CS271851B1 - Stable diagnostic preparations for azocopulable substances determination in biological liquids and materials - Google Patents

Description

Vynález ·· týká «loženi e zpúeobu přípravy stabilního dlagnotlckého přípravku ke etenovenl azokopulovatelných látek, zejména bilirubinu e uroblllnogenu v biologických kapalinách a Materiálech·

Kvalitativní detekce a kvantitativní etanovenl různých součásti biologických kapalin a aatariálů, jako například moče,* aára; mozkomišního noku, atollca a podobně aa atalo v poaladnlch daaatllatioh jednou z nojdůlažitějěich diagnostických metod; «loužicích najan k potvrzeni nebo upřesněni konečné diagnosy, ala umožňující v mnoha případech stanovit diagnostiku onemoeněnl Jeětě dřivá, naž dojde k Jeho klinická manifestaci* Mázl významná vyěetřenl tohoto druhu patři mimo Jiná i stanoveni látek; poskytujících výrazná; spaeiflcká a kvantitativně probíhající azokopulaěnl reakce a dlazonlovými solemi. Typickými představiteli takovýchto azokopulaSnlch látek v biologických kapalinách a materiálech jsou dvě hlavni žluěová barvivá; bilirubin a urobillnogan, Oejich důkaz a stanovaní například v «oči, eáru nebo «tolicí představuja významný prostředek při stanoveni diagnosy různých krevních, jatarnlch nebo žlučových poruch a onemocněni.

Pro stanoveni obou uvedených látak azokopulačnl reakci byla v minulosti navržena celá řada aromatických diazoniových solit z nich sa věak Jako nejvhodnějěi ukázaly - a jsou taká nejvíc užívány - diazoniová aoll odvozená od anilinu, substituovaná na benzenovém jádře bu3 elektronekcaptornlml atomy, nebo skupinami, jako halogeny, sulfoakupinou nebo nitroskupinou pro stanoveni bilirubinu,' nabo akuplnami alaktrondonornimi, jako hydroxyl, alkyly, alkoxyly a podobně pro stanoveni uroblllnogenu. Společnou nevýhodu všech těchto diazoniových aoll Ja věak Jejich obočně známá malá stabilita vůči světlu, vlhkosti a jiným vlivům, takže pro provedeni příslušných stanoveni bilirubinu nebo uroblllnogenu ja potřebná tyto diazoniová aoll připravovat čaratvě těsně před použitia* Poněkud lapěl altuaea ja u diagnostických přípravků používaných v pevná fázi, tj, u taletových teatú nebo tzv. diagnoatických proužků. V těchto připravolch jaou diazoniová soli, stabilizovaná jako tatrafluoroborátová; chlorzlnečnatá nebo arylaulfonátová eoli, olea poněkud stabilnější; avěak 1 zda ja nutná běhám skladováni přípravky velmi pečlivě chránit před světlem a vzduěnáu vlhkosti; aby nedošlo k poaěrně rychlému rozkladu a znehodnoceni přípravků.

Prvním pokueaa o odstraněni tohoto nedostatku byl vynález, popsaný v britském patentu l;117,'25O. Podle tohoto vynálezu Ja v tabletových nebo proužkových testech, určených ka stanoveni bilirubinu v moči nebo aéru, nahražena diazoniová aůl příslušným triazanaa, který Ja v přípravku dokonale stabilní. Nevýhodou tohoto řešeni byla věak skutečnost; ža na tabletu nabo proužek bylo nutná po nanaeenl vzorku nanést taká silnou minerální kyselinu, kterou aa triazan převedl na reakce schopnou dlazonlovou eůl. V tomto ohledu bylo výhodnější řešeni podlá ča. autorského osvědčeni č. 200 564; ve kterém byly popsány diagnostická proužky; obsahující vadla příslušného triazanu již i vhodnou kyselinu,' takže proužky byly schopná poskytovat reakci a bilirubinem nebo urobilinoganem přímo,’ bez nutnosti dalši operace; tj. nanaeenl silná kyseliny. Nevýhodu tohoto řešeni věak byla opět skutečnost; ža příprava těchto proužků byla značně obtížná, protože v průběhu přípravy těohto proužků bylo nutná zabránit styku triazanu a kyselinou, aby k přeměně trlazenu na dlazonlovou důl nedošlo již v táto fázi. Navrhovaná řešeni, nanášet trlazen z nevodnáho rozpuětědla ne nosič e již nanesenou kyselinou bylo totiž použitelná jan pro některá triazeny; protože použitá trlezeny byly vesměs aubatltuovány hydrofilnlml karboxylovýml nabo sulfonovýai akuplnami, která značně snižovaly rozpustnost triazanů v navodnýoh rozpouštědlech.

Tanto nedostatek řaěl předložený vynález,* jehož,podstatou jaou diagnostické přípravky ka atanovanl azokopulovatelných součásti biologických kapalin a materiálů, zejména bilirubinu nebo uroblllnogenu; obeahujici popřípadě minerální nebo organickou kyselinu a/nabo kysala reagující sůl; dála obsahující benzenazoaloučenlnu obecného vzorca X

CS 271 851 Bl

ve kterém eubetituenty Rj až Rg jaou stejné nebo rozdílné atomy nebo akupiny, jeko vodik, halogen; nitroakuplna, eulfoekupine, popřípadě N-acylovaná skupino amidosulfonové, hydr oxyl/ alkyl nebo alkoxyl o 1 až 3 atomy uhliku; aralkoey ee 7 až 8 atomy uhlíku, trifluormathyl-ekupina, ekuplna-NH.R, va které R ja acatyl nebo benzoyl-ekupina, R₄ až R? znáči nazévlala na sobé vodik,' nižěl alkyl e 1 až 3 atomy uhlíku nebo oxoakuplnu a X značí atom uhliku, kyslíku nebo dualku popřípadě substituovaného nlžěim alkylem o počtu uhlíkových atomů 1 až 4; nabo akupinu obecného vzorce IX ^>N-N=N—/ —r₂ (II) ve kterém eubetituenty Rj až Rg jsou stejné nebo rozdílné atomy nebo skupiny; jako vodik, halogen,* nitroakuplna, eulfoekupine/ popřípadě N-acylované skupina amidosulfonové; hydroxyl, alkyl nebo alkoxyl β 1 až 3 atomy uhlíku, aralkoxyl ao 7 až 8 atomy uhliku, trlfluormathyl-ekupina, skupina NH.R; va které R ja acatyl nebo benzoyl-akuplna.

Bonzenazoaloučenlny obočného vzorce X,' jejichž použiti v diagnostických přípravcích tvoři hlavni předmět vynálezu,* jsou látky dokonale stabilní Jak vůči vzduěná vlhkosti, tak 1 vůči působeni světla. V kyselém prostředí aa věak rozkládají za vzniku ekvivalentního množství přialuSnó banzandlazonlové eoli/ ktoré potom vstupuje do vlastni azokopulačni reakce. Příaluěné kyselina nebo kyselo reagující látka může být a výhodou obsažena Již v prostředku podle vynálezu/ nebo může být přidána teprva v okamžiku provedeni analýzy; tj. při vlastním použiti prostředků podle vynálezu.

Diagnostická prostředky podlá tohoto vynálezu jaou podle způaobu provedeni použitelné jak pro apaktrofotomotrlcké stanoveni, při ktorých probíhá atanovanl azokopulovatolných látek v roztoku, tak 1 ve formě tablet nebo diagnostických proužků. Vo věoch těchto přípravcích Je možné - podle druhu azokopulovatalné látky - použit bonzanazosloučoniny obecného vzorce I substituované na benzenovém jádře nejrůznějšimi substituenty R^ až Rg podle výSe uvedené definice. Pro stanovení bilirubinu os nejlépe osvědčuji benzenazoaloučaniny, va kterých dva za eubetituentů R^ až Rg jeou atomy chloru v polohách 2/4-j 2,5- nebo 2/6- a třetí substituent je vodík/ pro stanoveni urobllinogonu potom bonzanazooloučeniny, va ktorých Rg je nižěl alkoxyl- například methoxyl- nebo ethoxyl-, nebo aralkoxyl-, kde R₂ ne například benzyloxyekupina a eubetituenty R^ a Rg jsou atomy vodíku, popřípadě trifluormathyl- skupina. Vadla uvedených dvou hlavních azokopulovetalných součásti biologických kapalin a materiálů jeou věak přípravky podle tohoto vynálezu vhodná pro důkaz a atanovanl 1 dalěích azokopulovetalných látek, jako ja například kyselina váni llylmaodlové, Jejíž atanovanl v moči mé velký význam pro diagnosu pheochromocytomu.

V tomto případě ja výhodné použit přípravek obsahující banzanazoaloučeninu, va které R₂ ja skupina NOg a eubetituenty Rj a Rg jaou vodíkové atomy. Hoterocyklickou část benzonazoaloučoniny obecného vzorce X může tvořit bu3 morfolin,' va kteróm X«O; nabo plperidin (X>C) nebo i piporazin (X»N)/ ktoré Jaou popřípadě dála substituovány bu3 skupinami alkylováml; jako jo tomu například u 2/5-dlmathylplparazlnu (R₄»R₆»CHg a R_g«R₇>H), nebo N-methylplparazlnu (X»N.CHg), nebo oxoakuplnami,' jako ja například dlkstopiperazin

CS 271 851 Bl (R₄Rq»0,’ Rg-Ry-H). V některých případech Je výhodné použiti i eubetituovaných N,N'-dle-(benzenezoelouSenin) odvozených od plpsrazinu; tj. benzanazosloučenln obecného vzorce I, u kterých X předetavuje ekupinu obecného vzorce II a aubatituenty R_x až R₃ jaou na obou benzenových jádrech atajné.

Minerální nabo organické kyselina a/nabo kysala reagující sůl; obsažené popřipadé v prostředcích podle vynálezu né dvojí funkci: jednak. Jak bylo uvedeno výée, způsobuje přadminu banzanazoaloučanlny obecného vzorce X na přlaluénou diazoniovou eůl; jednak vytváří 1 vhodně kyaalá prostředí, nutné v některých případech pro žádoucí průběh azokopulačni reakce ee etanovovanou látkou· Pro tento účel je nožné použit jakékoliv pevné nebo kapalné kyseliny,* jako je například kyselina chlorovodíkové,' kyselina astaf osf orečná,' kyselina citrónové,* vinné/ éíavelová,' nabo aromatické sulfonové kyaeliny nebo jejich aměai nobo 1 kysala reagující soli; jako například kyaalý airan draselný,' popřípadě vyžaduje-11 vlastni azokopulaěnl reakce rufiité hodnoty pH, 1 aněal kyselin a alkalickými soleni kyaolln.

3a eanozřejné, ža přípravky podle vynálezu nohou vadla uvedených dvou hlavních látek, tj. benzenazosloučeniny obecného vzorca I a popřípadě kysala raagujlci látky, obsahovat a výhodou i dalěí složky/ ktorá celý přípravek jeětě dála stabilizuji, popřípadě podporuji a urychluji průběh vlastni azokopulaěnl reakce.

□sou to v prvá řadě různá povrchově aktivní látky. Tyto látky, jejichž výhodnost použiti v obdobných přípravních ja obecně známá, urychluji průběh vlastni azokopulaěnl reakce a v některých případech 1 stabilizuji azobarvivo vzniklé při azokopulaěnl reakci. 3aJich přítomnost v diagnostických přípravcích ja dokonce nutné; jde-ll o atanovení azokopulaěnich látek; u ktorých probíhá azokopulaěnl reakce bez těchto akcelerátorů tak pomalu, ža ja tímto způsobem nalže prakticky vůbec stanovit. Typickým představitelem takovýchto azokopulovatslných látek je například tzv. •‘nepřímý bilirubin. Oako vhodné povrchově aktivní látky nohou být v přípravcích podle vynálezu použity látky anionaktlvnlho, katlonaktlvnlho nabo 1 nalonogannlho typu; Jako jsou například laurylaulfét, dlalkyaatary kyseliny sulfojantarové/ catyltrlmethylamonlum chlorid nabo bromid; benzyl-dl-aathyl-haxadacylaaonlua chlorid,' polyathylanglykol nabo různé polyoxyethylenfanoly. Tyto látky dokonce v mnoha připadoch zvyěujl i Intenzitu vzniklého zbarveni při azokopulaěnl reakci; ělmž lzs dosáhnout 1 zvýěenl citlivosti přípravků vúěl stanovované azokopulovatelné složce vyěatřovaného biologického materiálu.

Proti dosud známým přípravkům ka stanoveni azokopulovatslných látok vyniká řeěanl podle vynálezu nejen podstatně vyěěi stabilitou vůěi vzduěná vlhkosti a světlu, ala umožňuje i přípravu prostředků, která dosud nabylo možné vůbec vyrobit vzhledem ka značné nestabilitě některých dlazoniovýeh soli, jako ja například dlazotované kyselina aulfanllové nabo aulfanllamld,* které jaou v pevném auchém stavu až výbušné.

□ak bylo výěe uvedeno/ lza přípravky podle vynálezu použit jak ka apaktrofoto®africkému atanovení azokopulovatslných látek v roztoku; tak 1 ve formě tablet nabo tzv. diagnostických proužků. Provedeni přípravku podlá uvedených způsobů použiti ja samozřejmě rozdílné, jak ja zřejmé z níže uvedených příkladů.

Přiklad 1

Olagnoatlcké proužky ka stanoveni urobllinogonu v moči.

Filtrační papír o plošné hmotnosti 120 g/n² aa postupně naimpragnuje níže uvedenými roztoky A a B do nasyceni tak,* že po každé Impregnaci aa papír dokonala vyauěi proudem vzduchu o teplotě 60 °C. Nalmprognovaný a vysušený papír aa potom nařeže na čtverečky o rozměru 5x6 am a nalepí pomoci oboustranné samolepicí pásky na jeden konec podložky z bílé plastické hmoty o rozměru 6x90 mm.

Impregnační roztok Ai

Kyselina citrónové 20;o g

CS 271 851 Bl

Kyselina 1/5-naftalendlaulfonové 2Na-e: 1	14/0 g
Laurylaulfét sodný	2/5 g
Voda destilované	100 ml
Impregnační roztok B:
N-(4-eenzyloxybenzenazo)morfolin	0/65 g
Octan ethylnatý	100 ml

Tyto proužky se po namočení do moče obsahující uroblllnogen barvi Jasné červené,' přičemž Intenzita tohoto zbarveni Js přímo úměrná koncentraci uroblllnogenu v rozmezí 5 až 200 /Umol/1. V tomto ohledu jeou proužky zcela rovnocenné dosud známým proužkům obsahujícím mleto N-(4-benzyloxybenzenazo)morfolinu dlazonlovou eůl odvozenou od p-benz zyloxyenillnu/ jeou vSak podstatné atabllnějěl jak vůči vzduSné vlhkosti, tak zejména proti působeni světla. Prakticky identické vlastnosti vykazuji i proužky, u kterých byl N-(4-benzyloxybanzanazo)morfolln nahrazen N-(4-methoxybenzenazo)-piparidinem·

Přiklad 2

Diagnostické proužky ke stanoveni bilirubinu v moči.

Diagnostické proužky ae připraví způsobem popsaným v přikladu 1/ avSak s použitím filtračního papíru o ploSné hmotnosti 180 g/m² a Impregnačních roztoků o následujícím složenit

Impregnační roztok At

Kyselina metafoeforeČné 10/0 g

Kyselina vinné 3/1 g

Tetrafluoroborlten sodný 1,^JO g

3,9-Diethyl-6-hydroxy-trldekan-l-8ulfonové kyselina/ sodné sůl/ 25% vodný roztok 2/5 ml

Voda destilované 100 ml

Impregnační roztok Bt

N-(2/6-dichlorbanzanazo)morfolin 0,1 g

Octan ethylnatý 100 al

Tyto proužky indikuji přítomnost konjugovaného bilirubinu v moči atejně jako preuž ky a dlazonlovou soli odvozenou od 2/6-dlchloranillnu/ Jaou véak podstatně atabilnějěi a nadávají nespecifické reakce a řadou dalělch azokopulovatelných aoučást1 moče. Navíc, jejich reakce a bilirubinem ja intenzivnější a výraznější/ takže umožňuji nejen stanoveni 1 nejnižSlch nadfyzlologlckých koncentraci bilirubinu v moči,' ale i jeho spolehlivější aemikvantltativni stanoveni v rozsahu 6 až 100 ^umol/1»

Obdobné vlaatnoatl vykazuji i proužky/ u kterých byl N-(2/6-dlchlorbanzanazo)morfo lin nehrazen stejným hmotovým množstvím 2/4- nebo 2/5-dlchloranalogu/ nebo i N/N*-ble-(2/6-dichlorbanzenazo)-piparazinem. Při použiti 2/4- nebo 2,5-dichloreubatituovaných benzenazoelouČenln se vSak proužky při reakci a bilirubinem barvi flalovS až modroflalově a při přípravě proužků a N/N'-bla-(2/6-dichlorbenzanazo)plperazinem je možné této benzenazoeloučenlňý použit pouze v polovičním hmotovém množství'.

Přiklad 3

Přípravek pro stanoveni bilirubinu v séru

OemnS rozetřené homogenní směs o složeni

uhličitan aodný bazvodý	2/5 g
laktosa (monohydrét)	9/9 g
chlorid aodný	130 g
N-(2,'4-dlchlorbanzenazo)-N '-ethylpiparazin	38*9 g

CS 271 851 Bl se o sobě známým způsobem slisuje do tablet o hmotnosti 0,10 g.

Pro použiti těchto tablet při stanoveni bilirubinu v séru se tableta rozpuati v 10 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci » O,'165 mol/1. obsahujicicih polyethylenglykoldodecylether. K l,’5O ml takto připraveného roztoku se přidá 0,*10 ml vyšetřovaného séra a reakční roztok se po promícháni nechá stát při teplotS místnosti vs tmě po dobu 20 minut. Po této době se změří absorbance tohoto roztoku při vlnové délce 530 až 540 nm proti kontrolnímu roztoku. Ze zjištěné hodnoty absorbance se potom vypočte (například pomoci předem připravené kalibrační přimky) obsah celkového bilirubinu ve vyěotřovaném vzorku séra.

Provede-li ee rozpouštění tablety a dalSi stanoveni a použitím stejného množetvi kyseliny chlorovodíkové o etejné koncentraci, avěak bez přídavku polysthylenglykoldodecyletheru,' a vzniklé zbarveni ee vyhodnotí fotometricky přesně po 5 minutách, odpovídá odečtená hodnota absorbance obeahu tak zvaného přímého; konjugovaného bilirubinu ve vyšetřovaném vzorku séra.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Diagnostický přípravek ke stanoveni azokopulovatelných součásti biologických kapalin a materiálů; zejména bilirubinu a urobilinogenu,' obsahující popřípadě minerální nebo organickou kyselinu a/nebo kysele reagujíc! sůl) vyznačující ss tím; že obsahuje benzen- ^R5

   N=N-N X >-<

   ^R7 ^K6 (I) ve kterém substituenty R^ až R₃ jsou etejné nebo rozdílné atomy nebo skupiny, Jeko vodik, halogen; nitroskupine, sulfoekuplna; popřípadě N-acylovaná skupině amldoeulfonová, hydroxyi; alkyl nebo alkoxyl β 1 až 3 atomy uhlíku) aralkoxyl ee 7 až 8 atomy uhlíku, trlfluoromethyl-ekupina, ekupina-NH.R,' va které R Je aoetyl nebo banzoyl-ekupina;

   R₄ až Ry značí nezávisle na sobě vodík; nižSÍ alkyl β 1 až 3 atomy uhlíku nebo oxoskupinu a X značí atom uhlíku; kyslíku nebo dueiku popřípadě substituovaného nižSím alkylem p počtu uhlikových atomů 1 až 4,' nebo ekupinu obecného vzorce II ^>N-N=N-< 2—^r2