CS269929B1

CS269929B1 - Method of avidin isolation

Info

Publication number: CS269929B1
Application number: CS877882A
Authority: CS
Inventors: Hana Rndr Karaskova; Marcela Aussenbergova; Jiri Rndr Navratil; Bohuslava Placha; Frantisek Ing Cakl; Kamila Ing Mikova
Original assignee: Hana Rndr Karaskova; Marcela Aussenbergova; Jiri Rndr Navratil; Bohuslava Placha; Frantisek Ing Cakl; Kamila Ing Mikova
Priority date: 1987-11-04
Filing date: 1987-11-04
Publication date: 1990-05-14
Also published as: CS788287A1

Abstract

Účelem řešení je izolace avidinu z odpadní vody vznikající při výrobě lysozyrou. Uvedeného účelu se dosáhne tím, že avidin je z odpadní vody vznikající při výrobě lysozymu v první fázi navázán na silně kyselý ionex. Pak následuje vymytí avidinové frakce roztokem uhličitanu amonného o koncentraci 2,3 až 2,7 hmot. \ a zahuštění roztoku ultrafiltrací za současného odstranění nežádoucích solí. Potom je provedena purifikace na slabě kyselém ionexu a po opětném zahuštění a odsolení ultrafiltrací je získaný purifikovaný avidin usušen lyofilizací.The purpose of the solution is to isolate avidin from wastewater generated during the production of lysozyme. The stated purpose is achieved by avidin being bound to a strongly acidic ion exchange resin from wastewater generated during the production of lysozyme in the first phase. This is followed by washing the avidin fraction with an ammonium carbonate solution with a concentration of 2.3 to 2.7 wt. \ and concentration of the solution by ultrafiltration while simultaneously removing unwanted salts. Then purification is carried out on a weakly acidic ion exchange resin and, after re-concentration and desalting by ultrafiltration, the purified avidin obtained is dried by lyophilization.

Description

Vynález se týká způsobu izolace avidinu z odpadních vod vznikajících při výrobě Ivsozymu z vaječného bílku.The invention relates to a method for isolating avidin from wastewater generated during the production of Ivsozyme from egg white.

Dosud používané způsoby izolace avidinu využívají jako základní surovinu nativní vaječný bílek. Avidin tvoří cca 0,05 % hmot, celkových bílkovin slepičího vaječného bílku, což představuje při průměrném obsahu celkových bílkovin 10 % hmot, cca 50 mh avidinu a vil vaječného bílku. K získání purifikovaného avidinu o vysoké biologické aktivitě je nutno aplikovat opakované iontově výměnnou chromatrografií nebo afinitní chromatografií, které poskytují malé výtěžky při vysoké pracnosti a ekonomické náročnosti. Běžně používané sorbenty jsou katexy typu CM-celulosy nebo AMBERLITE.The methods used so far for isolating avidin use native egg white as the basic raw material. Avidin constitutes approximately 0.05% by weight of the total proteins of hen egg white, which represents, with an average total protein content of 10% by weight, approximately 50% by weight of avidin and villi of egg white. To obtain purified avidin with high biological activity, it is necessary to apply repeated ion-exchange chromatography or affinity chromatography, which provide low yields with high labor and economic demands. Commonly used sorbents are cation exchangers of the CM-cellulose or AMBERLITE type.

Výše uvedené nevýhody odstraňuje způsob izolace avidinu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že výchozí surovinou k izolaci avidinu jsou odpadní vody vznikající při výrobě lysozymu, obohacené avidinem, ve kterých je avidin obsažen v množství 1,0 až 2,0 hmot, z celkového obsahu bílkovin, což představuje cca 200 až 400 mg avidinu vil odpadní vody. Použití této odpadní vody umožní snížit počet purifikačních kroků k získání avidinu o vysoké biologické aktivitě při zařazení silně kyselého ionexu SUP - OSTSORB v první fázi purifikace. Navázaný avidin je vymýván roztokem uhličitanu amonného o koncentraci v rozmezí 2,3 až 2,7 % hmot. Získaná avidinová frakce je ultrafiltrací zahuštěna za současného odstranění solí. Koncentrát avidinové frakce je komplexně purifikován na slabě kyselém ionexu s výhodou CM-celulosy, CM-32 nebo CM-52 a po opětném zahuštění a odsolení ultrafiltrací usušen lyofilizací.The above disadvantages are eliminated by the method of isolating avidin according to the invention, the essence of which lies in the fact that the starting material for isolating avidin is wastewater generated during the production of lysozyme, enriched with avidin, in which avidin is contained in an amount of 1.0 to 2.0 wt. of the total protein content, which represents approximately 200 to 400 mg of avidin per 1000 ml of wastewater. The use of this wastewater will allow reducing the number of purification steps to obtain avidin with high biological activity when including the strongly acidic ion exchange resin SUP - OSTSORB in the first stage of purification. The bound avidin is washed out with an ammonium carbonate solution with a concentration in the range of 2.3 to 2.7 wt. %. The obtained avidin fraction is concentrated by ultrafiltration with simultaneous removal of salts. The avidin fraction concentrate is comprehensively purified on a weakly acidic ion exchange resin, preferably CM-cellulose, CM-32 or CM-52, and after reconcentration and desalting by ultrafiltration, dried by lyophilization.

Avidin je získáván pro schopnost vázat biotin (vitamin H, s extrémně vysokou asociační konstantou 10^ mol.l^-\ což předurčuje tuto dvojici k zavádění nové generace metod pro detekci proteinů a nukleových kyselin. Aplikace systému avidin - biotin představuje v současné době jeden z nejefektivnějších postupů v detekční fázi analýzy v tzv. imunochemických analytických metodách se značenými molekulami. Použitím této metody lze zásadním zplsotem Z^gít citlivost běžně používaného enzymoimunologického testu (ELISA) a vyrovnat se metodám využívajícím izotopové značení (RIA) s výhodou podstatně větší stability konjugátů a v neposlední řadě odstranění zdravotního rizika při práci s izotopy. Tyto metody jsou používány především v klinické biochemii (diagnostické testy).Avidin is obtained for its ability to bind biotin (vitamin H, with an extremely high association constant of 10^ mol.l ^- \, which predetermines this pair for the introduction of a new generation of methods for the detection of proteins and nucleic acids. The application of the avidin - biotin system currently represents one of the most effective procedures in the detection phase of analysis in the so-called immunochemical analytical methods with labeled molecules. By using this method, the sensitivity of the commonly used enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be significantly increased and it can be compared to methods using isotope labeling (RIA) with the advantage of significantly greater stability of conjugates and, last but not least, the elimination of health risks when working with isotopes. These methods are used mainly in clinical biochemistry (diagnostic tests).

Systém avidin - biotin je dále využíván ve výzkumu např. při studiu receptorů na povrchu biologických membrán, v histochemii, při izolaci enzymových podjednotek, nukleových kyselin a peptidů, při určování struktury bílkovin apod.The avidin-biotin system is also used in research, e.g. in the study of receptors on the surface of biological membranes, in histochemistry, in the isolation of enzyme subunits, nucleic acids and peptides, in determining the structure of proteins, etc.

Příklad .Example.

500 1 odpadních vod vznikajících při výrobě lysozymu o průměrných výchozích parametrech 2,0 % hmot, celkových bílkovin a 8 % hmot, chloridu draselného se opakovaně ultrafiltruje, až je výsledná koncentrace chloridu draselného max. 1 % hmot., a objem se zahustí na 100 1. K získanému roztoku se přidá 40 kg SHP-OSTSORBu, pH se upraví na 8,5 až 9,0 a při teplotě 4 až 10 °C se míchá 6 hod: Vzniklá supsenze se nechá ustát cca 12 hob. Následuje oddělení koncentrátu a nosič je 3krát promýván roztokem uhličitanu amonného : koncentraci nižší než 0,5 V hmot., a to vždy objemem 80 1 po dobu 15 min.500 l of wastewater generated during the production of lysozyme with average initial parameters of 2.0 wt% total protein and 8 wt% potassium chloride is repeatedly ultrafiltered until the resulting potassium chloride concentration is max. 1 wt%, and the volume is concentrated to 100 l. 40 kg of SHP-OSTSORB is added to the obtained solution, the pH is adjusted to 8.5 to 9.0 and stirred at a temperature of 4 to 10 °C for 6 hours: The resulting suspension is allowed to stand for about 12 hours. The concentrate is separated and the carrier is washed 3 times with an ammonium carbonate solution: concentration lower than 0.5 wt%, each time with a volume of 80 l for 15 minutes.

Avidin navázaný na sorbentu je vymýván 2krát 80 1 roztoku uhličitanu amonného o koncentraci 2,5 % hmot, po dobu 60 min.Avidin bound to the sorbent is eluted twice with 80 l of ammonium carbonate solution with a concentration of 2.5% by weight, for 60 min.

160 1 získané avidinové frakce se odsolí a zkoncentruje ultrafiltrací. Přes kolonu s 50 1 náplní CM-celulosy CM-32 (WHARMAN - 10 kg suché celulosy, což představuje využití ;ca 10 % kapacity kolony) se avidinová frakce nechá protékat s průtokovou rychlostí cca 200 ml/min. Nosič je promýván 100 1 roztoku uhličitanu amonného o koncentraci 0,3 až C.% hmot.160 l of the obtained avidin fraction is desalted and concentrated by ultrafiltration. The avidin fraction is allowed to flow through a column with 50 l of CM-cellulose CM-32 (WHARMAN - 10 kg of dry cellulose, which represents a utilization of about 10% of the column capacity) at a flow rate of about 200 ml/min. The carrier is washed with 100 l of ammonium carbonate solution with a concentration of 0.3 to C.% by weight.

CS 269929 SiCS 269929 Yes

Následuje postupné vymývání navázaných bílkovin použitím 0,5 až 3,0 % hmot, kontinuálního koncentračního gradientu roztokem uhličitanu amonného o celkovém objemu 150 1 (cca3 objemy náplně kolony). Po odtečení přibližně 15 % celkového objemu eluce začne vytékat roztok avidinu, ze kterého se následně odstraní přítomné soli ultrafiltrací a po jeho zahuštění se usuší lyofilizací.This is followed by gradual elution of bound proteins using a 0.5 to 3.0% by weight, continuous concentration gradient with ammonium carbonate solution with a total volume of 150 l (approx. 3 column filling volumes). After approximately 15% of the total elution volume has drained, the avidin solution begins to flow out, from which the salts present are subsequently removed by ultrafiltration and, after concentration, dried by lyophilization.

Výtěžek z tohoto objemu je 90 až 100 g avidinu o biologické aktivitě 10 až 13 bio tinu na 1 mg preparátu.The yield from this volume is 90 to 100 g of avidin with a biological activity of 10 to 13 biotin per 1 mg of preparation.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A method for isolating avidin, characterized in that the starting material is wastewater generated during the production of lysozyme, enriched with avidin, from which avidin is bound to a strongly acidic ion exchange resin in the first phase, followed by washing of the avidin fraction with an ammonium carbonate solution with a concentration of 2.3 to 2.7% by mass, and concentration by ultrafiltration while simultaneously removing unwanted salts, after which purification is performed on a weakly acidic ion exchange resin and, after reconcentration and desalting by ultrafiltration, the obtained purified avidin is dried by lyophilization.