CS272053B1

CS272053B1 - A method for producing thymosin fraction V and bovine fetal thymus

Info

Publication number: CS272053B1
Application number: CS869991A
Authority: CS
Inventors: Frantisek Mvdr Csc Tomsik; Karel Rndr Csc Nejedly
Original assignee: Frantisek Mvdr Csc Tomsik; Karel Rndr Csc Nejedly
Priority date: 1986-12-28
Filing date: 1986-12-28
Publication date: 1991-01-15
Also published as: CS999186A1

Abstract

Řeší se výroba thymosinu frakce V z bo-. vinních fetálních thymů, které je možno použít z exsanquinovaných fetů při výrobě bovinního fetálního séra, nebo novorozených telat rovněž exsanquinovaných^pro přípravu novorozeneckého séra. Tkán thymů se homogenizuje, centrifuguje a získaný supernatant se tepelně denaturuje při 80 °C, pak následuje precipitace síranem amonným do saturace 30 %. Získaná frak-- ce se ultrafiltruje s nominální odddělovací hranicí 15 až 20 tis., následně odsolí a lyofilizuje. Získaný thymosin frakce V obsahuje zisk až trojnásobného množství z 1 kg tkáně bovinních fetálních thymů oproti vzrostlým telatům. Byla prokázána mimořádná účinnost tohoto preparátu při diagnostice imunodeficiencí u dětí, při léčbě těchto poruch a podpůrné léčbě pacientů s nádorovým onemocněním.The production of thymosin fraction V from bovine fetal thymuses is addressed, which can be used from exsanguinated fetuses in the production of bovine fetal serum, or newborn calves also exsanguinated^for the preparation of newborn serum. The thymus tissue is homogenized, centrifuged and the obtained supernatant is thermally denatured at 80 °C, followed by precipitation with ammonium sulfate to 30% saturation. The obtained fraction is ultrafiltered with a nominal separation limit of 15 to 20 thousand, subsequently desalted and lyophilized. The obtained thymosin fraction V contains up to three times the amount of 1 kg of bovine fetal thymus tissue compared to adult calves. The extraordinary effectiveness of this preparation has been demonstrated in the diagnosis of immunodeficiencies in children, in the treatment of these disorders and in the supportive treatment of patients with cancer.

Description

Vynález řeší výrobu imunologicky aktivního preparátu thymosinu frakce V z bovinních fetálních thymů pro použití v klinické medicíně (imunologie, onkologie).The invention relates to the production of an immunologically active preparation of fraction V thymosin from bovine fetal thymes for use in clinical medicine (immunology, oncology).

V odborné literatuře je popsána izolace analogického preparátu, označeného jako frakce V, z telecích thymů (Hooper, J. A. et al., 1975; Ann, N. Y., Acad. Sci, 249, 125-144).Isolation of an analogous preparation, designated fraction V, from calf thymes has been described in the literature (Hooper, J. A. et al., 1975; Ann, N. Y., Acad. Sci, 249, 125-144).

Izolační postup vychází z desintegrace a extrakce thymu (ve fyziologickém roztoku), který po oddělení buněčných fragmentů umožňuje termální denaturací při 80 °C. Filtrát je po oddělení denaturovaných bílkovin srážen podchlazeným acetonem. Vysrážené bílkoviny jsou po rozpuštění ve slabém pufru frakcionovaně sráženy síranem amonným. Bílkovina, získaná izoelektrickým srážením (pH 4,0) mezi 25 a 50 % saturace, je ultrafiltrací zbavena látek o molekulové hmotnosti větší než 20 tis. Gelovou filtrací na koloně Sephadex G 25 se odstraní nízkomolekulární příměsi, zejména soli a nukleotidy. Získaná bílkovinná frakce se označuje jako thymosin frakce V a byla použita v nejrůznějších imunologických testech i klinických aplikacích (Hooper a kol., 1975). Z 1 kg telecích thymů se získává až 150 mg frakce V. Tento postup se stal základem pro přípravu komerčního preparátu, který je vyráběn některými zahraničními firmami (Hoffman-La Roche, Sigma, Serone).The isolation procedure is based on the disintegration and extraction of thymus (in saline), which after separation of the cell fragments allows thermal denaturation at 80 ° C. After separation of the denatured proteins, the filtrate is precipitated with subcooled acetone. The precipitated proteins are fractionated with ammonium sulfate after dissolution in a weak buffer. The protein, obtained by isoelectric precipitation (pH 4.0) between 25 and 50% saturation, is freed by ultrafiltration of substances with a molecular weight greater than 20 thousand. Gel filtration on a Sephadex G 25 column removes low molecular weight impurities, especially salts and nucleotides. The protein fraction obtained is called thymosin fraction V and has been used in a variety of immunoassays and clinical applications (Hooper et al., 1975). Up to 150 mg of fraction V is obtained from 1 kg of veal thymes. This procedure has become the basis for the preparation of a commercial preparation, which is manufactured by some foreign companies (Hoffman-La Roche, Sigma, Serone).

Podstata vynálezu spočívá ve využití fetálních bovinních thymů pro izolaci preparátu, v modifikování a zjednodušení izolačního postupu. Využitím bovinní fetální tkáně, která je získávána jako vedlejší produkt při výrobě bovinního fetálního séra podle autorského osvědčení 152219 dochází tímto způsobem k bezodpadové technologii.The essence of the invention lies in the use of fetal bovine thymes for the isolation of the preparation, in the modification and simplification of the isolation procedure. By using bovine fetal tissue, which is obtained as a by-product in the production of bovine fetal serum according to the author's certificate 152219, waste-free technology is achieved in this way.

Thymus z fetů je asepticky odebírán do média s antibiotiky, pak je přenesen do sterilního igelitového sáčku, vychlazen na teplotu 2 až 4 °C a následně sražen a uchováván při teplotě -15 až -20 °C.The fetal thymus is aseptically collected in antibiotic medium, then transferred to a sterile plastic bag, cooled to 2-4 ° C, and then coagulated and stored at -15 to -20 ° C.

Thymová tkáň je po homogenizaci a extrakci ve fyziologickém roztoku centrifugačně zbavena buněčných fragmentů. Supernatant se termálně denatureje při 80 °C, po ddělení denaturovaných bílkovin se provádí frakcionovaně vysolení síranem amonným. Bílkovina, která byla získána izoelektrickým srážením (pH 4,0), se po rozpuštění v pufru ultrafíltračně zbaví výše molekulárních látek (rozlišovací mez 15 až 20 tis.) a po koncentraci lyofilizací je odsolena gelovou filtrací.After homogenization and extraction in physiological saline, the thymic tissue is centrifuged free of cell fragments. The supernatant is thermally denatured at 80 ° C, and after separation of the denatured proteins, ammonium sulfate is fractionated. The protein, which was obtained by isoelectric precipitation (pH 4.0), is ultrafiltration to remove the amount of molecular substances by ultrafiltration (resolution limit 15 to 20 thousand) and after concentration by lyophilization it is desalted by gel filtration.

Takto získaný produkt, odpovídající frakci V podle citace Hooper, J. A. et al., 1975, se sterilně filtruje přes sadu filtrů MILLIPORE (nebo SARTORIUS) a testuje se na pyrogenitu. Sterilní, apyrogenní preparát je možno použít pro laboratorní i klinickou praxi.The product thus obtained, corresponding to fraction V according to Hooper, J. A. et al., 1975, is sterile filtered through a set of MILLIPORE (or SARTORIUS) filters and tested for pyrogenicity. A sterile, pyrogen-free preparation can be used for laboratory and clinical practice.

Thymosin frakce V není homogenní preparát; obsahuje alespoň 30 různých polypeptidů o molekulární hmotnosti 1 až 15 tis., z nichž většina je kyselé povahy o izoelektrickém bodu mezi 3,5 až 4,5 pH (Goldstein a kol., 1977). Podle uvedených literárních údajů je možno získat z 1 kg thymové tkáně telat až 150 mg frakce V.Thymosin fraction V is not a homogeneous preparation; contains at least 30 different polypeptides with a molecular weight of 1 to 15,000, most of which are acidic in nature with an isoelectric point between 3.5 and 4.5 pH (Goldstein et al., 1977). According to the literature, up to 150 mg of fraction V can be obtained from 1 kg of calf thymic tissue.

Výsledky postupu podle vynálezu ukázaly, že je možno získat od 180 mg do 400 mg thymosinu frakce V, s průměrným ziskem 298 mg. Je to preparát, který dokáže v některých případech normalizovat porušenou buněčnou imunitu. Přednost thymosinu před více purifikovanými thymovými faktory spočívá v komplexnosti účinku; v souhře působení imunologicky aktivních komponent preparátu.The results of the process according to the invention showed that from 180 mg to 400 mg of thymosin fraction V can be obtained, with an average yield of 298 mg. It is a preparation that can, in some cases, normalize impaired cellular immunity. The advantage of thymosin over more purified thymic factors lies in the complexity of the effect; in the interaction of immunologically active components of the preparation.

Navrhovaným postupem podle vynálezu je možno získat thymosin frakce V z fetálních thymů, který vykazuje podobnou charakteristiku podle literárních odkazů. Jeho kvalita byla vyhodnocena třemi testovacími schématy:The proposed process according to the invention makes it possible to obtain fraction V thymosin from fetal thymes which have similar characteristics according to the literature references. Its quality was evaluated by three test schemes:

a) testem aktivní E rozet, b) testem celkových E rozet, c) testem znovuobnovy T-lymfocytů.a) active E rosette test, b) total E rosette test, c) T-cell recovery test.

Experimentálně bylo prokázáno, že kvalita získaného preparátu je stejná, ale i předčí kvalitu thymosinu frakce V dováženou z KS.It was experimentally shown that the quality of the obtained preparation is the same, but also exceeds the quality of thymosin fraction V imported from KS.

' CS 272053 Bl 2'CS 272053 Bl 2

Vynález je dále objasněn na příkladu provedení, jímž ovšem jeho rozsah není omezen ani vyčerpán.The invention is further elucidated on the basis of an exemplary embodiment, by which, however, its scope is not limited or exhausted.

PříkladExample

Asi 2 kg fetálního thymu se zbaví hrubých částic tuku, blan, hematomů apod, a homogenizuje se po částech na mixeru 4 minuty při max. otáčkách ve fyziologickém roztoku (0,9 % NaCl) v poměru 200 g brzlíků na 500 ml roztoku. Po centrifugaci (30 min. při 2 500 rpm., křížový rotor) se supernatant zfiltruje přes smotek vaty, aby se odstranily flotující tukové částice. Filtrát se centrifuguje 1 hodinu při otáčkách 19 000 na ultraodstředivce Beckman L 8-55, supernatant zahřívá za stálého míchání 15 min. na vodní lázni 70 až 80 °C teplé a potom ihned filtruje přes skládaný filtr a jímá do kádinky chlazené ledem. 'About 2 kg of fetal thymus is freed of coarse particles of fat, membranes, hematomas, etc., and homogenized in portions on a mixer for 4 minutes at maximum speed in physiological saline (0.9% NaCl) in a ratio of 200 g of thymus per 500 ml of solution. After centrifugation (30 min at 2,500 rpm, cross rotor), the supernatant was filtered through a cotton swab to remove floating fat particles. The filtrate was centrifuged for 1 hour at 19,000 on a Beckman L 8-55 ultracentrifuge, and the supernatant was heated with stirring for 15 minutes. on a water bath 70 to 80 ° C warm and then immediately filtered through a pleated filter and collected in an ice-cooled beaker. '

Ve spojených filtrátech se upraví pH na 7,0 a během 30 až 40 min. se za stálého míchání přidává pevný síran amonný do 30 % saturace a v míchání se pokračuje minimálně 1 hod. Tekutina se centrifuguje 60 min. při 3 000 rpm (křížový rotor), v supernatantu se upraví kyselinou octovou pH na 4,0 během 30 min. se po částech přidává 14,6 g síranu amonného na 100 ml a nechá 1 hod. míchat. Tekutina se znovu centrifuguje 60 min., při 3 000 rpm, supernatant se slije a sediment rozsuspenduje ve 150 ml 10 mM Tris-Cl (+ 0,1 mM EDTA) o pH 8,0 a výsledné pH se upraví na 7,6. Pevné nečistoty se odfiltrují a tekutina podrobí ultrafiltraoí (Millipor, Sartorius, membránové ultráfiltry) s nominální oddělovací hranicí mol. hm. 15 až 20 tis. Ultrafiltrát se lyofilizuje, získaná látka (frakce IV) se rozpustí v deionizované vodě (2 g v 10 ml), pokud je třeba, upraví se pH na 7,6 a odstřeluje se 5 min. při 15 000:rpm. Supernatant se nanese na kolonu Sephadex G-25 eluuje deionizovanou vodou (pH 7,6) za použití peristaltické pumpy. Jednotlivé frkace zachycované po 9 min. se detekují na přítomnost peptidů spektrofotometricky při vlnové délce 214 m. U každé frakce se provádí také kvalitativní zkouška Nesslerovým činidlem na přítomnost NH^. Frakce přecházející eluci soli(síran amonný) se sloučí a lyofilizují (frakce V).The combined filtrates are adjusted to pH 7.0 over 30 to 40 minutes. solid ammonium sulphate is added to 30% saturation with constant stirring and stirring is continued for at least 1 hour. The liquid is centrifuged for 60 minutes. at 3,000 rpm (cross rotor), the pH of the supernatant is adjusted to 4.0 in 30 minutes. 14.6 g of ammonium sulphate per 100 ml are added portionwise and the mixture is stirred for 1 hour. The liquid is centrifuged again for 60 minutes at 3,000 rpm, the supernatant is decanted and the sediment is resuspended in 150 ml of 10 mM Tris-Cl (+ 0.1 mM EDTA) pH 8.0 and the resulting pH is adjusted to 7.6. The solid impurities are filtered off and the liquid is subjected to ultrafiltration (Millipor, Sartorius, membrane ultrafilters) with a nominal separation limit of mol. hm. 15 to 20 ths. The ultrafiltrate was lyophilized, the obtained substance (fraction IV) was dissolved in deionized water (2 g in 10 ml), if necessary, the pH was adjusted to 7.6 and centrifuged for 5 min. at 15,000: rpm. The supernatant was applied to a Sephadex G-25 column eluted with deionized water (pH 7.6) using a peristaltic pump. Individual fractions captured after 9 min. are detected for the presence of peptides spectrophotometrically at a wavelength of 214 m. A qualitative assay with Nessler's reagent for the presence of NH 4 is also performed on each fraction. Fractions eluting with salt (ammonium sulfate) were combined and lyophilized (fraction V).

Claims

Process for the production of fraction V thymosin from bovine fetal thymes, characterized in that bovine fetal thymic tissue obtained from fetuses in the production of bovine fetal serum is used for production, homogenized, centrifuged and the obtained supernatant is heat denatured at 80 ° C, followed by ammonium sulphate precipitation to saturation 30% ultrafiltration with a nominal molecular weight cut-off of 15 to 20 thous. and desalting the ultrafiltrate to remove all salt ions, after which the product is lyophilized.