CS270307B1

CS270307B1 - The urea enzyme assay method

Info

Publication number: CS270307B1
Application number: CS88438A
Authority: CS
Inventors: Petr Rndr Csc Solich; Sona Rndr Csc Valentova; Miroslav Doc Ing Csc Marek; Rolf Doc Rndr Csc Karlicek; Miroslav Rndr Csc Polasek
Original assignee: Solich Petr; Sona Rndr Csc Valentova; Marek Miroslav; Karlicek Rolf; Miroslav Rndr Csc Polasek
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1990-06-13
Also published as: CS43888A1

Abstract

Způsob stanovení, sestávající z hydrolýzy močoviny imobilizovanou ureasou a z kolorimetrického stanoveni uvolněného amoniaku průtokovou injekční analýzou, epočívé v tom, če ae do nosného proudu fosfátového pufru aplikuje vsorek obsahující močovinu, nosný proud ss uvsde do kontaktu s Imobilizovanou ureasou umístěnou pevně na nosiči v enzymovém reaktoru a po průchodu ss nosný proud s uvolněným amoniakem postupně smísí s činidlem 1, obsahujícím V o,l až o,5 M sallcylanu sodného, 1 až 8 mM nltroprualdu sodného, o,2 až o,3 M hydroxidu alkalického kovu a lo až 4o obj. % methanolu, g as činidlem II obsahujícím o,ol až o,5 M chlornártu alkalického kovu, načež ae aměa zahřeje η» teplotu 29 až 60 ĎC a fotometricky ae stanoví absorbance při 7oo yum, z níž lze stanovit množství močoviny v analyzovaném vzorkuA method of determination, consisting of the hydrolysis of urea by immobilized urease and the colorimetric determination of the released ammonia by flow-through injection analysis, comprising applying a sample containing urea to a carrier stream of phosphate buffer, bringing the carrier stream into contact with immobilized urease fixedly placed on a carrier in an enzyme reactor and, after passing through the carrier stream, gradually mixing the released ammonia with reagent 1 containing 0.1 to 0.5 M sodium salicylate, 1 to 8 mM sodium nitroprusside, 0.2 to 0.3 M alkali metal hydroxide and 10 to 40 vol. % methanol, and with reagent II containing 0.1 to 0.5 M alkali metal hypochlorite, whereupon the mixture is heated to a temperature of 29 to 60 °C and the absorbance at 700 μm is determined photometrically, from which the amount of urea in the mixture can be determined. the analyzed sample

Description

Vynález se týká způsobu enzymového stanovení močoviny.The invention relates to a method for the enzymatic determination of urea.

V analytické chemii a zvláště pak v klinické biochemii se čím dál více uplatňují postupy založené na enzymové katalýze. Při stanovení močoviny se používá ureasy, tl· enzymu, který hydrolyžuje močovinu na amoniak a oxid uhličitý. Průběh této enzymové reakce Jo možno sledovat na základě tvorby těchto komponent, přičemž se dává přednost stanovení amoniaku, reap, amonných iontů. NeJrozěířeněJěí Je kolorimetrická Bertholotova metoda založená na oxldatlvní kopulaci amoniaku o fenoly po reakci s chlornanem v alkalickém prostředí* Vedle kolorimetrické detekce amoniaku nalezly široké uplatnění také elektrochemické metody, at*Již ve spojení se skleněnou pH elektrodou, elektrodou selektivní na amonné lonty nebo amonnou elektrodou se vzduchovou mezerou či mířením amoniaku v plynné formě.In analytical chemistry and especially in clinical biochemistry, methods based on enzyme catalysis are increasingly used. Ureas, a enzyme that hydrolyzes urea to ammonia and carbon dioxide, is used to determine urea. The course of this enzymatic reaction Jo can be monitored on the basis of the formation of these components, with the determination of ammonia, reap, ammonium ions being preferred. The most common is the colorimetric Bertholot method based on oxidative coupling of ammonia to phenols after reaction with hypochlorite in alkaline medium * In addition to colorimetric detection of ammonia, electrochemical methods have also found wide application, at * by air gap or by targeting ammonia in gaseous form.

Při enzymovém stanovení močoviny se s ohledem na rozdílnost podmínek enzymové hydrolýzy močoviny a následného stanovení vzniklého amoniaku velmi často od sebe tyto dva stupně oddělují. Z tohoto hlediska Je velmi atraktivní použití průtokové injekční analýzy. Při tomto postupu se analyzovaný vzorek aplikuje přímo do nosného média obsahujícího aktivní ureasu a vytvořený amoniak Je detašován některou z uvedených metodik. Z důvodu snížení spotřeby enzymu, a tím' 1 výrazného zefektivnění analytického postupu. Je mnohem výhodnější použití ureasy v Imobilizované formě, která se v podobě tzv, „enzymové reaktorové elektrody používá ve spojení s elektrochemickou detekcí vzniklých produktů za vlastním „reaktorem , tj· za kolonkou čl kapilárou s imoblllzovanou ureasou. V tomto uspořádání však není možno dosáhnout větší frekvence nástřiků než 2o za hodinu, poněvadž pro každou analýzu Je potřebná určitá doba k ustanovení rovnováhy elektrochemického detektoru. .In the enzymatic determination of urea, the two steps are very often separated from one another due to the different conditions of the enzymatic hydrolysis of urea and the subsequent determination of the ammonia formed. From this point of view, the use of flow injection analysis is very attractive. In this procedure, the analyzed sample is applied directly to a carrier medium containing active urease and the ammonia formed is detected by any of the above methods. In order to reduce the consumption of enzyme, and thus significantly streamline the analytical procedure. It is much more advantageous to use urease in immobilized form, which is used in the form of a so-called "enzyme reactor electrode" in conjunction with electrochemical detection of the products formed behind the reactor itself, i.e. behind the column with a capillary with immobilized urease. In this arrangement, however, it is not possible to achieve a feed rate greater than 2 ° per hour, since some time is required for each analysis to establish the equilibrium of the electrochemical detector. .

Uvedenou nevýhodu odstraňuje způsob enzymového stanovení močoviny analýzou, skládající se z hydrolýzy močoviny imoblllzovanou ureasou a z kolorimetrického stanovení uvolněného amonlaku průtokovou Injekční analýzou, vyznačený tím, že se do nosného proudu fosfátového pufru aplikuje vzorek obsahující močovinu, nosný proud se uvede do kontaktu a Imoblllzovanou ureasou umístěnou pevně na nosiči v enzymovém reaktoru a po průchodu se nosný proud s uvolněným amoniakem postupně smísí s činidlem i, obsahujícím o,l až o,5 M aallcylanu sodného, 1 až β mM nltroprusidu sodného, o,2 až o,3 M hydroxidu alkalického kovu a lo až 4o $4 obj, methanolu, a a činidlem II obsahujícím ο,οΐ až o,6 M chlornanu alkalického kovu, načež se směs zahřeje na teplotu 25 až 6o °C a fotometrlcky se stanoví absorbance při 7oo yum, z níž lze stanovit množství močoviny v analyzovaném vzorku.This disadvantage is eliminated by a method for the enzymatic determination of urea by an analysis consisting of hydrolysis of urea by immobilized urease and colorimetric determination of released ammonium by flow injection analysis, characterized in that a sample containing urea is applied to a phosphate buffer carrier, the carrier stream is contacted and firmly on a support in an enzyme reactor and, after passing, the carrier stream with liberated ammonia is gradually mixed with reagent i containing 0.1 to 0.5 M sodium allycylanate, 1 to β mM sodium nitroprusside, 0.2 to 0.3 M alkaline hydroxide. metal and 10 to 40 volumes of methanol, and with a reagent II containing ο, ο ΐ to 0.6 M alkali metal hypochlorite, after which the mixture is heated to 25-60 ° C and the absorbance at 70 yum is determined photometrically, from which it can be determined the amount of urea in the analyzed sample.

Výhodou enzymového stanovení močoviny podle vynálezu Je především rychlost analýzy, kdy při průtoku kolem 1 ml/s nosného média jo možno provádět 6o analýz za hodinu s lineární odezvou pro koncentraci močoviny 25 až 5oo mmol.djn v nástřiku 4o až 9o yuLThe advantage of the enzymatic determination of urea according to the invention is in particular the speed of analysis, when at a flow rate of about 1 ml / s of carrier medium it is possible to perform 6o analyzes per hour with a linear response for urea concentration of 25 to 500 mmol.djn in 4o to 9o yuL injection.

Vynález Jo dokumentován příklady, aniž by se Jimi omezoval.The invention is documented by way of example and not limitation.

Příklad 1Example 1

Stanovení močoviny v krevním séruDetermination of urea in blood serum

Vzorky krevního séra byly řoděny vodou v poměru 1 i So a aplikovány bos doprotelnaco do nosného produ o,2 M fosfátového pufru pH 6,9 systému průtokové injekční analýzy. Po průchodu média s aplikovaným vzorkem enzymovým reaktorem obsahujícím Imoblllzovanou ureasu byla reakčnf směs se. vzniklým amoniakem smíchána s činidlem I, obsahujícím 0,37 M sallcylan sodný, 4 mM nitroprusid sodný, o,25 M hydroxid sodný a 3o obj. %ní methanol ve vodě, a potom s činidlem II, obsahujícím o,o3 M chlornan sodný.' Raakční směs potom byla průchodem přes reakční cívku zahřáta na 5o °C a množství vytvořeného barvlva byle proměřeno v průtokové kyvetě. Hodnota ab.orb.nc. při 7oo nrn je přímo úměrná množství močoviny obsažená v apllkovanám vxorku v rozsahu koncentrací 25 až 5oo yumol.dm^-^ pyj frekvenci 6o analýz za hodinu byla reprodukovalolnost stanovení močoviny charakterizována hodnotou relativní směrodatně odchylky 1,1 %.Blood serum samples were diluted with 10 .mu.l of water and applied barefoot to the carrier product with .2 M phosphate buffer pH 6.9 of the flow injection analysis system. After passing the sample medium through an enzyme reactor containing immobilized urease, the reaction mixture was stirred. the resulting ammonia is mixed with Reagent I containing 0.37 M sodium salicylate, 4 mM sodium nitroprusside, 0.25 M sodium hydroxide and 30% v / v methanol in water, and then with Reagent II containing 0.33 M sodium hypochlorite. ' The reaction mixture was then heated to 50 ° C by passing through a reaction coil and the amount of dye formed was measured in a flow cell. The value of ab.orb.nc. at 70 nm is directly proportional to the amount of urea contained in the applied sample in the concentration range of 25 to 500 yumol.dm ^{- at} a frequency of 60 analyzes per hour, the reproducibility of the urea determination was characterized by a value with a relative standard deviation of 1.1%.

CS 27o3o7 BlCS 27o3o7 Bl

Příklad 2Example 2

Stanovení močoviny v močiDetermination of urea in urine

Způsobem shodným Jako v příkladu 1 až na to, že činidlo II obsahovala o,o3 M chlornanu draselného, bylo prováděno stanovení obsahu močoviny ve vzorcích moči zředěných vodou 1 s 1 ooo až 1 t 2 ooo se «stejnou frekvencí nástřiků. Interferující obsah amonných lontů ve vzorcích moči byl odečten na základě shodného stanovení, aniž byl vzorek podroben účinku imobllizované ureasy v enzymovém reaktoru.In the same manner as in Example 1, except that reagent II contained 0.1 M potassium hypochlorite, the urea content of urine samples diluted with water was performed with 1 to 10 to 100 t with the same injection frequency. The interfering ammonium ion content in the urine samples was read by the same assay without subjecting the sample to the immobilized urease in the enzyme reactor.

Claims

Method for the enzymatic determination of urea by analysis, consisting of the hydrolysis of urea by immobilized urease and the colorimetric determination of released ammonia by flow injection analysis, characterized in that a sample containing urea is applied to a phosphate buffer carrier, the carrier stream is contacted the carriers in the enzyme reactor and, after passing, the carrier stream and the liberated ammonia are successively mixed with reagent I containing 0.1 to 0.5 M sodium sallcylanate, 1 to β mM sodium nitroprusside, 0.2 to 0.3 M alkali metal hydroxide, and 10 to 4% by volume of methanol, and with reagent Π containing 0.1 to 0.5 M of alkali metal hypochlorite, after which the mixture is heated to 25 to 60 ° C and the absorbance at 700 yum is determined photometrically, from which the amount of urea can be determined. in the analyzed sample.