CS269938B1 - Recombined pmp77 plasmid - Google Patents
Recombined pmp77 plasmid Download PDFInfo
- Publication number
- CS269938B1 CS269938B1 CS878304A CS830487A CS269938B1 CS 269938 B1 CS269938 B1 CS 269938B1 CS 878304 A CS878304 A CS 878304A CS 830487 A CS830487 A CS 830487A CS 269938 B1 CS269938 B1 CS 269938B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- plasmid
- pmp77
- recombined
- streptomycete
- ecori
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Vynález a· týká rekomblnovaného plasmidú. pMP77,který: se vyznačuje přítomností 'snadno vydélitelné genetická Informace, kódující syntézu enzymu tyrozínázy v bučkách streptomycet. ·
Rozvojem genetického inženýrství vznikla rozsáhlá potřeba vyčlenit genetickou informaci na snadno manipulovatelný extrachromosomový repllkon. který potom slouží jako vektorová molekula pro přenos genetické informace do zvolené hostitelské bučky, ,nebo jako snadný zdroj genetické informace při rekombinačních pokusech in vitro. Nejvhodnéjéími extrachromosomovými molekulami DNA pro genetické inženýrství ve stře ptomycetáchi Jsou ve streptomycetových bučkách se přirozené vyskytující molekuly plasmidú. V letech 198o až..1986 byla z různých streptomycetových kmenů izolována řada plasmidú a i když tyto plasmidysneobsahovaly žádné snadno detekovatelné geny, byl objev vétšiny z nich okamžité patentové chránént Namátkou uvádíme objevy kryptlckých streptomycetových plasmidú patentované v letech ΙθβΒύαζ 1985.
Plasmid pOA29 ze Streptomyces grlseus-Jap. patent 5914593 , plasmid pOA19 ze Streptomyces grlseus-Jap. patent 59143588 , plasmid pSJ2 ze S. Jumonjlnensis - jap. patent 59213391 nebo plasmid pATM 3 ze Streptomyces castaneoglobisporus - US patent 4518698.
K účinnému genetickému inženýrství ve streptomycetách Je však nutné také provést označení kryptlckých plasmidú snadno seloktovatelnými znaky. Takovými znaky mohou být geny kódující resistencl k antibiotiku či syntézu snadno detekovatelného pigmentu.
Jedním z takových genů je gen kódující syntézu hnédého pigmentu melaninu na půdách obsahujících lyrosln. Gen se nazývá mel a byl poprvé získán klonováním restrlkČních fragmentů kmene Streptomyces antlbioticus (Katz et al. J. Gen. Microbiol. 129 : 27o3, 1983).. Znovuzískání mel genu z plasmidú pU7o2 je obtížné, nebol* pU7O2 DNA musí být vysoce purlflkována. aby při klonování mel genu nedocházelo ke kom petici s restrikčníml fragmenty střep lomy četového chromo— somu, na kterých umísténé geny jeou bez problému expres ovány ve streptomycetách. Naproti tomu klonování v Escherichia coll zajlštuje získání homologního materiálu (mel genu) a případná kontaminace restrikčníml fragmenty nesoucími geny chromozomu E. coll, které ve své vétšiné nejsou expresovány ve streptomycetách. Je zanedbatelné,
Rekomblnovaný plasmid pMP77 podle vynálezu je charakterizovaný záménou 648 bp Pst I EcoRI resirikčního fragmentu plasmidú pBR322 fragmentem Pst I—EcoRI o velikosti 164o bp ze streptomycetového plasmidú pU622, který obsahuj* kompletní sekvenci mel genu včetné Jeho regulační oblasti kódující syntézu enzymu tyrozínázy v bučkách atreptomycet a zároveň je charakterizován restrikční mapou znázoménou na obr, 1. Silná' čára značí 164o bp velký fragment získaný štépením streptomycetového plasmidú pU622. Slabá čára značí vektorovou molekulu pBR322.
Konstrukce rekomblnovaného plasmidú pMP77 .
Z kmene E. coll HBlol (pBR322) byla izolována plasmidová DNA mnohokoplového plasmidú pBP.322 (Bolivar et al.. Gene 2: 95, 1977) o velikosti 4363 bp, kódující resistenci k antibiotikům ampicllinu a tetracykllnu. DNA plasmidú pBR322 byla štépena restrikčníml endonukleázaml EcoRI a Pstl, pro které Je v molekule DNA plasmidú pBR322 Jen jedno zásahové místo, přičemž zásahové místo pro restrikční endonukleázu Pst! je situováno v oblasti kódující resistenci k antibiotiku ampicllinu.
Vyžtépený Pstl—EcoRI restrikční fragment plasmidú pBR322 o velikosti 648 bp byl nahrazen Pstl—EcoRI restrikčním fragmentem o velikosti 164o bp získaným ze streptomycetového plasmidú pD622, který obsahuje kompletní sekvenci mel genu včetné Jeho regulačních oblastí, umožčující produkci melaninu streptomycetovou bučkou. Pstl—EcoRI restrikční fragment plasmidú pIJ622 byl vpraven do korespondujících míst pBR322 plasmidú ligací in vitro pomocí enzymu DNA ligázy.
Po vytvoření re kombinovaných molekul plasmidú pMP77 byly tyto molekuly transformovány do kompetentních bunék kmene E. coli HBlol a bučky obsahující molekuly rekombinované pMP77 DNA byly detekovány na základé jejich citlivosti k antibiotikům ampicllinu a tetracyklinu na příslušných agarových médiích. Transformované bučky kmene E.coli HBlol plasmidem pMP77 byly selektovány jako amplcllin sensitlvní a tetracyklln reslstentní. Takto připravený rekombinovaný plasmid
CS 269938 Bl’ .
si uchoval schopnost vektorové molekuly plasm Idu pBR322 zvyšovat svůj počet'kopií‘v < hostitelské ; buřiče E. coli, Jestliže byl přidán chloramfenlkol k exponenciálně rostoucí kultuře hostitele.' >
K ověření celistvostí klonované genetické informace byla z klonů E. coll HB lol; obsahujících plasmid pMP77 izolována DNA rekombinovaného plasmidu pMP7? a podrobena reslrikčníí «analýze. Restrikční analýza prokázala, že rekombincvaná plasmldová DNA pMP77 izolovaná ze sledovaných klonů obsahuje celistvý 1 64o bp velký restrikční fragment streptomycetového plasmidu pIJ622, Jehož orientace v molekule rekombinovaného plasmidu Je určena kom plemen tujícími kohesivními konci po Štěpení plasmidů pBR322 a pU622 restrikčními endonukleázaml Pst! a EcoRI.
Rekombinovaný plasmid pMP77 umožňuje snadno získat ve velkém množství a vysoké čistotě fragment DNA kódující ve streptomycetách tvorbu hnědého pigmentu melanlnu. Tvorba melaninu je snadno delekovatelným znakem a lze JI s výhodou použít k označení nově konstruovaných plasmidových i fágových vektorů pro klonování ve streptomycetách a proxlmální oblast mel genu k přípravě fúzovaných proteinů umožňujících transport «fúzovaného proteinu ze streptomycetové buňky.
Ligace 1 64o bp velkého Psti-EcoRI restrikčního fragmentu kódujícího syntézu melaninu ve streptomycetové buňce, do vektorové molekuly pBR322 dává možnost použít zvýšený počet restrikčnlch endonukleáz k vyštěpení restrikčního fragmentu s informací pro produkci melanlnu ve streptomycetové buňce.
Rekombinovaný plasmid pMP77 Je uložen v Československé sbírce mikroorganismů Univerzity J. E. Purkyně v Brně v kmeni Escherichia coli HBlol CCM 4oo6.
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZURekombinovaný plasmid pMP77 charakterizovaný záměnou 648 bp Pstl-EcoR! restrikčního fragmentu plasmidu pBR322 fragmentem Pstl—EcoRI o velikosti 1 64o bp ze streptomycetového plasmidu pIJ622, který obsahuje kompletní sekvenci mel genu včetně Jeho regulační oblasti kódující syntézu enzymu tyrozinázy v buňkách streptomycet a restrikční mapou, uložený v E. coli HBlol CCM4oo6.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS878304A CS269938B1 (en) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | Recombined pmp77 plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS878304A CS269938B1 (en) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | Recombined pmp77 plasmid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS830487A1 CS830487A1 (en) | 1989-10-13 |
| CS269938B1 true CS269938B1 (en) | 1990-05-14 |
Family
ID=5433402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS878304A CS269938B1 (en) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | Recombined pmp77 plasmid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS269938B1 (cs) |
-
1987
- 1987-11-19 CS CS878304A patent/CS269938B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS830487A1 (en) | 1989-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Groisman et al. | In vivo DNA cloning and adjacent gene fusing with a mini-Mu-lac bacteriophage containing a plasmid replicon. | |
| AU2014372562B2 (en) | A method of making adenovirus and corresponding plasmids | |
| EP0512017B1 (en) | Vaccines | |
| Gryczan et al. | Molecular cloning of heterologous chromosomal DNA by recombination between a plasmid vector and a homologous resident plasmid in Bacillus subtilis | |
| Wang et al. | Analysis of the membrane organization of an Escherichia coli protein translocator, HlyB, a member of a large family of prokaryote and eukaryote surface transport proteins | |
| Helmer et al. | A new chimeric gene as a marker for plant transformation: the expression of Escherichia coli β-galactosidase in sunflower and tobacco cells | |
| Yousefian et al. | Structural characterization of the EmrAB-TolC efflux complex from E. coli | |
| Wychowski et al. | A domain of SV40 capsid polypeptide VP1 that specifies migration into the cell nucleus. | |
| FI89507B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av genprodukter | |
| US5616326A (en) | Recombinant canine adenovirus 2 (CAV-2) | |
| Kodaira et al. | The dnaX gene encodes the DNA polymerase III holoenzyme τ subunit, precursor of the γ subunit, the dnaZ gene product | |
| Zhou et al. | Mutagenesis of the Agrobacterium VirE2 single-stranded DNA-binding protein identifies regions required for self-association and interaction with VirE1 and a permissive site for hybrid protein construction | |
| Plasterk et al. | Site-specific recombination by Gin of bacteriophage Mu: inversions and deletions | |
| Popham et al. | Cloning, characterization, and expression of the spoVB gene of Bacillus subtilis | |
| Babiss et al. | Deletion and insertion mutations in early region 1a of type 5 adenovirus that produce cold-sensitive or defective phenotypes for transformation | |
| Hickman et al. | Evidence that TET protein functions as a multimer in the inner membrane of Escherichia coli | |
| CN116102663A (zh) | 一种猴痘病毒b6r抗原及其制备方法与应用 | |
| US4634678A (en) | Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms | |
| IT8223166A1 (it) | VETTORI PLASMIDICI AD ESPRESSIONE IN Bacillus subtilis E PROCEDIMENTO PER LA LORO PREPARAZIONE | |
| Sprengel et al. | Translationally coupled initiation of protein synthesis in Bacillus subtilis | |
| Tilsner et al. | Plasmodesmal targeting and intercellular movement of potato mop-top pomovirus is mediated by a membrane anchored tyrosine-based motif on the lumenal side of the endoplasmic reticulum and the C-terminal transmembrane domain in the TGB3 movement protein | |
| Kamrud et al. | Expression strategy of the M genome segment of Hantaan virus | |
| CS269938B1 (en) | Recombined pmp77 plasmid | |
| Mougeot et al. | Identification of C-terminal amino acid residues of cauliflower mosaic virus open reading frame III protein responsible for its DNA binding activity. | |
| Ratet et al. | Construction and uses of a new transposable element whose insertion is able to produce gene fusions with the neomycin-phosphotransferase-coding region of Tn903 |