CS272963B1 - Mutants of "saccharomyces cerevisiae" gender's fungi defective in citrate cycle and method of their winning - Google Patents

Description

CS 272 963 B1

Vynález sa týká mutantov kvasiniek defektných v citrátovom cykle a sposobu ichzískavania. Jeho predmetom sú i kmene kvasiniek Saccharomyces cerevisiae CCY 22-15-15a CCY 22-15-16 vyznačujúce sa deficienciou v aktivitě enzýmového komplexu 2-oxogIuta-rátdehydrogenázy.

Cyklus trikarboxylových kyselin kvasiniek a iných eukaryotických organizmov je lo-kalizovaný v mitochondriách. Jeho cyklický sled reakci! je katalyzovaný séríou enzýmova jeho primárnou funkciou je odbúranie acetylkoenzýmu A na oxid uhličitý a vodu. Počastohto procesu ako reakčné médzxprodukty vznikajú rožne trikarboxylové a dikarboxylovékyseliny, ako napr. kyselina citrónová, izocitrónová, 2-oxoglutárová, jantárová, fumá-rová, jablčná a oxaloctová. Hoei existuje poměrně široká škála mutantov deficitnýchv rSznych mitochondriálnych funkciách, mutanty kvasiniek s poruchou v citrátovom cyklesú zriedkavé a na rozdiel například od respiračne deficitných sú relativné tažko selek-tovatelné, resp. identifikovatelné.

Mutanty kvasiniek, najma fakultativně anaeróbnych S. cerevisiae, s poruchou v citrá-tovom cykle sú pripravxtel'né postupom podl'a tohto vynálezu. Jeho podstata spočívá v tom,že haploidné buňky kvasiniek S. cerevisiae sa podrobia účinku fyzikálneho alebo chemic-kého mutagénu, napr. UV žiarenia, dusitanov alebo etylmetánsulfonátu a z populácie pre-žívajúcich buniek sa selektujú klony schopné dýchat a rást na pevných podach obsahujú-cich ako zdroj uhlíka ‘a energie etanol, pričom tieto klony sú nerastúce na iných ne-skvasiteTných zdrojoch uhlíka ako sú glycerol, pyruvát, laktát alebo acetát. Takétoklony v dosledku svojej metabolickej poruchy sú schopné vylučovat do okolitého prostre-dia organické kyseliny a preto sú identifikovatelné aj ako kolonie, ktoré počas rastuna pevných glukózových podach v dosledku poklesu pH v okolí kolonie menia farbu indiká-tora pH napr. brómkrezolovej purpure z purpurovej do žita. Analýzou enzýmových aktivitcitrátového cyklu v bezbunkových preparátoch, resp. v izolovaných mitochondriách vybra-ného mutanta, napr. stanovením aktivity 2-oxoglutarátdehydrogenázy sa presne identifi-kuje defekt v metabolizme selektovaných mutantov. Z takto připravených mutantov je mož-né žiadanú mutácíu 3alej preniesť i do iných kmeňov kvasiniek s odlišným genetickýmpozadím a to konjugáciou buniek alebo fúziou protoplastov mutanta a vybraného sester-ského kmeňa, na čo po sporulácii vzniknutých buniek heterozygótnych v MAT géne sa vý-běrů klony so žiadaným rekombinovaným genómom obsahujúce i mutáciu v citrátovom cykle.

Takýmito sposobmi sa připravili mutanty kvasiniek S. cerevisiae CCY 22-15-15(TS 20-10A genotypu MAT a adel lys2) a CCY 22-15-16 (JS10-3C genotypu MATočadel leu2)neschopné oxidovať 2-oxoglutarát, v dosledku čoho sa samotný 2-oxoglutarát, jeho pre-kurzory alebo produkty jeho metabolizmu (napr. kyselina glutamová) hromadia v bunke,resp. sú z nej vo zvýšenej miere vylučované do okolitého prostredia. Buňky týchto mu-tantov sú schopné rást na glukóze i za anaeróbnych podmienok v přítomnosti ergosterolua nenasýtených mastných kyselin. Nie sú schopné asimilovat pyruvát, laktát, acetát aniglycerol. V porovnaní so štandardnýmí kmeňmí ich aeróbne rastové výtažky na glukózei etanole sú znížené.

Vynález je možné uskutočňovať podlb nasledovných príkladov bez toho, aby sa ibana ne výlučné obmedzoval. Příklad 1

Buňky (107 buniek/ml 0,05 M citrát-fosfátového pufru o pH 4,0) haploidného kmeňakvasiniek S. cerevisiae TS 20 (MAT a adel lys2) sa vystavili účinku NaNOg (3 mg/ml) nadobu 20 min. Po premytí a zriedení sa buňky vysiali na pevné glukózové pódy (glukóza20 g/1, pepton 20 g/1, kvasničný autolyzát 10 g/1, agar 20 g/1) a vyrastené kolonie(50-150 kolonií/Petriho miska) po troch dnoch rastu při 30 C sa replikou prenieslina pevné glycerolové pody (glycerol 20 g/1, pepton 10 g/1, kvasničný autolyzát 10 g/1,agar 20 g/1) a pevné etanolové pódy (etanol 20 g/1, pepton 10 g/1, kvasničný autolyzát

Claims (4)

1. CS 272 963 B1 10 g/1, agar 20 g/1). Po siedmych dňoch inkubácie při 30 °C sa vybral klon nerastúci naglycerole ale slabo rastúci na atanole. U tohto klonu sa potvrdila neschopnost jeho bu-niek rásť na acetáte, laktáte a pyruváte, V izolovaných mitochondriách sa zistila ne-schopnost oxidovat 2-oxoglutarát tak v polarografických ako aj spektrofotometrickýchanalýzach. Příklad 2 Buňky (107 buniek/ml 0,05 M fosfátového pufru o pH 7,0) haploidného kmeňa kvasi-niek S. cerevisiae TS 20 (MAT a adel lys2) sa vystavili účinku etylmetansulfonátu(15 mg/ml) po dobu dvoch hodin. Buňky sa premyli, zriedili a vysiali v koncentrácii50-150 kolóniu tvoriacich buniek/Petriho miska na pevné glukózové pódy s brómkrezolo-vou purpurou ako indikátorom pH (glukóza 20 g/1, pepton 10 g/1, kvasničný autolyzét10 g/1, agar 20 g/1, bromkrezolová purpur 30 mg/ml, pH 7,0). Po 3 dňoch rastu pri 30 °Csa vyrastené kolonie replikou preniesli na glycerolové pevné médiá a etanolové pevnémédiá zloženia ako v příklade 1. Klony, ktorých kolonie v svojom okolí odfarbovali pur-purová farbu glukózových agarových pod do žita a po replike nerástli na glycerole avšakslabo rástli na etanole sa preklonovali a po potvrdení fenotypu sa podrobili analýzeaktivity 2-oxoglutarátdehydrogenázy v izolovaných mitochondriách. Buňky dýchajúcichklonov neschopných oxidovat 2-oxoglutarát sa vybrali a skrížili so sesterským kmeňom S. cerevisiae GRF18 (MAT e£ leu2 his3) opačného párovacieho typu a komplementárnych ge-netických znakov. Ich prototrofne selektované diploidné potomstvo sa podrobilo sporu-lácii a tetrádovej analýze. Selektovali sa klony žiadaného genotypu schopné tvořit ko-lonie na pevných etanolových médiách za súčasnej neschopnosti rastu na pevných glycero-lových pódach. Mutanty kvasiniek s poruchou v citrátovom cykle sú použitelné pri štúdiu funkciea biogenézy enzýmov citrátového cyklu ako aj pri izolácii a klonovaní génov špecifiku-júcich odpovedajúce enzýmové systémy. Naviac sú použitelné i pri fermentačnej přípravěkarboxylových kyselin, resp. ktoré takéto mutanty v porovnaní so štandardným kmeňom doživného prostredia vylučujú vo zvýšenej miere· PREDMET VYNÁLEZl)

   1. Mutanty kvasiniek rodu S. cerevisiae, defektné v citrátovom cykle, obzvlášť v reakcii2-oxoglutarátdehydrogenázy.
2. 2. Mutant kmeňa kvasinky S. cerevisiae CCY 22-15-15.
3. 3. Mutant kmeňa kvasinky S. cerevisiae CCY 22-15-16.
4. 4. Sposob výroby podl'a bodu 1, vyznačujúci sa tým, že po mutageněze s fyzikálnymi alebochemickými mutagénmi sa z populácii kvasiniek selektujú dýchajúce klony, ktoré prianalyzovanej teplote rastů na etanole ale postrádajú schopnosť rásť na iných ne-skvasitel'ných zdrojoch uhlíka a energie, a a/alebo ktoré z metabolizovatelných zdro-jov uhlíka produkujú vačšie množstvo kyselin, a/alebo ktoré na základe výsledkov bio-chemických analýz sú změněné v množstve, aktivitě alebo vlastnosticha enzýmov mito-chondriálneho citrátového cyklu, například v aktivitě komplexu 2-oxoglutarátdehydro-genázy.