zásadně jsou použi telné všechny obvyklé chránící skupiny aminoskupiny, které se mohou znovu odštěpit bez nepříznivého vlivu na amidickou vazbu, Jako zvláště výhodné se ukázalo použití terč. butoxykarbonylové chránící skupiny nebo benzoyloxykarbonylové chránící skupiny.
Po reakci diaminů s jednou chráněnou aminoskupinou s deriváty resorufinu obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě VII se případně zavedené chránící skupiny znovu odštěpí a popřípadě se leukobarvivo vzniklé jako meziprodukt oxiduje na resorufinový systém. Odště pění chránící skupiny aminoskupiny z navázaného diaminů se přitom provádí za obvyklých podmínek, výhodně působením trifluoroctové kyseliny.
Takto získané deriváty resorufinu obsahující aminoskupiny se mohou konjugovat obvyklým způsobem s ligandy nebo s analogy ligandů obecného vzorce III, které obsahují
ny aktivovat. Tato aktivace se může provádět shora popsaným způsobem. Výhodné je použití ligandů popřípadě analogů ligandů obecného vzorce III, ve kterém X2 znamená aktivované esterové skupiny.
Jako zvláště výhodné se ukázaly především K-hydroxysukcinimidestery. Konjugace sama se provádí zásadně analogicky podle způsobu, který byl popsán pro přímou konjugaci derivátů resorufinu s ligandy nebo s analogy ligandů s přihlédnutím k zaměněným úlohám funkčních skupin.
Další reakce produktů, které se získají po kopulaci derivátů resorufinu obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě obecného vzorce VII s mezimústkem obecného vzorce IV, t j. Z3-ií-X4, s nízkomolekulárními ligandy X^-A, například a hapteny, se provádí výhodně ve směsi vody nebo pufru a rozpouštědla rozpustného ve vodě, jako například 1,4-dioxanu, methanolu nebo ethanolu. Výhodně se používá směsi O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,5 a 1,4-dioxanem v poměru 1:1, Je rovněž možné sledovat průběh reakce chromatografií na tenké vrstvě,Seakce může trvat mezi 1 a 24 hodinami, většinou je však již po 1 až 18 hodinách zcela ukončena.
Pro reakci derivátů resorufinu obecných vzorců Ila/IIb, popřípadě obecného vzorce VII nebo obecných vzorců VIHa/VlIIb, s vyaokomolekulárními ligandy obecného vzorce III, se jako zvláště výhodné ukázaly K-hydroxysukcinimidestery. Tak postačí například při kopulaci na králičí IgG již 6 mol derivátu resorufinu na 1 mol IgG, aby se dosáhl stupeň značení 3 molekul resorufinu na 1 mol IgG, Fluorescenční barviva, které byla dosud obvyklá pro tento účel, a která mají maximální vlnovou délku absorpce % max /· 470 nm, obsahující jako reaktivní skupinu isothiokyanátový zbytek nebo zbytek chloridu sulfonové kyseliny, jako například fluoreaceinisothiokyanát nebo texasská červeň, se musí za účelem kopulace na králičí IgG používat v podstatně vyšším nadbytku bar viva, aby se dosáhlo stejného stupně značení.
Konjugace vysokomolekulámí cli sloučenin obecného vzorce III, jako například bílkovin, se provádí v pufru, zvláště výhodně v O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH
Eeakční teplota má vždy činit'10 až 35 °C. Výhodně se reakce provádí při teplotě místnosti.
Ha základě zvláště příznivých spektrálních vlastností se předložený vynález rovněž týká použití sloučenin obecného vzorce la a Ib při analytických postupech, při kterých se zjištuje popřípadě měří fluorescenční vlastnost sloučenin obecného vzorce la/lb, popřípadě produktů přeměny těchto sloučenin v závislosti na použitém způsobu přípravy.
Při heterogenních imunoanalýzách je zapotřebí rozdělení ligandů vázaných na protilátky a volných ligandů srážením vhodnými látkami nebo použitím protilátek vázaných na pevné nosiče dříve než ee stanovuje buň koncentrace volných ligandů nebo koncentrace vá zaných ligandů. Při homogenních imunoanalýzách se stanovení komplexní vazby protilátka-ligand ve vzorku provádí bez takového rozdělování. K metodám homogenní imunoanalýzy počítáme například fluorescenční imunoanalýzy s řízeným zastavením reakce, fluorescenční imunoanalýzy a použitím pomocných prostředků, jakož i fluorescenční polarisační metody, při nichž se používá jako značkovacích prostředků fluorescenčních látek. Zvláště posléze uvedená metoda postrádá dosud vzhledem k nevýhodám používaných upotřebitelných fluorescenčních značkovacích prostředků, které byly popsány v úvahu, vhodné značkovací prostředky. Vzhledem k tomu, že,sloučeniny obecných vzorců la nebo Ib mají absorpční maxima a emisní maxima, která leží vysoce nad maximy biologického materiálu, která působí rušivě v tělních tekutinách v důsledku své vlastní fluorescence, jsou zvláště vhodné pro použití při fluorescenční polarisační imunoanalýze. Další výhoda sloučenin vyráběných postupem podle vynálezu spočívá v tom, že při vhodné substituci mají zvláště vysoký Stokesův posun až do asi 70 nm.
Fluorescenční polarizační imunoanalýza je zásadně založena pa principu obvyklé fluorescenční imunoanalýzy. z
Jestliže se vhodné fluorescenčně značené ligandy aktivují za účelem fluorescence lineárně polarisovaným světlem, pak molekula může vzhledem k nepatrnému časovému zpomalení mezi aktivací a emisí - dříve než začne emitovat záření - rotovat. Tím se pootočí rovina lineárně polarisovaného světla rovněž o určitý úhel. U řady molekul může během tohoto krátkého časového intervalu docházet rotační difusí k určité depolarisaci fluorescenční emise. Pro polarisaci emitované fluorescence platí, že je o to vyšší, oč větší je molekula, a v důsledku toho čím pomalejší-je rotace. Tento vzájemný vztah lze využít pro měření vazby ligandů na protilátky, protože volné, značená ligandy mají menší objem molekuly než komplexy značených ligandů navázaných na protilátky. Obráceně je pak polarizace proporcionální vůči koncentraci ligandů, která se stanovuje a která je přítomna ve vzorku.
Koncentrace značených ligandů nebo analogonů ligandů a protilátky, které je zapotřebí pro takovéto imunologické postupy, se řídí podle použitého měřicího zařízení, jakož i podle příslušných charakteristických vlastností použitého značeného ligandů nebo značeného analogonů ligandů a samotné protilátky. Zásadně závisí tyto koncentrace přirozeně také na koncentraci určovaného ligandů a musí se tudíž empiricky zjišío•vat. Tato zjištění může každý odborník provést jednoduchou optimalizací.
Koncentrace ligandů, která se má určit, kolísá obecně od asi 10 až do asi 10-^ M. Je výhodné, jestliže se pro měření upraví koncentrace ligandů ve stanovovaném vzorku od asi 10“^ do asi 10^2 M, zvláště výhodně od asi 10“^ do asi 10-^ M. Vyšší koncentrace ligandů se mohou měřit po zředění původního vzorku.
Měření se provádí při určitých hodnotách pH, které mohou dosahovat od asi 3 až do asi 12. Obvykle se pohybují v xozaezí od asi 5 až do asi 10, výhodně v rozsahu pH ad asi 6 do asi 9. K dosažení a udržování hodnoty pH během měření se mohou používat různé pufry, jako například borátový pufr, fosfátový pufr, karbonátový pufr nebo Tris-pufr. Pro předložený vynález není rozhodující jaký pufr se použije. Výběr se řídí především použitou protilátkou, podle ligandů, který se „má stanovovat, jakož i podle použitého fluorescenčního značkovacího prostředku.
Fluorescenční polarisační imunoanalýzy se provádějí výhodně při konstantní teplotě, Obvykle lze volit teplotu v rozsahu od asi 0 do 50 °C, výhodně v rozsahu od asi 10 do asi 40 °C.
Přesný vzájemný vztah mezi polarisaci a koncentrací ligandů nebo analogonů ligandu, který se stanovuje, lze vždy odečíst z kalibrační křivky. Takové křivky se získají tím, že se změří hodnoty polarisace roztoků látek a rozdílnými avšak známými koncentra cemi. Neznámé koncentrace ligandů ve zkoumaném vzorku se pak mohou při znalosti polari sace zjistit z takovýchto kalibračních křivek.
Širokou oblast použití sloučenin obecných vzorců Ia a lb, které se vyrábějí postupem podle vynálezu, nutno spatřovat v jejich obecné použitelnosti jakožto fluores cenčního značkovacího prostředku. Tak se mohou například pro imunofluorescenční mikroskopii učinit viditelnými pomocí fluorescenčně značných protilátek jakožto antigeny bílkoviny nebo celé buňky.· Odpovídajícím způsobem lze rovněž přímo pozorovat rozdělení haptenu nebo antigénu v buňce, jestliže se do buňky přivede příslušná fluorescenčně značená sloučenina, a sleduje se například pod mikroskopem. Přitom se - na rozdíl od shora popsaných fluorescenčních imunoanalýz - nemění fluorescenční vlastnosti derivátů resorufinu.
Claims (2)
- (1)Vzorek: lidské sérum od dárce se známým množstvím difenylhydantoinu. Ke zhotovení kalibrační křivky se použije sérum lidského dárce, které obsahuje difenylhydantoin v koncentracia) 2,5 /Ug/mlb) 5 yug/mlc) 10 yug/mld) 20 /Ug/mle) 40 yUg/ml. roztok protilátky:450 /Ug protilátky/ml O,1M roztoku natriumfosfátového pufru (pH 7,8)Protilátky se získají imunisací ovcí difenylhydantoinem, který je vázán na albumin hovězího séra, podle obvyklých metod.Antisérum se čistí srážením síranem amonným a chromatografii na celulose DEAE, (3) roztok difenylhydantoinresorufinu (10~6 M):kbnjugát difenylhydantoin-resorufin z příkladu li) v O,1M roztoku natriumfosfátového pufru (pH 7,8).Naměřené výsledky, které byly získány pomocí roztoků difenylhydantoinu la), lb), lc), Id) a le), jsou znázorněny na připojeném výkresu. Na tomto výkresu jsou vyneseny koncentrace difenylhydantoinu vzorců (/Ug/ml) vůči naměřeným.hodnotám polarisace (mP).Pomocí takové kalibrační křivky lze také stanovovat koncentraci difenylhydantoinu ve vzorcích s neznámým obsahem difenylhydantoinu.Srovnatelná kalibrační křivka se rovněž získá v případě, že se místo shora používaného konjugátu difenylhydantoinu z příkladu li) použije vždy konjugátu difenylhydantoinu z příkladů 2, 7 nebo 9f).Příklad 16Stanovení aktivity endoglykosidázy pomocí resorufin-(vyšší)glykopeptidu na bázi mannosyPoznámka: v další Části textu bude používáno výrazu (vyšší) mannosaglykopeptid z důvodu jednoduššího vyjádření vlastního významu tohoto slova, kterým je vyšší glykopeptid, ve kterém je částí cukru mannosa.a) Značení (vyšší)mannosaglykopeptidu K'-hydroxysukoinimidesterem H-(4-resorufinylkarbony1)-sarkosinu50 mg (vyšší)mannosaglykopeptidu (vyrobeného podle Huanga a dalších, Carbohydrate Ses. 1^, 127-137 (1970) se smísí s přídavkem 10 ml O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,0. Boztok se dodatečně upraví na pH 8,0. Potom se přidá 25 mg N*-hydroxysukcinimidesteru N(4-resorufinylkarbonyl)sarkosinu rozpouštěného ve 3 ml dioxanu, po jedné hodině se znovu přidá stejné množství N-hydroxysukcinimidesteru barviva ve 3 ml dioxanu. Směs se míohá 14 hodin při teplotě místnosti, potom se odpaří ve vakuu dioxan a zbytek se zředí vodou na obsah 70 ml a potom pufrem A (= 0,02M roztok TEIS-HC1, 2 mM chloridu hořečnatého, 2 mM chloridu manganatého, 2 mM chloridu vápenatého, pH 7,2) na objem 140 ml. Hodnota pH se dodatečně upraví vodným amoniakem na 7,2. Přitom vzniklá sraženina se odstředí. Supernatant se přenese na sloupec Con A-Sepharose (l.xl5 cm). Pufrem A se vymývá volné barvivo. Jakmile protékající kapalina již není červená, vymývá se 1. frakoe resorufin-(vyšší)mannosaglykopeptidu pomocí 2% methylmannosidu v pufru A jakožto elučním Činidlem (asi 100 ml). Potom se vymývá 2. frakce 2% vodným methylmannosidem. Obě frakce se dialyzují proti vodě a lyofilizují se. Obě frakoe jsou vhodné ke stanovování aktivity endoglykosidázy, které je popsáno v odstavci b) dále.b) Stanovení aktivity endoglykosidázyEesorufin-(vyšší)mannosaglykopeptid se inkubuje ve vhodném pufru s endoglykosidázou, například endoglykosidáza H a citrátový pufr pH 5,5 (= vzorek 1). Paralelně k tomuto pokusu se současně provádí pokus se vzorkem, který neobsahuje ěndoglykosidázu, ale jinak je shodný (= vzorek 2). Po inkubaci se k oběma vzorkům přidá Con A-Sepharose a směs se protřepává, aby se vázal resorufin-(vyšší)mannosaglykopeptid. Peptid značený resorůfinem, u něhož byla část cukru v důsledku aktivity enzymu odštěpena, se neváže.Po 15 minutách se Con A-Sepharose odstředí, supernatant se upraví na pH 7,5 a změří se fluorescence (excitace například 550 nm, emise JVmax ” ^95 nm). Eozdíl mezi vzorkem 1 a nulovou hodnotou (= vzorek 2) udává mnžství Štěpeného resorufin-(vyšší)mannosaglykopeptidu a je tudíž mírou aktivity enzymu.pSbdmět VYNÁLEZU ve kterýchE1, E2, Ε·\ p4 θ K5j ]rterj4 mohou být vždy stejné nebo navzájem rozdílné, znamenají atom vodíku, atom halogenu, karboxyskupinu, karboxamidoskupinu, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, kyanoskupinu, nitroskupinu, alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, které jsou popřípadě substituovány karboxyskupinou, karboxamidoskupinou, alkoxykarbonylovou skupinou s 1 až 5 atomy uhlíku v alkoxylové části, kyanoskupinou nebo nitroskupinou,4 5 přičemž E a E mohou společně představovat anelovany aromaticky uhlovodík se 6 až 10 atomy uhlíku, který je popřípadě substituován jednou nebo několika substituenty svolenými ze skupiny, která je tvořena sulfoskupinou, karboxyskupinou a alkoxyskupinou a 1 až 5 atomy uhlíku,Z znamená můstkový člen vytvořený ze zbytků X”1·, X2, X^, Χ?ί a M, přičemž X1, X2, X-\ χ4 θ M mají dále uvedené významy,A znamená zbytek haptenu, antigénu, protilátky, substrátu či nosiče a n znamená celé číslo od 1 do 200, vyznačující se tím, že se na sloučeniny obecných vzorců lía a lib ve kterýchR1, R2, R^, a R·5 mají významy uvedené pod obecným vzorcem la a Ib, aX1 znamená reaktivní skupinu, jako skupinu -COOH, -COOT, -GOOCOgT·1·,-NCO, -NCS,-HC=CH-CO-,-CCH^-NHj,-CHO, -SO2C1, nebo-CG-N !00T, přičemžT znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku nebo elektronegativovaný zbytek esteru, jako například zbytek N-hydroxysukcinimidesteru,Τ’*· znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku a m znamená celé číslo od 0 do 3, aHal znamená atom halogenu, a v případě skupin obsahujících primární aminoskupinu znamená rovněž skupinu s odpovídající sekundární aminoskupinou, nebo má význam dále uvedenéo 12 ho substituentu X s tím, že význam substituentů X a X je stejný nebo navzájem různý, působí diaminem, dikarboxylovou kyselinou nebo jejím derivátem, čialdehydem nebo aminokarboxylovou kyselinou obecného vzorce IVX3 - M - X4 (IV) ve kterémX3 a X4 znamenají reaktivní skupiny aM znamená zbytek bifunkční sloučeniny s 1 až 5 atomy uhlíku, a ligandem obecného vzorce IIIX2 - A (III) ve kterém oX znamená reaktivní skupinu, jako skupinu -NHg, -SH, -OH, -COOH nebo sekundární aminoskupinu odpovídající skupině -NH0, nebo má význam shora 1 uvedeného substituentu X s tím, že při téže reakci je význam substituentů χΐ a X2 stejný nebo navzájem různý, aA má shora uvedený význam, přičemž se popřípadě při jednotlivých reakčních stupních zavedou chránící skupiny a potom se opět odštěpí a jednotlivé reaktivní skupiny χ·5·, X2, X3 a X4 se popřípadě převedou na jiné reaktivní skupiny.1,6 g triacetylderivátu popsaného v příkladu 9b) se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu 8d) s oxalylchloridem a N-butoxykarbonylpiperazinem. Výtěžek: 1,2 g.'ή-NMH spektrum (deuterochloroform):cf = 1,49 (s, 9H), 2,12, 2,27, 2,46 (vždy s, 12H), 3,0- 3,9 (m, 8H),7,03 (d, J = 9 Hz, IH), 7,16 - 7,94 ppm (m, 6H).d) N'-butoxykarbonylpiperazid 9-hydroxy-5-benzo/a/-fenoxazon-8-karboxylové kyselinyAnalogickým postupem jako je popsán v příkladu lf) se z 0,93 g triacetylderivátu z příkladu 9c) získá 0,51 g produktu.Hodnota Ef = 0,69 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).e) Trifluoracetát piperazidu 9-hydroxy-6-benzo/a/-fenoxazon-8-karboxylové kyselinyZ 0,5 g butoxykarbonyl-chráněné sloučeniny popsané v příkladu 9d) se analogickým postupem jako je popsán v příkladu Ih) získá 0,5 g produktu.Hodnota E^. = 0,02 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).£) Kopulace piperazidu 9-hydroxy-5-benzo/a/fenoxazon-8-karboxylové kyseliny s H-hydroxysukcinimidesterem 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyselinyZ 50 mg piperazidu, který byl připraven podle příkladu 9e) a 150 mg N-hydroxysukcinimidesteru 2-(l-difenyIhydantoinyl)octové kyseliny se analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) získá 70 mg produktu.Hodnota E^ - (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).UV/VIS (0,1 molární roztok kaliumfosfátového pufru, pH 8,0):- 560 nm yG maxFluorescenční emise: _ = 615 nm.jC max ^H-NME spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):3,0- 4,5 (m, 10H), 6,37 (s, IH), 6,80 (d, J = 8 Hz, IH),7,2 - 7,35 (m, 10H), 7,35 - 8,0 (m, 3H), 8,10 (dvojitý d,J = 8 a 2 Hz, IH), 8,56 (dvojitý d, J = 8 a 2 Hz, IH),9,60 ppm (s, IH).Příklad 10 (1-dif enylhydantoinylmethylkarbonyDpiperazid 8-ethylresorufin-4-karboxylové kyselinya) 6-ethyl-4-nitrosoresorcinAnalogickým postupem jako v příkladu 8a) se z 7,5 g 4-ethylresoreinu, 4,5 g hydroxidu draselného a S ml isopentylnitritu získá vo formě žluté pevné látky 6-ethyl-4~nitrosoresorcin.Výtěžek: 7,5 g.Hodnota R^ = 0,37 (silikagel, rozpouštědlový systém;směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).b) 8-ethylresorufin-4-karboxylová kyselinaAnalogickým postupem jako je popsán v příkladu la) se z 7,4 g 6-ethyl-4-nitrosoresorcinu, 6,8 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny, 3,9 g oxidu manganičitého a 5 ml koncentrované kyseliny sírové po redukci 8 g práškového zinku získá 9,5 g produktu.Hodnota B^, = 0,05 (silikagel, rozpoustědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).c) H*-butoxykarbonylpiperazid K,0,0-triacetyl-8-ethyldihydroresorufin-4-karboxylové kyselinyAnalogickým postupem jako je popsán v příkladu ld) se z 7,7 g 8-ethylresorufin~-4-karboxylové kyseliny, 15,4 g chloridu cínatého, 30 ml ledové kyseliny octové a15,3 ml acetanhydridu získá N,0,0-triacetyl-8-ethylresorufin-é-karboxylová kyselina, která se jako surový produkt analogickým postupem jako je popsán v příkladu 1c) přímo dále zpracovává na chlorid kyseliny a analogickým postupem jako je popsán v příkladu le) se přímo dále zpracovává na butoxykarbonylpiperazid.Výtěžek: 4 g.Hodnota = 0,86 (silikagel, rozpoustědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).d) H - butoxykarbonylpiperazid 8-ethylresorufin-4-karboxylové kyseliny4 g N -butoxykarbonylpiperazidu N,0,0-triacetyl-8-ethyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu lf) a lg) odpovídající N'-butoxykarbonylpiperazid karboxylové kyseliny.Výtěžek: 0,5 g.Hodnota = 0,67 (silikagel, rozpoustědlový systém:směs chloroformu a methanolu v poměru 4:1).ejTrifluoracetát piperazidu 8-ethylresorufin-4-karboxylové kyseliny330 mg odpovídajícího butoxykarbonylpiperazidu se nechá v klidu 1,5 hodiny ve 35 ml směsi dichlormethanu a trifluoroctové kyseliny v poměru 6:1. Po odpaření se zbytek digeruje s etherem, produkt se odfiltruje a vysuší.Výtěžek: 350 mg.Hodnota = 0,33 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1).f) Reakce s K-hydroxysukcinimidesterem 2-(1-difenylhydantoinyl)octové kyselinyGS 273630 B2Analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 325 mg trifluoracetátu piperazidu 8-ethylresorufin-4-karboxylové kyseliny a 435 mg N-hydroxysukcinimidesteru 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyseliny získá 120 mg produktu.Hodnota = 0,43 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).^H-NMR (perdeuterovaný dimethylsulfoxid);(f = 1,15 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,52 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 3,1 - 4,0 (m,8H), 4,25 - 4,45 (m, 2H), 6,42 (s, široký, 1H), 6,94 (d, J = = 9,0 Hz, lHj, 7,3 - 7,5 (m, 11H), 7,68 (d, J = 9,0 Hz, 1H),9,54 (s, 1H), 11,2 ppm (s, široký, 1H).UV/ViS (0,1 molární roztok kaliumfosfátového pufru, pH = 8,0):„ = 575 nm.fo maxFluorescenční emise: = 598 nm.λ maxPříklad 11 (l-difenylhydantoinylmethylkarbonyl)piperazid 8-chlorresorufin-4-karboxylové kyselinya) 8-chlorresazurin-4-karboxylová kyselinaZ 17,3 g 4-chlor-6-nitrosoresorcinu (připraveného podle Plampina a Gaina,J. Med. Chem. ť>, 247 (1963)), 15,4 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny, 8,6 g oxidu manganičitého a 10,7 ml koncentrované kyseliny sírové se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu la) 8-chlorresazurin-4-karboxylová kyselina.Výtěžek: 17,1 g.Hodnota R^ = 0,58 (silikagel, rozpouštědlový systém;směs butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1).b) N,0,O-triacetyl-8-chlordihydroresorufinkarboxylová kyselina16,3 g 8-chlorresazurin-4-karboxylové kyseliny a 18,9 g chloridu cínatého se zahřívá 1/2 hodiny ve 100 ml směsi ledové kyseliny octové a acetanhydridu v poměru 1:1 na teplotu 80 °C a potom se směs vylije do 500 ml vody ochlazené ledem. Reakční směs se míchá 2 hodiny, potom se zfiltruje za účelem odstranění sraženiny a vysuší se pomocí prostředku Sicapent Pevná látka se vyjme 500 ml acetonu a nerozpustné zbytky se odfiltrují. Filtrát se odpaří a po vysušení se získá 12,3 g produktu.Hodnota R^. = 0,39 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).^H-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):(Τ' = 2,25 (s, 3H), 2,33 (s, 6H), 7,16 Cd, J= 8,8 Hz, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,76 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,90 ppm (s, 1H).c) N'-butoxykarbonylpiperazid 8-chlorresorufin-4-karboxylové kyselinyAnalogickým postupem jako v příkladu lb), c) a e) až g) se získá z 5 g Ν,Ο,Ο-triacetyl-8-chlordihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny 0,8 g produktu.Hodnota Rp = 0,7 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).d) Trifluoracetát piperazidu 8-chlorresorufin~4-karboxylové kyselinyZ 0,8 g butoxykarbonyl-chráněné sloučeniny z příkladu lle) se získá 0,81 g produktu analogickým postupem jako je popsán v příkladu lh).Hodnota = 0,07 (silikagel, rozpouštědlový systém;směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1)e) Kopulace piperazidu 8-chlorresorufin-4-karboxylové kyseliny s N-hydroxysukcinimideste rem 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyselinyAnalogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 400 mg trifluoracetátu piperazidu 8-chlorresorufin-4-karboxylové kyseliny a 410 mg N-hydroxysukcinimidesteru 2-(l-difenylhydantoinyl)-octové kyseliny získá žádaný produkt.Výtěžek: 150 mg.Hodnota = 0,38 (silikagel, rozpouštědlový systém;směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1)WAIS (O,1M roztok kaliumfosfátového pufru pH 8,0):= 581 nm jV raax = 597 nm.Fluorescenční emise: J maxPříklad 12Kopulace piperazidu 8-chlorresorufin-l-karboxylové kyseliny s (2-aminoethyl)amidem theofylin-7-propionové kyselinya) 8-chlorresorufin-1-karboxylová kyselina8,7 g 4-chlor-6-nitrosoresorcinu a 7,71 g 3,5-dihydroxybenzoové kyseliny se rozpustí ve 200 ml methanolu, k získanému roztoku se při teplotě 0 °C přidá 4,8 g oxidu manganičitého a po Částech 5,3 ml koncentrované kyseliny sírové. Reakční směs se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti, potom se zfiltruje a až do barevného přechodu na modrou barvu 3e přidá amoniak a 200 ml vody. Získaný roztok se zfiltruje, k filtrátu se přidá 25 ml koncentrovaného amoniaku a 20 g práškového zinku při chlazení ledem a potom se směs bez dalšího chlazení míchá dalších asi 15 minut. Ke směsi se přidá 200 mg aktivního uhlí, směs se zfiltruje, filtrát se okyselí na pH 2 a vyloučený derivát resorufinu se odstředí.Výtěžek: 3,9 gHodnota = 0,88 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1).b) N,0,0-triacetyl-8-chlordihydroresorufin-l-karboxylová kyselinaZ 3,5 g 8-chlorresorufin-l-karboxylové kyseliny se analogickým postupem jako je popsán v příkladu lb) získá 3,2 g produktu.Hodnota = 0,43 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).c) Trifluoracetát piperazidu 8-chlorresorufin-l-karboxylové kyselinyZ 3 g triacetylderivátu, který byl připraven jako v příkladu 10b) se získá analogickým postupem, jako se popisuje v příkladech 1c) až lh) 1,4 g produktu.CS 273630 Β2Hodnota Rf = 0,08 (silikagel, rozpouStědlový systém:směs chloroformu, methanolu, ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).d) Kopulace piperazidu 8-chlorresorufin-l-karboxylové kyseliny s (2-aminoethyl)amidem theofylin-7-propionové kyselinyZ 420 mg piperazidu N,0,0-triacetyl-8-chlórdihydroresorufin-l-karboxylové kyseliny a 300 mg (2-aminoethyl)amidu theofylin-7-propionové kyseliny se získá 190 mg produktu.Příklad 13Značení imunoglobulinu G pomocí Η'-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyDsarkosinu100 mg lidského imunoglobulinu G (IgG) se rozpustí v 10 ml O,1M kalimfosfátového pufru o pH 8,0 a k získanému roztoku se přidá 5 mg N*-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinkarbonyl)sarkosinu (srov. příklad 7e). Směs se ponechá v klidu 12 hodin při teplotě místnosti a potom se chromatografuje na sorbentu Ultrogel ACA 2002 (LKB). Značená bílkovina se přitom vymývá před volným nízkomolekulámím resorufinem. Stupeň značení se zjišíuje měřením extinkce. Činí hodnotu 3, tzn., že na molekulu imunoglobulinu G jsou vázány 3 molekuly derivátu resorufinu.Příklad 14Značení imunoglobulinu G pomocí N*-hyaroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyselinya) N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylová kyselina2,0 g chloridu N,0,0-triácetyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny, který je popsán v příkladu lc), se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu le) a 0,9 g hydrochloridu methylesteru piperidin-4-karboxylové kyseliny, analogickým postupem jako ja popsán v příkladu lf) a lg) se produkt deacetyluje a oxiduje a zmýdelní se působením hydroxidu sodného na N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylovou kyše linu.Výtěžek: 0,9 g.Hodnota Rf = 0,44 (silikagel RP-18, rozpouStědlový systém:směs nitromethanu a ethylalkoholu v poměru 4:1).UV/VIS (0,111 roztok kaliumfosfátového pufru, pH 8,5):= 576,2 nm ·b) N'-hydroxysukcinimidester H-(4-i,esorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyselinyZ 200 mg N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny, 240 mg N-hydro xysukcinimidu a 468 mg dicyklohexylkarbodiimidu se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu 7e) 190 mg produktu.Hodnota Rf = 0,7 (silikagel RP-18, rozpouStědlový systém:směs nitromethanu a ethanolu v poměru 4:1).IČ spektrum (technika KBr):3415 (m, široký), 1814 (w), 1773 (m), 1734 (s, 1626 (m), 1214 (m) cm1c) Značení králičího imunoglobulinu G pomocí N'-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny maxCS 273630 32K 10 mg králičího imunoglobulinu G rozpuštěného v 1 ml O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,5 se přidá 100 /ul roztoku 1,9 mg N-hyóroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny v 1 ml 1,4-dioxanu a směs se ponechá stát 2 hodiny při teplotě místnosti. To odpovídá poměru 6,4 mol derivátu resorufinu na 1 mol králičího imunoglobulinu G.Po chromatografii na AGA 202 sa použití O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,5 jako elučního činidla se získá frakce bílkoviny, která má absorpční poměr A578//A280 ~ c°ž odpovídá stupni zatížení 3,4 mol resorufinu na 1 mol imunoglobulinu G.Přidá-li se při analogickém pokusu k 10 mg králičího imunoglobulinu G 20 ^ul roztoku aktivovaného resorufinu, pak se získá při 1,05 mol nabídnutého barviva na 1 mol imunoglobulinu G stupeň zařízení 0,8.Absorpční maximum imunoglobulinu G značeného resorufinem činí 578 nm. Roztok fluoreskuje intenzívně světle červenou barvu.Vystaví-li se roztok imunoglobulinu G značeného resorufinem po dobu jednoho měsíce dennímu světlu, klesne hodnota fluorescence na 59 % původní hodnoty, zatímco u analogicky vyrobeného imunoglobulinu G značeného fluoresceinisothiokyanátera na 16 % a u imunoglobulinu G značeného texasskou červení na 12 %.Příklad 15Stanovení difenylhydantoinu v lidském séru pomocí ΕΡΙΑK 1950 /Ul O,1M roztoku natriumfosfátového pufru (pH 7,8) se přidá 5 ,ul vzorku /5 yUl roztoku protilátky (2) a 25 /Ul roztoku difenylhydantoin-resorufinu zUi <3) (1)Po 5-minutové inkubaci při teplotě 37 °C se měří fluorescenční polarisace. (excitační vlnová délka: 575 nm, emisní vlnová délka 594 nm, měřicí přístroj: fluorescenční spektrometr 650-108, Hitachi).1 g triacetylderivátu, který je popsán v příkladu 8d) se nechá reagovat analogickým způsobem jako je popsán v příkladech lg) až lh).Výtěžek: 0,43 g.f) Kopulace H-hydroxysukcinimidesteru 2-(1-difenylhydantoinyl)octové kyseliny s piperazidem 6-methylresorufin-4-kar boxylové kyseliny222 mg sloučeniny získané v příkladu 8e) se nechá reagovat s 200 mg N-hydroxysukcinimidesteru 2-(1-difenylhydantoinyl)octové kyseliny.Výtěžek: 250 mg.UV/VIS (0,1 molární kaliumfosfátový pufr, pH 8,0):= 584 nm.maxFluorescenční emise: η = 600 nm.yv maxPříklad 9Kopulace piperazidu 9-hydroxy-5-benzoZa7fenoxazon~8~karboxylové kyseliny s N-hydroxysukcinimidesterem/2-(1-difenylhydantoinylVoctové kyseliny a) 12-oxid 9-hydroxy-5-benzoZá/fenoxazon~8-karboxylové kyseliny2,84 g 1,3-dihydroxy-4-nitrosonaftalenu, 2,'31 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny, 1,29 g burelu a 1,6 ml koncentrované kyseliny sírové se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu la).Výtěžek: 2,8 g.Hodnota Ef = 0,63 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru4:1:1).b) 12-acetyl-5,9-diaeeto3tybenzol/á/fenoxazon-8-karboxylová kyselinaAnalogickým postupem jako je popsán v příkladu 8c) se z 2,4 g 12- oxidu 9-hydroxy-5-benzo/á/fenoxazon-8-karboxylové kyseliny získá 1,8 g triacetylované dihydrosloučeninyHodnota E^ = 0,31 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).c) N'-butoxykarbonylpiperazid 12-acetyl-5,9-diacetoxybenzoZa/fenoxazin-8-karboxylové kyseliny£= 1,36 (s, 9H); 2,81 (a, 4H); 2,9- 3,2 (a, 2H); 4,5- 4,9 (m, 1H);7,03 (s, 2H); 7,63 (d, J = 9 Hz, 1H); 7,90 (s, 2H); 9,2 (s, 1H).Příklad 4Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s 3-0-/3-(N-sukeinimidooxy karbony 1) propyl/éstradiolemAnalogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 212. mg trifluoracetátu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 220 mg 3-0-/3-(N-sukcinimidyloxýkarbony)propyl/3stradiolu získá 295 mg produktu.Hodnota E^ « 0,58 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).3-0-/3-(N-sukcinimidoxykarbonyl)propyÍ/-es'tr8diol se získá obvyklým způsobem z 3-0-karboxypropylestradiolu (z estradiolu a brommáselné kyseliny analogicky podle postupu, který popsali Lubke a další v Immunologische Teste fur niedermolekulare Wirkstoffe, G. Thieme Verlag, Stuttgart, str. 94) a N-hydroxysukcinimidu v přítomnosti dieyklohexylkarbo diimidu.Příklad 5 Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s N-/3-(N-sukcinimidoxykarbony1) propyl/fenobarbitalem ·Analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 212 mg trifluoracetátu piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 205 mg N-/3 (N-sukcinimidoxykarbonyl)propyl/fenobarbitalu získá 220 mg produktu.Hodnota H^. = 0,45 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).N-/3-(N-sukcinimidoxykarbonyl)propyl/-fenobarbital se získá obvyklým způsobem' z fenobarbital-l-máselné kyseliny (T. Nistikawa a další, Clin. Chim. Acta 91 (1979), str. 59) a N-hydroxysukcinimidu v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu.Příklad 6Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s N-hydroxysukcinimidesterem theofylin-7-propionové kyselinyZ 212 mg trifluoracetátu piperazidu reeorufin-4-karboxylové kyseliny a 175 mgN-hydroxysukcinimidesteru theofylin-7-propionové kyseliny se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) 200 mg produktu.Hodnota R^, = 0,44 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).N-Hydroxysukcinimidester theofylin-7-propionové kyseliny se získá obvyklým způsobem z theofylin-7-propionové kyseliny (T. Nistikawa a dalěi, Chem. Pharm. Bull. 27 (1979) str. 893) a N-hydroxysukcinimidu v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu. Příklad 7Kopulace N*-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)sarkosinu s 1-(2-aminoethy1)difenyIhydantoinema) (terč.butoxykarbonyImethyljmethylamid N,0,0-triacetyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny10 g chloridu kyseliny, který je popsán v příkladu lc), se nechá reagovat analogickým způsobem jako v příkladu le) s terč. butylesterem sarkosinu.Výtěžek: 7,5 g.Hodnota R^, = 0,77 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1),b) (terč.butoxykarbonylmethyl)methylamid N-acetyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny7.5 g produktu, který je popsán v příkladu 7a), se analogickým postupem jako je popsán v příkladu 1 f) deacetyluje.Výtěžek: 5,2 g.Hodnota E^, = 0,56 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).c) (terc.butoxykarbonylmethyl)methylamid resorufin-4-karboxylové kyseliny4.5 g produktu popsaného v příkladu 7b) se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu lg). 'Výtěžek: 2,6 g.Hodnota R^, = 0,64 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).d) (karboxymethyl)methylamid resorufin-4-karboxylové kyseliny0,55 g produktu popsaného v příkladu 7 o) se ponechá stát v klidu 1 hodinu při teplotě místnosti v 6 ml trifluoroctové kyseliny. Potom se reakční směs odpaří k suchu zbytek se roztírá 3 etherem á produkt se odfiltruje.Výtěžek: 0,45 g.Hodnota R^ = 0,11 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).e) N·—hydroxysukcinimidester N-(4~resorufinylksrbonyl)sarkosinu200 mg produktu z příkladu 7d) se míchá s 72 mg N-hydroxysukcinimidu a 138 mg dicyklohexylkarbodiimidu 14 hodin ve 40 ml tetrahydrofuranu. Vyloučená močovina se odfiltruje, filtrát se odpaří a odparek se chromatografuje na silikagélu (RP IS) za použití směsi nitromethanu a ethanolu v poměru 4:1 jako elučního činidla.Výtěžek: 150 mgHodnota Rf = 0,79 (silikagel SP-18, rozpouštědlový systém:směs nitromethanu a ethanolu v poměru 4:1).f) Kopulace N*-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)sarkosinu s l-(2-aminoe thyl)difenylhydantoinem125 mg N-hydroxysukcinimidesteru z příkladu 7e) se míchá 1 hodinu s 90 mg l-(2-aminoethyl)-difenylhydantoinem ve 40 ml směsi dioxanu a kaliumfosfátového pufru o pH8,5 v poměru 1:1. Dioxan se úplně odpaří, k odparku se přidá až do úplné barevné přeměny amoniak, směs se zfiltruje a z filtrátu se přidáním chlorovodíkové kyseliny vyloučí produkt.Výtěžek: 110 mg.Hodnota B^ = 0,78 (silikagel, rozpouštědlový syBtém:směs n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1).UV/VIS (0,1 molární roztok kaliumfosfátového pufru, pH 8,0):=575 nm.maxFluorescenční emise: = 592 nm.J/maXPříklad 8Kopulace piperazidu 6-methylresorufin-4-karboxylové kyseliny a N-hydroxysukcinimidesterem /2-(1-difenylhydantoinyl)/octové kyselinya) 2-methyl-4-nitrosoresorcin19,8 g 2-methylresorcinu a 13,4 g hydroxidu draselného se rozpustí ve 120 ml ethanolu a roztok se ochladí na teplotu 5 °C. K takto ochlazenému roztoku se přikape 24 ml isopentylnitritu, směs se míchá 3 hodiny a sraženina se odfiltruje. Žlutá pevná látka se vmíchá do 200 ml 5N roztoku kyseliny sírové. Přitom se vyloučí světle žlutý produkt.Výtěžek: 22 g.Hodnota Ef = 0,53 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).b) 6-methylresazurin-4-karboxylová kyselina ' 15,3 g 2-methyl-4-nitrosoresorcinu, 15,4 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny, 8,8 g burelu a 11 ml koncentrované kyseliny sírové se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu la).Výtěžek: 28,7 g.Hodnota = 0,15 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).e) H,0,0-triacetyl-6-methyldihydroresorufin-4-karboxylovó kyselinaZ 10 g 6-methylresazurin-4-karboxylové kyseliny, 19,8 g chloridu cínatého, 20 ml acetanhydridu a 150 ml ledové kyseliny octové se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu lb) přímo triacetylované leukosloučenina. Surový produkt se čistí vyvařením v acetonu.Výtěžek: 7,3 g.Hodnota = 0,51 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).lílffl spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid;= 2,10, 2,25, 2,29, 2,33 (vždy s, 12H), 7,00, 7,09, 7,50 a 7,74 ppm (vždy d, J = 8,8 Hz, 4H),d) N'-butoxykarbonylpiperazid N, 0,0-triacetyl-6-methyldihydroresorufin-4-karboxylové kyselinyAnalogickým postupem jako je popsán v příkladech ld) až le) se z 5 g H,0,0-triacetyl-6-methyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny, 10,7 ml oxalylchloridu a 2 g H-butoxykarbonylpiperazinu získá 3 g produktu.Hodnota E^. = 0,57 (silikagel, rozpouštědlový systém: ethylacetát).e) Trifluoracetát piperazidu 6-methylresorufin-4-karboxylové kyseliny1)2 g (9,5 mmol) N-hydroxysukcinimidu. Roztok se ochladí na 10 °C a potom se k němu přikape roztok 2,3 g (9,9 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu ve 40 ml ethylenglykoldimethyletheru. Po 2 hodinách míchání při teplotě místnosti se vyloučená dicyklohexylmočovina odfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku při teplotě 40 °C. Zbytek se roztírá s isopropylalkoholem a suspenze se zfiltruje. Produkt se vysuší v exsikátoru při teplotě místnosti.Výtěžek: 9,19 g = 94 % teorie (celkový výtěžek, vztaženo na tyroxin = 81 %).Hodnota E^ = 0,6 (vysoceúčinná kapalinová chromatografie HPTLC-EP 18; rozpouštědlový systém: směs acetonitrilu a vody v poměru 8:2).^H-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):1 g terc.butoxykarbonylderivátu popsaného v příkladu lg) se ponechá stát 15 minut ve 20 ml trifluoroctové kyseliny. Roztok se odpaří, zbytek se digeruje s etherem a produkt se odfiltruje.Výtěžek: 0,96 g.Hodnota R^. = 0,92 (silikagel, rozpouštědlový systém;směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).i) Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s N-hydroxysukcinimidesterem 3-{l-difenylhydantoinyl)-propionové kyseliny191 mg trifluoracetátu piperazidu popsaného v příkladu lh) a 210 mg N-hydroxysukcinimidesteru 3-(1-difenyIhydantoinylJpropionové kyseliny (připraveného ze sodné soli difenylhydantoinu a ethylesteru 3-brompropionové kyseliny analogicky podle postupu, který popsal Cooc a další, Res. Communications in Chemical Pathology and Pharmacology J5 (1973), str. 7.67) se míchá po dobu 15 hodin ve 20 ml dioxanu a 20 ml O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,5. Vyloučený produkt se odfiltruje, filtrát se odpaří a odparek se chromatografuje na silikagelu (RP18) za použití isopro pylalkoholu jako elučního činidla, přičemž se získá další část produktu. Produkt se překrystaluje ze směsi ethylacetátu a methanolu a získá se celkem 250 mg kopulačního produktu.Hodnota R^ = 0,61 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1).1H-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):(7- 2,6 - 2,8 (m, 2H); 3,0 - 3,8 (m, IOH);6,74 (d, J = 2,2 Hz, 1H);6,82 (d, J = 9,5 Hz, 1H);6,91 (dvojitý d, J = 9, 5 a 2,2 Hz);7,25 - 7,33 (m, 10H);7,55 a 7,66 ppm (vždy d, J = 9,5 Hz, 2H).UV/VIS (O,1M kaliumfosfátový pufr pH 7,5):X máx = 576’8Fluorescenční emise: = 592 nm.X maxPříklad 2Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s N-hydroxysukcinimidoesterem3-fl-difenylhydantoinylJoctové kyselinyAnalogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 365 mg trifluoracetátu piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 339 mg N-hyčroxysukciniwidesteru 3-(l-difenylhydantoinyDoctové kyseliny získá 210 mg žádaného produktu.Hodnota Rj, = 0,82 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1).^H-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):(T= 3,2 - 4,5 (m, IOH); 6,60 (d, J = 2,4 Hz, 1H); 6,71 (d, J = 9,5 Hz, 1H);6,80 (dvojitý d, J = 9,05 a 2,4 Hz, 1H); 7,39 (s, IOH);7,52 (d, J = 9,5 Hz, 1H); 7,61 (d, J = 9,0 Hz, 1H); 9,65 ppm (s, 1H).UV/VIS (0,ltó roztok kaliumfosfátového pufru, pH 8,0):= 575,4 nmΛ maxFluorescenční emise: = 592 nm.Příklad 3Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s N-hyóroxysukcinimidesterem N-terč.butoxykarbony1-L-thyroxinuAnalogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 212 mg trifluoracetátu piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 419 mg N-hydroxysukcinimidesteru K-terc. butoxykarbonyl-L-thyrosinu získá 320 mg produktu.Hodnota R^, = 0,58 (silikagel, rozpouštědlový systém:směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1:0,1)H-Hydroxysukcinimidester N-terc.butoxykarbony1-thyroxinu se získá následujícím způsobem:a) N-terc.butoxykarbonylthyroxinRoztok 10 g (12,5 mmol) monohydrátu sodné soli L-thyroxinu ve směsi 300 ml dioxanu a vody v poměru 2:1 a 15 ml IN roztoku hydroxidu sodného se smísí s přídavkem 3 g (13,75 mmol) di-terc.butyldikarbonátu (BOOgO a směs se míchá při teplotě místnosti za vyloučení světla.Přidáním 2M roztoku hydrogensíranu draselného se hodnotě pH upraví na 2, provede se extrakce ethylacetátem, ethylacetátový extrakt se promyje vodou, vysuší se síranem sodným a odpaří se. Pevný zbytek se rozetře a petroletherem, suspenze se zfiltruje a produkt se vysuší v exsilkátoru.Výtěžek: 9,45 g = θ6 % teorie.Hodnota R,-. = 0,6 (silikagel,rozpouStědlový 3ysténi:směs chloroformu, ligroinu a octové kyseliny v poměru 6:3:1).b) N-hydroxysukcinimideater N-BOC-thyroxinuK roztoku 8,8 g L-BOC-thyroxinu ve 200 ml ethylenglykoldimethyletheru se přidá
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako bifunkční sloučeniny s 1 až 5 atomy uhlíku používá piperazinu, 1,2-ethylendiaminu, glycinu, sarkosinu, β -slaninu nebo piperidin-4-karboxylové kyseliny.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS104187A CS273630B2 (en) | 1985-07-25 | 1987-02-17 | Method of resorufine's derivatives production |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853526565 DE3526565A1 (de) | 1985-07-25 | 1985-07-25 | Resorufin-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung in fluoreszenzimmunoassays |
| CS549286A CS273617B2 (en) | 1985-07-25 | 1986-07-18 | Method of resorufine's derivatives production |
| CS104187A CS273630B2 (en) | 1985-07-25 | 1987-02-17 | Method of resorufine's derivatives production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS104187A2 CS104187A2 (en) | 1990-08-14 |
| CS273630B2 true CS273630B2 (en) | 1991-03-12 |
Family
ID=25746179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS104187A CS273630B2 (en) | 1985-07-25 | 1987-02-17 | Method of resorufine's derivatives production |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS273630B2 (cs) |
-
1987
- 1987-02-17 CS CS104187A patent/CS273630B2/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS104187A2 (en) | 1990-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5304645A (en) | Resorufin derivatives | |
| EP1928822B1 (en) | Violet laser excitable dyes and their method of use | |
| US8148539B2 (en) | Cyanine dye labelling reagents | |
| US7875261B2 (en) | Fluorinated resorufin compounds and their application | |
| US20050123935A1 (en) | Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents | |
| US9513284B2 (en) | Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents | |
| CA2288275A1 (en) | Glycoconjugated fluorescent labeling reagents | |
| EP3341377B1 (en) | Polyfluoreno[4,5-cde]oxepine conjugates and their use in methods of analyte detection | |
| US20200408739A1 (en) | Carbopyronone Compounds Useful as Diagnostic Adjuvants | |
| Clavé et al. | A universal and ready-to-use heterotrifunctional cross-linking reagent for facile synthetic access to sophisticated bioconjugates | |
| EP1770129B1 (en) | Modified carbocyanine dyes and their conjugates | |
| CS273630B2 (en) | Method of resorufine's derivatives production | |
| US20230131000A1 (en) | UV Excitable Polyfluorene Based Conjugates and Their Use in Methods of Analyte Detection |